RU2657433C1 - Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием - Google Patents

Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием Download PDF

Info

Publication number
RU2657433C1
RU2657433C1 RU2017112833A RU2017112833A RU2657433C1 RU 2657433 C1 RU2657433 C1 RU 2657433C1 RU 2017112833 A RU2017112833 A RU 2017112833A RU 2017112833 A RU2017112833 A RU 2017112833A RU 2657433 C1 RU2657433 C1 RU 2657433C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
trophoblast
total
miscarriage
trophoblast cells
Prior art date
Application number
RU2017112833A
Other languages
English (en)
Inventor
Дмитрий Игоревич Соколов
Валентина Анатольевна Михайлова
Алана Олеговна Агнаева
Олеся Николаевна Беспалова
Александр Мкртичевич Гзгзян
Лариса Павловна Вязьмина
Сергей Алексеевич Сельков
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта" filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта"
Priority to RU2017112833A priority Critical patent/RU2657433C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2657433C1 publication Critical patent/RU2657433C1/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к репродуктивной медицине, и может быть использовано для оценки риска невынашивания беременности. Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием, отличающийся тем, что у пациентки определяют цитотоксическую активность NK-клеток периферической крови в секреторной фазе менструального цикла в отношении клеток трофобласта линии Jeg-3 по формуле: ЦЭпац=СЦЭпац-СБГэксп+оБГ, где ЦЭпац - цитотоксическая активность NK-клеток у пациентки, %; СЦЭпац - средняя цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта; СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте; оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта, где: СБГэксп={(Хн/Xобщ)1+(Хн/Хобщ)2+…+(Хн/Хобщ)n}×100%/n, где Хн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; Хобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров; n - количество повторов; СЦЭпац={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+…+(Yн/Yобщ)n}×100%/n, где Yн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови в каждой лунке; Yобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови; n - количество повторов. Если значение цитотоксической активности NK-клеток у женщины с привычным невынашиванием превышает предварительно определенное значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла, оценивают высокий риск невынашивания беременности. Способ расширяет арсенал средств и позволяет дать иммунологическую оценку риска невынашивания беременности. 2 пр., 4 ил.

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к репродуктивной медицине, и может быть использовано для оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием.
Известен способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием, при котором определяют содержание в сыворотке крови волчаночного антикоагулянта, антител к кардиолипину и к фосфатидилсерину (Jaslow C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. - 2010. - Vol. 93. - 1234-1243).
Недостаток способа состоит в том, что только у 40% женщин с привычным невынашиванием беременности выявляются изменения, выходящие за рамки нормальных значений (Jaslow C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. - 2010. - Vol. 93. - 1234-1243). У 60% женщин с привычным невынашиванием беременности уточнить причины развития заболевания не удается (Jaslow C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. - 2010. - Vol. 93. - 1234-1243). Другой недостаток способа состоит в том, что указанные параметры не позволяют оценить функциональные взаимодействия между клетками матери и клетками трофобласта, которые могут вносить вклад в повышение риска развития невынашивания беременности (Kuon R.J. et al. Immune profiling in patients with recurrent miscarriage // Journal of reproductive immunology. - 2015. - Vol. 108. - 136-141).
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств по оценке риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием и возможность дать иммунологическую оценку этого риска.
Указанный технический результат достигается тем, что согласно изобретению у пациенток с привычным невынашиванием беременности определяют цитотоксическую активность NK-клеток периферической крови в секреторной фазе менструального цикла в отношении клеток трофобласта линии Jeg-3, и, если значение цитотоксической активности NK-клеток превышает предварительно определенное значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла, прогнозируют высокий риск невынашивания беременности.
Среди множества иммунологических параметров в патогенезе привычного невынашивания беременности выделяют определение количества NK-клеток и реализуемую ими цитотоксическую функцию (Pandey М.К. et al. An update in recurrent spontaneous abortion // Archives of gynecology and obstetrics. - 2005. - Vol. 272. - 95-108).
При этом имеются данные, свидетельствующие о том, что содержание NK-клеток в периферической крови не отличается между небеременными женщинами с невынашиванием беременности и здоровыми фертильными женщинами (Emmer P.M. et al. Peripheral natural killer cytotoxicity and CD56(pos)CD16(pos) cells increase during early pregnancy in women with a history of recurrent spontaneous abortion // Human reproduction. - 2000. - Vol. 15. - 1163-1169).
В заявляемом способе достоверные различия цитотоксической активности NK-клеток периферической крови у здоровых женщин и у женщин с высоким риском невынашивания беременности были получены в секреторной фазе менструального цикла.
Для определения цитотоксической активности NK-клеток в качестве клеток-мишеней использовали клетки трофобласта линии Jeg-3, воспроизводящие основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики инвазивного трофобласта первого триместра беременности (Kohler P.O. and Bridson W.E. Isolation of hormone-producing clonal lines of human choriocarcinoma // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. - 1971. - Vol. 32. - 683-687).
Преимущество использования клеток трофобласта линии Jeg-3 по сравнению со стандартными клетками-мишенями К562 состоит в моделировании межклеточных взаимодействий, которые могут протекать при наступлении беременности в маточно-плацентарном комплексе.
Таким образом, способ позволяет дать иммунологическую оценку риска невынашивания беременности.
В исследование, на котором основано изобретение, входили следующие группы пациентов: здоровые небеременные фертильные женщины в пролиферативной фазе менструального цикла (ПФМЦ) (n=20) и в секреторной фазе менструального цикла (СФМЦ) (n=20), женщины с физиологической беременностью (ФБ) на сроке 6-7 недель (n=25), небеременные женщины с привычным невынашиванием беременности (ПНБ) в ПФМЦ (n=19) и в СФМЦ (n=23).
Для каждого пациента измерение цитотоксической активности NK-клеток проводили не менее чем в 4 повторах. При каждой постановке опыта цитотоксической активности NK-клеток также измеряли базовую гибель клеток трофобласта в отсутствие мононуклеаров. Статистическая обработка данных включала вычисление среднего арифметического уровня базовой гибели клеток трофобласта.
Для проведения исследования используют мононуклеары, выделенные из периферической крови пациентки при помощи стандартного метода центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин (Boyum А. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Introduction // Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation. Supplementum. - 1968. - Vol. 97. - 7). После выделения мононуклеары периферической крови, содержащие NK-клетки, инкубируют в полной культуральной среде, содержащей модифицированную среду DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия. В эксперименте применяют клетки трофобласта линии Jeg-3, воспроизводящие основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики инвазивного трофобласта первого триместра беременности (Kohler P.O. andBridson W.E. Isolation of hormone-producing clonal lines of human choriocarcinoma // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. - 1971. - Vol. 32. - 683-687). За сутки до эксперимента производят подготовку клеток трофобласта, осуществляют дезинтеграцию монослоя с помощью экспозиции в растворе трипсин-версен (1:1), затем половину полученной суспензии клеток помещают в новый матрас для адгезионных культур, добавляют 12 мл полной культуральной среды, 1% буферного раствора HEPES и 10% ЭТС. На следующий день осуществляют дезинтеграцию клеток трофобласта, проводят обработку клеток раствором 5-,6-карбоксифлуоресцеинадиацетатсукцинилмидилового эфира (КФДЭ) и инкубируют в течение 4 часов с мононуклеарами периферической крови в соотношении эффектор: мишень 10:1. Часть клеток трофобласта инкубируют в аналогичной культуральной среде без добавления мононуклеров для определения базовой гибели клеток трофобласта. После этого оценивают количество жизнеспособных и нежизнеспособных клеток трофобласта с помощью окраски клеток раствором пропидия иодида. Часть клеток трофобласта не обрабатывают растворами КФДЭ и пропидия иодида и используют в качестве отрицательного контроля при оценке флюоресценции клеток.
Среднюю базовую гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров в каждом эксперименте вычисляют по формуле
СБГэксп={(Хн/Хобщ)1+(Хн/Хобщ)2+…+{(Хн/Хобщ)n}*100%/n, где
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте (%);
Хн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;
Хобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;
n - количество повторов (лунок).
Предварительно проводится оценка показателя общей базовой гибели клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров по формуле:
оБГ=(СБГэксп1+СБГэксп2+…+СБГэкспm)/m, где
оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров (%);
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров;
m - количество экспериментов (не менее 30 повторов).
Показатель общей базовой гибели клеток трофобласта (оБГ) является общей характеристикой клеток трофобласта линии Jeg-3 в конкретных условиях культивирования. До постановки эксперимента по способу оценки риска невынашивания беременности у конкретной пациентки рекомендуется предварительно оценить показатель оБГ, с этой целью рекомендуется оценить СБГэксп не менее, чем в 30 повторах. В дальнейшем полученная величина принимается в качестве константной, в каждом эксперименте данный показатель вычислять не требуется.
Затем вычисляют средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта в каждом эксперименте по формуле:
СЦЭпац={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+…+(Yн/Yобщ)n}*100%/n, где
СЦЭпац - средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта (%);
Yн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови в каждой лунке;
Yобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови;
n - количество повторов (лунок) (не менее 4 повторов).
Затем оценивают цитотоксический эффект NK-клеток пациента с учетом усредненных значений по формуле
ЦЭпац=СЦЭпац-СБГэксп+оБГ, где
ЦЭпац - цитотоксический эффект NK-клеток пациента, %;
СЦЭпац - средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта;
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте;
оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта
Полученные данные были статистически обработаны с помощью программы Statistica 10. Для сравнения полученных данных использовался U-критерий Манна-Уитни, являющийся непараметрическим аналогом t-критерия Стьюдента. Статистически значимыми признавались различия при р<0,05, р<0,01, р<0,001.
В табл. 1 для каждой группы пациентов представлены значения медианы, в фигурных скобках приведены значения верхнего и нижнего квартиля.
Установлено, что цитотоксическая активность NK-клеток периферической крови здоровых фертильных женщин в ПФМЦ была повышена по сравнению с показателем группы женщин с физиологической беременностью. Различий между группой фертильных женщин в СФМЦ и группой женщин с физиологической беременностью не выявлено. У фертильных женщин в СФМЦ была снижена по сравнению с соответствующим показателем для ПФМЦ (Табл. 1).
Figure 00000001
Достоверность различий: различия между группами представлены в виде значения р с индексом, соответствующим номерам сравниваемых групп.
У небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта была повышена в СФМЦ по сравнению с ПФМЦ. Группа небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности в СФМЦ отличается повышенной цитотоксической активностью NK-клеток в отношении трофобласта по сравнению с соответствующим показателем для группы небеременных фертильных женщин в СФМЦ (36%) (Табл. 1).
Таким образом, выявление показателей ЦЭпац у женщин с привычным невынашиванием в СФМЦ выше, чем значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла, является негативным прогностическим признаком для наступления беременности.
Способ иллюстрируется фиг. 1-4, где:
на фиг. 1 представлена двумерная гистограмма распределения относительного количества клеток трофобласта, необработанных КФДЭ и раствором пропидий иодида (а) в координатах FSC-SSC; б) в координатах FSC-FITC;
на фиг. 2 представлена двумерная гистограмма распределения относительного количества клеток трофобласта, обработанных раствором КФДЭ (а) в координатах FSC-SSC; б) в координатах FSC-FITC; в) в координатах FSC-PE;
на фиг. 3 представлена двумерная гистограмма распределения относительного количества клеток трофобласта, обработанных раствором КФДЭ и раствором пропидий иодида в координатах FSC-PE. Регион Dead cells содержит нежизнеспособные клетки трофобласта. а)-г) Лунка 1-4;
на фиг. 4 представлена двумерная гистограмма распределения относительного количества клеток трофобласта, обработанных раствором КФДЭ и раствором пропидий иодида, в опытных пробах, инкубированных с мононуклеарами периферической крови, (а) в координатах FSC-SSC, б) в координатах FSC-FITC. Регион Jeg-3 содержит клетки трофобласта; в)-е) в координатах FSC-PE - лунки 1-4. Регион Dead cells содержит нежизнеспособные клетки трофобласта.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
Для оценки цитотоксической активности NK-клеток периферической крови в отношении клеток трофобласта используют клетки трофобласта линии Jeg-3.
I. Порядок исследования.
1. Подготовка рабочих растворов.
1.1. Культуральная среда DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ пирувата натрия (полная культуральная среда).
1.2. Раствор версена стерильный.
1.3. Раствор трипсина стерильный.
1.4. Раствор градиента плотности фиколл-верографин.
1.5. Раствор Хенкса стерильный.
2. Подготовка необходимых материалов.
2.1. Планшет 96-луночный, стерильный, с крышкой, прозрачный, круглодонный.
2.2. Флакон для культивирования прилипающих культур с вентилируемой синей крышкой 75 см2.
2.3. Камера Горяева.
2.4. Стерильные наконечники на 5 мл.
2.5. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 10 мкл, до 300 мкл, до 1000 мкл.
2.6. Конические стерильные пробирки объемом 13 мл, 15 мл, 50 мл.
2.9. Раствор пропидия иодида 1 мкг/мл, приготовленный на PBS.
3. Подготовка необходимого оборудования:
3.1 Вертикальный ламинарно-потоковый шкаф.
3.2 Набор механических дозаторов переменного объема.
3.3 Центрифуга.
3.4 Термостат.
3.5 Вортекс.
3.6 Холодильник 6+2°C.
3.7 CO2 инкубатор.
3.8 Проточный цитофлюориметр, оборудованный 488 нм лазером, датчиками прямого и бокового светорассеяния, датчиками учета флюоресценции FITC (519 нм), РЕ (578 нм).
II. Культивирование клеток трофобласта линии Jeg-3.
Порядок работы.
1. До начала процедуры прогреть стерильные контейнеры со средой для культивирования клеток трофобласта, стерильным раствором трипсина и стерильным раствором версена при температуре 37°C.
2. Все необходимые материалы, перечисленные в разделе I (п. 1-2), внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.
3. Смешать стерильно раствор трипсина с раствором версена (ТВ), содержащий равные части раствора трипсина и раствора версена.
4. Аккуратно слить старую среду из флакона 75 см2 для культивирования с клетками трофобласта, добавить 5 мл стерильного раствора ТВ, чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить раствор ТВ. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора ТВ. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором. Похлопать флакон по бокам, чтобы снять клетки со стенок флакона.
5. Добавить 5 мл ранее приготовленной среды для клеток трофобласта в флакон 75 см2.
6. Тщательно ресуспендировать. Перенести 700 мкл среды с клетками в новый флакон 75 см2 и долить в него 10 мл среды для культивирования.
7. Культивировать клеточную культуру во влажной атмосфере с 7% CO2 при 37°C в течение 72 часов или до образования клетками 2/3 монослоя.
III. Выделение мононуклеаров из периферической крови.
1. Все необходимые материалы, перечисленные в разделе I (п. 1-2), внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.
2. Подогреть раствор Хенкса и раствор градиента плотности фиколл-верографин в термостате 37°C.
3. Подписать и внести в ламинар (из расчета на анализ 1 пациента): 1 пробирку на 50 мл, 3 пробирки на 13 мл, 1 пробирку на 15 мл.
4. Внести в пробирки на 13 мл по 4 мл раствора градиента. В пробирки на 50 мл внести по 12 мл Хенкса, в пробирки для отмывки мононуклеаров внести по 10 мл Хенкса.
5. Смешать 6 мл периферической крови с теплым раствором Хенкса в соотношении 1:2.
6. Пипеткой на 1 мл аккуратно наслоить разведенную раствором Хенкса периферическую кровь на раствор градиента из расчета на 4 мл градиента по 6 мл разведенной крови.
7. Центрифугировать 400 g в течение 30 мин при 22°C.
8. Стерильно внести пробирки в ламинарно-потоковый шкаф. Отобрать 4-5 мл плазмы пипеткой на 1 мл и слить ее. Собрать кольцо мононуклеаров.
9. Перенести мононуклеары в пробирку с 10 мл раствора Хенкса.
10. Центрифугировать 200 g в течение 10 мин при 22°C.
11. Аккуратно слить надосадочную жидкость, добавить к мононуклеарам 3 мл раствора Хенкса, ресуспендировать.
12. Посчитать концентрацию мононуклеаров в камере Горяева. Добавить 10 мл раствора Хенкса.
13. Центрифугировать 200 g в течение 10 мин при 22°C.
14. Аккуратно слить надосадочную жидкость. Развести клетки в культуральной среде на основе DMEM до концентрации 3 млн/мл.
15. Перенести по 100 мкл клеток в лунки круглодонных планшетов.
IV. Проведение эксперимента.
1. Подогреть культуральную среду DMEM, полную культуральную среду для клеток трофобласта линии JEG-3, раствор ТВ в термостате 37°C.
2. Все необходимые материалы, перечисленные в разделе I (п. 1-2), внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.
3. Развести в 5 мл теплой культуральной среды DMEM 4 мкл КФДЭ (стоковый раствор: 4,48 ммоль/л) и ресуспендировать.
4. Аккуратно слить старую среду из флакона для культивирования с клетками трофобласта, добавить 5 мл стерильного раствора культуральной среды DMEM, слить среду. Повторно добавить 5 мл стерильного раствора культуральной среды DMEM, слить среду. Внести раствор красителя КФДЭ.
5. Инкубировать в течение 10 мин при 37°C, 7% CO2.
6. Слить раствор красителя, внести 10 мл холодной культуральной среды DMEM.
7. Повторить отмывку: слить раствор холодной культуральной среды и повторно внести 10 мл холодной культуральной среды DMEM.
8. Слить раствор культуральной среды.
9. Добавить во флакон для культивирования клеток трофобласта 5 мл стерильного раствора ТВ, чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить раствор ТВ. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора ТВ. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором.
10. Внести 2 мл теплой среды для клеток трофобласта.
11. Аккуратно смыть клетки со стенок флакона струей среды.
12. Посчитать концентрацию клеток в камере Горяева. Развести клетки в полной культуральной среде для клеток трофобласта линии JEG-3 до концентрации 0,6 млн/мл.
13. Перенести по 50 мкл клеток в планшет с предварительно засеянными мононуклеарами периферической крови, ресуспендировать. Внести в 4 лунки без мононуклеаров по 150 мкл клеток JEG-3.
14. Центрифугировать планшет при 100 g в течение 3 мин при 22°C.
15. Инкубировать пробы в течение 4 часов при 37°C, 5% СО2.
16. Обработать пробы раствором пропидий иодида. Конечная концентрация пропидия иодида должна составлять 2 мкг/мл. Оставить неокрашенной 1 пробу с клетками JEG-3.
17. Инкубировать пробы 20 минут при 4°C.
18. Добавить в пробы по 300 мкл стандартного фосфатно-солевого буфера.
V. Проведение анализа и учет результатов.
Анализ клеток проводят на проточном цитофлюориметре, оборудованном 488 нм лазером, по четырем параметрам: интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции по каналу FITC (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 519 нм), флуоресценции по каналу РЕ (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 578 нм). В пробе с необработанными КФДЭ и красителем пропидий иодида анализируют 10000 событий. На двумерной гистограмме с координатами FSC-SSC выделяют регион Cells, содержащий клетки трофобласта (фиг. 1а). Клетки из региона Cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-FITC (фиг. 1б). Границу квадрантов на графике устанавливают на основании измерения контрольной пробы, необработанной раствором КФДЭ (фиг. 1б). При измерении опытной пробы, обработанной раствором КФДЭ, клетки из региона Cells (фиг. 2а) проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-FITC. Анализируют 3000 событий в квадранте Jeg-3 (фиг. 2б), данное количество соответствует количеству клеток трофобласта. Затем события из квадранта Jeg-3 проецируют на двумерную гистограмму с координатами FSC-PE. Границу квадрантов на графике устанавливают на основании измерения контрольной пробы, необработанной раствором пропидия иодида (фиг. 2в). При измерении пробы, обработанной растворами КФДЭ и пропидия иодида, на двумерной гистограмме с координатами FSC-PE анализируют относительное количество погибших клеток трофобласта линии Jeg-3 (клетки из квадранта Jeg-3, обработанные красителем пропидия иодида) (базовая гибель клеток трофобласта) (фиг. 3а-г). Минимальное число повторов (лунок) для определения базовой гибели клеток трофобласта составляет 4. Регион Dead cells содержит клетки трофобласта, обработанные раствором пропидия иодида. Количество событий в квадранте Dead cells соответствует нежизнеспособным клеткам трофобласта. На фиг. 3 представлено 4 результата измерения базовой гибели клеток трофобласта (фиг. 3а-г). Процент нежизнеспособных клеток трофобласта, представленный на рисунке соответствует отношению количества клеток трофобласта, обработанных раствором пропидий иодида к общему количеству клеток трофобласта, измеренных в конкретной пробе, и соответствует соотношению Хн/Хобщ в формуле. Гибель клеток в контрольных лунках (после инкубации клеток трофобласта без мононуклеаров периферической крови) не должна превышать 30%.
Затем проводят учет количества событий в квадранте Dead cells после инкубации клеток трофобласта с мононуклеарами периферической крови при (фиг. 4, а-е). По количеству событий в квадрантах Dead cells определяют процент нежизнеспособных клеток трофобласта. Процент нежизнеспособных клеток трофобласта, представленный на фиг. 4 соответствует отношению количества клеток трофобласта, окрашенных раствором пропидия иодида к общему количеству клеток трофобласта, измеренных в конкретной пробе, и соответствует соотношению Yн/Yобщ в формуле. Повторов (лунок) должно быть не менее 4 для оценки цитотоксической активности NK-клеток.
Затем вычисляют среднюю базовую гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров в эксперименте по формуле
СБГэксп={(Хн/Хобщ)1+(Хн/Хобщ)2+…+{(Хн/Хобщ)n}*100%/n, где
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте (%);
Хн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;
Хобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;
n - количество повторов (лунок).
Предварительно проводится оценка показателя общей базовой гибели клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров по формуле
оБГ=(СБГэксп1+СБГэксп2+…+СБГэкспm)/m, где
оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров (%);
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта при инкубации в отсутствие мононуклеаров;
m - количество экспериментов (не менее 30 повторов).
Показатель общей базовой гибели клеток трофобласта (оБГ) является общей характеристикой клеток трофобласта линии Jeg-3 в конкретных условиях культивирования. До постановки эксперимента по способу оценки риска невынашивания беременности у конкретной пациентки рекомендуется предварительно оценить показатель оБГ, с этой целью рекомендуется оценить СБГэксп не менее, чем в 30 повторах. В дальнейшем полученная величина принимается в качестве константной, в каждом эксперименте данный показатель вычислять не требуется. В данном исследовании оБГ составляет 26,4%.
Затем вычисляют средний цитотоксический эффект NK-клеток фракции мононуклеаров периферической крови в отношении клеток трофобласта по формуле:
СЦЭпац={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+…+(Yн/Yобщ)n}*100%/n, где
СЦЭпац - средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта (%);
Yн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови в каждой лунке;
Yобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови;
n - количество повторов (лунок) (не менее 4 повторов).
Затем оценивают цитотоксический эффект NK-клеток пациента с учетом усредненных значений по формуле:
ЦЭпац=СЦЭпац-СБГэксп+оБГ, где:
ЦЭпац - цитотоксический эффект NK-клеток пациента, %;
СЦЭпац - средний цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта;
СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте;
оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта
Делают вывод о риске невынашивания беременности для пациентки путем сравнения ЦЭпац с показателем ЦЭ для здоровых фертильных женщин в СФМЦ. Если значение ЦЭпац превышает предварительно определенное значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла, оценивают высокий риск невынашивания беременности.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка 1, здоровая фертильная женщина в СФМЦ. Базовая гибель клеток трофобласта составила в четырех повторах 17,4%, 18,3%, 21,6%, 17,4%. Средняя базовая гибель составляет СБГэксп={(Хн/Хобщ)1+(Хн/Хобщ)2+(Хн/Хобщ)3+{(Хн/Хобщ)4}*100%/4=(17,4+18,3+21,6+17,4)/4=18,7%
Затем вычисляют цитотоксический эффект NK-клеток: СЦЭпац1={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+(Yн/Yобщ)3+(Yн/Yобщ)4}*100%/4=(28,7+28,4+26,0+26,5)/4=27,4%
Затем вычисляют общую базовую гибель клеток трофобласта в эксперименте. В данном исследовании оБГ составила 26,4%.
Затем усредняют показатели цитотоксического эффекта для пациента по формуле: ЦЭпац1=СЦЭпац1-СБГэксп+оБГ=27,4-18,7+26,4=35,1%.
Полученный результат сравнивают с показателем ЦЭ для здоровых фертильных женщин с СФМЦ равным 36%. Делают вывод о благоприятном прогнозе наступления беременности.
Пример 2. Пациентка 2, женщина с привычным невынашиванием беременности в СФМЦ. Базовая гибель клеток трофобласта составила в четырех повторах 19,3%, 20,4%, 19,0%, 20,1%. Средняя базовая гибель составляет: СБГэксп={(Хн/Хобщ)1+(Хн/Хобщ)2+(Хн/Хобщ)3+{(Хн/Хобщ)4}*100%/4=(19,3+20,4+19,0+20,1)/4=19,7%
Затем вычисляют цитотоксический эффект NK-клеток: СЦЭпац2={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+(Yн/Yобщ)3+(Yн/Yобщ)4}*100%/4=(37,6+39,6+38,0+38,2)/4=38,4%
Затем вычисляют общую базовую гибель клеток трофобласта в эксперименте. В данном исследовании оБГ составила 26,4%.
Затем усредняют показатели цитотоксического эффекта для пациента по формуле: ЦЭпац2=СЦЭпац2-СБГэксп+оБГ=38,4-19,7+26,4=45,1%
ЦЭ составил 45,1%, в данном случае показатель превышает нормальное значение (36% - показатель ЦЭ для здоровых фертильных женщин в СФМЦ), что свидетельствует о неблагоприятном прогнозе наступления беременности - высокий риск невынашивания беременности.
Предлагаемый способ расширяет арсенал средств по оценке риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием и дает иммунологическую оценку этого риска.

Claims (19)

  1. Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием, отличающийся тем, что у пациентки определяют цитотоксическую активность NK-клеток периферической крови в секреторной фазе менструального цикла в отношении клеток трофобласта линии Jeg-3 по следующей формуле:
  2. ЦЭпац=СЦЭпац-СБГэксп+оБГ,
  3. где
  4. ЦЭпац - цитотоксическая активность NK-клеток у пациентки, %;
  5. СЦЭпац - средняя цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта;
  6. СБГэксп - средняя базовая гибель клеток трофобласта в каждом эксперименте;
  7. оБГ - общая базовая гибель клеток трофобласта,
  8. где:
  9. СБГэксп={(Хн/Xобщ)1+(Хн/Хобщ)2+…+{(Хн/Хобщ)n}×100%/n,
  10. где
  11. Хн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;
  12. Хобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных в культуральной среде без добавления мононуклеаров;
  13. n - количество повторов;
  14. СЦЭпац={(Yн/Yобщ)1+(Yн/Yобщ)2+…+(Yн/Yобщ)n}×100%/n,
  15. где
  16. Yн - количество нежизнеспособных клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови в каждой лунке;
  17. Yобщ - общее количество клеток трофобласта, инкубированных с мононуклеарами периферической крови;
  18. n - количество повторов;
  19. и если значение цитотоксической активности NK-клеток у женщины с привычным невынашиванием превышает предварительно определенное значение цитотоксической активности NK-клеток у здоровых фертильных женщин в секреторной фазе менструального цикла, оценивают высокий риск невынашивания беременности.
RU2017112833A 2017-04-13 2017-04-13 Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием RU2657433C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017112833A RU2657433C1 (ru) 2017-04-13 2017-04-13 Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017112833A RU2657433C1 (ru) 2017-04-13 2017-04-13 Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2657433C1 true RU2657433C1 (ru) 2018-06-13

Family

ID=62620323

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2017112833A RU2657433C1 (ru) 2017-04-13 2017-04-13 Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2657433C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2285926C2 (ru) * 2005-01-19 2006-10-20 Уральский НИИ охраны материнства и младенчества Способ прогнозирования угрозы прерывания беременности с ранних сроков гестации
RU2341799C1 (ru) * 2007-07-26 2008-12-20 ФГУ Ростовский НИИ акушерства и педиатрии Федерального агентства по здравоохранению и социальному равитию Способ прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2285926C2 (ru) * 2005-01-19 2006-10-20 Уральский НИИ охраны материнства и младенчества Способ прогнозирования угрозы прерывания беременности с ранних сроков гестации
RU2341799C1 (ru) * 2007-07-26 2008-12-20 ФГУ Ростовский НИИ акушерства и педиатрии Федерального агентства по здравоохранению и социальному равитию Способ прогнозирования невынашивания беременности при урогенитальной инфекции

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JASLOW C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. 2010. Vol. 93. р. 1234-1243. *
JASLOW C.R. et al. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses // Fertility and sterility. 2010. Vol. 93. р. 1234-1243. ВИКНЯНЩУК А.Н. и др. "Клетки трофобласта подавляют пролиферативную активность NK-клеток при беременности". Журнал акушерства и женских болезней. ТОМ LXV. Спецвыпуск 2016, с. 78, 79. СТЕПАНОВА О.И. и др. "Влияние цитокинов на миграционную активность клеток трофобласта линии Jeg-3". Медицинский академический журнал. 2012. N 3, с. 92, 93. *
ВИКНЯНЩУК А.Н. и др. "Клетки трофобласта подавляют пролиферативную активность NK-клеток при беременности". Журнал акушерства и женских болезней. ТОМ LXV. Спецвыпуск 2016, с. 78, 79. *
СТЕПАНОВА О.И. и др. "Влияние цитокинов на миграционную активность клеток трофобласта линии Jeg-3". Медицинский академический журнал. 2012. N 3, с. 92, 93. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hoeller et al. Epstein-Barr virus–positive diffuse large B-cell lymphoma in elderly patients is rare in Western populations
Singh et al. Immunological properties of human decidual macrophages–a possible role in intrauterine immunity
JE˛ DRZEJCZAK et al. Consequences of semen inflammation and lipid peroxidation on fertilization capacity of spermatozoa in in vitro conditions
Koopmans et al. Chimerism occurs in thyroid, lung, skin and lymph nodes of women with sons
EP3194420B3 (en) Identifying status of male fertility by determining sperm capacitation
Shaikly et al. Analysis of HLA-G in maternal plasma, follicular fluid, and preimplantation embryos reveal an asymmetric pattern of expression
Masuda et al. Endometrial stem/progenitor cells in menstrual blood and peritoneal fluid of women with and without endometriosis
Xu et al. Changes of human decidual natural killer cells cocultured with YFP-Toxoplasma gondii: implications for abnormal pregnancy
Hey-Cunningham et al. Circulating and endometrial regulatory T cell and related populations in endometriosis and infertility: Endometriosis is associated with blunting of endometrial cyclical effects and reduced proportions in moderate-severe disease
Kowal et al. Identification of a clinical signature predictive of differentiation fate of human bone marrow stromal cells
RU2657433C1 (ru) Способ оценки риска невынашивания беременности у женщин с привычным невынашиванием
CN108152189B (zh) 一种精子表面出云蛋白1的定量检测方法
Lin et al. Effects of cytomegalovirus infection on extravillous trophoblast cells invasion and immune function of NK cells at the maternal‐fetal interface
Wolff et al. Peripheral blood stem cell transplants do not result in endometrial stromal engraftment
CN110361534B (zh) 评估胚胎和预测体外受精成功率的化学标记物和其应用
RU2768461C1 (ru) Способ оценки цитопротективного эффекта препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения в отношении клеток трофобласта в условиях их взаимодействия с естественными киллерами
Shams et al. The satellite cell colony forming cell assay as a tool to measure self-renewal and differentiation potential
Wu et al. A comprehensive multiparameter flow cytometry panel for immune profiling and functional studies of frozen tissue, bone marrow, and spleen
Maini et al. Monocyte and neutrophil isolation, migration, and phagocytosis assays
JP6751104B2 (ja) 哺乳動物における着床用の体外受精胚を選択するためのバイオマーカーとしての可溶性ｃｄ１４６の使用
Cuadrado-Torroglosa et al. Increased cytotoxic natural killer cells in the endometrium alone cannot be considered the immunological cause of recurrent miscarriage
CN112708653B (zh) 一种用月经血预测反复流产和/或诊断反复流产的原因的检测方法
Norozi-Hafshejani et al. MACS-DGC versus DGC sperm wash procedure: comparing clinical outcomes in couples with male factor infertility undergoing ICSI: a clinical trial study
RU2581925C2 (ru) Способ оценки аллогенного иммунного ответа в кратковременной смешанной культуре мононуклеаров неродственных доноров
Huber et al. Natural killer cell-based predictive assay for pregnancy outcome in frozen embryo transfer cycles

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20190414