RU2660550C1 - Method for obtaining an injectable resorbable implant based on polycaprolactone and multipotent stormal cells from umbilical cord - Google Patents
Method for obtaining an injectable resorbable implant based on polycaprolactone and multipotent stormal cells from umbilical cord Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660550C1 RU2660550C1 RU2017122733A RU2017122733A RU2660550C1 RU 2660550 C1 RU2660550 C1 RU 2660550C1 RU 2017122733 A RU2017122733 A RU 2017122733A RU 2017122733 A RU2017122733 A RU 2017122733A RU 2660550 C1 RU2660550 C1 RU 2660550C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polycaprolactone
- particles
- cells
- implant
- multipotent
- Prior art date
Links
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 title claims abstract description 83
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 title claims abstract description 68
- 239000007943 implant Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 206010066218 Stress Urinary Incontinence Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 229960003943 hypromellose Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 claims abstract description 7
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 29
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 29
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 8
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 4
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 claims description 4
- -1 or PDGF Proteins 0.000 claims description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 claims description 3
- 101100281008 Homo sapiens FGF2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 26
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 26
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical group O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 15
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 14
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229920003232 aliphatic polyester Polymers 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 3
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 3
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 3
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 3
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 2
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000001446 dark-field microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 2
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 2
- 230000008035 nerve activity Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 1,1-Dichloroethane Chemical compound CC(Cl)Cl SCYULBFZEHDVBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVUFZLGLMCACRE-UHFFFAOYSA-N 2-methylidene-1,3-dioxepane Chemical compound C=C1OCCCCO1 AVUFZLGLMCACRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 244000117499 Colubrina elliptica Species 0.000 description 1
- 101100075837 Drosophila melanogaster Mabi gene Proteins 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000000271 Encopresis Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010021639 Incontinence Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 241000489861 Maximus Species 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 208000012287 Prolapse Diseases 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 102000013394 Troponin I Human genes 0.000 description 1
- 108010065729 Troponin I Proteins 0.000 description 1
- 206010047370 Vesicoureteric reflux Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 1
- 230000011759 adipose tissue development Effects 0.000 description 1
- 229920006125 amorphous polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N methane;hydrate Chemical compound C.O VUZPPFZMUPKLLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 238000007750 plasma spraying Methods 0.000 description 1
- 229920000191 poly(N-vinyl pyrrolidone) Polymers 0.000 description 1
- 238000004184 polymer manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010526 radical polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007151 ring opening polymerisation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000005070 sphincter Anatomy 0.000 description 1
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 201000008618 vesicoureteral reflux Diseases 0.000 description 1
- 208000031355 vesicoureteral reflux 1 Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N ε-Caprolactone Chemical compound O=C1CCCCCO1 PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/35—Fat tissue; Adipocytes; Stromal cells; Connective tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к регенеративной медицине и тканевой инженерии и предназначено для восстановления объема и плотности волокнистой соединительной ткани стенки органа и увеличения ее биомеханических свойств. Изобретение позволяет изготовить инъекционную форму имплантата на основе полученных с помощью сверхкритического диоксида углерода частиц поли-ε-капролактона размером 100-150 мкм либо инъекционную форму имплантата на основе полученных с помощью сверхкритического диоксида углерода частиц поли-ε-капролактона размером 100-150 мкм, импрегнированных рекомбинантным человеческим фактором роста, и мультипотентных стромальных клеток.The invention relates to regenerative medicine and tissue engineering and is intended to restore the volume and density of the fibrous connective tissue of the organ wall and increase its biomechanical properties. EFFECT: invention makes it possible to manufacture an injection form of an implant based on particles of poly-ε-caprolactone 100-150 μm obtained using supercritical carbon dioxide or an injection form of an implant based on particles of poly-ε-caprolactone 100-150 microns obtained using supercritical carbon dioxide, impregnated recombinant human growth factor; and multipotent stromal cells.
Несостоятельность и различные формы дисплазии волокнистой соединительной ткани являются одной из причин развития таких распространенных социально-значимых заболеваний, как стрессовое недержание мочи, энкопрез, пролапс, везикоуретеральный рефлюкс, гастроэзофагеальный рефлюкс и др. Перспективным подходом, в принципе способным снизить частоту интра- и пост-операционных осложнений, а также обеспечить эффективную реабилитацию больных, является использование локального введения объемообразующих средств, создающих в области трансплантации дополнительный объем соединительной ткани, необходимый для восстановления равновесного давления между сообщающимися отделами мочеполовой или пищеварительной системы (например, мочевым пузырем и уретрой) [1]. Преимуществом введения инъекционных имплантатов является простота и удобство техники выполнения, возможность проведения под местной анестезией в амбулаторных условиях, хорошая переносимость, минимизация осложнений. Поиск идеального объемообразующего средства был начат еще в конце 20 века, однако результаты введения политетрафторэтиленовых частиц, поперечно-сшитого коллагена, гиалуроновой кислоты, аутогенного жира или хряща, силиконовых имплантатов и прочих инъекционных агентов не удовлетворяли клиницистов [1-4]. Предварительные результаты клинических исследований позволили сформулировать основные требования к имплантату: для создания продолжительного эффекта компоненты должны быть биосовместимыми, обладать минимальной иммуногенностью, длительное время сохраняться в области введения и не мигрировать в окружающие ткани [1, 5].Insolvency and various forms of fibrous connective tissue dysplasia are one of the reasons for the development of such common socially significant diseases as stress urinary incontinence, encopresis, prolapse, vesicoureteral reflux, gastroesophageal reflux, etc. A promising approach that can, in principle, reduce the incidence of intra- and post- operational complications, as well as to ensure effective rehabilitation of patients, is the use of local administration of volume-forming agents that create in the field of transplant tion additional volume of connective tissue necessary to restore equilibrium pressure between the communicating parts of the genitourinary or digestive system (eg, bladder and urethra) [1]. The advantage of introducing injection implants is the simplicity and convenience of the execution technique, the possibility of performing under local anesthesia on an outpatient basis, good tolerance, minimizing complications. The search for the ideal volume-forming agent was begun at the end of the 20th century, but the results of the introduction of polytetrafluoroethylene particles, cross-linked collagen, hyaluronic acid, autogenic fat or cartilage, silicone implants and other injection agents did not satisfy clinicians [1-4]. Preliminary results of clinical studies allowed us to formulate the basic requirements for the implant: to create a lasting effect, the components must be biocompatible, have minimal immunogenicity, remain in the injection area for a long time and not migrate to the surrounding tissue [1, 5].
Известны объемообразующие препараты на основе силиконовых (патент US 8658215 В2, дата публикации 25.02.2014) и керамических микросфер (патент US 6537574 В1, дата публикации 25.03.2003). Недостатком подобных препаратов является невозможность биорезорбции вводимых частиц, которые остаются в организме реципиента в течение всей его жизни и способны вызывать хроническую воспалительную реакцию ткани на инородной тело [1].Volume-forming preparations based on silicone are known (patent US 8658215 B2, publication date 02.25.2014) and ceramic microspheres (patent US 6537574 B1, publication date 03.25.2003). The disadvantage of such drugs is the inability to bioresorb the introduced particles, which remain in the recipient's body throughout his life and are capable of causing a chronic inflammatory reaction of the tissue to a foreign body [1].
Известны объемообразующие препараты на основе биорезорбируемых полилактидных и полилактогликолидных частиц (патент ЕР 1411861 В1, дата публикации 04.04.2012). Конечными продуктами их биодеструкции являются водорастворимые нетоксичные продукты нормального метаболизма, которые либо выводятся из организма естественным путем, либо претерпевают дальнейшую цепочку химических превращений плоть до углекислого газа и воды. Основным недостатком данных препаратов является малый размер частиц, который колеблется в пределах 20-120 мкм, что может привести к их миграции из области трансплантации [1]. Кроме того, характерные времена биорезорбции этих полимеров могут значительно варьировать в зависимости от целого ряда многочисленных факторов [6], что уменьшает эффективность применения данных веществ в отдаленном периоде.Volume-forming preparations based on bioresorbable polylactide and polylactoglycolide particles are known (patent EP 1411861 B1, publication date 04.04.2012). The final products of their biodegradation are water-soluble non-toxic products of normal metabolism, which are either excreted from the body naturally or undergo a further chain of chemical transformations of the flesh to carbon dioxide and water. The main disadvantage of these drugs is the small particle size, which ranges from 20-120 microns, which can lead to their migration from the transplantation region [1]. In addition, the characteristic bioresorption times of these polymers can vary significantly depending on a number of numerous factors [6], which reduces the effectiveness of the use of these substances in the long term.
Наиболее близким к изобретению является объемообразующий препарат на основе биорезорбируемого поликапролактона (патент WO 2009014441 А2, дата публикации 29.01.2009). Преимуществами поликапролактона является его высокая биосовместимость и длительный срок резорбции в организме, который исчисляется месяцами или даже годами, что значительно превышает показатели других алифатических полиэфиров - полилактидов и полигликолидов [7-9]. К недостатку данного изобретения следует отнести использование потенциально токсичных агентов (TWEEN, дихлорэтана) в процессе производства полимера.Closest to the invention is a volume-forming preparation based on bioresorbable polycaprolactone (patent WO 2009014441 A2, publication date 01/29/2009). The advantages of polycaprolactone are its high biocompatibility and long term resorption in the body, which is calculated in months or even years, which significantly exceeds the performance of other aliphatic polyesters - polylactides and polyglycolides [7-9]. The disadvantage of this invention is the use of potentially toxic agents (TWEEN, dichloroethane) in the polymer manufacturing process.
Основным общим недостатком традиционных методов формирования полимерных частиц из алифатических полиэфиров (выщелачивание, двойная эмульсия технология, разделение фаз) является использование органических растворителей (ацетон, хлороформ, хлорид метилена и др.). Их остаточные примеси обладают выраженной степенью токсичности, что негативно сказывается на качестве конечного продукта. Однако получение полимерных структур и биоактивных композитов на их основе, содержащих минимально возможное количество примесей, возможно при использовании сверхкритического диоксида углерода (ск-СО2) [10]. Это обусловлено уникальным сочетанием в нем свойств газов высокого давления (низкая вязкость, высокий коэффициент диффузии, отсутствие сил поверхностного натяжения) и жидкостей (высокая растворяющая и пластифицирующая способность) [11]. Важно также, что после завершения процесса, диоксид углерода легко и практически без остатка удаляется из полимера простым сбросом давления ниже критического значения (Ркр=7,4 МПа). [12]. В настоящем изобретении использован экологически чистый и безопасный ск-СО2, который позволяет проводить нетоксичную обработку полимерных материалов практически при комнатной температуре (Ткр=31°С) с существенно более высокой эффективностью, чем при использовании обычных газов или жидких растворителей.The main common drawback of traditional methods of forming polymer particles from aliphatic polyesters (leaching, double emulsion technology, phase separation) is the use of organic solvents (acetone, chloroform, methylene chloride, etc.). Their residual impurities have a pronounced degree of toxicity, which negatively affects the quality of the final product. However, the preparation of polymer structures and bioactive composites based on them containing the smallest possible amount of impurities is possible using supercritical carbon dioxide (cc-CO 2 ) [10]. This is due to the unique combination of the properties of high pressure gases (low viscosity, high diffusion coefficient, the absence of surface tension forces) and liquids (high dissolving and plasticizing ability) [11]. It is also important that after the completion of the process, carbon dioxide is easily and practically without residue removed from the polymer simply by depressurizing below a critical value (P cr = 7.4 MPa). [12]. The present invention uses environmentally friendly and safe cc-CO 2 , which allows non-toxic treatment of polymeric materials at almost room temperature (T cr = 31 ° C) with significantly higher efficiency than using conventional gases or liquid solvents.
На эффективность восстановления недостатка соединительной ткани можно влиять путем локальной доставки биологически активных молекул: FGF2, NGF, IGF1, BDNF и др. [13-15]. Однако необходимо не просто доставить данные вещества в ткань, но и обеспечить их длительное там присутствие, что невозможно при однократном введении вследствие небольшого времени полужизни белков. Данную проблему также можно решить при использовании сверхкритической флюидной (СКФ) технологии обработки материалов, одним из преимуществ которой является возможность модифицирования полимеров. Сорбция СО2 в объеме аморфных полимеров (к которым и относится большинство алифатических полиэфиров, используемых сегодня в биомедицине и фармакологии) приводит к снижению температуры их стеклования и пластификации. Как правило, этот процесс сопровождается набуханием полимера и увеличением его свободного объема. Эти условия способствуют эффективному включению различных термолабильных биоактивных компонентов внутрь полимерной матрицы без использования токсичных органических растворителей и высоких температур [16]. В настоящем изобретении использована СКФ обработка поликапролактоновых частиц, которая позволяет равномерно распределять биологически активные вещества внутри полимерной матрицы, обеспечивая постоянный и длительный выход биоактивных молекул в окружающие ткани по мере резорбции материала.The effectiveness of restoration of connective tissue deficiency can be influenced by local delivery of biologically active molecules: FGF2, NGF, IGF1, BDNF, etc. [13-15]. However, it is necessary not only to deliver these substances to the tissue, but also to ensure their continued presence there, which is impossible with a single injection due to the short half-life of the proteins. This problem can also be solved by using supercritical fluid (GFR) material processing technology, one of the advantages of which is the ability to modify polymers. Sorption of CO 2 in the volume of amorphous polymers (which includes the majority of aliphatic polyesters used today in biomedicine and pharmacology) leads to a decrease in their glass transition and plasticization temperatures. As a rule, this process is accompanied by swelling of the polymer and an increase in its free volume. These conditions contribute to the effective incorporation of various thermolabile bioactive components into the polymer matrix without the use of toxic organic solvents and high temperatures [16]. The present invention uses GFR processing of polycaprolactone particles, which allows you to evenly distribute biologically active substances within the polymer matrix, providing a constant and long-term release of bioactive molecules into the surrounding tissue as the material is resorbed.
Полимерные носители помимо функции объемообразующего агента могут выполнять также функцию носителя (скэффолда) для клеточного компонента имплантата: введение иммобилизованных на носителе клеток способствует лучшему восполнению недостатка соединительной ткани в области трансплантации. В качестве клеточного компонента таких конструкций используют фибробласты слизистой полости рта, МСК жировой ткани, амниотической жидкости, костного мозга и др. [17-20]. Очевидно, что поверхность полимерных носителей должна обеспечивать эффективное прикрепление клеток и способствовать их выживаемости в условиях in vivo. Несомненным достоинством СКФ технологий синтеза полимерных микрочастиц является возможность контроля и управления их морфологией поверхности, плотностью и пористостью [12]. В настоящем изобретении использована СКФ технология для обеспечения воспроизводимости получения полимерных частиц с заданными физико-химическими и механическими свойствами, оптимальными для адгезии клеток на их поверхности.Polymeric carriers, in addition to the function of a volume-forming agent, can also perform the function of a carrier (scaffold) for the cellular component of the implant: the introduction of cells immobilized on the carrier helps to better fill the lack of connective tissue in the transplantation area. Fibroblasts of the oral mucosa, MSCs of adipose tissue, amniotic fluid, bone marrow, etc., are used as the cellular component of such structures [17–20]. Obviously, the surface of the polymer carriers should ensure the effective attachment of cells and contribute to their survival in vivo. The undoubted advantage of GFR technologies for the synthesis of polymer microparticles is the ability to control and control their surface morphology, density and porosity [12]. In the present invention, SCF technology was used to ensure reproducibility of obtaining polymer particles with desired physicochemical and mechanical properties that are optimal for cell adhesion on their surface.
Вопрос выбора источника клеток для восполнения дефектов соединительной ткани до сих пор остается открытым [21, 22]. Показано, например, что периуретральная трансплантация МСК животным с моделированным стрессовым недержанием мочи более эффективна, чем трансплантация дермальных фибробластов, приводит к улучшению васкуляризации соединительной ткани и положительно влияет на показатели LPP (leak point pressure, давление точки подтекания); при этом основным предполагаемым механизмом терапевтической активности МСК является паракринный [23, 24]. В настоящем изобретении в качестве терапевтического агента допускается использование МСК, выделенных из вартонова студня пупочного канатика человека: данные клетки обладают высочайшим регенераторным потенциалом и по праву могут считаться новым «золотым стандартом» клеточной терапии [25, 26]. В случае невозможности использования аутогенной культуры МСК пупочного канатика и отказа от использования аллогенной культуры МСК пупочного канатика в изобретении допускается использование аутогенной культуры МСК из других источников (например, жировой ткани).The question of choosing a cell source to make up for defects in connective tissue is still open [21, 22]. It was shown, for example, that periurethral transplantation of MSCs in animals with simulated stress urinary incontinence is more effective than transplantation of dermal fibroblasts, leads to improved vascularization of connective tissue and positively affects LPP (leak point pressure, leak point pressure); in this case, the main suggested mechanism of therapeutic activity of MSCs is paracrine [23, 24]. In the present invention, the use of MSCs isolated from the Warton jelly of the human umbilical cord is allowed as a therapeutic agent: these cells have the highest regenerative potential and can rightfully be considered the new "gold standard" of cell therapy [25, 26]. If it is not possible to use an autogenous culture of umbilical cord MSCs and refuse to use an allogenic umbilical cord MSC culture, the invention allows the use of an autogenic culture of umbilical cord MSCs from other sources (for example, adipose tissue).
Важным компонентом объемообразующего препарата, помимо самих полимерных частиц, является среда введения, которая должна обеспечить равномерное распределение частиц при трансплантации. Данная задача может быть решена за счет использования сред с высоким показателем вязкости (гелей). В настоящем изобретении в качестве среды введения допускается использование растворов гидроксипропилметилцеллюлозы (гипромеллозы), карбоксиметилцеллюлозы, гиалуроната натрия, поливинилпирролидона, глицерола и их комбинаций. Преимуществами данных веществ являются возможность регулирования вязкости раствора, стабильность и высокая биосовместимость [27-31].An important component of the volume-forming preparation, in addition to the polymer particles themselves, is the injection medium, which should ensure uniform distribution of particles during transplantation. This problem can be solved by using media with a high viscosity index (gels). In the present invention, the use of solutions of hydroxypropyl methylcellulose (hypromellose), carboxymethyl cellulose, sodium hyaluronate, polyvinylpyrrolidone, glycerol and combinations thereof is allowed. The advantages of these substances are the ability to control the viscosity of the solution, stability and high biocompatibility [27-31].
Технической задачей изобретения является создание инъекционной формы биорезорбируемого имплантата для восстановления объема и плотности соединительной ткани стенки органа и улучшения ее биомеханических характеристик, обладающего высокой биосовместимостью. Техническим результатом изобретения является создание двух вариантов имплантатов:An object of the invention is the creation of an injectable form of a bioresorbable implant to restore the volume and density of the connective tissue of the organ wall and improve its biomechanical characteristics, which has high biocompatibility. The technical result of the invention is the creation of two options for implants:
1. Имплантат на основе полученных с помощью сверхкритического диоксида углерода частиц поликапролактона размером 100-150 мкм в среде введения, состоящей из гипромеллозы, либо карбоксиметилцеллюлозы, либо гиалуроната натрия, либо поливинилпирролидона, либо глицерола, либо их комбинации.1. An implant based on supercritical carbon dioxide particles of polycaprolactone with a size of 100-150 μm in an injection medium consisting of hypromellose, or carboxymethyl cellulose, or sodium hyaluronate, or polyvinylpyrrolidone, or glycerol, or a combination thereof.
2. Имплантат на основе полученных с помощью сверхкритического диоксида углерода частиц поликапролактона размером 100-150 мкм, импрегнированных рекомбинантным человеческим FGF2, либо PDGF, либо VEGF, либо NGF, либо IGF1, либо BDNF и аутогенных, либо аллогенных мультипотентных стромальных клеток в среде введения, состоящей из гипромеллозы, либо карбоксиметилцеллюлозы, либо гиалуроната натрия, либо поливинилпирролидона, либо глицерола, либо их комбинации.2. An implant based on supercritical carbon dioxide particles of polycaprolactone 100-150 μm in size, impregnated with recombinant human FGF2, or PDGF, or VEGF, or NGF, or IGF1, or BDNF and autogenic or allogeneic multipotent stromal cells in the injection medium, consisting of hypromellose, or carboxymethyl cellulose, or sodium hyaluronate, or polyvinylpyrrolidone, or glycerol, or a combination thereof.
Для получения указанного результата предложен способ получения инъекционной формы имплантата, включающий в себя: (вариант 1) этап монолитизации поликапролактона с помощью сверхкритичной флюидной технологии (СКФ), этап измельчения монолита поликапролактона и отбора фракции 100-150 мкм, этап переноса поликапролактоновых частиц в среду введения, либо (вариант 2) этап монолитизации и импрегнации ростовым фактором поликапролактона с помощью сверхкритичной флюидной технологии (СКФ), этап измельчения монолита поликапролактона и отбора фракции 100-150 мкм, этап получения клеточной культуры мультипотентных стромальных клеток (МСК) человека, этап соединения клеточного и матричного компонентов конструкции, этап переноса поликапролактоновых частиц с адгезированными на них клетками в среду введения.To obtain this result, a method for producing an injectable implant is proposed, which includes: (option 1) the stage of monolithization of polycaprolactone using supercritical fluid technology (GFR), the stage of grinding the monolith of polycaprolactone and selecting a fraction of 100-150 microns, the stage of transfer of polycaprolactone particles to the injection medium or (option 2) the stage of monolithization and impregnation of polycaprolactone with the growth factor using supercritical fluid technology (GFR), the stage of grinding the polycaprolactone monolith and
Поли-ε-капролактон - частично-кристаллический полимер, который получают в реакциях полимеризации с раскрытием цикла из капролактона, используя анионный, катионный катализ или в процессе свободно-радикальной полимеризации открытого типа из 2-метилен-1,3-диокзепана. В изобретении использован низкомолекулярный поли-ε-капролактон (Sigma-Aldrich), Mw~14000 с температурой стеклования в диапазоне 55-60°С.Poly-ε-caprolactone is a partially crystalline polymer, which is obtained in ring-opening polymerization reactions from caprolactone using anionic, cationic catalysis or in the process of open-type free radical polymerization from 2-methylene-1,3-dioxepane. The invention used a low molecular weight poly-ε-caprolactone (Sigma-Aldrich), M w ~ 14000 with a glass transition temperature in the range of 55-60 ° C.
Для СКФ-монолитизации поли-ε-капролактона используют диоксид углерода ОСЧ, ГОСТ 8050-85 (Балашихинский кислородный завода).For SCF monolithization of poly-ε-caprolactone, carbon dioxide is used, OSH, GOST 8050-85 (Balashikha oxygen plant).
Для СКФ-синтеза поликапролактоновых микрочастиц применяют метод СКФ-монолитизации с последующим криоизмельчением.For SCF synthesis of polycaprolactone microparticles, the method of SCF monolithization followed by cryo-grinding is used.
Мелкодисперсный порошок поли-ε-капролактона помещают в тефлоновую кассету (пресс-форму) 4×5×20 мм3, которую загружают в камеру высокого давления лабораторной установки. Камеру уплотняют, продувают и заполняют СО2 при комнатной температуре до давления 10 МПа. После этого включают нагрев, и температура камеры возрастает до 32°С. По мере разогрева камеры давление в ней постепенно увеличивается, и при достижении температуры 32°С, рабочее давление устанавливается в диапазоне от 10 до 20 МПа. Всю систему выдерживают при этих условиях в течение 120 минут, достаточных для полной пластификации содержимого пресс-формы, и производят сброс давления до атмосферного значения. Полученный продукт выдерживают в атмосферных условиях в течение 12 часов для полного удаления СО2 из полимера, полученный отвержденный материал извлекают из кассеты.Fine powder of poly-ε-caprolactone is placed in a Teflon cassette (mold) 4 × 5 × 20 mm 3 , which is loaded into a high-pressure chamber of a laboratory setup. The chamber is sealed, purged and filled with CO 2 at room temperature to a pressure of 10 MPa. After that, heating is turned on, and the temperature of the chamber rises to 32 ° C. As the chamber warms up, the pressure in it gradually increases, and when the temperature reaches 32 ° C, the working pressure is set in the range from 10 to 20 MPa. The entire system is maintained under these conditions for 120 minutes, sufficient to completely plasticize the contents of the mold, and release pressure to atmospheric values. The resulting product was kept under atmospheric conditions for 12 hours to completely remove CO 2 from the polymer, the resulting cured material was removed from the cartridge.
В связи с высокой вязкостью и пластичностью измельчение поли-ε-капролактона проводят в лабораторной криомельнице ударного типа при 1500 об/мин. Для криоизмельчения допускается использование жидкого азота: гранулы предварительно охлаждают в среде жидкого азота в течение 3-5 минут, после чего навеску (10 г) загружают в мельницу с одновременным введением 100-200 мл жидкого азота и перемалывают в течение 5 минут. Для криоизмельчения также допускается использование сухого льда: гранулы охлажденного до -18°С полимера вместе с мелкоколотым (3-5 мм3) сухим льдом засыпают в мельницу и перемалывают полученную смесь в течение 10 минут.Due to the high viscosity and ductility, the grinding of poly-ε-caprolactone is carried out in a shock-type laboratory cryomel mill at 1500 rpm. The use of liquid nitrogen is allowed for cryo grinding: the granules are pre-cooled in liquid nitrogen for 3-5 minutes, after which a sample (10 g) is loaded into the mill with the simultaneous introduction of 100-200 ml of liquid nitrogen and ground for 5 minutes. The use of dry ice is also allowed for cryogrinding: the granules of the polymer cooled to -18 ° C together with fine-crushed (3-5 mm 3 ) dry ice are poured into the mill and the resulting mixture is ground for 10 minutes.
Для получения фракции поликапролактоновых частиц размером 100-150 мкм используют калиброванные сита. Верхняя граница обусловлена внутренним диаметром иглы 20G (603 мкм), которую можно использовать для инъекционного введения имплантата. Нижняя граница обусловлена требованиями к размеру частиц (не менее 80 мкм) для предотвращения их миграции после трансплантации [1].To obtain a fraction of polycaprolactone particles with a size of 100-150 microns, calibrated sieves are used. The upper limit is due to the inner diameter of the 20G needle (603 μm), which can be used for injection of the implant. The lower boundary is due to the requirements for particle size (not less than 80 microns) to prevent their migration after transplantation [1].
Полученные поликапролактоновые частицы переносят в среду введения из расчета 30-100 мг частиц на 1 мл среды. В качестве среды введения используют раствор гипромеллозы, либо карбоксиметилцеллюлозы, либо гиалуроната натрия, либо поливинилпирролидона, либо глицерола, либо их комбинации вязкостью не менее 1000 ср (centipoise = мПа⋅с) при 25°С.The obtained polycaprolactone particles are transferred to the injection medium at the rate of 30-100 mg of particles per 1 ml of medium. A solution of hypromellose, or carboxymethyl cellulose, or sodium hyaluronate, or polyvinylpyrrolidone, or glycerol, or a combination of viscosity of at least 1000 cf (centipoise = mPa⋅s) at 25 ° C, is used as the injection medium.
Для получения частиц поли-ε-капролактона, импрегнированных факторами роста, перед монолитизацией навеску поликапролактоновых частиц пропитывают водным раствором FGF2, либо PDGF, либо VEGF, либо NGF, либо IGF1, либо BDNF из расчета 1 нг фактора на 1 мг частиц. Далее получение микрочастиц проводят аналогично описанному выше способу.To obtain particles of poly-ε-caprolactone impregnated with growth factors, before monolithization, a weighed portion of polycaprolactone particles is impregnated with an aqueous solution of FGF2, or PDGF, or VEGF, or NGF, or IGF1, or BDNF at the rate of 1 ng factor per 1 mg of particles. Further, the preparation of microparticles is carried out similarly to the method described above.
В качестве клеточного компонента имплантата используют мультипотентные стромальные клетки (МСК), выделенные из вартонова студня пупочного канатика, либо жировой ткани, либо другой ткани-источника МСК человека. Материал отмывают от крови, с помощью хирургических инструментов удаляют эпителий и кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают. Используют ферментативный метод изолирования клеток из ткани: инкубация в растворе, содержащем по 200 Ед/мл коллагеназ I и II типов (ПанЭко), в течение 40 минут при 37°С. Полученную суспензию клеток отмывают от ферментов и рассаживают в культуральную посуду без дополнительной обработки подложки из расчета 3 тысячи клеток в 1 мл среды. Для культивирования используют среду DMEM/F12 (ПанЭко) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (РАА) до 10%. После достижения субконфлуентного монослоя клетки открепляют от подложки раствором трипсина-ЭДТА (ПанЭко) и переносят в новую культуральную посуду. В изобретении допускается использование клеточной культуры, прошедшей не более 4 пассажей.Multipotent stromal cells (MSCs) isolated from the Warton jelly of the umbilical cord, or adipose tissue, or other source tissue of human MSCs are used as the cellular component of the implant. The material is washed from the blood, with the help of surgical instruments, the epithelium and blood vessels are removed, the remaining tissue is crushed. An enzymatic method of isolating cells from tissue is used: incubation in a solution containing 200 IU / ml of type I and II collagenases (PanEco) for 40 minutes at 37 ° C. The resulting suspension of cells is washed from enzymes and seated in a culture dish without additional processing of the substrate at the rate of 3 thousand cells in 1 ml of medium. For cultivation using medium DMEM / F12 (PanEco) with the addition of fetal calf serum (RAA) up to 10%. After reaching a subconfluent monolayer, the cells are detached from the substrate with a trypsin-EDTA solution (PanEco) and transferred to a new culture dish. The invention allows the use of cell culture that has passed no more than 4 passages.
Для верификации принадлежности используемых клеток к МСК в соответствии с требованиями ISCT (International Society for Cellular Therapy) [32] подтверждаютTo verify the belonging of the cells used to MSCs in accordance with the requirements of ISCT (International Society for Cellular Therapy) [32] confirm
1) способность клеток к росту на необработанной культуральной подложке;1) the ability of cells to grow on an untreated culture substrate;
2) специфический профиль экспрессии поверхностных антигенов (CD73+, CD90+, CD105+, CD45-, CD34-, CD11b-, CD19-, HLA-DR-;2) a specific expression profile of surface antigens (CD73 +, CD90 +, CD105 +, CD45-, CD34-, CD11b-, CD19-, HLA-DR-;
3) способность клеток к дифференцировке в адипогенном, хондрогенном или остеогенном направлении in vitro под действием индукторов.3) the ability of cells to differentiate in adipogenic, chondrogenic or osteogenic in vitro direction under the influence of inducers.
Для соединения клеточного и матричного компонентов конструкции поликапролактоновые частицы и суспензию МСК (30-100 мг частиц и 5 млн клеток в 1 мл среды) переносят в пробирки-биореакторы (SPL), которые размещают на орбитальном шейкере (BioSan) в СО2-инкубаторе. После инкубирования в течение 1-3 суток частицы с адгезированными на них клетками осаждают центрифугированием и переносят в среду введения аналогично описанному выше способом.To connect the cellular and matrix components of the construct, polycaprolactone particles and a suspension of MSCs (30-100 mg of particles and 5 million cells in 1 ml of medium) are transferred to bioreactor tubes (SPL), which are placed on an orbital shaker (BioSan) in a CO 2 incubator. After incubation for 1-3 days, particles with cells adhered to them are precipitated by centrifugation and transferred to the injection medium in the same way as described above.
Пример 1. Получение и характеристика инъекционного имплантатаExample 1. Obtaining and characterization of an injection implant
Стандартизация полученных с помощью сверхкритической флюидной технологии частиц поли-ε-капролактонаStandardization of particles of poly-ε-caprolactone obtained using supercritical fluid technology
Изучение морфологии поверхности поликапролактоновых частиц методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) проводили с помощью микроскопа LEO 1450 (Zeiss). Для этого исследуемые образцы помещали на проводящую (углеродную) клейкую ленту, на которую затем методом плазменного напыления наносили тонкую (0,05-0,1 мкм) пленку золота, обеспечивающую требуемую электропроводность их поверхности. Результаты СЭМ анализа микроструктур, полученных из поли-ε-капролактона при давлении диоксида углерода в камере высокого давления 13 МПа и температуре 32°С, позволили определить, что каждая отдельно взятая частица полученных мелкодисперсных порошков имеет сложную составную структуру микронного масштаба (фигура 1). Это является свидетельством того, что в результате процессов СКФ пластификации алифатического полиэфира и последующего "вспенивания" при резком сбросе давления СО2, вызывающего мелкомасштабные механические пертурбации всей системы, происходит эффективное образование высокопористых структур.The surface morphology of polycaprolactone particles was studied by scanning electron microscopy (SEM) using a LEO 1450 microscope (Zeiss). For this, the test samples were placed on a conductive (carbon) adhesive tape, onto which a thin (0.05-0.1 μm) gold film was then deposited by plasma spraying, which provided the required electrical conductivity of their surface. The SEM analysis of microstructures obtained from poly-ε-caprolactone at a pressure of carbon dioxide in a high pressure chamber of 13 MPa and a temperature of 32 ° C allowed us to determine that each individual particle of the obtained fine powders has a complex micron-scale composite structure (figure 1). This is evidence that as a result of GFR processes of plasticization of aliphatic polyester and subsequent "foaming" with a sharp pressure drop of CO 2 , which causes small-scale mechanical perturbations of the entire system, highly porous structures are formed.
Эффективность отбора фракции поликапролактоновых частиц размером 100-150 мкм проводили с помощью обсчета темнопольных микрофотографий с помощью программного обеспечения LAS AF v.3.1.0 build 8587 (Leica Microsystems) (фигура 2). По результатам анализа более 98% частиц попадает в заданный размерный интервал, что обеспечивает беспрепятственное инъекционное введение имплантата и сводит к минимуму возможность миграции частиц из области трансплантации.The efficiency of the selection of fractions of polycaprolactone particles with a size of 100-150 μm was carried out by calculating dark-field microphotographs using the LAS AF v.3.1.0 build 8587 software (Leica Microsystems) (figure 2). According to the results of the analysis, more than 98% of the particles fall within a given size range, which ensures unimpeded injection of the implant and minimizes the possibility of particle migration from the transplantation area.
Определение динамики высвобождения ростового фактора (FGF2) из поликапролактоновых частиц в условиях in vitroDetermination of the dynamics of the release of growth factor (FGF2) from polycaprolactone particles in vitro
Для оценки динамики высвобождения FGF2 из поликапролактоновых частиц использовали набор для ИФА-определения FGF2 (BioLegend) с чувствительностью 4 пг/мл. Для этого навеску импрегнированных FGF2 (PAN-Biotech) частиц (7 мг) переносили в лунку, содержащую 200 мкл раствора Хенкса (ПанЭко), и помещали в CO2-инкубатор на 7 суток. В качестве контрольных использовали лунки, содержащие навеску неимпрегнированных фактором роста поликапролактоновых частиц в растворе Хенкса, или лунки только с раствором Хенкса. Анализ результатов (фигура 3) показал, что в условиях in vitro в водном растворе происходит постепенное накопление FGF2 за счет высвобождения фактора из импрегнированных микрочастиц.To assess the dynamics of the release of FGF2 from polycaprolactone particles, the ELISA kit for FGF2 ELISA determination (BioLegend) with a sensitivity of 4 pg / ml was used. For this, a sample of impregnated FGF2 (PAN-Biotech) particles (7 mg) was transferred to a well containing 200 μl of Hanks solution (PanEco) and placed in a CO 2 incubator for 7 days. As a control, we used wells containing a sample of non-impregnated growth factor polycaprolactone particles in Hanks solution, or wells with Hanks solution only. An analysis of the results (Figure 3) showed that under in vitro conditions in the aqueous solution, FGF2 gradually accumulates due to the release of the factor from the impregnated microparticles.
Характеристика МСК человекаCharacteristic of human MSCs
МСК человека выделяли из вартонова студня пупочного канатика ферментативным методом, в качестве ростовой среды использовали DMEM/F12 с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки до 10%. Для анализа иммунофенотипа использовали BD Stemflow™ hMSC Analysis Kit (BD). Анализ проводили на цитофлуориметре FACS Calibur с помощью программы Cell Quest (BD). Для направленной дифференцировки in vitro использовали готовые среды StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit, Osteogenesis Differentiation Kit или Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco), верификацию дифференцировки проводили общепринятыми гистохимическими методами. Проведенная характеристика культур (фигура 4) подтверждает их принадлежность к мультипотентым стромальным клеткам.Human MSCs were isolated from the Warton jelly of the umbilical cord by the enzymatic method; DMEM / F12 with the addition of fetal calf serum up to 10% was used as the growth medium. For analysis of the immunophenotype, the BD Stemflow ™ hMSC Analysis Kit (BD) was used. The analysis was performed on a FACS Calibur cytofluorimeter using the Cell Quest (BD) software. For targeted in vitro differentiation, the prepared StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit, Osteogenesis Differentiation Kit or Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco) media were used, and differentiation was verified by conventional histochemical methods. The characterization of cultures (Figure 4) confirms their belonging to multipotent stromal cells.
Исследование биосовместимости полученных с помощью сверхкритической флюидной технологии частиц поли-ε-капролактона in vitroIn vitro study of biocompatibility of supercritical fluid technology for poly-ε-caprolactone particles
Исследование влияния полученных с помощью сверхкритической флюидной технологии частиц поли-ε-капролактона на жизнеспособность МСК пупочного канатика проводили с помощью колориметрического МТТ-теста. К МСК пупочного канатика, культивируемым в лунках 96-луночного планшета, добавляли нативные или импрегнированные FGF2 поликапролактоновые частицы (7 мг частиц на 200 мкл среды). После инкубации в течение 1, 3 или 7 суток частицы удаляли, в лунки вносили МТТ (Sigma-Aldrich) до конечной концентрации 1,5 мг/мл и инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Появление кристаллов формазана визуализировали с помощью инвертированного микроскопа (Zeiss). После удаления среды в лунки вносили 100 мкл диметилсульфоксида (Sigma-Aldrich), инкубировали 15 минут (режим «встряхивание») и измеряли оптическую плотность (λ=570 нм) с помощью спектрофотометра Multiskan GO (ThermoFisher Scientific). Результаты MTT-теста показали, что поликапролактоновые носители, не импрегнированные белком FGF2, не оказывали значимого влияния на МСК пупочного канатика человека, а поликапролактоновые частицы, импрегнированные FGF2, значимо повышали детектируемую с помощью теста суммарную активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий клеток на 7 сутки (фигура 5). Таким образом, нативные поликапролактоновые частицы не обладают цитотоксическими свойствами по отношению к МСК пупочного канатика (оценка «0 - нецитотоксичен» по шкале цитотоксичности в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-5-2009), а высвобождение ростового фактора FGF2 из импрегнированных частиц стимулирует пролиферативную активность данных клеток.Investigation of the effect of poly-ε-caprolactone particles obtained using supercritical fluid technology on the vitality of umbilical cord MSCs was performed using a colorimetric MTT test. Native or impregnated FGF2 polycaprolactone particles (7 mg particles per 200 μl medium) were added to umbilical cord MSCs cultured in the wells of a 96-well plate. After incubation for 1, 3 or 7 days, the particles were removed, MTT (Sigma-Aldrich) was added to the wells to a final concentration of 1.5 mg / ml and incubated for 2 hours at 37 ° C. The appearance of formazan crystals was visualized using an inverted microscope (Zeiss). After removing the medium, 100 μl of dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich) was added to the wells, incubated for 15 minutes (shake mode) and the absorbance (λ = 570 nm) was measured using a Multiskan GO spectrophotometer (ThermoFisher Scientific). The results of the MTT test showed that polycaprolactone carriers not impregnated with FGF2 protein did not significantly affect human umbilical cord MSCs, while polycaprolactone particles impregnated with FGF2 significantly increased the total activity of mitochondrial succinate dehydrogenase detected by the test (cell figure 5 on day 7) . Thus, native polycaprolactone particles do not have cytotoxic properties with respect to umbilical cord MSCs (rating “0 - non-cytotoxic” on the cytotoxicity scale in accordance with GOST R ISO 10993-5-2009), and the release of growth factor FGF2 from impregnated particles stimulates proliferative activity data cells.
Оценку биосовместимости полученных с помощью сверхкритической флюидной технологии частиц поли-ε-капролактона проводили также методом прямого контакта. Для этого частицы добавляли к суспензии МСК пупочного канатика и переносили в культуральную посуду. Результаты исследования показали, что прямой контакт частиц и клеток не препятствовал экспансии клеточной культуры и не оказывал цитопатического действия. На 7 сутки сокультивирования во всех случаях наблюдали активное обрастание микрочастиц клетками, вследствие которого последние оказывались прикрепленными к подложке (фигура 6). На основании полученных данных можно предположить, что активное заселение микрочастиц резидентными клетками будет продолжаться в условиях in vivo.The biocompatibility of the particles of poly-ε-caprolactone obtained using supercritical fluid technology was also evaluated by direct contact. For this, particles were added to the umbilical cord MSC suspension and transferred to culture dishes. The results of the study showed that direct contact of particles and cells did not interfere with the expansion of cell culture and did not exert a cytopathic effect. On the 7th day of co-cultivation in all cases, active fouling of microparticles by cells was observed, as a result of which the latter appeared to be attached to the substrate (figure 6). Based on the data obtained, it can be assumed that the active population of microparticles by resident cells will continue in vivo.
Заселение поликапролактоновых частиц мультипотентными стромальными клеткамиPopulation of polycaprolactone particles with multipotent stromal cells
Для соединения клеточного и матричного компонентов конструкции поликапролактоновые частицы, импрегнированные FGF2, и суспензию МСК пупочного канатика (30-100 мг частиц и 5 млн клеток в 1 мл среды) переносили в пробирки-биореакторы (SPL), которые размещали на орбитальном шейкере (BioSan) (режим - 75 об/мин) в СО2-инкубаторе. После инкубирования в течение 1-3 суток частицы с адгезированными на них клетками осаждали центрифугированием (500 об/мин, 5 мин). Для количественной оценки адгезии клетки фиксировали 2% параформальдегидом (Serva) и окрашивали DAPI (Sigma-Aldrich) (фигура 7). С помощью программного обеспечения LAS AF v.3.1.0 build 8587 (Leica Microsystems) подсчитывали количество адгезированных клеток, нормированное на единицу площади поверхности, которое составило 455,7±28,1 клеток/мм2.To connect the cellular and matrix components of the construct, polycaprolactone particles impregnated with FGF2 and a suspension of umbilical cord MSCs (30-100 mg of particles and 5 million cells in 1 ml of medium) were transferred to bioreactor tubes (SPL), which were placed on an orbital shaker (BioSan) (mode - 75 rpm) in a CO 2 incubator. After incubation for 1-3 days, particles with cells adhering to them were precipitated by centrifugation (500 rpm, 5 min). To quantify adhesion, cells were fixed with 2% paraformaldehyde (Serva) and stained with DAPI (Sigma-Aldrich) (Figure 7). Using the LAS AF v.3.1.0 build 8587 software (Leica Microsystems), the number of adhered cells was normalized per unit surface area, which was 455.7 ± 28.1 cells / mm 2 .
Для оценки влияния частиц, импрегнированных FGF2, на свойства адгезированных на их поверхности МСК пупочного канатика клетки непосредственно на носителе окрашивали с антителами к положительным маркерам МСК CD90, CD73 и CD105 (фигура 8).To assess the effect of particles impregnated with FGF2 on the properties of umbilical cord MSC adhered to their surface, cells directly on the carrier were stained with antibodies to positive MSC markers CD90, CD73 and CD105 (Figure 8).
Результаты исследования показали, что МСК пупочного канатика способны эффективно заселять полученные с помощью сверхкритической флюидной технологии поликапролактоновые частицы, импрегнированные FGF2, при сохранении специфического иммунофенотипа.The results of the study showed that umbilical cord MSCs are able to efficiently populate polycaprolactone particles impregnated with FGF2 obtained using supercritical fluid technology, while maintaining a specific immunophenotype.
Соединение поликапролактоновых частиц и среды введенияCompound of polycaprolactone particles and administration medium
Получение суспензии поликапролактоновых частиц в вязкой среде введения происходило без каких-либо затруднений: даже при высокой концентрации (более 100 мг на 1 мл) частицы не образовывали конгломератов (фигура 9).Obtaining a suspension of polycaprolactone particles in a viscous administration medium occurred without any difficulties: even at a high concentration (more than 100 mg per 1 ml), the particles did not form conglomerates (figure 9).
Пример 2. Оценка эффективности инъекционного имплантата на модели стрессового недержания мочиExample 2. Evaluation of the effectiveness of an injection implant in a model of stress urinary incontinence
Исследование проводили на половозрелых самках крыс Sprague Dawley массой 250-320 г. Перед проведением эксперимента у всех самок регистрировали базовый уровень LPP - leak point pressure, давление в мочевом пузыре, необходимое для истечения первой капли мочи. Для моделирования стрессового недержания мочи животным делали двусторонние надрезы над большой ягодичной мышцей, препарировали ягодичную мышцу, обеспечивая доступ к нервным отросткам, отходящим от седалищного нерва. При помощи электрокоагулятора (мощность 50 ЕД) коагулировали нервные отростки, среди которых находился и половой нерв, в течение 10-15 с. The study was carried out on sexually mature female Sprague Dawley rats weighing 250-320 g. Before the experiment, all females recorded the baseline level of LPP - leak point pressure, the pressure in the bladder necessary for the expiration of the first drop of urine. To simulate stress urinary incontinence, animals were made bilateral incisions over the gluteus maximus muscle, the gluteus muscle was dissected, providing access to the nerve processes extending from the sciatic nerve. Using an electrocoagulator (power of 50 PIECES), the nerve processes coagulated, among which was the reproductive nerve, for 10-15 seconds.
На 7 сутки после оперативного вмешательства у крыс измеряли LPP, после чего периуретрально вводили 0,9% раствор NaCl (группа сравнения 1), объемообразующий препарат «Уродекс» (группа сравнения 2), поликапролактоновые частицы в 8% растворе гипромеллозы (экспериментальная группа 1) или поликапролактоновые частицы, импрегнированные FGF2, с адгезированными на них МСК пупочного канатика (экспериментальная группа 2). Введение осуществляли в 3-4 точки вокруг уретры, объем введения составил 100 мкл.On the 7th day after surgery, rats were measured with LPP, after which a 0.9% NaCl solution (comparison group 1), the urodex volume-forming preparation (comparison group 2), polycaprolactone particles in an 8% hypromellose solution (experimental group 1) were periurethrally administered. or polycaprolactone particles impregnated with FGF2, with umbilical cord MSC adhered to them (experimental group 2). The introduction was carried out at 3-4 points around the urethra, the volume of injection was 100 μl.
LPP измеряли на 14, 21 и 30 сутки после моделирования стрессового недержания мочи. Результаты измерений показали резкое снижение LPP после повреждения полового нерва, что подтверждает релевантность выбранной экспериментальной модели. В группе сравнения с введением 0,9% раствора NaCl значение LPP оставалось низким на протяжении всего эксперимента. В группах с введением объемообразующих препаратов LPP начинал повышаться на 7 сутки после трансплантации (14 сутки после повреждения нерва) и возвращался к исходным показателям на 14 сутки после трансплантации (21 сутки после операции), оставаясь на том же уровне и далее (фигура 10).LPP was measured on
Часть животных выводили из эксперимента на 7 сутки после двустороннего повреждения полового нерва с целью верификации используемой модели, животных групп сравнения и экспериментальных групп - на 14 и 30 сутки после повреждения. Осуществляли забор уретры вместе с мочевым пузырем, материал помещали в 10% раствор формалина, затем заливали в парафин и делали серийные поперечные срезы толщиной 5-7 мкм на 15 уровнях от дистального конца уретры до шейки мочевого пузыря. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Для морфометрического исследования измеряли площадь просвета уретры (Sпросвета) и площадь области уретры в пределах наружного периметра циркулярного (наружного) мышечного слоя (Sуретры). Рассчитывали индекс площади просвета уретры (ISпросвета) как отношение (Sпросвета/Sуретры)100%. Результаты измерений показали резкое увеличение ISпросвета после повреждения полового нерва, что подтверждает релевантность выбранной экспериментальной модели. В группе сравнения с введением 0,9% раствора NaCl значение ISпросвета оставалось высоким на протяжении всего эксперимента. В группах с введением объемообразующих препаратов ISпросвета начинал понижаться на 7 сутки после трансплантации (14 сутки после повреждения нерва), однако не возвращался к исходным показателям до окончания эксперимента (30 сутки после операции). При этом на 14 сутки максимальное улучшение было зарегистрировано в группе с введением тканеинженерной конструкции на основе поликапролактоновых частиц, импрегнированных FGF2, и МСК пупочного канатика, хотя на 30 сутки значимых различий между группами с введением объемообразующих средств не было обнаружено (фигура 11).Some animals were taken out of the experiment on the 7th day after bilateral damage to the genital nerve in order to verify the model used, the animals of the comparison and experimental groups on the 14th and 30th days after the damage. The urethra was taken together with the bladder, the material was placed in a 10% formalin solution, then it was poured into paraffin and serial cross-sections were made with a thickness of 5-7 μm at 15 levels from the distal end of the urethra to the bladder neck. The preparations were stained with hematoxylin and eosin. For morphometric studies, the urethral lumen area (S-lumen) and the area of the urethral region within the outer perimeter of the circular (outer) muscle layer (Surethra) were measured. The index of the urethral lumen area (ISlight) was calculated as the ratio (Slight / Surethra) of 100%. The measurement results showed a sharp increase in IS lumen after damage to the genital nerve, which confirms the relevance of the selected experimental model. In the comparison group with the introduction of 0.9% NaCl, the IS luminosity remained high throughout the experiment. In groups with the introduction of volume-forming drugs, IS lumen began to decrease 7 days after transplantation (14 days after nerve damage), but did not return to baseline until the end of the experiment (30 days after surgery). At the same time, on
При морфологическом исследовании, выполненном на окрашенных гематоксилином и эозином срезах проксимальной и средней третей уретры, отмечали нормальное строение органа: отсутствие истончения циркулярного слоя мышц, четко визуализируемый просвет, отсутствие соединительнотканной капсулы в месте трансплантации. В периуретральной области на отдаленных сроках выявляли участки с частицами поликапролактона (фигура 12), признаков миграции частиц из области введения обнаружено не было.In a morphological study performed on sections of the proximal and middle third of the urethra stained with hematoxylin and eosin, the normal structure of the organ was noted: the absence of thinning of the circular layer of muscles, a clearly visible lumen, the absence of a connective tissue capsule at the site of transplantation. In the periurethral region at long-term intervals, areas with polycaprolactone particles were detected (Figure 12), no signs of particle migration from the injection area were found.
С помощью флуоресцентной микроскопии было показано, что адгезированные на поверхности поликапролактоновых частиц МСК пупочного канатика, несущие витальную метку РКН26 (Sigma-Aldrich), также не мигрируют из области трансплантации. При этом иммуногистохимическое исследование не подтвердило дифференцировку МСК в гладкомышечные или скелетномышечные клетки (фигура 13). Таким образом, заместительный механизм не является ведущим в реализации терапевтического потенциала МСК в составе инъекционного имплантата для лечения стрессового недержания мочи.Using fluorescence microscopy, it was shown that umbilical cord MSC adhered to the surface of polycaprolactone particles carrying the vital label PKN26 (Sigma-Aldrich) also did not migrate from the transplantation area. However, an immunohistochemical study did not confirm the differentiation of MSCs into smooth muscle or skeletal muscle cells (Figure 13). Thus, the substitution mechanism is not leading to the realization of the therapeutic potential of MSCs as part of an injection implant for the treatment of stress urinary incontinence.
Таим образом, данные физиологического, морфологического и морфометрического исследований подтверждают эффективность применения инъекционного имплантата на основе полученных с помощью сверхкритической флюидной технологии частиц поли-ε-капролактона размером 100-150 мкм либо на основе полученных с помощью сверхкритической флюидной технологии частиц поли-ε-капролактона размером 100-150 мкм, импрегнированных FGF2, и МСК пупочного канатика на модели стрессового недержания мочи.Thus, the data of physiological, morphological and morphometric studies confirm the effectiveness of the injection implant on the basis of particles of poly-ε-caprolactone obtained using supercritical fluid technology with a size of 100-150 μm or on the basis of particles of poly-ε-caprolactone obtained using supercritical fluid technology 100-150 microns, impregnated with FGF2, and umbilical cord MSCs on a model of stress urinary incontinence.
Список использованных источниковList of sources used
1. Smith's Textbook of Endourology. Edited by: Arthur D. Smith. ВС Decker Inc. Hamilton, 2007.1. Smith's Textbook of Endourology. Edited by: Arthur D. Smith. Sun Decker Inc. Hamilton, 2007.
2. Pickard R., Reaper J., Wyness L., et al. Periurethral injection therapy for urinary incontinence in women. Cochrane Database Syst Rev. 2003; (2): CD003881.2. Pickard R., Reaper J., Wyness L., et al. Periurethral injection therapy for urinary incontinence in women. Cochrane Database Syst Rev. 2003; (2): CD003881.
3. Rovner E.S., Wein A.J. Treatment options for stress urinary incontinence. Rev. Urol. 2004; 6 (Suppl. 3): S29-47.3. Rovner E.S., Wein A.J. Treatment options for stress urinary incontinence. Rev. Urol. 2004; 6 (Suppl. 3): S29-47.
4. Dmochowski RR, Appell RA. Injectable agents in the treatment of stress urinary incontinence in women: where are we now? Urology. 2000 Dec 4; 56(6 Suppl 1):32-40.4. Dmochowski RR, Appell RA. Injectable agents in the treatment of stress urinary incontinence in women: where are we now? Urology. 2000 Dec 4; 56 (6 Suppl 1): 32-40.
5. Davis NF, Kheradmand F, Creagh T. Injectable biomaterials for the treatment of stress urinary incontinence: their potential and pitfalls as urethral bulking agents. Int Urogynecol J. 2013 Jun; 24(6):913-9. Doi: 10.1007/s00192-012-2011-9.5. Davis NF, Kheradmand F, Creagh T. Injectable biomaterials for the treatment of stress urinary incontinence: their potential and pitfalls as urethral bulking agents. Int Urogynecol J. 2013 Jun; 24 (6): 913-9. Doi: 10.1007 / s00192-012-2011-9.
6. Degradation Rate of Bioresorbable Materials: Prediction and Evaluation. Edited by F.Buchanan. 2008. Woodhead Publishing Limited. Cambridge, England.6. Degradation Rate of Bioresorbable Materials: Prediction and Evaluation. Edited by F.Buchanan. 2008. Woodhead Publishing Limited. Cambridge, England.
7. Saralidze K, Koole LH, Knetsch ML. Polymeric Microspheres for Medical Applications. Materials 2010, 3, 3537-3564; doi:10.3390/ma3063537.7. Saralidze K, Koole LH, Knetsch ML. Polymeric Microspheres for Medical Applications. Materials 2010, 3, 3537-3564; doi: 10.3390 / ma3063537.
8. Woodruff M.A., Hutmacher D.W. The return of a forgotten polymer-polycaprolactone in the 21st century. Prog. Polym. Sci. 2010; 35: 1217-56.8. Woodruff M.A., Hutmacher D.W. The return of a forgotten polymer-polycaprolactone in the 21st century. Prog. Polym. Sci. 2010; 35: 1217-56.
9. Brugmans M.M., Soekhradj-Soechit R.S., van Geemen D. et al. Superior Tissue Evolution in Slow-Degrading Scaffolds for Valvular Tissue Engineering. Tissue Eng. Part A. 2016; 22(1-2): 123-32.9. Brugmans M.M., Soekhradj-Soechit R.S., van Geemen D. et al. Superior Tissue Evolution in Slow-Degrading Scaffolds for Valvular Tissue Engineering. Tissue Eng. Part A. 2016; 22 (1-2): 123-32.
10. Tai H., Popov V.K., Shakesheff K.M., Howdle S.M. Putting the fizz into chemistry: applications of supercritical carbon dioxide in tissue engineering, drug delivery and synthesis of novel block copolymers. Biochemical Society Transactions 2007; 35: 516-521.10. Tai H., Popov V.K., Shakesheff K.M., Howdle S.M. Putting the fizz into chemistry: applications of supercritical carbon dioxide in tissue engineering, drug delivery and synthesis of novel block copolymers. Biochemical Society Transactions 2007; 35: 516-521.
11. McHugh M.A., Krukonis Val J. Supercritical fluid extraction: Principles and practice; - Boston, MA, Butterworth-Heinemann, 2-d edition, 1994.11. McHugh M.A., Krukonis Val J. Supercritical fluid extraction: Principles and practice; - Boston, MA, Butterworth-Heinemann, 2-d edition, 1994.
12. Гумеров Ф.М., Сабирзянов A.H., Гумерова Г.И. Суб- и сверхкритические флюиды в процессах переработки полимеров; - Казань: Фэн, 2000.12. Gumerov F.M., Sabirzyanov A.H., Gumerova G.I. Sub- and supercritical fluids in polymer processing processes; - Kazan: Feng, 2000.
13. Oh SH, Bae JW, Kang JG, Kim IG, Son JY, Lee JY, Park KD, Lee JH. Dual growth factor-loaded in situ gel-forming bulking agent: passive and bioactive effects for the treatment of urinary incontinence. J Mater Sci Mater Med. 2015 Jan; 26(l):5365. Doi: 10.1007/s10856-014-5365-3.13. Oh SH, Bae JW, Kang JG, Kim IG, Son JY, Lee JY, Park KD, Lee JH. Dual growth factor-loaded in situ gel-forming bulking agent: passive and bioactive effects for the treatment of urinary incontinence. J Mater Sci Mater Med. 2015 Jan; 26 (l): 5365. Doi: 10.1007 / s10856-014-5365-3.
14. Sumino Y, Yoshikawa S, Mori K, Mimata H, Yoshimura N. IGF-1 as an Important Endogenous Growth Factor for Recovery from Impaired Urethral Continence Function in Rats with Simulated Childbirth Injury. J Urol. 2016 Jun; 195(6):1927-35. Doi: 10.1016/j.juro.2015.12.087.14. Sumino Y, Yoshikawa S, Mori K, Mimata H, Yoshimura N. IGF-1 as an Important Endogenous Growth Factor for Recovery from Impaired Urethral Continence Function in Rats with Simulated Childbirth Injury. J Urol. 2016 Jun; 195 (6): 1927-35. Doi: 10.1016 / j.juro.2015.12.0.087.
15. Song QX, Chermansky С J, Birder LA, Li L, Damaser MS. Brain-derived neurotrophic factor in urinary continence and incontinence. Nat Rev Urol. 2014 Oct;l l(10):579-88. Doi: 10.103 8/nrurol.2014.244.15. Song QX, Chermansky C J, Birder LA, Li L, Damaser MS. Brain-derived neurotrophic factor in urinary continence and incontinence. Nat Rev Urol. 2014 Oct; l l (10): 579-88. Doi: 10.103 8 / nrurol.2014.244.
16. Cape S.P., Villa J.A., Huang E.T., Yang Т.Н., Carpenter J.F., Sievers R.E. Preparation of active proteins, vaccines and pharmaceuticals as fine powders using supercritical or near-critical fluids. Pharmaceutical Research, Expert Review 2008; 25: 1967-1990.16. Cape S.P., Villa J.A., Huang E.T., Yang T.N., Carpenter J.F., Sievers R.E. Preparation of active proteins, vaccines and pharmaceuticals as fine powders using supercritical or near-critical fluids. Pharmaceutical Research, Expert Review 2008; 25: 1967-1990.
17. Mangera A, Bullock AJ, Roman S, Chappie CR, MacNeil S. Comparison of candidate scaffolds for tissue engineering for stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse repair. BJU Int. 2013 Sep; 112(5):674-85.Doi: 10.111 l/bju.12186.17. Mangera A, Bullock AJ, Roman S, Chappie CR, MacNeil S. Comparison of candidate scaffolds for tissue engineering for stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse repair. BJU Int. 2013 Sep; 112 (5): 674-85. Doi: 10.111 l / bju.12186.
18. Roman Regueros S, Albersen M, Manodoro S, Zia S, Osman N1, Bullock AJ, Chappie CR, Deprest J, MacNeil S. Acute in vivo response to an alternative implant for urogynecology. Biomed Res Int. 2014; 2014:853610. Doi: 10.1155/2014/853610.18. Roman Regueros S, Albersen M, Manodoro S, Zia S, Osman N1, Bullock AJ, Chappie CR, Deprest J, MacNeil S. Acute in vivo response to an alternative implant for urogynecology. Biomed Res Int. 2014; 2014: 853610. Doi: 10.1155 / 2014/853610.
19. Kim BS, Chun SY, Lee JK, Lim HJ, Bae JS, Chung HY, Atala A, Soker S, Yoo JJ, Kwon TG. Human amniotic fluid stem cell injection therapy for urethral sphincter regeneration in an animal model. BMC Med. 2012 Aug 21;10:94. Doi: 10.1186/1741-7015-10-94.19. Kim BS, Chun SY, Lee JK, Lim HJ, Bae JS, Chung HY, Atala A, Soker S, Yoo JJ, Kwon TG. Human amniotic fluid stem cell injection therapy for urethral sphincter regeneration in an animal model. BMC Med. 2012
20. Kim SO, Na HS, Kwon D, Joo SY, Kim HS, Ann Y. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation enhances closing pressure and leak point pressure in a female urinary incontinence rat model. Urol Int. 2011; 86(1):110-6. Doi: 10.1159/000317322.20. Kim SO, Na HS, Kwon D, Joo SY, Kim HS, Ann Y. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation enhances closing pressure and leak point pressure in a female urinary incontinence rat model. Urol Int. 2011; 86 (1): 110-6. Doi: 10.1159 / 000317322.
21. Boissier R, Karsenty G. Cellular therapy and urinary incontinence. Prog Urol. 2012 Jul; 22(8):454-61. Doi: 10.1016/j.purol.2012.04.008.21. Boissier R, Karsenty G. Cellular therapy and urinary incontinence. Prog Urol. 2012 Jul; 22 (8): 454-61. Doi: 10.1016 / j.purol.2012.04.00.00.
22. Dissaranan C, Cruz MA, Couri BM, Goldman HB, Damaser MS. Stem cell therapy for incontinence: where are we now? What is the realistic potential? Curr Urol Rep.2011 Oct; 12(5):336-44. Doi: 10.1007/s 11934-011-0210-4.22. Dissaranan C, Cruz MA, Couri BM, Goldman HB, Damaser MS. Stem cell therapy for incontinence: where are we now? What is the realistic potential? Curr Urol Rep. 2011 Oct; 12 (5): 336-44. Doi: 10.1007 / s 11934-011-0210-4.
23. Sadeghi Z, Isariyawongse J, Kavran M, Izgi K2, Marini G, Molter J, Daneshgari F, Flask CA, Caplan A, Hijaz A. Mesenchymal stem cell therapy in a rat model of birth-trauma injury: functional improvements and biodistribution. Int Urogynecol J. 2016 Feb;27(2):291-300. Doi: 10.1007/s00192-015-2831-5.23. Sadeghi Z, Isariyawongse J, Kavran M, Izgi K2, Marini G, Molter J, Daneshgari F, Flask CA, Caplan A, Hijaz A. Mesenchymal stem cell therapy in a rat model of birth-trauma injury: functional improvements and biodistribution . Int Urogynecol J. 2016 Feb; 27 (2): 291-300. Doi: 10.1007 / s00192-015-2831-5.
24. Deng K, Lin DL, Hanzlicek B, Balog B, Penn MS, Kiedrowski MJ, Hu Z, Ye Z, Zhu H, Damaser MS. Mesenchymal stem cells and their secretome partially restore nerve and urethral function in a dual muscle and nerve injury stress urinary incontinence model. Am J Physiol Renal Physiol. 2015 Jan 15; 308(2):F92-F100. Doi: 10.1152/ajprenal.00510.2014.24. Deng K, Lin DL, Hanzlicek B, Balog B, Penn MS, Kiedrowski MJ, Hu Z, Ye Z, Zhu H, Damaser MS. Mesenchymal stem cells and their secretome partially restore nerve and urethral function in a dual muscle and nerve injury stress urinary incontinence model. Am J Physiol Renal Physiol. 2015
25. Arutyunyan I, Elchaninov A, Makarov A, Fatkhudinov T. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells Int. 2016; 2016:6901286. Doi: 10.1155/2016/6901286.25. Arutyunyan I, Elchaninov A, Makarov A, Fatkhudinov T. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells Int. 2016; 2016: 6901286. Doi: 10.1155 / 2016/6901286.
26. El Omar R, Beroud J, Stoltz JF, Menu P, Velot E, Decot V. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell-based therapies? Tissue Eng Part В Rev. 2014 Oct; 20(5):523-44. Doi: 10.1089/ten.TEB.2013.0664.26. El Omar R, Beroud J, Stoltz JF, Menu P, Velot E, Decot V. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell-based therapies? Tissue Eng Part In Rev. 2014 Oct; 20 (5): 523-44. Doi: 10.1089 / ten.TEB.2013.0664.
27. Wu H, Du S, Lu Y, Li Y, Wang D. The application of biomedical polymer material hydroxypropyl methyl cellulose(HPMC) in pharmaceutical preparations. J. Chem. Pharm. Res., 2014, 6(5):151-160.27. Wu H, Du S, Lu Y, Li Y, Wang D. The application of biomedical polymer material hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC) in pharmaceutical preparations. J. Chem. Pharm. Res., 2014, 6 (5): 151-160.
28. Cena RB, Park JG, Kim HJ, Son KY, Kim DS, Kang MI, Park SI, Moon du G, Yang DY, Yu DS, Lee JI, Cho КО. Effects of crosslinked dextran in hydroxylpropyl methylcellulose on soft tissue augmentation in rats. J Biomed Mater Res В Appl Biomater. 2014 Jan; 102(1):131-40. Doi: 10.1002/jbm.b.32989.28. Cena RB, Park JG, Kim HJ, Son KY, Kim DS, Kang MI, Park SI, Moon du G, Yang DY, Yu DS, Lee JI, Cho KO. Effects of crosslinked dextran in hydroxylpropyl methylcellulose on soft tissue augmentation in rats. J Biomed Mater Res In Appl Biomater. 2014 Jan; 102 (1): 131-40. Doi: 10.1002 / jbm.b.32989.
29. Sannino A, Esposito A, De Rosa A, Cozzolino A, Ambrosio L, Nicolais L. Biomedical application of a superabsorbent hydrogel for body water elimination in the treatment of edemas. J Biomed Mater Res A. 2003 Dec 1; 67(3): 1016-24.29. Sannino A, Esposito A, De Rosa A, Cozzolino A, Ambrosio L, Nicolais L. Biomedical application of a superabsorbent hydrogel for body water elimination in the treatment of edemas. J Biomed Mater Res A. 2003 Dec 1; 67 (3): 1016-24.
30. Kim H, Jeong H, Han S, Beack S, Hwang BW, Shin M, Oh SS, Hahn SK. Hyaluronate and its derivatives for customized biomedical applications. Biomaterials. 2017 Apr; 123:155-171. Doi: 10.1016/j.biomaterials.2017.01.029.30. Kim H, Jeong H, Han S, Beack S, Hwang BW, Shin M, Oh SS, Hahn SK. Hyaluronate and its derivatives for customized biomedical applications. Biomaterials. 2017 Apr 123: 155-171. Doi: 10.1016 / j.biomaterials.2017.01.01.029.
31. Liu X, Xu Y, Wu Z, Chen H. Poly(N-vinylpyrrolidone)-modified surfaces for biomedical applications. Macromol Biosci. 2013 Feb; 13(2): 147-54. Doi: 10.1002/mabi.201200269.31. Liu X, Xu Y, Wu Z, Chen H. Poly (N-vinylpyrrolidone) -modified surfaces for biomedical applications. Macromol Biosci. 2013 Feb; 13 (2): 147-54. Doi: 10.1002 / mabi.201200269.
32. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4):315-7.32. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8 (4): 315-7.
Подписи к фигурамCaptions to figures
Фиг. 1. СЭМ микрофотографии поликапролактоновых частиц после СКФ-монолитизации и криоизмельчения (А) или после СКФ-монолитизации и импрегнации FGF2 и криоизмельчения (Б).FIG. 1. SEM microphotographs of polycaprolactone particles after SCF monolithization and cryogrinding (A) or after SCF monolithization and impregnation of FGF2 and cryogrinding (B).
Фиг. 2. Темнопольные микрофотографии поликапролактоновых частиц (А) и поликапролактоновых частиц, импрегнированных FGF2 (Б), после калибрования. Маркер масштаба 100 мкм.FIG. 2. Dark-field micrographs of polycaprolactone particles (A) and polycaprolactone particles impregnated with FGF2 (B) after calibration. Marker scale of 100 microns.
Фиг. 3. Динамика высвобождения FGF2 из импрегнированных поликапролактоновых частиц.FIG. 3. The dynamics of the release of FGF2 from impregnated polycaprolactone particles.
Фиг. 4. Характеристика МСК пупочного канатика. А - Внешний вид культуры клеток. Фазово-контрастная микроскопия, маркер масштаба 200 мкм. Б - Профиль экспрессии поверхностных антигенов. В - Индуцированная дифференцировка in vitro в адипогенном (слева), остеогенном (в центре) и хондрогенном (справа) направлениях. Темнопольная микроскопия, маркер масштаба 200 мкм.FIG. 4. Characteristic of MSC of the umbilical cord. A - Appearance of cell culture. Phase contrast microscopy, 200 micron marker. B - Expression profile of surface antigens. B - Induced differentiation in vitro in adipogenic (left), osteogenic (in the center) and chondrogenic (right) directions. Dark-field microscopy, 200 micron marker.
Фиг. 5. Оценка цитотоксичности поликапролактоновых частиц и поликапролактоновых частиц, импрегнированных FGF2, с помощью МТТ-теста. Данные представлены в виде (сред.±ст.откл.).FIG. 5. Assessment of the cytotoxicity of polycaprolactone particles and polycaprolactone particles impregnated with FGF2 using the MTT test. The data are presented in the form (medium ± senior).
Фиг. 6. Оценка цитотоксичности поликапролактоновых частиц (А) и поликапролактоновых частиц, импрегнированных FGF2 (Б), методом прямого контакта. Фазово-контрастная микроскопия, ×50.FIG. 6. Assessment of the cytotoxicity of polycaprolactone particles (A) and polycaprolactone particles impregnated with FGF2 (B) by direct contact. Phase contrast microscopy, × 50.
Фиг. 7. Прикрепление МСК пупочного канатика к поверхности поликапролактоновых частиц, импрегнированных FGF2. Ядра клеток докрашены DAPI. Совмещение темнопольной и флуоресцентной микроскопии, ×100.FIG. 7. Attachment of the umbilical cord MSC to the surface of polycaprolactone particles impregnated with FGF2. Cell nuclei were stained with DAPI. Combination of dark-field and fluorescence microscopy, × 100.
Фиг. 8. Сохранение экспрессии положительных маркеров МСК CD73 (A), CD90 (Б) и CD 105 (В) при культивировании клеток на поверхности поликапролактоновых частиц, импрегнированных FGF2. Ядра клеток докрашены DAPI. Темнопольная (слева) и флуоресцентная микроскопия, ×100.FIG. 8. Preservation of the expression of positive markers of MSC CD73 (A), CD90 (B) and CD 105 (C) upon culturing cells on the surface of polycaprolactone particles impregnated with FGF2. Cell nuclei were stained with DAPI. Dark field (left) and fluorescence microscopy, × 100.
Фиг. 9. Соединение поликапролактоновых частиц и среды введениея (8% гипромеллозы) в концентрациях 35 мг/мл (А) и 100 мг/мл (Б). Фазово-контрастная микроскопия, ×50.FIG. 9. The compound of polycaprolactone particles and the medium introducing (8% hypromellose) at concentrations of 35 mg / ml (A) and 100 mg / ml (B). Phase contrast microscopy, × 50.
Фиг. 10. Оценка эффективности применения инъекционного имплантата на модели стрессового недержания мочи: динамика LPP.FIG. 10. Evaluation of the effectiveness of the use of an injection implant in a model of stress urinary incontinence: LPP dynamics.
Фиг. 11. Оценка эффективности применения инъекционного имплантата на модели стрессового недержания мочи: динамика ISпросвета.FIG. 11. Evaluation of the effectiveness of the use of an injection implant in a model of stress urinary incontinence: dynamics of IS lumen.
Фиг. 12. Локализация поликапролактоновых частиц (А) или поликапролактоновых частиц, импрегнированных FGF2, с адгезированными на них МСК пупочного канатика (Б) в периуретралыюй области на 7 сутки после трансплантации. Окрашивание гематоксилином и эозином. Светлопольная микроскопия, ×50.FIG. 12. Localization of polycaprolactone particles (A) or polycaprolactone particles impregnated with FGF2 with umbilical cord MSC (B) adhered to them in the periurethral region 7 days after transplantation. Hematoxylin and eosin staining. Bright field microscopy, × 50.
Фиг. 13. Трансплантация инъекционного имплантата на основе поликапролактоновых частиц, импрегнированных FGF2, и МСК пупочного канатика, несущих витальную метку РКН26 (красное свечение), в периуретральную область. 30 сутки после введения. Гладкомышечная ткань окрашена с антителами к αSMA (зеленое свечение, А), скелетная мышечная ткань окрашена с антителами к Troponin I (зеленое свечение, Б). Ядра клеток докрашены DAPI. Флуоресцентная микроскопия, ×10 (слева) и ×20 (справа).FIG. 13. Transplantation of an injection implant based on polycaprolactone particles impregnated with FGF2 and umbilical cord MSCs bearing the vital mark RKH26 (red glow) into the periurethral region. 30 days after administration. Smooth muscle tissue is stained with antibodies to αSMA (green glow, A), skeletal muscle tissue is stained with antibodies to Troponin I (green glow, B). Cell nuclei were stained with DAPI. Fluorescence microscopy, × 10 (left) and × 20 (right).
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122733A RU2660550C1 (en) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Method for obtaining an injectable resorbable implant based on polycaprolactone and multipotent stormal cells from umbilical cord |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122733A RU2660550C1 (en) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Method for obtaining an injectable resorbable implant based on polycaprolactone and multipotent stormal cells from umbilical cord |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2660550C1 true RU2660550C1 (en) | 2018-07-06 |
Family
ID=62815419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017122733A RU2660550C1 (en) | 2017-06-28 | 2017-06-28 | Method for obtaining an injectable resorbable implant based on polycaprolactone and multipotent stormal cells from umbilical cord |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2660550C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115926259A (en) * | 2022-12-13 | 2023-04-07 | 江苏西宏生物医药有限公司 | Polycaprolactone microsphere gel |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080118477A1 (en) * | 2006-11-09 | 2008-05-22 | Rush University Medical Center | Umbilical cord mesenchymal stem cells support cord blood hematopoiesis |
| WO2009014441A2 (en) * | 2007-07-26 | 2009-01-29 | Aqtis Ip Bv | Microparticles comprising pcl and uses thereof |
| RU2504406C1 (en) * | 2012-11-21 | 2014-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ КПССЗ" СО РАМН) | Method for making bioresorbed small-diameter hybrid vascular graft |
-
2017
- 2017-06-28 RU RU2017122733A patent/RU2660550C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080118477A1 (en) * | 2006-11-09 | 2008-05-22 | Rush University Medical Center | Umbilical cord mesenchymal stem cells support cord blood hematopoiesis |
| WO2009014441A2 (en) * | 2007-07-26 | 2009-01-29 | Aqtis Ip Bv | Microparticles comprising pcl and uses thereof |
| RU2504406C1 (en) * | 2012-11-21 | 2014-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ КПССЗ" СО РАМН) | Method for making bioresorbed small-diameter hybrid vascular graft |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115926259A (en) * | 2022-12-13 | 2023-04-07 | 江苏西宏生物医药有限公司 | Polycaprolactone microsphere gel |
| CN115926259B (en) * | 2022-12-13 | 2024-05-28 | 江苏西宏生物医药有限公司 | Polycaprolactone microsphere gel |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Luo et al. | Application of bioactive hydrogels combined with dental pulp stem cells for the repair of large gap peripheral nerve injuries | |
| Goodarzi et al. | Preparation and in vitro characterization of cross-linked collagen–gelatin hydrogel using EDC/NHS for corneal tissue engineering applications | |
| Tang et al. | Mussel-inspired injectable hydrogel and its counterpart for actuating proliferation and neuronal differentiation of retinal progenitor cells | |
| Liu et al. | Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering | |
| Wang et al. | Silk fibroin/collagen/hyaluronic acid scaffold incorporating pilose antler polypeptides microspheres for cartilage tissue engineering | |
| Chen et al. | Injectable self-crosslinking HA-SH/Col I blend hydrogels for in vitro construction of engineered cartilage | |
| Chen et al. | Hierarchical macro-microporous WPU-ECM scaffolds combined with microfracture promote in situ articular cartilage regeneration in rabbits | |
| Montembault et al. | A material decoy of biological media based on chitosan physical hydrogels: application to cartilage tissue engineering | |
| Cheng et al. | Extracellular matrix imitation utilizing nanofibers-embedded biomimetic scaffolds for facilitating cartilage regeneration | |
| Li et al. | 3D printing of microenvironment‐specific bioinspired and exosome‐reinforced hydrogel scaffolds for efficient cartilage and subchondral bone regeneration | |
| Li et al. | Bioinspired polysaccharide hybrid hydrogel promoted recruitment and chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells | |
| Sun et al. | Polylysine-decorated macroporous microcarriers laden with adipose-derived stem cells promote nerve regeneration in vivo | |
| Mahoney et al. | Current therapeutic strategies for adipose tissue defects/repair using engineered biomaterials and biomolecule formulations | |
| US11998658B2 (en) | Injectable porous hydrogels | |
| Narayanan et al. | Biomimetic glycosaminoglycan-based scaffolds improve skeletal muscle regeneration in a Murine volumetric muscle loss model | |
| Ghandforoushan et al. | Novel nanocomposite scaffold based on gelatin/PLGA-PEG-PLGA hydrogels embedded with TGF-β1 for chondrogenic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro | |
| Sharath et al. | Human adipose tissue derivatives as a potent native biomaterial for tissue regenerative therapies | |
| Yao et al. | Chitosan-based thermosensitive composite hydrogel enhances the therapeutic efficacy of human umbilical cord MSC in TBI rat model | |
| Ju et al. | A photo-crosslinked proteinogenic hydrogel enabling self-recruitment of endogenous TGF-β1 for cartilage regeneration | |
| Hao et al. | Biofabrication of cell-free dual drug-releasing biomimetic scaffolds for meniscal regeneration | |
| Yang et al. | The differential in vitro and in vivo responses of bone marrow stromal cells on novel porous gelatin–alginate scaffolds | |
| Wan et al. | BMSCs laden injectable amino-diethoxypropane modified alginate-chitosan hydrogel for hyaline cartilage reconstruction | |
| Liao et al. | Potential and recent advances of microcarriers in repairing cartilage defects | |
| Abpeikar et al. | Macroporous scaffold surface modified with biological macromolecules and piroxicam-loaded gelatin nanofibers toward meniscus cartilage repair | |
| EP4338764A2 (en) | Tissue scaffold |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190629 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20210819 |