RU2657808C1 - Method for determining production of interferons as congenital immunity parameters - Google Patents
Method for determining production of interferons as congenital immunity parameters Download PDFInfo
- Publication number
- RU2657808C1 RU2657808C1 RU2017124353A RU2017124353A RU2657808C1 RU 2657808 C1 RU2657808 C1 RU 2657808C1 RU 2017124353 A RU2017124353 A RU 2017124353A RU 2017124353 A RU2017124353 A RU 2017124353A RU 2657808 C1 RU2657808 C1 RU 2657808C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ifn
- virus
- vero
- serum
- vsv
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к иммунологии, вирусологии, биотехнологии и лабораторной диагностике в медицине и может быть использовано для диагностики параметров врожденного иммунитета и при различных заболеваниях инфекционной (вирусной, бактериальной, грибковой) и неинфекционной (аллергической, аутоиммунной, онкологической) этиологии. Изобретение может быть также использовано для контроля активности и качества выпускаемых препаратов интерферона (ИФН), а также при скрининговых исследованиях индукторов образования ИФН различной химической природы.The invention relates to immunology, virology, biotechnology and laboratory diagnostics in medicine and can be used to diagnose the parameters of innate immunity in various diseases of infectious (viral, bacterial, fungal) and non-infectious (allergic, autoimmune, oncological) etiology. The invention can also be used to control the activity and quality of produced preparations of interferon (IFN), as well as in screening studies of inducers of the formation of IFN of various chemical nature.
Неспецифическая реактивность включает в себя систему интерферона (ИФН), состояние которой в основном характеризует врожденный иммунитет организма. В 60-80-х годах прошлого века был разработан микрометод, описанный как тестирование «интерферонового статуса» здоровых людей и пациентов с различными заболеваниями (Tilles J.G. 1968; Rubinstein S 1981; Kirchner H 1982; Doldi К 1985). Этот метод находится в постоянном усовершенствовании, т.к. актуальность в тестировании продукции ИФН клетками крови сохраняется до сегодняшних дней.Nonspecific reactivity includes the interferon system (IFN), the state of which mainly characterizes the innate immunity of the body. In the 60-80s of the last century, a micromethod was developed, described as testing the “interferon status” of healthy people and patients with various diseases (Tilles J.G. 1968; Rubinstein S 1981; Kirchner H 1982; Doldi K 1985). This method is in continuous improvement since the relevance in testing production of IFN by blood cells remains to this day.
Внедрение в медицинскую практику иммуноактивных препаратов обуславливает изучение механизмов действия этих препаратов и предусматривает определение их влияния на процессы продукции ИФН. Углубленные исследования ИФН статуса с определением отвечаемости клеток крови на иммуноактивные препараты помогут определить тактику лечения при разных формах патологии и прогнозировать исход заболевания.The introduction of immunoactive drugs into medical practice leads to the study of the mechanisms of action of these drugs and provides for the determination of their influence on the production processes of IFN. In-depth studies of IFN status with the determination of the response of blood cells to immunoactive drugs will help determine treatment tactics for various forms of pathology and predict the outcome of the disease.
Методы количественного определения биологической активности иммуноактивных препаратов (препаратов ИФН и их индукторов, иммуномодуляторов, вакцин) и оценки ИФН статуса требуют дальнейшего поиска и усовершенствования этих методик, соответственно требованиям их стандартизации для возможности использования в оказании медико-лабораторных услуг населению.Methods for the quantitative determination of the biological activity of immunoactive drugs (IFN preparations and their inducers, immunomodulators, vaccines) and assessment of IFN status require further search and improvement of these methods, in accordance with the requirements of their standardization, for use in the provision of medical and laboratory services to the population.
В существующих методах постановки ИФН статуса используются дорогостоящие чувствительные к ИФН клеточные культуры фибробластов (ФЛЭЧ, ЛЭЧ, ФЭЧ, М-19, М-22 и др.). Запасы этих культур остались не во всех музеях клеток, а пассажи начинаются только с 20 или 30-го. К сожалению, пригодный рабочий потенциал культуры клеток фибробластов эмбриона человека составляет ограниченное (6-14) количество пассажей. Для введения этих культур требуются питательные среды с добавлением высококачественной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Так как качество ЭТС варьируется от партии к партии, существует постоянная потенциальная возможность контаминации вирусами, микоплазмами, бактериями и др., что делает невозможным стандартизировать процесс введения клеточных культур.Existing methods for setting IFN status use expensive IFN-sensitive cell cultures of fibroblasts (FLECH, LEC, PEC, M-19, M-22, etc.). The stocks of these cultures were not left in all cell museums, and the passages begin only on the 20th or 30th. Unfortunately, the suitable working potential of a human embryo fibroblast cell culture is a limited (6-14) number of passages. The introduction of these cultures requires nutrient media supplemented with high-quality fetal calf serum (ETS). Since the quality of ETS varies from batch to batch, there is a constant potential for contamination with viruses, mycoplasmas, bacteria, etc., which makes it impossible to standardize the process of introducing cell cultures.
Известно решение по патенту RU 2518295, опубл. 10.06.2014: IL-1бета-связывающие антитела и их фрагменты.A known solution according to patent RU 2518295, publ. 06/10/2014: IL-1 beta-binding antibodies and their fragments.
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложено IL-1β-связывающее антитело или его IL-1β-связывающий фрагмент, включающее вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи. Указанное антитело связывается с IL-1β человека с константой диссоциации менее 1 пМ. Описаны варианты антитела. Раскрыты соответствующие кодирующие нуклеиновые кислоты (НК), а также: вектор для переноса НК в клетку-хозяина, клетка-хозяин для продуцирования кодируемого полипептида. Описано применение антитела для получения других форматов указанного антитела: «верблюдизированного», «VHH-содержащего антитела», «нанотела». Раскрыта фармацевтическая композиция для лечения или профилактики связанного с IL-1β заболевания или состояния у млекопитающего на основе антитела, а также способ лечения или профилактики связанного с IL-1β заболевания или состояния у млекопитающего. Использование изобретения обеспечивает новые антитела, специфичные к IL-1β, с повышенной аффинностью к IL-1β, что может найти применение в медицине для профилактитки, лечения заболеваний, опосредованных активностью к IL-1β.The invention relates to immunology and biotechnology. An IL-1β-binding antibody or an IL-1β-binding fragment thereof comprising a variable region of a heavy chain and a light chain is provided. The indicated antibody binds to human IL-1β with a dissociation constant of less than 1 pM. Variants of an antibody are described. Relevant coding nucleic acids (NKs) are disclosed, as well as: a vector for transferring NKs to a host cell, a host cell to produce an encoded polypeptide. Describes the use of antibodies to obtain other formats of the specified antibodies: "camelid", "VHH-containing antibodies", "Nanobodies". A pharmaceutical composition is disclosed for treating or preventing an IL-1β-related disease or condition in a mammal based on an antibody, as well as a method for treating or preventing an IL-1β-related disease or condition in a mammal. The use of the invention provides new antibodies specific for IL-1β, with increased affinity for IL-1β, which can be used in medicine for prophylaxis, treatment of diseases mediated by activity against IL-1β.
Изобретение дополнительно относится к клетке (например, выделенной или очищенной клетке), содержащей нуклеиновую кислоту или вектор настоящего изобретения. Данная клетка может представлять собой клетку любого типа, способную трансформироваться нуклеиновой кислотой или вектором настоящего изобретения таким образом, чтобы она могла продуцировать кодируемый ими полипептид. Данная клетка предпочтительно является клеткой млекопитающего, такого как человек, и более предпочтительно является клеткой гибридомы, эмбриональной стволовой клеткой или оплодотворенной яйцеклеткой.The invention further relates to a cell (eg, an isolated or purified cell) comprising a nucleic acid or a vector of the present invention. This cell may be any type of cell capable of being transformed by a nucleic acid or a vector of the present invention so that it can produce the polypeptide encoded by them. The cell is preferably a mammalian cell, such as a human, and more preferably a hybridoma cell, an embryonic stem cell, or a fertilized egg.
Сайт инициации репликации выбирают на основе типа клетки-хозяина, используемой для экспрессии. В качестве примера, сайт инициации репликации из плазмиды pBR322 (Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass) применим для большинства грамотрицательных бактерий, тогда как различные сайты инициации репликации из SV40, полиомавируса, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (VSV) или папилломавирусов (таких как HPV или BPV) могут быть использованы для клонирования векторов в клетках млекопитающих.The replication initiation site is selected based on the type of host cell used for expression. As an example, the replication initiation site from plasmid pBR322 (Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, Mass) is applicable to most gram-negative bacteria, while the different replication initiation sites are from SV40, polyomavirus, adenovirus, and vesicular stomatitis virus (VSV ) or papillomaviruses (such as HPV or BPV) can be used to clone vectors in mammalian cells.
Наиболее близким аналогом является решение по патенту RU 2335535, C12N 1/21, опубл. 10.10.2008, бюл. №28, в котором описан способ приготовления композиций активного цитокина-интерферона-гамма, ускоряющим иммунную реакцию. В способе использовали клетки бычьей почки, инфицированные вирусом VSV. Клетки Pseudomonas использовали как биофабрику для производства IFN-γ, способную продуцировать до 40% или больше интерферона от общего клеточного белка. Технической проблемой прототипа и иных известных способов является использование дорогостоящей культуры клеток фибробластов эмбриона человека с ограниченной способностью к пассированию.The closest analogue is the solution according to patent RU 2335535, C12N 1/21, publ. 10/10/2008, bull. No. 28, which describes a method for preparing active cytokine-interferon-gamma compositions accelerating the immune response. The method used bovine kidney cells infected with the VSV virus. Pseudomonas cells were used as a biofactory for the production of IFN-γ, capable of producing up to 40% or more of interferon from the total cellular protein. The technical problem of the prototype and other known methods is the use of an expensive cell culture of human embryo fibroblasts with a limited ability to passivation.
Задачей изобретения является замена культуры клеток и усовершенствование самой методики до возможности использования в массовых исследованиях.The objective of the invention is to replace the cell culture and improve the technique itself to the possibility of use in mass research.
Технический результат: полная замена прикрепляемой культуры клеток фибробластов эмбриона человека (ФЛЭЧ, ЛЭЧ, ФЭЧ, М-19, М-22 и др.), требующей обязательного присутствия эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), на адаптированную бессывороточную линию клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero). Техническим результатом использования заявленного способа также является возможность проверить состояние неспецифической реактивности организма до иммунокоррекции; проводить научно обоснованную тактику персонифицированного применения в клинической практике иммуноактивных препаратов, таких как индукторы интерферонов, иммуномодуляторы; контролировать состояние врожденного иммунитета в динамике иммунокоррекции.EFFECT: full replacement of the attached culture of human embryo fibroblast cells (PHEC, LEC, PEC, M-19, M-22, etc.), requiring the obligatory presence of fetal calf serum (ETS), with an adapted serum-free green monkey kidney tubule epithelial cell line (Vero). The technical result of using the claimed method is also the ability to check the state of nonspecific reactivity of the body before immunocorrection; conduct scientifically based tactics of personified use in clinical practice of immunoactive drugs, such as interferon inducers, immunomodulators; monitor the state of innate immunity in the dynamics of immunocorrection.
Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета, характеризующийся использованием культуры клеток млекопитающего, чувствительной к интерферону, инфицированной вирусом везикулярного стоматита VSV, отличающийся тем, что в качестве культуры клеток млекопитающего используют культуру клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero), производят количественное определение продукции интерферонов I и II типов, основанное на оценке 50% защиты монослоя бессывороточной линии клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero) от индуцированного тест-вирусом везикулярного стоматита (VSV) цитодеструктивного эффекта, способ характеризуется введением проб индивидуума в лунки с чувствительной к ИФН клеточной культуре Vero и последующей обработкой тест-вирусом VSV.The specified technical result is achieved due to the fact that the claimed method for determining the production of interferons as parameters of innate immunity, characterized by using a mammalian cell culture sensitive to interferon infected with vesicular stomatitis virus VSV, characterized in that a culture of renal tubule epithelium cells is used as a mammalian cell culture green monkey (Vero), quantify the production of interferons of types I and II, based on an assessment of 50% to protect the monolayer of the serum-free green monkey kidney tubule epithelial cell line (Vero) from the test virus-induced vesicular stomatitis (VSV) cyto-destructive effect, the method is characterized by introducing individual samples into wells with IFN-sensitive Vero cell culture and subsequent treatment with the VSV test virus.
Для определения ИФН-продуцирующей способности лейкоцитов асептически берут кровь из локтевой вены в стерильную пробирку с гепарином.To determine the IFN-producing ability of leukocytes, blood is aseptically taken from the ulnar vein into a sterile tube with heparin.
Для синтеза ИФН I и II типа в 160 мкл среды RPMI-1640 вносят 20 мкл NDV (в дозе 108 EID50 в 1 мл аллантоисной жидкости) и в 160 мкл среды RPMI-1640 вносят 20 мкл ФГА (в концентрации 100 мкг/мл) соответственно, затем во все лунки добавляют по 20 мкл цельной гепаринизированной крови, а содержимое каждой лунки перемешивают; планшеты инкубируют в термостате при 37°C 24-48 ч в атмосфере 5% CO2; после инкубации супернатанты отбирают в стерильные планшеты, а оставшуюся кровь центрифугируют для получения сывороточного ИФН; отобранные супернатанты и сыворотку/плазму крови хранят в холодильнике до этапа титрования.For the synthesis of IFN type I and type II, 20 μl of NDV (at a dose of 10 8 EID 50 in 1 ml of allantoic fluid) is added to 160 μl of RPMI-1640 medium and 20 μl of PHA (at a concentration of 100 μg / ml) is added to 160 μl of RPMI-1640 medium ), respectively, then 20 μl of whole heparinized blood is added to all wells, and the contents of each well are mixed; the plates are incubated in a thermostat at 37 ° C for 24-48 hours in an atmosphere of 5% CO 2 ; after incubation, supernatants are collected in sterile plates, and the remaining blood is centrifuged to obtain serum IFN; the selected supernatants and serum / plasma are stored in a refrigerator until the titration step.
Определение функциональной активности ИФН проводят путем титрования в луночных плоскодонных планшетах на монослое клеток Vero, в первую лунку ряда вносят 100 мкл образца/супернатанта с последующими 2-кратными разведениями, для ИФН I типа первое разведение 1 к 10.The determination of the functional activity of IFN is carried out by titration in flat-bottom well plates on a mono-layer of Vero cells, 100 μl of sample / supernatant are added to the first well of the series, followed by 2-fold dilutions; for IFN type I, the first dilution is 1 to 10.
Условием теста определения ИФН статуса является постановка контроля дозы вируса (положительный контроль) и контроля клеток (отрицательный контроль).A test condition for determining IFN status is the setting of virus dose control (positive control) and cell control (negative control).
В качестве индикаторного тест-вируса используют вирус VSV, который в день титрования проб 10-кратно титруется для подтверждения активности и выявления рабочего титра. Исходя из полученного результата титрования тест-вируса, готовят разведение вируса в требуемом объеме, содержащем 1-10 ЦПД (цитопатогенных доз), при этом по 100 мкл рабочего разведения вируса добавляют в каждую лунку планшета, кроме контроля клеток, и еще раз ставят контроль дозы вируса; на следующие сутки при положительном контроле дозы вируса проводят визуальный учет результатов по ЦПД тест-вируса, используя инвертированный микроскоп; за титр ИФН принимают его максимальное разведение, в котором наблюдается 50% защита клеток монослоя от цитопатогенного действия тест-вируса.As an indicator test virus, the VSV virus is used, which is titrated 10 times on the day of titration of samples to confirm activity and identify the working titer. Based on the obtained result of the titration of the test virus, virus dilution is prepared in the required volume containing 1-10 CPD (cytopathogenic doses), while 100 μl of the working virus dilution is added to each well of the plate, in addition to cell control, and dose control is set again. a virus; the next day, with a positive control of the dose of the virus, a visual recording of the results of the test virus CPD is carried out using an inverted microscope; for the titer of IFN take its maximum dilution, in which there is 50% protection of the cells of the monolayer from the cytopathogenic effect of the test virus.
За средние показатели ИФН в норме у взрослых определяют значения для ИФН I типа от 640 Ед/мл, ИФН II типа - от 64 Ед/мл, сывороточного ИФН<2-8 Ед/мл, а у детей до 1 года повышенные значения уровня ИФН в сыворотке крови считают физиологической возрастной нормой, а также 2-кратно сниженные показатели продукции ИФН I/II типов по сравнению с показателями нормы взрослых.For average IFN values, normal in adults determine the values for IFN type I from 640 units / ml, type II IFN from 64 units / ml, serum IFN <2-8 units / ml, and in children under 1 year of age, increased IFN levels in blood serum is considered a physiological age norm, as well as 2-fold reduced production rates of IFN I / II types compared with adult rates.
Постановку реакции отвечаемости лейкоцитов к иммуноактивным препаратам проводят аналогично описанному способу определения продукции ИФН, только на этапе предобработки в 140 мкл RPMI-1640 дополнительно вносят 20 мкл препарата в концентрации, подобранной опытным путем; посредством эмпирического скрининга подбора разведений препаратов от 100 до 10000 раз определяют рабочий диапазон разведения каждого препарата; оценку действия препарата in vitro проводят в сравнении с величиной ИФН I или II типа, и по этому сравнению судят об отвечаемости лейкоцитов крови человека и проводят эффективный выбор для профилактики и лечения.The reaction of the response of leukocytes to immunoactive drugs is carried out similarly to the described method for determining the production of IFN, only at the pre-treatment stage in 140 μl of RPMI-1640 additionally add 20 μl of the drug in a concentration selected experimentally; through empirical screening of the selection of dilutions of drugs from 100 to 10,000 times determine the working range of dilution of each drug; evaluation of the in vitro effect of the drug is carried out in comparison with the value of IFN type I or II, and this comparison is used to judge the responsiveness of human blood leukocytes and make an effective choice for prevention and treatment.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Для определения ИФН-продуцирующей способности лейкоцитов асептически берется кровь из локтевой вены в стерильную пробирку с гепарином.To determine the IFN-producing ability of leukocytes, blood is taken aseptically from the cubital vein into a sterile tube with heparin.
Пробоподготовка проводится с использованием стерильных 96-луночных круглодонных планшетах.Sample preparation is performed using sterile 96-well round-bottom plates.
Для синтеза ИФН I и II типа в 160 мкл среды RPMI-1640 вносится 20 мкл NDV (в дозе 108 EID50 в 1 мл аллантоисной жидкости) и в 160 мкл среды RPMI-1640 вносится 20 мкл ФГА (в концентрации 100 мкг/мл) соответственно. Затем во все лунки добавляется по 20 мкл цельной гепаринизированной крови. Содержимое каждой лунки хорошо перемешивается. Планшеты инкубируются в термостате при 37°C 24-48 ч в атмосфере 5% CO2. После инкубации супернатанты отбираются в стерильные планшеты. Оставшаяся кровь центрифугируется для получения сывороточного ИФН. Отобранные супернатанты и сыворотка/плазма крови хранятся в холодильнике до этапа титрования.For the synthesis of IFN type I and type II, 20 μl of NDV (at a dose of 10 8 EID 50 in 1 ml of allantoic fluid) is added to 160 μl of RPMI-1640 medium and 20 μl of PHA (at a concentration of 100 μg / ml) is added to 160 μl of RPMI-1640 medium ) respectively. Then, 20 μl of whole heparinized blood is added to all wells. The contents of each well mix well. The plates are incubated in a thermostat at 37 ° C for 24-48 hours in an atmosphere of 5% CO 2 . After incubation, supernatants are collected in sterile plates. The remaining blood is centrifuged to obtain serum IFN. The selected supernatants and serum / plasma are stored in a refrigerator until the titration step.
Определение функциональной активности ИФН проводится путем титрования в 96-луночных плоскодонных планшетах на монослое клеток Vero. В первую лунку ряда вносят 100 мкл образца/супернатанта с последующими 2-кратными разведениями. Для ИФН I типа первое разведение 1 к 10.The determination of the functional activity of IFN is carried out by titration in 96-well flat-bottom plates on a monolayer of Vero cells. 100 μl of sample / supernatant was added to the first well of the row, followed by 2-fold dilutions. For IFN type I, the first dilution is 1 to 10.
Обязательным условием теста определения ИФН статуса является постановка контроля дозы вируса (положительный контроль) и контроля клеток (отрицательный контроль). В качестве индикаторного тест-вируса используется вирус VSV, который в день титрования проб 10-кратно титруется для подтверждения активности и выявления рабочего титра. Исходя из полученного результата титрования тест-вируса, готовится разведение вируса в требуемом объеме, содержащем 1-10 ЦПД (цитопатогенных доз). По 100 мкл рабочего разведения вируса добавляется в каждую лунку планшета, кроме контроля клеток, и еще раз ставится контроль дозы вируса. На следующие сутки при положительном контроле дозы вируса проводится визуальный учет результатов по ЦПД тест-вируса, используя инвертированный микроскоп. При проведении массовых исследований возможна спектрофотометрическая оценка результатов после окрашивания. За титр ИФН принимается его максимальное разведение, в котором наблюдается 50% защита клеток монослоя от цитопатогенного действия тест-вируса.A prerequisite for the test for determining IFN status is the establishment of a dose control of the virus (positive control) and cell control (negative control). VSV virus is used as an indicator test virus, which is titrated 10 times on the day of titration of samples to confirm activity and detect a working titer. Based on the result of the titration of the test virus, the virus is being diluted in the required volume containing 1-10 CPD (cytopathogenic doses). 100 μl of the working dilution of the virus is added to each well of the plate, except for the control of the cells, and once again the virus dose control is set. The next day, with a positive control of the dose of the virus, a visual recording of the results of the test virus CPD is carried out using an inverted microscope. When conducting mass studies, spectrophotometric evaluation of the results after staining is possible. For the titer of IFN, its maximum dilution is taken, in which there is 50% protection of the monolayer cells from the cytopathogenic effect of the test virus.
Показатели нормы продукции ИФНIFN production rate indicators
За средние показатели ИФН в норме у взрослых определены значения для ИФН I типа от 640 Ед/мл, ИФН II типа - от 64 Ед/мл, сывороточного ИФН<2-8 Ед/мл. В отношении детей до 1 года следует отметить повышенные значения уровня ИФН в сыворотке крови, что является физиологической возрастной нормой, а также 2-кратно сниженные показатели продукции ИФН I/II типов по сравнению с показателями нормы взрослых.For average IFN values in normal adults, the values for IFN type I are from 640 U / ml, IFN type II - from 64 units / ml, serum IFN <2-8 units / ml. For children under 1 year of age, increased serum IFN levels should be noted, which is the physiological age norm, as well as 2-fold decreased indicators of IFN I / II types compared to adults.
Определение индивидуальной отвечаемости клеток к препаратамDetermination of individual cell response to drugs
Внедрение в медицинскую практику иммуноактивных препаратов обуславливает изучение механизмов действия этих препаратов и предусматривает определение их влияния на процессы продукции ИФН лейкоцитами крови человека.The introduction of immunoactive drugs into medical practice leads to the study of the mechanisms of action of these drugs and provides for the determination of their influence on the processes of production of IFN by human blood leukocytes.
Поэтому дополнением к определению продукции ИФН является разработанный метод определения индивидуальной отвечаемости клеток крови конкретного пациента к иммуноактивным препаратам. Отвечаемость клеток оценивают по нарастанию титров ИФН I или II типов после воздействия указанных препаратов на лейкоциты периферической крови in vitro. Клиническое наблюдение и лабораторное исследование продукции ИФН в динамике помогут оценить правильность тактики лечения и прогнозировать исход заболевания.Therefore, in addition to determining the production of IFN is a developed method for determining the individual response of blood cells of a particular patient to immunoactive drugs. Responsibility of cells is assessed by the increase in titers of IFN type I or II after exposure of these drugs to peripheral blood leukocytes in vitro. Clinical observation and laboratory research of IFN products in dynamics will help to assess the correctness of treatment tactics and predict the outcome of the disease.
Постановка реакции отвечаемости лейкоцитов к иммуноактивным препаратам проводится аналогично описанному способу определения продукции ИФН, только на этапе предобработки в 140 мкл RPMI-1640 дополнительно вносится 20 мкл препарата в концентрации, подобранной опытным путем. Эмпирический скрининг подбора разведений препаратов, проведенный нами, от 100 до 10000 раз, позволил определить рабочий диапазон разведения каждого препарата. Оценка действия препарата in vitro проводится в сравнении с величиной ИФН I или II типа, что позволяет судить об отвечаемости лейкоцитов крови человека и проводить эффективный выбор для профилактики и лечения. К иммуноактивным препаратам относятся препараты интерферона: -альфа: Виферон, Гриппферон, Интрон, Реальдирон, Реаферон, Роферон и др.; -бета: Бетаферон, Генфаксон, Ребиф, Ронбетал, Синновекс и др.; -гамма: Ингарон. Все эти препараты ИФН используются для ограниченного количества показаний по описанным в инструкциях схемах: вирусные гепатиты, лимфомы, хронический грануломатоз, рассеянный склероз, саркома Калоши, генитальные кондиломы и др. Это все тяжелые хронические и рецидивирующие заболевания вирусной, онкогенной и аутоиммунной природы, при которых в больших клинических исследованиях доказана терапевтическая эффективность длительного поддержания уровня ИФН в организме. В отношении препаратов ИФН следует отметить, что в реакции in vitro с клетками крови человека на них всегда имеется высокая отвечаемость клеток, поэтому нет необходимости в постановке реакции отвечаемости на эти препараты и их назначение идет по клиническим показаниям.The reaction of the response of leukocytes to immunoactive drugs is carried out similarly to the described method for determining the production of IFN, only at the pretreatment stage in 140 μl of RPMI-1640 an additional 20 μl of the drug is added in a concentration selected experimentally. The empirical screening of the selection of dilutions of drugs, conducted by us, from 100 to 10,000 times, allowed us to determine the working range of dilution of each drug. Evaluation of the effect of the drug in vitro is carried out in comparison with the value of IFN type I or II, which allows us to judge the responsiveness of human blood leukocytes and make an effective choice for prevention and treatment. Immunoactive drugs include interferon preparations: -alpha: Viferon, Grippferon, Intron, Realdiron, Reaferon, Roferon and others; -beta: Betaferon, Genfaxon, Rebif, Ronbetal, Sinnovex and others; -gamma: Ingaron. All these IFN drugs are used for a limited number of indications according to the schemes described in the instructions: viral hepatitis, lymphomas, chronic granulomatosis, multiple sclerosis, Kaloshi sarcoma, genital warts, etc. These are all serious chronic and recurrent diseases of a viral, oncogenic and autoimmune nature, in which in large clinical trials, the therapeutic efficacy of prolonged maintenance of IFN levels in the body has been proven. With respect to IFN preparations, it should be noted that in vitro reactions with human blood cells there is always a high cell response, therefore, there is no need for a response response to these drugs and their purpose is according to clinical indications.
Индукторы ИФН: аллокин-альфа, амиксин, кагоцел, неовир, ридостин, циклоферон и др. Иммуномодуляторы: арбидол, галавит, глутоксим, изопринозин, иммунал, иммуномакс, имунорикс, имунофан, ликопид, панавир, полиоксидоний, тактивин, тимоген и др.IFN inducers: allokin-alpha, amixin, kagocel, neovir, ridostin, cycloferon, etc. Immunomodulators: arbidol, galavit, glutoxim, isoprinosine, immunal, immunomax, immunorix, imunofan, lycopid, panavir, tiocinone, drindin, tioxinone.
Следует отметить, что к иммуноактивным препаратам (индукторам ИФН, иммуномодуляторам) имеется разная отвечаемость клеток периферической крови. Оценка выявленных изменений может служить ориентиром в диагностике, лечении и прогнозе заболеваний как вирусной, так и невирусной этиологии.It should be noted that there are different responses of peripheral blood cells to immunoactive drugs (IFN inducers, immunomodulators). Evaluation of the revealed changes can serve as a guide in the diagnosis, treatment and prognosis of diseases of both viral and non-viral etiology.
Показания, при которых необходимо исследование продукции ИФН:Indications for which it is necessary to study the production of IFN:
- вирусные инфекции: острые и хронические формы;- viral infections: acute and chronic forms;
- аллергические и аутоиммунные заболевания;- allergic and autoimmune diseases;
- рецидивирующие оппортунистические инфекции;- recurrent opportunistic infections;
- часто болеющие дети;- often sick children;
- врожденные и приобретенные дефекты системы ИФН;- congenital and acquired defects of the IFN system;
- клинические испытания препаратов ИФН, индукторов ИФН и иммуномодуляторов;- clinical trials of IFN preparations, IFN inducers and immunomodulators;
- клиническое применение вышеназванных препаратов и оценка эффективности терапии;- clinical use of the above drugs and assessment of the effectiveness of therapy;
- разработка индивидуальных схем лечения препаратами ИФН, его индукторами и другими иммуноактивными препаратами.- development of individual treatment regimens with IFN preparations, its inducers and other immunoactive drugs.
Снижение продукции ИФН I и II типов, которое может быть и причиной, и следствием острых и хронических инфекционных (вирусных, бактериальных, грибковых) и неинфекционных (аллергических, аутоиммунных) заболеваний, свидетельствует о врожденном или приобретенном дефиците/недостаточности системы ИФН. Следует заметить, что результаты исследования продукции ИФН необходимо рассматривать в комплексе с остальными лабораторными и клинико-анамнестическими данными. Исследование параметров продукции ИФН используют для подбора и оценки эффективности терапии при использовании препаратов экзогенного ИФН, индукторов ИФН и иммуномодуляторов. По мнению Хаитова P.M. (2003), основным критерием для назначения препаратов иммуномодуляторов является клиническая картина заболевания, проявляющаяся хроническим инфекционно-воспалительным процессом, трудно поддающимся адекватному антиинфекционному лечению. Это положение можно отметить для всех иммуноактивных препаратов.A decrease in the production of IFN types I and II, which can be both a cause and a consequence of acute and chronic infectious (viral, bacterial, fungal) and non-infectious (allergic, autoimmune) diseases, indicates a congenital or acquired deficiency / insufficiency of the IFN system. It should be noted that the results of a study of IFN products must be considered in conjunction with other laboratory and clinical-anamnestic data. The study of the parameters of production of IFN is used to select and evaluate the effectiveness of therapy when using exogenous IFN preparations, IFN inducers and immunomodulators. According to Khaitov P.M. (2003), the main criterion for the administration of immunomodulatory drugs is the clinical picture of the disease, which manifests itself as a chronic infectious and inflammatory process that is difficult to adequately anti-infectious treatment. This position can be noted for all immunoactive drugs.
В результате многочисленных дублирований постановки ИФН статуса на разных культурах клеток нами было выявлено, что показатели продукции ИФН были одинаковыми как на культуре клеток фибробластов эмбриона человека, так и на культуре клеток почки зеленой мартышки Vero, культивируемой на сывороточных и бессывороточных питательных средах. Нами предложена эпителиальная культура клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, адаптированная к бессывороточной питательной среде. Преимущество использования этой культуры очевидно. Бессывороточные среды упрощают очистку и дальнейшую работу с клетками, позволяют точно оценивать клеточные функции (все процессы обусловлены свойствами клеток, а не побочными эффектами сыворотки), повышают воспроизводимость результатов. Это дает возможность стандартизировать процесс ведения клеточной культуры, снизить себестоимость. И так как Vero, в отличие от других клеточных культур, не продуцирует свой эндогенный ИФН, то в самой постановке не требуется этапа инактивации вируса NDV, что существенно сокращает время реакции.As a result of numerous duplications of IFN status setting on different cell cultures, we found that IFN production indices were the same both on the human embryo fibroblast cell culture and on the Vero green monkey kidney cell culture, cultured on serum and serum-free culture media. We proposed an epithelial cell culture of the kidney of the African green monkey Vero, adapted to serum-free culture medium. The advantage of using this culture is obvious. Serum-free media simplify cleaning and further work with cells, make it possible to accurately assess cellular functions (all processes are determined by the properties of cells, and not by-effects of serum), and increase reproducibility of results. This makes it possible to standardize the process of maintaining a cell culture, to reduce the cost. And since Vero, unlike other cell cultures, does not produce its endogenous IFN, the formulation itself does not require the stage of inactivation of the NDV virus, which significantly reduces the reaction time.
Выявленная чувствительность клеток Vero, культивируемых на бессывороточных средах, к ИФН I и II типов, сохраняется при неограниченной способности к пассированию. Нами предложена замена дорогостоящей линии клеток фибробластов эмбриона человека на близкородственную культуру клеток Vero (почки зеленой африканской мартышки), адаптированной к бессывороточной питательной среде.The revealed sensitivity of Vero cells cultured on serum-free media to IFN types I and II is preserved with unlimited passivation ability. We have proposed the replacement of an expensive human embryo fibroblast cell line with a closely related Vero cell culture (green African monkey kidney) adapted to a serum-free culture medium.
Благодаря использованию бессывороточной клеточной культуры с неограниченным количеством пассажей, становится возможным разрешить проблему стандартизации условий ведения культуры клеток, повысить воспроизводимость результатов. Так как клетки Vero не вырабатывают свой эндогенный ИФН, то это дает возможность существенного сокращения сроков проведения метода, за счет выпадения этапа инактивации вируса NDV.Thanks to the use of serum-free cell culture with an unlimited number of passages, it becomes possible to solve the problem of standardizing the conditions for maintaining cell culture and to increase the reproducibility of the results. Since Vero cells do not produce their endogenous IFN, this makes it possible to significantly reduce the time of the method, due to the loss of the stage of inactivation of the NDV virus.
Нами подобрана оптимально-адекватная доза индикаторного тест-вируса 1-10 ЦПД для выявления низких титров продукции ИФН лейкоцитами крови человека, в отличие от 100 ЦПД, заявленных в других методиках. Доза 100 ТЦД50 обычно используется для выявления противовирусной активности высокодозных препаратов ИФН (более 1 млн МЕ/мл). Нами определены рабочие диапазоны дозы каждого препарата путем эмпирического скрининга подбора разведений.We have selected the optimal adequate dose of the indicator test virus 1-10 CPD to detect low titers of IFN production by human blood leukocytes, in contrast to the 100 CPPs declared in other methods. A dose of 100 TCD 50 is usually used to detect the antiviral activity of high-dose IFN drugs (more than 1 million IU / ml). We determined the working dose ranges of each drug by empirical screening of dilution selection.
Заявленный способ определения продукции интерферонов как параметров врожденного иммунитета является важным критерием состояния организма в норме и при различных заболеваниях инфекционной (вирусной, бактериальной, грибковой) и неинфекционной (аллергической, аутоиммунной, онкологической) этиологии; дает возможность использования в оказании медико-лабораторных услуг населению, сокращая сроки исследования.The claimed method for determining the production of interferons as parameters of innate immunity is an important criterion for the state of the body in the norm and for various diseases of infectious (viral, bacterial, fungal) and non-infectious (allergic, autoimmune, oncological) etiology; makes it possible to use in the provision of medical and laboratory services to the population, reducing the duration of the study.
К тому же, заявленное нами изобретение может быть использовано для контроля активности и качества выпускаемых препаратов ИФН, а также при скрининговых исследованиях индукторов образования ИФН различной химической природы. В отличие от предыдущих методов впервые предложена замена дорогостоящей культуры клеток фибробластов эмбриона человека на менее затратную, с неограниченной способностью к пассированию, культуру клеток эпителия почечных канальцев зеленой мартышки (Vero), адаптированную к бессывороточной питательной среде. Это позволяет стандартизировать процесс ведения культуры и дает возможность применения метода в оказании массовых медико-лабораторных услуг населению.In addition, the invention claimed by us can be used to control the activity and quality of produced preparations of IFN, as well as in screening studies of inducers of the formation of IFN of various chemical nature. In contrast to previous methods, the replacement of an expensive human embryo fibroblast cell culture with a less expensive, with unlimited passaging ability, green monkey kidney tubule epithelial cell culture (Vero) adapted to serum-free culture medium was first proposed. This allows you to standardize the process of conducting culture and makes it possible to use the method in providing mass medical and laboratory services to the population.
Исследование продукции интерферона в комплексе с другими лабораторными и клинико-анамнестическими данными помогут оценить правильность тактики лечения и прогнозировать исход заболевания.A study of interferon production in combination with other laboratory and clinical and anamnestic data will help to assess the correctness of treatment tactics and predict the outcome of the disease.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017124353A RU2657808C1 (en) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Method for determining production of interferons as congenital immunity parameters |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017124353A RU2657808C1 (en) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Method for determining production of interferons as congenital immunity parameters |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2657808C1 true RU2657808C1 (en) | 2018-06-15 |
Family
ID=62620205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017124353A RU2657808C1 (en) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | Method for determining production of interferons as congenital immunity parameters |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2657808C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116219078A (en) * | 2023-05-08 | 2023-06-06 | 上海惠盾因泰生物科技有限公司 | IL-29 biological activity determination method |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2129275C1 (en) * | 1995-07-06 | 1999-04-20 | Научно-исследовательский институт детских инфекций | Method of determining interferon in infant blood |
-
2017
- 2017-07-10 RU RU2017124353A patent/RU2657808C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2129275C1 (en) * | 1995-07-06 | 1999-04-20 | Научно-исследовательский институт детских инфекций | Method of determining interferon in infant blood |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| В.В. Малиновская и др. Интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции и его коррекция препаратом рекомбинантного интерферона-α2b (Ви фероном) / Российский Аллергологический Журнал, 2008, N6, стр. 71-78. * |
| ОФС.1.7.2.0002.15. Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток. Введена 01.01.2016. * |
| ОФС.1.7.2.0002.15. Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток. Введена 01.01.2016. В.В. Малиновская и др. Интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции и его коррекция препаратом рекомбинантного интерферона-α2b (Ви фероном) / Российский Аллергологический Журнал, 2008, N6, стр. 71-78. Т.П.Оспельникова и др. Противовирусная активность препаратов интерферона бета 1а / Вопросы вирусологии, 2015, N6, стр. 24-28. * |
| Т.П.Оспельникова и др. Противовирусная активность препаратов интерферона бета 1а / Вопросы вирусологии, 2015, N6, стр. 24-28. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116219078A (en) * | 2023-05-08 | 2023-06-06 | 上海惠盾因泰生物科技有限公司 | IL-29 biological activity determination method |
| CN116219078B (en) * | 2023-05-08 | 2023-07-11 | 上海惠盾因泰生物科技有限公司 | IL-29 biological activity determination method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Munro et al. | Cytomegalovirus retinitis in HIV and non-HIV individuals | |
| Wang et al. | Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system | |
| Fitzgerald-Bocarsly et al. | Plasmacytoid dendritic cells and type I IFN: 50 years of convergent history | |
| Shinozawa et al. | Recapitulation of clinical individual susceptibility to drug-induced QT prolongation in healthy subjects using iPSC-derived cardiomyocytes | |
| Korpi-Steiner et al. | Human rhinovirus induces robust IP-10 release by monocytic cells, which is independent of viral replication but linked to type I interferon receptor ligation and STAT1 activation | |
| Ensoli et al. | Inflammatory cytokines and HIV-1-associated neurodegeneration: oncostatin-M produced by mononuclear cells from HIV-1-infected individuals induces apoptosis of primary neurons | |
| Osman et al. | M-CSF inhibits anti–HIV-1 activity of IL-32, but they enhance M2-like phenotypes of macrophages | |
| Singal et al. | Absence of Detectable HL—A Antigens on Cultured Fibroblasts in Progeria | |
| Achim et al. | Inflammation in AIDS and the role of the macrophage in brain pathology | |
| Wang et al. | Proteomic modeling for HIV-1 infected microglia-astrocyte crosstalk | |
| Els et al. | Psychiatric co-morbidity in South African HIV/AIDS patients | |
| Wang et al. | Human airway lineages derived from pluripotent stem cells reveal the epithelial responses to SARS-CoV-2 infection | |
| RU2657808C1 (en) | Method for determining production of interferons as congenital immunity parameters | |
| Potula et al. | Association of platelet-derived growth factor-B chain with simian human immunodeficiency virus encephalitis | |
| Danave et al. | Feline immunodeficiency virus decreases cell-cell communication and mitochondrial membrane potential | |
| JP5373610B2 (en) | Method for measuring ligand-receptor binding inhibitory activity | |
| Schuenke et al. | Human microglial cell isolation from adult autopsy brain: brain pH, regional variation, and infection with human immunodeficiency virus type 1 | |
| Ahsan et al. | Polyomaviruses: an overview | |
| Lumngwena et al. | HIV-1 subtype C transmitted founders modulate dendritic cell inflammatory responses | |
| Martinat et al. | Theiler's virus infection of primary cultures of bone marrow-derived monocytes/macrophages | |
| Kurstak | Psychiatry and biological factors | |
| CN115181816B (en) | Detection method for virus titer in ultra-low virus titer system and application thereof | |
| RU2626832C1 (en) | Method for neutralising antibodies determination in blood serum of patients with multiple sclerosis, treated with interferon-beta drugs | |
| Tsai et al. | Absence of the lectin-like domain of thrombomodulin reduces HSV-1 lethality of mice with increased microglia responses | |
| US11104915B2 (en) | Viral vector assay and vector |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200711 |