RU2662085C1

RU2662085C1 - Method for evaluating the degree of risk of adverse evaluation of disease in patients with gastric cancer

Info

Publication number: RU2662085C1
Application number: RU2016125106A
Authority: RU
Inventors: Эмилия Владимировна Иванова; Ирина Викторовна Кондакова; Ольга Владимировна Черемисина; Сергей Геннадьевич Афанасьев; Елена Сергеевна Колегова
Priority date: 2016-06-22
Filing date: 2016-06-22
Publication date: 2018-07-23
Also published as: RU2016125106A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to the field of medicine, specifically to oncology, and relates to a method for determining the degree of risk of an adverse outcome of a disease in patients with gastric cancer. Essence of the method: in the stomach tumor, the total calpain activity is determined, Chymotrypsin-like total proteasome activity, activity of 26S and 20S proteasome pools, content of subunits amount α Σα, content of the LMP7 subunit, content of the LMP2 subunit, content of the PA28β, subunit, content of the Rpt6 subunit, also take into account the age of the patients. Then, the values of the discriminant functions Y1, Y2 are calculated from the equations. At Y1>Y2, a low, and at Y1<Y2 – high risk of adverse outcome of stomach cancer, in the case when the characteristics of the object presented for recognition satisfy the condition Y1=Y2, recognition is impossible without additional information. Sensitivity of the method is 67 %, the specificity is 96 %.

EFFECT: increasing the accuracy of the method.

1 cl, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, касается способов определения степени риска неблагоприятного исхода заболевания у больных раком желудка.The invention relates to medicine, specifically to oncology, relates to methods for determining the risk of an adverse outcome of a disease in patients with gastric cancer.

К числу наиболее распространенных онкологических заболеваний органов желудочно-кишечного тракта как в России, так и за рубежом относится рак желудка (РЖ). В структуре общей заболеваемости онкологической патологией он составляет 7,0%. Следует отметить, что РЖ более распространен среди мужского населения (8,6%), нежели среди женского (5,5%) [1]. Известно, что главным прогностическим фактором при РЖ служит резектабельность [6]. После радикального хирургического лечения 5-летняя выживаемость в зависимости от окончательной стадии заболевания составляет: IA - 95%, IB - 85%, II - 54%, IIIA - 37%, IIIB - 11%, IV - менее 7% [7]. На сегодня разработаны алгоритмы лечения РЖ на разных стадиях заболевания, включающие радикальное хирургическое лечение, неоадьювантную химиотерапию, адьювантную химио- и лучевую терапию. В этой связи для коррекции тактики планируемой терапии актуальной является оценка прогноза исхода заболевания на основании показателей внутриклеточного протеолиза и, как следствие, формирование групп повышенного риска.Among the most common oncological diseases of the organs of the gastrointestinal tract both in Russia and abroad is gastric cancer. In the structure of the general incidence of oncological pathology, it is 7.0%. It should be noted that RJ is more common among the male population (8.6%) than among the female (5.5%) [1]. It is known that the main prognostic factor in cancer is resectability [6]. After radical surgical treatment, 5-year survival depending on the final stage of the disease is: IA - 95%, IB - 85%, II - 54%, IIIA - 37%, IIIB - 11%, IV - less than 7% [7]. Algorithms for the treatment of pancreatic cancer at various stages of the disease have been developed to date, including radical surgical treatment, neoadjuvant chemotherapy, adjuvant chemo- and radiation therapy. In this regard, to correct the tactics of the planned therapy, it is relevant to assess the prognosis of the outcome of the disease based on indicators of intracellular proteolysis and, as a result, the formation of high-risk groups.

В литературе представлено немного объективных и надежных критериев прогноза исхода заболевания у пациентов с диагнозом рак желудка.The literature provides few objective and reliable criteria for predicting the outcome of a disease in patients diagnosed with gastric cancer.

Одним из существующих способов оценки прогноза исхода заболевания при раке желудка является способ прогнозирования гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка, который заключается в проведении иммуногистохимической оценки процента экспрессии протеина альдо-кето редуктазы I В 10 семейства (AKR1B10) в клетках рака желудка кишечного типа, формирующих железистоподобные структуры, располагающиеся в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки желудка, рассчитывают коэффициент регрессии β с помощью метода множественной регрессии из пакета программ Statistica 6,0 for Windows, при этом в качестве переменного параметра используют процент экспрессии AKR1B10 в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки желудка, а в качестве независимого параметра используют показатель, отражающий наличие опухолевых структур в разных слоях стенки желудка: «1» - в слизистом слое, «2» - подслизистом, «3» - мышечном, «4» - серозном, причем если опухоль прорастает до мышечного слоя, то оценивают экспрессию только в трех слоях, и при значении коэффициента регрессии β, равном или более «0,25», случай относят к группе высокого риска развития гематогенных метастазов, при значении коэффициента регрессии β менее «-0,25» случай относят к группе низкого риска развития гематогенных метастазов [5].One of the existing methods for assessing the prognosis of disease outcome in gastric cancer is a method for predicting hematogenous metastasis in the intestinal type of gastric cancer, which consists in conducting an immunohistochemical assessment of the percentage of expression of the protein of the aldo-keto reductase I 10 family (AKR1B10) in gastric cancer cells forming glandular structures located in the mucous, submucous, muscle and serous layers of the stomach wall, calculate the regression coefficient β using the multiple regression from the Statistica 6.0 for Windows software package, while the AKR1B10 expression percentage in the mucous, submucous, muscle and serous layers of the stomach wall is used as a variable parameter, and an indicator reflecting the presence of tumor structures in different layers of the wall is used as an independent parameter stomach: “1” - in the mucous layer, “2” - submucosa, “3” - muscle, “4” - serous, and if the tumor grows to the muscle layer, expression is evaluated only in three layers, and with a value of the regression coefficient β equal to silt and more than “0.25”, the case is referred to the group of high risk of developing hematogenous metastases, with a regression coefficient β less than “-0.25”, the case is referred to the group of low risk of developing hematogenous metastases [5].

Известен способ прогнозирования метастазирования опухолевого процесса у больных раком желудка, заключающийся в том, что в периферической венозной крови обследуемых лиц определяют абсолютное содержание моноцитов и концентрацию фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). При содержании моноцитов менее 0,35⋅10⁹ кл/л и TNF-α более 55 пг/мл прогнозируют высокую вероятность метастазирования [4].A known method for predicting metastasis of the tumor process in patients with gastric cancer, which consists in the fact that in the peripheral venous blood of the examined individuals determine the absolute content of monocytes and the concentration of tumor necrosis factor alpha (TNF-α). With a monocyte content of less than 0.35 × ^{10 9} cells / L and TNF-α greater than 55 pg / ml, a high probability of metastasis is predicted [4].

Наиболее близким к заявляемому способу является способ прогнозирования исхода заболевания, использующий математическое моделирование. Способ, предложенный Е.М. Непомнящей с соавт., включает определение молекулярных показателей: маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркеров апоптоза р53 и bcl-2 методом иммуногистохимии [3]. Проводят иммуногистохимическое исследование и устанавливают, что при абсолютных значениях при перстневидно-клеточном раке: р53 - 10%, bcl-2 - 10%, Ki-67 - 12%; при недифференцированном раке: р53 - 13%, bcl-2 - 11%, Ki-67 - 9%; при аденокарциноме: р53 - 10%, bcl-2 - 9%, Ki-67 - 12% прогнозируют возникновение метастазов в лимфоузлах. При р53 - 6%, bcl-2 - 5%, Ki-67 - 10% прогнозируют отсутствие метастатического поражения лимфоузлов. С помощью этих прогностических факторов можно предсказать исход заболевания, выживаемость и вероятность возникновения метастазов у больных при отсутствии лечения, планирования лечебных мероприятий [6].Closest to the claimed method is a method for predicting the outcome of a disease using mathematical modeling. The method proposed by E.M. Nepomnyaschi et al. Includes the determination of molecular indicators: a proliferative activity marker Ki-67 and apoptosis markers p53 and bcl-2 by immunohistochemistry [3]. An immunohistochemical study is carried out and it is established that at absolute values for cricoid-cell carcinoma: p53 - 10%, bcl-2 - 10%, Ki-67 - 12%; with undifferentiated cancer: p53 - 13%, bcl-2 - 11%, Ki-67 - 9%; with adenocarcinoma: p53 - 10%, bcl-2 - 9%, Ki-67 - 12% predict the occurrence of metastases in the lymph nodes. At p53 - 6%, bcl-2 - 5%, Ki-67 - 10% predict the absence of metastatic lymph node damage. Using these prognostic factors, one can predict the outcome of the disease, survival and the likelihood of metastases in patients with no treatment, planning treatment measures [6].

Недостатками этого способа являются:The disadvantages of this method are:

- отсутствие чувствительности и специфичности, что не позволяет оценить практическую значимость и эффективность применения способа;- lack of sensitivity and specificity, which does not allow to evaluate the practical significance and effectiveness of the method;

- сложность, длительность и высокая стоимость проведения анализа, связанная с иммуногистохимическим исследованием.- the complexity, duration and high cost of the analysis associated with immunohistochemical studies.

Новая техническая задача - повышение точности информативности, сокращение времени способа.A new technical task is to increase the accuracy of information content, reducing the time of the method.

Для решения поставленной задачи в способе определения степени риска неблагоприятного исхода заболевания у больных раком желудка, включающем исследование ткани опухоли, причем в опухоли желудка определяют общую кальпаиновую активность, химотрипсинподобную тотальную активность протеасом, активность 26S и 20S пулов протеасом, содержание субъединиц сумма α Σα, содержание субъединицы LMP7, содержание субъединицы LMP2, содержание субъединицы РА28β, содержание субъединицы Rpt6, также учитывают возраст пациентов, затем рассчитывают значения дискриминантных функций Y1, Y2 по уравнениям:To solve the problem in a method for determining the risk of an adverse outcome of a disease in patients with gastric cancer, including the study of tumor tissue, moreover, the total calpain activity, chymotrypsin-like total proteasome activity, the activity of 26S and 20S proteasome pools, the content of subunits, the sum of α Σα, the content are determined in a tumor of the stomach LMP7 subunits, LMP2 subunit content, PA28β subunit content, Rpt6 subunit content, also take into account the age of the patients, then calculate the values of the discrimination nantnyh functions Y1, Y2 by the equations:

Y=-0,015*X1+0,006*X2+0,085*X3+0,011*X4+0,083*X5+0,006*X6+0,100*X7+0,087*X8+0,066*X9+0,681*X10-45,698;Y = -0.015 * X1 + 0.006 * X2 + 0.085 * X3 + 0.011 * X4 + 0.083 * X5 + 0.006 * X6 + 0.100 * X7 + 0.087 * X8 + 0.066 * X9 + 0.681 * X10-45.698;

Y2=-0,017*X1-0,006*X2+0,146*X3+0,004*X4+0,122*X5+0,012*X6+0,123*X7+0,098*X8+0,102*X9+0,831*X10-74,476,Y2 = -0.017 * X1-0.006 * X2 + 0.146 * X3 + 0.004 * X4 + 0.122 * X5 + 0.012 * X6 + 0.123 * X7 + 0.098 * X8 + 0.102 * X9 + 0.831 * X10-74.476,

где X1 - общая кальпаиновая активность, ⋅10³ Ед./мг белка;where X1 - total calpain activity, ⋅10 ³ Unit / mg protein;

Х2 - химотрипсинподобная тотальная активность протеасом, ⋅10³ Ед./мг белка;X2 - chymotrypsin-like total proteasome activity, ⋅10 ³ Unit / mg protein;

Х3 - активность 26S пула протеасом, ⋅10³ Ед./мг белка;X3 - activity of the 26S proteasome pool, ⋅10 ³ Unit / mg protein;

Х4 - активность 20S пула протеасом, ⋅10³ Ед./мг белка;X4 - activity of the 20S pool of proteasomes, ⋅10 ³ Unit / mg protein;

Х5 - содержание субъединиц сумма α;X5 — subunit content, sum α;

Х6 - содержание субъединицы LMP7;X6 is the content of the LMP7 subunit;

Х7 - содержание субъединицы LMP2;X7 is the content of the LMP2 subunit;

Х8 - содержание субъединицы РА28β;X8 is the content of the subunit of PA28β;

Х9 - содержание субъединицы Rpt6;X9 is the content of the Rpt6 subunit;

Х10 - возраст пациентов;X10 - age of patients;

при Y1>Y2, пациента относят к группе с низким, а при Y1<Y2 - к группе с высоким риском неблагоприятного исхода рака желудка, в случае когда признаки объекта, предъявляемого для распознавания, удовлетворяют условию Y1=Y2, распознавание невозможно без привлечения дополнительной информации.for Y1> Y2, the patient is assigned to the low group, and for Y1 <Y2, to the group with a high risk of an unfavorable outcome of gastric cancer, if the signs of the object presented for recognition satisfy the condition Y1 = Y2, recognition is impossible without additional information .

Чувствительность метода составляет 67%, специфичность - 96%. Результаты классификации представлены в таблице 1.The sensitivity of the method is 67%, specificity is 96%. The classification results are presented in table 1.

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

Для оценки прогноза исхода заболевания у больных РЖ проводят определение активности следующих молекулярных параметров: кальпаинов, химотрипсинподобной тотальной активности протеасом, активности 26S и 20S пулов протеасом, содержание Σα, LMP7, LMP2, РА28Рβ Rpt6 субъединиц протеасом в опухоли желудка. Для этого образец опухоли желудка, взятый при хирургическом вмешательстве, гомогенизируют до порошкообразного состояния в жидком азоте. 26S и 20S протеасомы выделяют методом высаливания с помощью сульфата аммония до 40% и до 70% насыщения соответственно [2]. Химотрипсинподобную активность протеасом и активность кальпаинов оценивают по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, США) [13]. Образовавшийся продукт регистрируют на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132, и специфический ингибитор кальпаинов - ALLN. За единицу активности протеасом и кальпаинов принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом и кальпаинов выражают в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяют по методу Лоури.To assess the prognosis of disease outcome in patients with cancer, the following molecular parameters are determined: calpains, chymotrypsin-like total proteasome activity, activity of 26S and 20S proteasome pools, the content of Σα, LMP7, LMP2, PA28Pβ Rpt6 proteasome subunits in a stomach tumor. For this, a sample of a tumor of the stomach taken during surgery is homogenized to a powder state in liquid nitrogen. 26S and 20S proteasomes are isolated by salting out using ammonium sulfate up to 40% and up to 70% saturation, respectively [2]. The chymotrypsin-like activity of proteasomes and the activity of calpains are evaluated by hydrolysis of the fluorogenic oligopeptide Suc-LLVY-AMC (Sigma, USA) [13]. The resulting product is recorded on a Hitachi-850 fluorimeter (Japan) at an excitation wavelength of 380 nm and an emission of 440 nm. To assess the activity of impurity proteases, a specific proteasome inhibitor, MG132, and a specific calpain inhibitor, ALLN, are used. The unit of activity of proteasomes and calpains is the amount of the enzyme at which 1 nmol of Suc-LLVY-AMC is hydrolyzed for 1 min. The specific activity of proteasomes and calpains is expressed in units of activity per 1 mg of protein. Protein content is determined by the Lowry method.

Электрофоретическое разделение белков для последующего Вестерн-блоттинга проводят по Laemmli в 13% полиакриламидном геле. Пробы наносят в буфере, содержащем 0,0625М трис-HCl (рН 6,8), 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий. После электрофореза осуществляют перенос полипептидов на PVDF-мембрану (Immobylon, Millipore, США). Иммунодетекцию проводят согласно протоколу для «SNAP i.d.» (Millipore, США) с первичными антителами к субъединицам α1α2α3α5α6α7, LMP7, Rpt6, LMP2 и РА28β протеасом и к β-актину, а также вторичными антителами goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase (HRP) и goat ani-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, США) в разведениях, рекомендованных производителем. Затем мембрану подвергают обработке системой хемилюминесцентной детекции ECL (GE Healthcare, Великобритания). Плотность полос оценивают с помощью компьютерной программы «ImageJ». Стандартизацию проводят относительно β-актина. Результаты выражают в процентах от содержания субъединиц протеасом в неизмененной ткани.Electrophoretic separation of proteins for subsequent Western blotting is carried out according to Laemmli in 13% polyacrylamide gel. Samples were applied in a buffer containing 0.0625 M Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.01% bromphenol blue. After electrophoresis, polypeptides are transferred to the PVDF membrane (Immobylon, Millipore, USA). Immunodetection is carried out according to the protocol for "SNAP id" (Millipore, USA) with primary antibodies to the α1α2α3α5α6α7 subunits, LMP7, Rpt6, LMP2 and PA28β proteasomes and β-actin, as well as goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase secondary antibodies (HRP) and goat ani-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, USA) in dilutions recommended by the manufacturer. The membrane is then treated with an ECL chemiluminescent detection system (GE Healthcare, UK). The density of the bands is estimated using the computer program "ImageJ". Standardization is carried out relative to β-actin. Results are expressed as a percentage of the content of proteasome subunits in unchanged tissue.

Такой подход к оценке прогноза исхода заболевания у больных РЖ обусловлен рядом предпосылок.This approach to assessing the prognosis of disease outcome in patients with cancer is due to a number of prerequisites.

На развитие и прогрессирование РЖ, помимо клинико-морфологических параметров заболевания, влияют и индивидуальные биологические особенности злокачественных опухолей. Новые молекулярные маркеры, отражающие прогрессирования РЖ, позволят расширить возможности персонализированной терапии и помогут прогнозировать ее отдаленные результаты, что в конечном итоге повысит качество и эффективность лечения РЖ. Известно, что протеолитические процессы, протекающие в опухоли, отличаются от процессов, идущих в нормально функционирующей ткани. Исключением для данного процесса не являются протеасомная и кальпаиновая протеолитические системы.The development and progression of cancer, in addition to the clinical and morphological parameters of the disease, is influenced by the individual biological characteristics of malignant tumors. New molecular markers reflecting the progression of pancreatic cancer will expand the possibilities of personalized therapy and help predict its long-term results, which will ultimately increase the quality and effectiveness of treatment of pancreatic cancer. It is known that proteolytic processes occurring in a tumor differ from processes that occur in normally functioning tissue. The exception to this process are not the proteasome and calpain proteolytic systems.

Изучалось состояние активации убиквитин-протеасомной системы в скелетных мышцах при РЖ. Показано, что расщепление определенных флуорогенных оснований увеличивалось в мышцах больных РЖ по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об увеличении активности протеасом не только в ткани РЖ, но и в скелетных мышцах, как следствие развивающейся кахексии [12]. Показано, что протеасомная система является важным механизмом при развитии РЖ, индуцированного HP. Бактерии, инфицирующие слизистую оболочку желудка, способны влиять на активность протеасом в ее клетках, повреждая процесс деубиквитинирования белков, не подлежащих деградации. К числу таких белков относится опухолевый супрессор RUNX3, который инактивируется при РЖ, индуцированном HP [11].We studied the state of activation of the ubiquitin-proteasome system in skeletal muscle in pancreatic cancer. It was shown that the cleavage of certain fluorogenic bases increased in the muscles of patients with cancer compared with the control group, which indicates an increase in the activity of proteasomes not only in the tissue of the cancer, but also in skeletal muscle, as a result of developing cachexia [12]. The proteasome system has been shown to be an important mechanism in the development of HP induced by RH. Bacteria that infect the mucous membrane of the stomach are capable of affecting the activity of proteasomes in its cells, damaging the process of deubiquitination of proteins that are not subject to degradation. Among these proteins is the RUNX3 tumor suppressor, which is inactivated in HP induced by RH [11].

Известно, что экспрессия специфического для ткани желудка кальпаина-9 снижена в опухоли, но неизвестно, можно ли это отнести к опухолевым изменениям или это является специфичным для ткани ЖКТ [8]. Следует отметить, что для гастро-эзофагеальных аденокарцином возможно определение экспрессии кальпаинов-1 и -2 для оценки прогноза данной патологии. Кроме того, аналогичные результаты характерны для злокачественных новообразований яичников: высокая экспрессия кальпаина-2 ассоциирована с резистентностью к препаратам платины и низкой безметастатистической и общей выживаемостью [9, 10].It is known that the expression of gastric tissue-specific calpain-9 is reduced in the tumor, but it is not known whether this can be attributed to tumor changes or whether it is specific for the gastrointestinal tissue [8]. It should be noted that for gastroesophageal adenocarcinomas, it is possible to determine the expression of calpains-1 and -2 to assess the prognosis of this pathology. In addition, similar results are characteristic of ovarian malignancies: high expression of calpain-2 is associated with resistance to platinum preparations and low metastatic and overall survival [9, 10].

Информативность отобранных критериев подтверждена также наличием значимых различий в активности протеасом и кальпаинов, а также экспрессии субъединиц протеасом в опухоли желудка и неизмененной ткани, выявленных при исследовании 70 пациентов (средний возраст 57,9±10,2 лет) с морфологически верифицированным диагнозом РЖ Т1-4N0-3M0, которым было проведено хирургическое лечение.The informational content of the selected criteria was also confirmed by the presence of significant differences in the activity of proteasomes and calpains, as well as the expression of proteasome subunits in tumors of the stomach and unchanged tissue, revealed in a study of 70 patients (mean age 57.9 ± 10.2 years) with a morphologically verified diagnosis of T1- 4N0-3M0, which underwent surgical treatment.

Оценка прогноза исхода заболевания у больных РЖ проводилась на основании показателей состояния протеолитических систем (химотрипсинподобная активность тотального пула протеасом, пулов 26S и 20S, субъединичный состав протеасом, активность кальпаинов), клинико-морфологических данных (возраст пациентов, стадия Т, наличие метастазов в регионарные лимфоузлы, степень дифференцировки опухоли). Общее количество пациентов, включенных в анализ, составило 45 человек.The assessment of the prognosis of the disease outcome in patients with cancer was carried out on the basis of indicators of the state of proteolytic systems (chymotrypsin-like activity of the total pool of proteasomes, pools 26S and 20S, subunit composition of proteasomes, activity of calpains), clinical and morphological data (patient age, stage T, the presence of metastases to regional lymph nodes , degree of tumor differentiation). The total number of patients included in the analysis was 45 people.

Классификация проводилась для групп 1 - неблагоприятный исход, 0 - благоприятный исход.Classification was carried out for groups 1 - unfavorable outcome, 0 - favorable outcome.

Дискриминантный анализ включал следующие этапы: первичный отбор признаков для построения модели, набор обучающей выборки (группы пациентов, у которых регистрируются отобранные признаки), отбор информативных признаков и формирование на их основе группы дифференциальных функций, проверка качества полученной модели. Наиболее значимые прогностические показатели представлены в таблице 1. Общая кальпаиновая активность (XI), Химотрипсинподобная тотальная активность протеасом (Х2), Активность 26S пула протеасом (Х3) Активность 20S пула протеасом (Х4) Содержание субъединиц сумма α (Х5) Содержание субъединиц сумма α (Х5) Содержание субъединицы LMP7 (Х6) Содержание субъединицы LMP2 (Х7) Содержание субъединицы РА28β (Х8) Содержание субъединицы Rpt6 (Х9) Возраст пациентов (Х10).The discriminant analysis included the following stages: initial selection of features for building the model, a set of training samples (groups of patients for whom selected features are recorded), selection of informative features and the formation of groups of differential functions based on them, quality control of the resulting model. The most significant prognostic indicators are presented in Table 1. Total calpain activity (XI), Chymotrypsin-like total activity of proteasomes (X2), Activity of 26S proteasome pool (X3) Activity of 20S proteasome pool (X4) Subunit content sum α (X5) Subunit content sum α ( X5) LMP7 (X6) subunit content LMP2 (X7) subunit content PA28β (X8) subunit content Rpt6 (X9) subunit content Patient age (X10).

Оценку качества полученных функций проводили на 20 пациентах, не включенных в основную выборку. Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составили, соответственно, 67% и 96%.The quality assessment of the obtained functions was performed on 20 patients not included in the main sample. The sensitivity and specificity of the obtained discriminant model were, respectively, 67% and 96%.

Клинические примерыClinical examples

Пример 1: Больная Н., 64 года, поступила в торако-абдоминальное отделение Томского НИИ онкологии 07.11.2012 с жалобами на боли в эпигастральной области, отсутствие аппетита. Пациентке была проведена видиогастроскопия с биопсией из слизистой оболочки для верификации диагноза. Гистологическое заключение: аденокарцинома желудка низкой степени гистологической дифференцировки. Для определения прогноза исхода у данной пациентки была использована разработанная математическая модель прогноза исхода. При исследовании получены следующие значения показателей Х1-Х10:Example 1: Patient N., 64 years old, was admitted to the thoraco-abdominal department of the Tomsk Research Institute of Oncology on 07.11.2012 with complaints of pain in the epigastric region, lack of appetite. The patient underwent a videogastroscopy with a biopsy from the mucous membrane to verify the diagnosis. Histological conclusion: adenocarcinoma of the stomach with a low degree of histological differentiation. To determine the prognosis of outcome for this patient, the developed mathematical model of prognosis of outcome was used. The study obtained the following values of the indicators X1-X10:

X1=35⋅10³ Ед./мг белка;X1 = 35⋅10 ³ Units / mg protein;

Х2=152⋅10³ Ед./мг белка;X2 = 152⋅10 ³ Units / mg protein;

Х3=175⋅10³ Ед./мг белка;X3 = 175⋅10 ³ Units / mg protein;

Х4=144,8⋅10³ Ед./мг белка;X4 = 144.8 × 10 ³ U / mg protein;

Х5=43,62%;X5 = 43.62%;

Х6=118,63%;X6 = 118.63%;

Х7=87,57%;X7 = 87.57%;

Х8=153,96%;X8 = 153.96%;

Х9=156,22%;X9 = 156.22%;

X 10=64 года.X 10 = 64 years.

На первом этапе проводился расчет дискриминантных функций Y1 и Y2 с учетом показателей у данной больной.At the first stage, the discriminant functions Y1 and Y2 were calculated taking into account the parameters of this patient.

Y1=-0,015*35,0+0,006*152,0+0,085*175,0+0,011*144,8+0,083*43,62+0,006*118,63+0,100*87,57+0,087*153,96+0,066*156,22+0,681 *64-45,698=51,53Y1 = -0.015 * 35.0 + 0.006 * 152.0 + 0.085 * 175.0 + 0.011 * 144.8 + 0.083 * 43.62 + 0.006 * 118.63 + 0.100 * 87.57 + 0.087 * 153.96 + 0.066 * 156.22 + 0.681 * 64-45.698 = 51.53

Y2=-0,017*35-0,006*152,0+0,146*175,0+0,004*144,8+0,122*43,62+0,012*118,63+0,123*87,57+0,098*153,96+0,102*156,22+0,831 *64-74,476=51,89Y2 = -0.017 * 35-0.006 * 152.0 + 0.146 * 175.0 + 0.004 * 144.8 + 0.122 * 43.62 + 0.012 * 118.63 + 0.123 * 87.57 + 0.098 * 153.96 + 0.102 * 156.22 + 0.831 * 64-74.476 = 51.89

При расчете дискриминантных функций выяснилось, что Y1<Y2. Таким образом, пациентка классифицируется в группу «высокий прогноз неблагоприятного исхода», с уровнем значимости р<0,05, что означает высокий прогноз неблагоприятного исхода у данной пациентки.When calculating the discriminant functions, it turned out that Y1 <Y2. Thus, the patient is classified into the group “high prognosis of an unfavorable outcome”, with a significance level of p <0.05, which means a high prognosis of an unfavorable outcome in this patient.

Дальнейшее наблюдение за пациенткой показало, что 18.01.2013 она умерла.Further monitoring of the patient showed that she died on 01/18/2013.

Пример 2: Больная Т., 50 лет, поступила в торако-абдоминальное отделение Томского НИИ онкологии 25.09.2013 с жалобами на боли в эпигастральной области, отсутствие аппетита, нарушения пищеварения. Пациентке была проведена видеогастроскопия с биопсией из слизистой оболочки для верификации диагноза. Гистологическое заключение: аденокарцинома желудка высокой степени гистологической дифференцировки. Для определения прогноза исхода у данной пациентки была использована разработанная математическая модель прогноза исхода. При исследовании получены следующие значения показателей Х1-Х10:Example 2: Patient T., 50 years old, was admitted to the thoraco-abdominal department of the Tomsk Research Institute of Oncology on 09/25/2013 with complaints of pain in the epigastric region, lack of appetite, and digestive disorders. The patient underwent a video gastroscopy with a biopsy from the mucous membrane to verify the diagnosis. Histological conclusion: gastric adenocarcinoma of a high degree of histological differentiation. To determine the prognosis of outcome for this patient, the developed mathematical model of prognosis of outcome was used. The study obtained the following values of the indicators X1-X10:

X1=25,31⋅10³ Ед./мг белка;X1 = 25.31 × 10 ³ U / mg protein;

Х2=157,84⋅10³ Ед./мг белка;X2 = 157.84⋅10 ³ U / mg protein;

Х3=92,86⋅10³ Ед./мг белка;X3 = 92.86 × 10 ³ U / mg protein;

Х4=35,19⋅10³ Ед./мг белка;X4 = 35.19 ⋅ 10 ³ U / mg protein;

Х5=38,15%;X5 = 38.15%;

Х6=158,52%;X6 = 158.52%;

Х7=116,85%;X7 = 116.85%;

Х8=174,14%;X8 = 174.14%;

Х9=215,48%;X9 = 215.48%;

X 10=50 лет.X 10 = 50 years.

Y1=-0,015*25,31+0,006*157,84+0,085*92,86+0,011*35,19+0,083*38,15+0,006*158,52+0,100*116,85+0,087*174,14+0,066*215,48+0,681*50-45,698=42,35Y1 = -0.015 * 25.31 + 0.006 * 157.84 + 0.085 * 92.86 + 0.011 * 35.19 + 0.083 * 38.15 + 0.006 * 158.52 + 0.100 * 116.85 + 0.087 * 174.14 + 0.066 * 215.48 + 0.681 * 50-45.698 = 42.35

Y2=-0,017*25,31-0,006*157,84+0,146*92,86+0,004*35,19+0,122*38,15+0,012*158,52+0,123*116,85+0,098*174,14+0,102*215,48+0,831*50-74,476=39,37Y2 = -0.017 * 25.31-0.006 * 157.84 + 0.146 * 92.86 + 0.004 * 35.19 + 0.122 * 38.15 + 0.012 * 158.52 + 0.123 * 116.85 + 0.098 * 174.14 + 0.102 * 215.48 + 0.831 * 50-74.476 = 39.37

При расчете дискриминантных функций выяснилось, что Y1>Y2. Таким образом, пациентка классифицируется в группу «низкий прогноз неблагоприятного исхода», с уровнем значимости р<0,05, что означает низкий прогноз неблагоприятного исхода у данной пациентки.When calculating the discriminant functions, it turned out that Y1> Y2. Thus, the patient is classified into the group “low prognosis of an unfavorable outcome”, with a significance level of p <0.05, which means a low prognosis of an unfavorable outcome in this patient.

В настоящее время пациентка жива, данных за рецидив и метастазирование не получено.Currently, the patient is alive, data for relapse and metastasis have not been received.

Таким образом, разработанный способ позволяет объективизировать критерии прогноза исхода у больных РЖ, а также с высокой долей чувствительности и специфичности прогнозировать у них развитие исхода, что в свою очередь позволяет планировать адекватный объем лечения в рамках послеоперационной терапии РЖ.Thus, the developed method allows you to objectify the criteria for predicting the outcome in patients with cancer, as well as with a high degree of sensitivity and specificity to predict their development of the outcome, which in turn allows you to plan an adequate amount of treatment in the framework of postoperative treatment of cancer.

Источники информацииInformation sources

1. Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) [текст] // Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой / М.: МНИОИ им. П.А. Герцена филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России. 2015. - 250 с.1. Malignant neoplasms in Russia in 2013 (morbidity and mortality) [text] // Ed. HELL. Kaprina, V.V. Starinsky, G.V. Petrova / M.: MNIII im. P.A. Herzen branch of Federal State Budgetary Institution "Federal Medical Center named after P.A. Herzen »Ministry of Health of Russia. 2015 .-- 250 p.

2. Множественность форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению / Е.Б. Абрамова, Т.М. Астахова, П.А. Ерохов и др. // Известия РАН. Серия биологическая. - 2004. -№2. - С. 150-156.2. The multiplicity of forms of the proteasome and some approaches to their separation / E.B. Abramova, T.M. Astakhova, P.A. Erokhov et al. // Bulletin of the Russian Academy of Sciences. Biological Series. - 2004.-№2. - S. 150-156.

3. Пат. 2445632, Российская Федерация, МПК G01N 33/53, G01N 33/68. Способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка / Е.М. Непомнящая [и др.]; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи». 2010132604/15; заявл. 03.08.2010; опубл. 20.03.2012.3. Pat. 2445632, Russian Federation, IPC G01N 33/53, G01N 33/68. A method for predicting metastases in patients with gastric cancer / E.M. Nepomniachtaya [et al.]; Applicant and patent holder of the Federal State Institution "Rostov Scientific Research Cancer Institute of the Federal Agency for High-Tech Medical Care". 2010132604/15; declared 08/03/2010; publ. 03/20/2012.

4. Пат. 2455924, Российская Федерация, МПК А61В 5/00, G01N 33/48. Способ прогнозирования метастазирования опухолевого процесса у больных раком желудка / А.В. Полетаева [и др.]; заявитель и патентообладатель Учреждение Российской академии наук Институт физиологии природных адаптаций Уральского отделения Российской Академии Наук. - 2011112226/14; заявл. 30.03.2011; опубл. 20.07.2012.4. Pat. 2455924, Russian Federation, IPC А61В 5/00, G01N 33/48. A method for predicting metastasis of the tumor process in patients with gastric cancer / A.V. Poletaeva [and others]; Applicant and patent holder Institution of the Russian Academy of Sciences Institute of Physiology of Natural Adaptations, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences. - 2011112226/14; declared 03/30/2011; publ. 07/20/2012.

5. Пат. 2470308, Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка / М.В. Завьялова [и др.]; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда РАН. - 2011134537/15; заявл. 17.08.2011; опубл. 20.12.2012.5. Pat. 2470308, Russian Federation, IPC G01N 33/53. A method for predicting hematogenous metastasis in the intestinal type of gastric cancer / M.V. Zavyalova [et al.]; applicant and patentee Federal State Budgetary Institution “Scientific Research Institute of Oncology” of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Institution of the Russian Academy of Sciences V.A. Engelhard RAS. - 2011134537/15; declared 08/17/2011; publ. 12/20/2012.

6. Пути улучшения результатов лечения больных раком желудка IV стадии [текст] / В.И. Чиссов, Л.А. Вашакмадзе, А.В. Бутенко и др. // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - №2 (14). - С. 3-7.6. Ways to improve the results of treatment of patients with stage IV gastric cancer [text] / V.I. Chissov, L.A. Vashakmadze, A.V. Butenko et al. // Siberian Oncology Journal. - 2005. - No. 2 (14). - S. 3-7.

7. Скоропад, В.Ю. Метахромные злокачественные опухоли у больных, радикально оперированных по поводу рака желудка [текст] / В.Ю. Скоропад, Б.А. Бердов, И.Г. Козлов // Сибирский онкологический журнал. - 2010. - №6(42). - С. 5-11.7. Skoropad, V.Yu. Metachromic malignant tumors in patients radically operated on for gastric cancer [text] / V.Yu. Skoropad B.A. Berdov, I.G. Kozlov // Siberian Oncology Journal. - 2010. - No. 6 (42). - S. 5-11.

8. Спирина, Л.В. Роль внутриклеточного специфического протеолиза в онкогенезе [текст] / Л.В. Спирина, И.В. Кондакова // Вопросы онкологии. - 2008. - Т. 54, №6. - С. 690-694.8. Spirina, L.V. The role of intracellular specific proteolysis in oncogenesis [text] / L.V. Spirina, I.V. Kondakova // Questions of oncology. - 2008. - T. 54, No. 6. - S. 690-694.

9. Calpain-2 expression is associated with response to platinum based chemotherapy, progression-free and overall survival in ovarian cancer / S.J. Storr, S. Safuan, C.M. Woolston, et al. // J Cell Mol Med. - 2012. - Vol. 16, №.10. - P. 2422-2428.9. Calpain-2 expression is associated with response to platinum based chemotherapy, progression-free and overall survival in ovarian cancer / S.J. Storr, S. Safuan, C.M. Woolston, et al. // J Cell Mol Med. - 2012. - Vol. 16, No. 10. - P. 2422-2428.

10. Expression of the calpain system is associated with poor clinical outcome in gastro-oesophageal adenocarcinomas / S.J. Storr, X. Pu, J. Davis, et al. // J Gastroenterol. - 2013. - [Epub ahead of print].10. Expression of the calpain system is associated with poor clinical outcome in gastro-oesophageal adenocarcinomas / S.J. Storr, X. Pu, J. Davis, et al. // J Gastroenterol. - 2013. - [Epub ahead of print].

11. Helicobacter pylori CagA targets gastric tumor suppressor RUNX3 for proteasome-mediated degradation / Y.H. Tsang, A. Lamb, J. Romero-Gallo et al. // Oncogene. - 2010. - Vol. 14. - P. 5643-5650.11. Helicobacter pylori CagA targets gastric tumor suppressor RUNX3 for proteasome-mediated degradation / Y.H. Tsang, A. Lamb, J. Romero-Gallo et al. // Oncogene. - 2010 .-- Vol. 14. - P. 5643-5650.

12. Increased Muscle Proteasome Activity Correlates With Disease Severity in Gastric Cancer Patients / M. Bossola, M. Muscaritoli, P. Costelli et al. // Annals of surgery. - 2003. - Vol.237, №3. - P. 384-389.12. Increased Muscle Proteasome Activity Correlates With Disease Severity in Gastric Cancer Patients / M. Bossola, M. Muscaritoli, P. Costelli et al. // Annals of surgery. - 2003. - Vol. 237, No. 3. - P. 384-389.

13. 26 S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrate / Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. // The J of Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - №. 31. - P. 21963-21972.13.26 S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrate / Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. // The J of Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - No. 31. - P. 21963-21972.

Примечание: Wilks Lambda - величина, отвечающая за выполнение условий о правомерности включения показателя в модель и значимости различий значений дискриминантной функции в группах, что является необходимым условием при создании модели; P-level - уровень значимости.Note: Wilks Lambda - the value that is responsible for fulfilling the conditions on the legality of including the indicator in the model and the significance of differences in the values of the discriminant function in groups, which is a necessary condition for creating the model; P-level - level of significance.

Claims

A method for determining the risk of an adverse outcome of a disease in patients with gastric cancer, including a study of tumor tissue, characterized in that the total calpain activity, chymotrypsin-like total proteasome activity, the activity of 26S and 20S proteasome pools, the content of subunits, the sum of α Σα, the content of the LMP7 subunit , the content of the LMP2 subunit, the content of the PA28β subunit, the content of the Rpt6 subunit, also take into account the age of the patients, then the values of the discriminant functions Y1, Y2 p are calculated about equations:

Y1 = -0.015 * X1 + 0.006 * X2 + 0.085 * X3 + 0.011 * X4 + 0.083 * X5 + 0.006 * X6 + 0.100 * X7 + 0.087 * X8 + 0.066 * X9 +

0.681 * X10-45.698;

Y2 = -0.017 * X1-0.006 * X2 + 0.146 * X3 + 0.004 * X4 + 0.122 * X5 + 0.012 * X6 + 0.123 * X7 + 0.098 * X8 + 0.102 * X9 + 0.831 * X10-74.476,

where X1 - total calpain activity, ⋅10 ³ Unit / mg protein;

X2 - chymotrypsin-like total proteasome activity, ⋅10 ³ Unit / mg protein;

X3 - activity of the 26S proteasome pool, ⋅10 ³ Unit / mg protein;

X4 - activity of the 20S pool of proteasomes, ⋅10 ³ Unit / mg protein;

X5 — subunit content, sum α;

X6 is the content of the LMP7 subunit;

X7 is the content of the LMP2 subunit;

X8 is the content of the subunit of PA28β;

X9 is the content of the Rpt6 subunit;

X10 - age of patients;

if Y1> Y2, a low is determined, and if Y1 <Y2, a high risk of an unfavorable outcome of gastric cancer is determined, when the signs of an object presented for recognition satisfy the condition Y1 = Y2, recognition is impossible without additional information.