RU2658350C1 - Method for electroimobilization of antibodies - Google Patents
Method for electroimobilization of antibodies Download PDFInfo
- Publication number
- RU2658350C1 RU2658350C1 RU2017103538A RU2017103538A RU2658350C1 RU 2658350 C1 RU2658350 C1 RU 2658350C1 RU 2017103538 A RU2017103538 A RU 2017103538A RU 2017103538 A RU2017103538 A RU 2017103538A RU 2658350 C1 RU2658350 C1 RU 2658350C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- electric field
- antibodies
- chamber
- electrodes
- particles
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к прикладной биохимии и иммунологии, и может быть использовано при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов и сенсоров на основе кварцевых резонаторов.The invention relates to applied biochemistry and immunology, and can be used in the design of medical immunobiological preparations and sensors based on quartz resonators.
Известен способ иммобилизации белковых молекул за счет использования в качестве активирующего агента триэтоксисилана (3, 3-диэтоксипропил, ДЭПТЭС) в количестве, не превышающем трехкратный молярный избыток по отношению к количеству гидроксильных групп, имеющихся на поверхности носителя. Основным недостатком этого способа является многоэтапность и длительность проведения манипуляций с использованием значительных количеств ингредиентов, разноплановых вспомогательных средств и специального оборудования [А.с. СССР №681837. Опубл. в Бюл. №47, 23.12.1980].A known method of immobilization of protein molecules by using triethoxysilane (3, 3-diethoxypropyl, DEPTES) as an activating agent in an amount not exceeding a triple molar excess with respect to the amount of hydroxyl groups present on the surface of the carrier. The main disadvantage of this method is the multi-stage and the duration of the manipulation using significant amounts of ingredients, diverse aids and special equipment [A.S. USSR No. 681837. Publ. in bull. No. 47, 12/23/1980].
Известна методика предварительной активации в плазме полиэтиленимина функциональной неорганической поверхности кварцевого резонатора для покрытия последней реакционно-функциональными группами и последующей иммобилизации сенсорных молекул - антител для детекции гомологичных антигенов инфекций, представляющих потенциальную угрозу популяции человека и животным, как диким, так и живущим под мониторингом людей.A known technique is the preliminary activation in plasma of polyethylenimine of the functional inorganic surface of a quartz resonator to cover the last reaction-functional groups and the subsequent immobilization of sensory molecules - antibodies to detect homologous antigens of infections that pose a potential threat to human populations and animals, both wild and living under human monitoring.
Несмотря на высокую эффективность образования реакционно-функциональных групп на поверхности резонатора за счет энергии УВЧ-поля в вакууме последующая ковалентная иммобилизация специфических сенсорных молекул проводилась со значительным перерасходом иммуноглобулинов, а также без дополнительного энергетического воздействия на процесс фиксации белковых молекул на неорганической поверхности [Пат. РФ №2510830. Опубл. в Бюл. №10, 10.04.2014].Despite the high efficiency of the formation of reaction-functional groups on the surface of the resonator due to the energy of the UHF field in vacuum, the subsequent covalent immobilization of specific sensor molecules was carried out with a significant overrun of immunoglobulins, as well as without additional energy impact on the process of fixing protein molecules on an inorganic surface [Pat. RF №2510830. Publ. in bull. No. 10, 04/10/2014].
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ электроиммобилизация С-пептида проинсулина на чипе кварцевого сенсора для аффинной очистки белка [Melles Е., Anderson Н., Wallinder D., Shafqat J., Bergman Т., Aastrup Т., Jornvall H. Electroimmobilization of C-peptide to a quartz crystal microbalance sensor chip for protein affinity purification // Analitical Biochemistry / - 2005, Vol. 341. - P. 89-93]. В этой работе авторы модифицировали пъезокварцевый биосенсор Attana 80 (фирма «Attana», Stockholm, Sweden) таким образом, чтобы прикладываемый потенциал электрического поля распространялся на функциональную поверхность кварца и жидкостный поток исследуемого аналита за счет дополнительного электрода. При этом предусмотрена возможность вариации потенциала поля от «-» 8 до «+» 8 В/см относительно поверхности кварца при расстоянии между электродами 10 мм, т.е. амплитуда напряженности поля и его направленность могли быть изменены в широких пределах. В то же время эффективность иммобилизации лигандов, как показали авторы в материалах работы на графиках изменения частотной характеристики кварца, при дополнительном воздействии электрическим полем стабильно воспроизводима и подтверждается кратной возможностью иммобилизации и элюции лигандов.Closest to the claimed invention is a method of electroimmobilization of C-peptide of proinsulin on a quartz sensor chip for affinity protein purification [Melles E., Anderson N., Wallinder D., Shafqat J., Bergman T., Aastrup T., Jornvall H. Electroimmobilization of C-peptide to a quartz crystal microbalance sensor chip for protein affinity purification // Analitical Biochemistry / - 2005, Vol. 341. - P. 89-93]. In this work, the authors modified the piezoelectric quartz biosensor Attana 80 (Attana, Stockholm, Sweden) in such a way that the applied potential of the electric field spreads over the functional surface of quartz and the liquid flow of the analyte under study due to an additional electrode. At the same time, it is possible to vary the field potential from “-” 8 to “+” 8 V / cm relative to the surface of the quartz with a distance between the electrodes of 10 mm, i.e. the amplitude of the field strength and its directivity could be changed over a wide range. At the same time, the efficiency of ligand immobilization, as shown by the authors in the materials on graphs of changes in the frequency characteristics of quartz, is additionally stably reproducible under additional exposure to an electric field and is confirmed by the multiple possibility of ligand immobilization and elution.
Основным недостатком предложенной авторами методики является отсутствие указаний на удельные электрометрические параметры прикладываемого поля к электродам модифицированной модели биосенсора Attana 80. Также следует отметить сложность и длительность выполнения отдельных этапов и манипуляций при иммобилизации аминокислотных фрагментов с использованием энергии электрического поля для выделения очищенных белковых молекул.The main drawback of the methodology proposed by the authors is the lack of indications of the specific electrometric parameters of the applied field to the electrodes of the Attana 80 modified biosensor model. It is also worth noting the complexity and length of the individual steps and manipulations involved in the immobilization of amino acid fragments using electric field energy to isolate purified protein molecules.
Целью изобретения является упрощение способа, сокращение расхода белкового раствора и сроков получения иммобилизованных белковых молекул на электропроводных поверхностях кварцевого генератора и/или частицах носителя - стандартного образца магнитного сорбента (СО МС) за счет приложения энергии постоянного и/или пульсирующего электрического поля в однородном магнитном поле.The aim of the invention is to simplify the method, reduce the consumption of protein solution and the timing of obtaining immobilized protein molecules on the electrically conductive surfaces of the crystal oscillator and / or particles of the carrier - a standard sample of magnetic sorbent (CO MS) by applying the energy of a constant and / or pulsating electric field in a uniform magnetic field .
Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови основано на способности их фракций приобретать разновеликие заряды в растворе и перемещаться с отличающимися скоростями в поле постоянного электрического тока за счет возникающих сил явления электромагнитной индукции.The electrophoretic separation of blood serum proteins is based on the ability of their fractions to acquire different-sized charges in solution and to move with different speeds in the field of direct electric current due to the arising forces of the phenomenon of electromagnetic induction.
Выделению белков из биологического материала и белково-липидных комплексов биомембран способствует обработка их детергентами - додецил сульфат натрия и др. Отличия аминокислотных составов белковых фракций сыворотки крови при рН 8,6 приводят к отличиям величины заряда, но сохраняется один знак заряда - «отрицательный». При этом глобулины растворимы только в слабосолевых растворах и являются амфотерными полиэлектролитами. В поле постоянного электрического тока в щелочной среде (рН>7,0) белки перемещаются к аноду (плюс), в кислой среде (рН<7) белки перемещаются к катоду (минус) [http;//www.studfiles.ru/preview/3579524/page:3/].The separation of proteins from biological material and protein-lipid complexes of biomembranes is facilitated by treatment with their detergents — sodium dodecyl sulfate, etc. Differences in the amino acid composition of the protein fractions of blood serum at pH 8.6 lead to differences in the magnitude of the charge, but one sign of charge remains - “negative”. Moreover, globulins are soluble only in slightly salt solutions and are amphoteric polyelectrolytes. In a field of constant electric current in an alkaline medium (pH> 7.0), proteins move to the anode (plus), in an acidic environment (pH <7) proteins move to the cathode (minus) [http; // www.studfiles.ru/preview / 3579524 / page: 3 /].
Кроме того, для повышения эффективности разделения по молекулярным массам фракций белков известна методика повторно-кратковременного воздействия на перемещаемые пулы молекул за счет приложения дополнительных совпадающих по направленности импульсов постоянного электрического поля, способствующих повышению эффективности и увеличению скорости процесса, т.е. приводят к сокращению времени.In addition, to increase the efficiency of separation of protein fractions by molecular masses, a technique is known for repeatedly intermittently affecting moving pools of molecules by applying additional dc pulses of a constant electric field that coincide in direction, contributing to an increase in efficiency and an increase in the speed of the process, i.e. lead to a reduction in time.
Сущность технического решения способа заключается в экспериментальном обосновании физико-химических и иммунобиологических параметров ингредиентов для сокращения времени, экономии растворов антител и повышения эффективности их иммобилизации на электропроводных поверхностях за счет приложения к электродам вертикальной микроэлектрофоретической камеры, заполненной гранулами silica gel 40, находящейся в однородном магнитном поле, и энергии постоянного электрического поля, а также дополнительных совпадающих по направленности импульсов постоянного электрического поля при нанесении сенсорного покрытия на электроды и/или размещении обрабатываемых объектов в виде частиц стандартного образца магнитного сорбента на электродах.The essence of the technical solution of the method is to experimentally substantiate the physicochemical and immunobiological parameters of the ingredients to reduce time, save antibody solutions and increase the efficiency of their immobilization on electrically conductive surfaces by applying a vertical microelectrophoretic chamber filled with silica gel 40 granules in a uniform magnetic field to the electrodes , and the energy of a constant electric field, as well as additional pulses coinciding in direction a constant electric field when applying a sensor coating to the electrodes and / or placing the processed objects in the form of particles of a standard sample of a magnetic sorbent on electrodes.
Для отработки опытным путем параметров электроиммобилизации антител в буферном растворе авторами была сконструирована разборная вертикальная микроэлектрофоретическая камера в виде колонки цилиндрической формы высотой 0,3; 2,0 и 7,0 мм. В зависимости от высоты колонок и прикладываемых импульсов электрического поля его напряженность составила от 3,7 до 120 В/см. При этом были учтены известные магнитные и электрометрические параметры длительности, напряженности и плотности тока на единицу поверхности поперечного сечения обрабатываемого образца, а также магнитные параметры однородного магнитного поля, образуемого ниобиевыми магнитами с напряженностью, составившей 250,0 тТ. За счет этого поля удерживаются частицы частиц стандартного образца магнитного сорбента на поверхности электродов, а наличие гранул silica gel 40 и ограничивает проявления тепловой и электроиндуцированной конверсии. Величина тока из расчета на единицу поперечного сечения микрокамеры составляет 600 μА/см2. Удельная энергия электрического поля, прикладываемого к одной единице площади поперечного сечения микроэлектрофоретической камеры, в среднем составляет 2,9 Вт/см2. При этом энергия, прикладываемая к единице объема этой камеры, без учета энергии кратковременных импульсов, соответственно, составляет от 0,13 до 1,92 Вт/см3.To experimentally test the parameters of the electrical immobilization of antibodies in a buffer solution, the authors constructed a collapsible vertical microelectrophoretic chamber in the form of a cylindrical column with a height of 0.3; 2.0 and 7.0 mm. Depending on the height of the columns and the applied pulses of the electric field, its intensity ranged from 3.7 to 120 V / cm. In this case, the known magnetic and electrometric parameters of the duration, intensity and current density per unit surface area of the cross-section of the treated sample, as well as the magnetic parameters of a uniform magnetic field formed by niobium magnets with a strength of 250.0 tT, were taken into account. Due to this field, particles of particles of a standard sample of a magnetic sorbent are retained on the surface of the electrodes, and the presence of silica gel 40 granules limits the manifestations of thermal and electro-induced conversion. The current value per unit cross section of the microchamber is 600 μA / cm 2 . The specific energy of the electric field applied to one unit of the cross-sectional area of the microelectrophoretic chamber, on average, is 2.9 W / cm 2 . Moreover, the energy applied to a unit volume of this chamber, without taking into account the energy of short-term pulses, respectively, is from 0.13 to 1.92 W / cm 3 .
Возможность практического использования заявляемого способа электроиммобилизации антител на электропроводной поверхности подтверждена примерами конкретной электроиммуноиммобилизацией бруцеллезных и туляремийных антител на функциональных золотых электродах кварцевых пластин и/или на частицах стандартного образца магнитного сорбента.The practical use of the proposed method of electroimmobilization of antibodies on a conductive surface is confirmed by examples of specific electroimmunoimmobilization of brucellosis and tularemia antibodies on functional gold electrodes of quartz plates and / or on particles of a standard sample of a magnetic sorbent.
Пример 1. Электроиммобилизацию специфических бруцеллезных антител в буферном растворе проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретической камере высотой 2,0 мм в однородном магнитном поле с основанием в виде постоянного ниобиевого магнита диаметром 15 и высотой 2,0 мм. За счет магнитного поля последний фиксировался к стальной пластине, а резиновая геметизирующая прокладка вокруг него во время работы системы прижималась замкнутым магнитным полем, образуемым с магнитом верхнего электрода. Один из кварцевых резонаторов ДМ-7 диаметром 14 мм с золотыми электродами, выведенными на одну его сторону, помещали электродами вниз на магните, а на открытую функциональную поверхность устанавливали диэлектрическую цилиндрическую муфту диаметром 15 с внутренним каналом диаметром 10,5 и высотой 2 мм. Объем камеры аккуратно заполняли гранулами silica gel 40, из расчета его последующего изменения объема, при внесении активирующего биоспецифического буферного раствора антител к бруцеллезной сыворотке. Раствор антител готовили на основе исходного концентрированного × 10-ного трис-ацетатного буферного раствора (ТАБ) с концентрацией додецилсульфата натрия 0,5% путем внесения во флакон 4-х частей дистиллированной воды, 2-х частей ТАБ, 1-й части бруцеллезной сыворотки с концентрацией антител 1,0 мг/мл. Объем камеры полностью заполняли приготовленным буферным раствором антител. К увлажненной поверхности силикагеля сверху функциональным электродом, обращенным вниз, прикладывали кварцевый резонатор, которым выравнивали сыпучий наполнитель. Поверх кварцевой пластины устанавливали контакт токовода в виде токопроводящего немагнитного (бронзового) цилиндра диаметром 16 мм с установленным в его нижней части ниобиевым магнитом диаметром 10 и толщиной 1,0 мм, обеспечивавшим герметичность и фиксацию контактов приложения электрического поля с напряженностью 12,5 В/см в течение 2-х мин. Напряженность, ток, сопротивление и проводимость системы контролировали мультиметром. При этом удельная мощность электрического поля, прикладываемого к одной единице площади поперечного сечения микрокамеры, в среднем составила 2,9 Вт/см2, а энергия, прикладываемая к единице объема микрокамеры, без учета энергии кратковременных импульсов, составила от 0,142 Вт/см3. Кварцевые электроды, использованные в качестве анода (плюс) и катода (минус), извлекали из микрокамеры, промывали в 10-кратно разведенном физиологическом растворе, высушивали, сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 1453±3,74 и 1820±2,23 Гц. В потоке суспензии клеток бруцелл с концентрацией 104 м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку с помощью векторного анализатора цепей CPNA-330 (ЗАО «ЭТНА», Москва), отмечали снижение частот резонаторов анодного и катодного соответственно на 467±2,45 и 615±4,61 Гц.Example 1. Specific brucellosis antibodies were immobilized in a buffer solution in a vertical collapsible microelectrophoretic chamber 2.0 mm high in a uniform magnetic field with a base in the form of a permanent niobium magnet with a diameter of 15 and a height of 2.0 mm. Due to the magnetic field, the latter was fixed to the steel plate, and the rubber hemerizing gasket around it was pressed during operation of the system by a closed magnetic field formed with the magnet of the upper electrode. One of the DM-7 quartz resonators with a diameter of 14 mm with gold electrodes placed on one side of it was placed with the electrodes down on a magnet, and a dielectric cylindrical sleeve with a diameter of 15 with an internal channel of 10.5 in diameter and 2 mm in height was installed on an open functional surface. The chamber volume was neatly filled with silica gel 40 granules, based on its subsequent volume change, when an activating biospecific buffer solution of antibodies to brucellosis serum was introduced. The antibody solution was prepared on the basis of the initial concentrated × 10-tris-acetate buffer solution (TAB) with a concentration of sodium dodecyl sulfate 0.5% by adding 4 parts of distilled water, 2 parts of TAB, 1 part of brucellosis serum to the vial with an antibody concentration of 1.0 mg / ml. The chamber volume was completely filled with the prepared antibody buffer solution. A quartz resonator was applied to the moistened surface of silica gel from above with a functional electrode facing down, with which a bulk filler was leveled. On top of the quartz plate, a current lead contact was made in the form of a conductive non-magnetic (bronze) cylinder with a diameter of 16 mm and a niobium magnet with a diameter of 10 and a thickness of 1.0 mm installed in its lower part, which ensured tightness and fixation of the contacts of the application of an electric field with a voltage of 12.5 V / cm within 2 minutes The voltage, current, resistance and conductivity of the system were controlled by a multimeter. The specific power of the electric field applied to one unit of the cross-sectional area of the microchamber averaged 2.9 W / cm 2 , and the energy applied to a unit volume of the microchamber, without taking into account the energy of short-term pulses, was from 0.142 W / cm 3 . The quartz electrodes used as the anode (plus) and cathode (minus) were removed from the microchambers, washed in a 10-fold diluted physiological solution, dried, and the frequency shift on the anode and cathode quartz resonators was 1453 ± 3.74 and 1820 ± 2, respectively , 23 Hz. In the flow of a suspension of brucella cells with a concentration of 10 4 m.k./ ml, forcibly passing through a liquid cell using a CPNA-330 vector network analyzer (ZAO ETNA, Moscow), a decrease in the frequencies of the anode and cathode resonators by 467 ± 2, respectively , 45 and 615 ± 4.61 Hz.
Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в качестве активирующего биоспецифического раствора использовали буферный раствор антител к туляремийному микробу. Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 724,38±0,14 и 724,46±0,24 Гц. В потоке суспензии клеток туляремии с концентрацией 104 м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку с помощью векторного анализатора цепей CPNA-330, отмечали снижение частот резонаторов анодного и катодного соответственно на 724,39±0,14 и 1188,15 Гц.Example 2. It differs from example 1 in that a buffer solution of antibodies to tularemia microbe was used as an activating biospecific solution. The frequency shift at the anode and cathode quartz resonators, respectively, amounted to 724.38 ± 0.14 and 724.46 ± 0.24 Hz. In the flow of a suspension of tularemia cells with a concentration of 10 4 m.k./ ml, forcibly passing through the liquid cell using a CPNA-330 vector network analyzer, a decrease in the frequencies of the anode and cathode resonators was noted by 724.39 ± 0.14 and 1188.15, respectively Hz
Пример 3. Отличается от примера 1 тем, что к электродам постоянного электрического тока дополнительно прикладывали 30 импульсов постоянного тока общей длительностью 3,0 сек с напряженностью 36 В/см. Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 1188,15±12,03 и 1179,46±15,35 Гц. В потоке суспензии клеток бруцелл с концентрацией 104 м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку, отмечали снижение частот резонаторов анодного и катодного соответственно на 693,42±11,43 и 584,25±6,52 Гц.Example 3. It differs from example 1 in that 30 DC pulses with a total duration of 3.0 seconds and a voltage of 36 V / cm were additionally applied to the electrodes of direct electric current. The frequency shift at the anode and cathode quartz resonators, respectively, amounted to 1188.15 ± 12.03 and 1179.46 ± 15.35 Hz. In the flow of the suspension of brucella cells with a concentration of 10 4 m.k./ ml, forcibly passing through the liquid cell, a decrease in the frequencies of the anode and cathode resonators was noted by 693.42 ± 11.43 and 584.25 ± 6.52 Hz, respectively.
Пример 4. Отличается от примера 1 тем, что в качестве активирующего биоспецифического раствора использовали буферный раствор антител к туляремийному микробу, а к электродам постоянного электрического тока дополнительно прикладывали 10 импульсов постоянного тока общей длительностью 3,0 сек с напряженностью 36 В/см. Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 543,27±9,19 и 678,62±11,26 Гц. В потоке суспензии клеток туляремии с концентрацией 104 м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку с помощью векторного анализатора цепей CPNA-330, отмечали снижение частот резонаторов соответственно на 374,00±8,39 и 375,08±8,46 Гц.Example 4. It differs from example 1 in that a buffer solution of antibodies to tularemia microbe was used as an activating biospecific solution, and 10 DC pulses with a total duration of 3.0 sec and a voltage of 36 V / cm were additionally applied to the electrodes of direct current. The frequency shift at the anode and cathode quartz resonators, respectively, was 543.27 ± 9.19 and 678.62 ± 11.26 Hz. In the flow of a suspension of tularemia cells with a concentration of 10 4 m.k. / ml, forcibly passing through the liquid cell using a CPNA-330 vector network analyzer, a decrease in the resonator frequencies by 374.00 ± 8.39 and 375.08 ± 8, respectively, was noted. 46 Hz.
Пример 5. Отличается от примера 1 тем, что электроиммобилизацию специфических бруцеллезных антител в буферном растворе проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретической камере высотой 0,3 мм при напряженности электрического поля 83 В/см в течение 1,0 мин. Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 430±15,51 и 1390±10,59 Гц. В потоке суспензии клеток бруцелл с концентрацией 104 м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку с помощью векторного анализатора цепей CPNA-330, отмечали снижение частот резонаторов соответственно на 2355±14,48 и 2835±11,76 Гц.Example 5. It differs from example 1 in that the electroimmobilization of specific brucellosis antibodies in a buffer solution was carried out in a vertical collapsible microelectrophoretic chamber 0.3 mm high with an electric field strength of 83 V / cm for 1.0 min. The frequency shift at the anode and cathode quartz resonators, respectively, was 430 ± 15.51 and 1390 ± 10.59 Hz. In a flow of a suspension of brucella cells with a concentration of 10 4 m.k./ ml, forcibly passing through a liquid cell using a CPNA-330 vector network analyzer, a decrease in the resonator frequencies by 2355 ± 14.48 and 2835 ± 11.76 Hz, respectively, was noted.
Пример 6. Отличается от примера 1 тем, что в качестве активирующего биоспецифического раствора использовали буферный раствор антител к туляремийному микробу, а электроиммобилизацию проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретической камере высотой 0,3 мм при напряженности электрического поля 83 В/см в течение 1,0 мин.Example 6. It differs from example 1 in that a buffer solution of antibodies to tularemia microbe was used as an activating biospecific solution, and electroimmobilization was carried out in a vertical collapsible microelectrophoretic chamber 0.3 mm high with an electric field strength of 83 V / cm for 1.0 min .
Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно,составил, 497,83±5,92 и 541,64±10,21 Гц, затем в потоке суспензии клеток бруцелл концентрацией 104 м.к./мл отмечали снижение частот резонаторов соответственно на 378,09±7,27 и 425,86±5,71 Гц.The frequency shift at the anodic and cathodic quartz resonators, respectively, was 497.83 ± 5.92 and 541.64 ± 10.21 Hz, then, in the flow of the suspension of brucella cells with a concentration of 10 4 m.k./ ml, a decrease in the frequency of the resonators was noted, respectively 378.09 ± 7.27 and 425.86 ± 5.71 Hz.
Пример 7. Отличается от примера 1 тем, что электроиммобилизацию специфических антител в их буферном растворе проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретической камере высотой 7,0 мм при напряженности электрического поля 4,2 В/см и удельной плотности энергии на единицу объема 0,142 Вт/см3 в течение 4-х мин. При этом предварительно на золотые электроды в виде кварцевых пластин ДМ-7 нанесли по 25 мг частиц стандартного образца магнитного сорбента, удерживаемого в однородном магнитном поле ниобиевыми магнитами. Магносорбенты многократно промывали раствором ФСБ до нулевой экстинкции на спектрофотометре. После многократной отмывки магнитного сорбента в растворе ФСБ до нулевой экстинкции на спектрофотометре и приведения их к концентрации 1:10 в растворе ФСБ по традиционной методике выполняли ИФА, показавшему пороговую чувствительность 103 м.к./мл, с более чем двукратным увеличением оптической плотности в опыте по сравнению с контролем.Example 7. It differs from example 1 in that the electrical immobilization of specific antibodies in their buffer solution was carried out in a vertical collapsible microelectrophoretic chamber 7.0 mm high with an electric field strength of 4.2 V / cm and specific energy density per unit volume of 0.142 W / cm 3 within 4 minutes In this case, 25 mg of particles of a standard sample of a magnetic sorbent held in a uniform magnetic field by niobium magnets were preliminarily applied to gold electrodes in the form of DM-7 quartz plates. Magnosorbents were repeatedly washed with a FSB solution to zero extinction on a spectrophotometer. After repeated washing of the magnetic sorbent in the FSB solution to zero extinction on a spectrophotometer and bringing them to a concentration of 1:10 in the FSB solution, an ELISA was performed according to the traditional method, which showed a threshold sensitivity of 10 3 MK / ml, with a more than twofold increase in optical density in experience compared to control.
Пример 8. Отличается от примера 1 тем, что в качестве активирующего биоспецифического раствора использовали буферный раствор антител туляремийного микроба, а их электроиммобилизацию проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретическо камере высотой 7,0 мм при напряженности электрического поля 4,2 В/см в течение 4-х мин. При этом предварительно на золотые электроды в виде кварцевых пластин ДМ-7 нанесли по 25 мг частиц стандартного образца магнитного сорбента, удерживаемого в однородном магнитном поле ниобиевыми магнитами. Магносорбенты многократно промывали раствором ФСБ до нулевой экстинкции на спектрофотометре. После многократной отмывки магнитного сорбента в растворе ФСБ до нулевой экстинкции на спектрофотометре и приведения их к концентрации 1:10 в растворе ФСБ по традиционной методике выполняли ИФА, показавшему пороговую чувствительность 103 м.к./мл, с более чем двукратным увеличением оптической плотности в опыте по сравнению с контролем.Example 8. It differs from example 1 in that a buffer solution of tularemia microbe antibodies was used as an activating biospecific solution, and their electroimmobilization was carried out in a vertical collapsible microelectrophoretic chamber 7.0 mm high with an electric field strength of 4.2 V / cm for 4- x min In this case, 25 mg of particles of a standard sample of a magnetic sorbent held in a uniform magnetic field by niobium magnets were preliminarily applied to gold electrodes in the form of DM-7 quartz plates. Magnosorbents were repeatedly washed with a FSB solution to zero extinction on a spectrophotometer. After repeated washing of the magnetic sorbent in the FSB solution to zero extinction on a spectrophotometer and bringing them to a concentration of 1:10 in the FSB solution, an ELISA was performed according to the traditional method, which showed a threshold sensitivity of 10 3 MK / ml, with a more than twofold increase in optical density in experience compared to control.
Таким образом, заявляемый способ практически осуществим и имеет преимущество, так как обеспечивает получение сенсоров на основе кварцевых резонаторов и/или МИС с высокой стандартностью, чувствительностью, воспроизводимостью, стабильностью, демонстративностью регистрируемых результатов реакций. Применение способа возможно при конструировании гравиметрических иммуносенсоров; при разработке новых и выпуске коммерческих препаратов МИБП с более высоким уровнем эффективности их иммунологических характеристик.Thus, the inventive method is practicable and has an advantage, since it provides sensors based on quartz resonators and / or MIS with high standard, sensitivity, reproducibility, stability, and demonstrativeness of the recorded reaction results. The application of the method is possible in the design of gravimetric immunosensors; in the development of new and production of commercial MIBP preparations with a higher level of effectiveness of their immunological characteristics.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103538A RU2658350C1 (en) | 2017-02-02 | 2017-02-02 | Method for electroimobilization of antibodies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017103538A RU2658350C1 (en) | 2017-02-02 | 2017-02-02 | Method for electroimobilization of antibodies |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2658350C1 true RU2658350C1 (en) | 2018-06-20 |
Family
ID=62620446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017103538A RU2658350C1 (en) | 2017-02-02 | 2017-02-02 | Method for electroimobilization of antibodies |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2658350C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU193055U1 (en) * | 2018-12-07 | 2019-10-11 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | UNIVERSAL DEVICE FOR ELECTROIMMUNOIMMOBILIZATION AND ELECTROCHEMICAL OXIDATION OF FUNCTIONAL SURFACES |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2389022C2 (en) * | 2008-07-08 | 2010-05-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий" (ФГУ РКНПК Росмедтехнологий) | Sorbent for removal of immunoglobulins |
| RU2510830C2 (en) * | 2012-04-13 | 2014-04-10 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for preparing microgravimetric immunosensor |
| RU2515197C1 (en) * | 2012-10-22 | 2014-05-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Method of immobilising biomolecules on surface of magnetically controlled iron nanoparticles coated with carbon coating |
-
2017
- 2017-02-02 RU RU2017103538A patent/RU2658350C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2389022C2 (en) * | 2008-07-08 | 2010-05-10 | Федеральное государственное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий" (ФГУ РКНПК Росмедтехнологий) | Sorbent for removal of immunoglobulins |
| RU2510830C2 (en) * | 2012-04-13 | 2014-04-10 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Method for preparing microgravimetric immunosensor |
| RU2515197C1 (en) * | 2012-10-22 | 2014-05-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Method of immobilising biomolecules on surface of magnetically controlled iron nanoparticles coated with carbon coating |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MELLES E., ANDERSON Н. et al. Electroimmobilization of C-peptide to a quartz crystal microbalance sensor chip for protein affinity purification // Analitical Biochemistry, 2005, Vol. 341, стр. 89-93. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU193055U1 (en) * | 2018-12-07 | 2019-10-11 | Федеральное казённое учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | UNIVERSAL DEVICE FOR ELECTROIMMUNOIMMOBILIZATION AND ELECTROCHEMICAL OXIDATION OF FUNCTIONAL SURFACES |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Muramatsu et al. | Piezoelectric immuno sensor for the detection of Candida albicans microbes | |
| Neumann | The relaxation hysteresis of membrane electroporation | |
| Yosypchuk et al. | Preparation and properties of mercury film electrodes on solid amalgam surface | |
| Jiang et al. | Mast cell-based electrochemical biosensor for quantification of the major shrimp allergen Pen a 1 (tropomyosin) | |
| Liu et al. | Detection of estradiol at an electrochemical immunosensor with a Cu UPD| DTBP–Protein G scaffold | |
| EP0690983A1 (en) | Pulsed electrochemical detection using polymer electroactive electrodes | |
| JPH05505463A (en) | Enhanced capillary zone electrophoresis method and its implementation device | |
| CN101341402B (en) | Methods and apparatus for improving the sensitivity of capillary zone electrophoresis | |
| WO1990015779A1 (en) | Device for electroactivating fluids and preparations consisting of electroactivated fluids | |
| MY139466A (en) | Apparatus and methods for detecting nucleic acid in biological samples | |
| RU2658350C1 (en) | Method for electroimobilization of antibodies | |
| Yang et al. | Repeatedly usable immobilized pH gradient in a monolithic capillary column | |
| GB2264783A (en) | Electrophoretic analysis method utilising wave effect | |
| CN102788833B (en) | Kit for detecting low-abundance and low-molecular-weight protein spectrum | |
| Paleček et al. | Ionic strength-dependent structural transition of proteins at electrode surfaces | |
| RU193055U1 (en) | UNIVERSAL DEVICE FOR ELECTROIMMUNOIMMOBILIZATION AND ELECTROCHEMICAL OXIDATION OF FUNCTIONAL SURFACES | |
| Černocká et al. | Voltammetric and chronopotentiometric protein structure-sensitive analysis | |
| Smaini et al. | Electrochemical detection and removal of mercury (II) at DNA modified carbon paste electrode | |
| CN103278370A (en) | Method sutiable for two-dimensional electrophoresis extraction and separation of total protein of rat and mouse testicular tissue sample | |
| CN104109677B (en) | Clenbuterol aptamer and electrochemical biosensor of aptamer for detecting clenbuterol | |
| CN102809498A (en) | Preparation method of low-abundance low-molecular-weight protein-rich material | |
| Melles et al. | Electroimmobilization of proinsulin C-peptide to a quartz crystal microbalance sensor chip for protein affinity purification | |
| DE60128144D1 (en) | DEVICE AND METHOD FOR SEPARATING MOLECULES AND MOTION OF FLUIDS BY ELECTROPHORESIS | |
| Al Sana et al. | Influence of antibody insertion on the electrochemical behavior of polypyrrole films by using fast QCM measurements | |
| Zhang et al. | Simultaneous determination of ten antibiotics in natural water samples by capillary electrophoresis with electrochemiluminescence detection coupled with hollow fiber-solid phase extraction |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190203 |