RU2656188C1

RU2656188C1 - Synthetic analgesic means of peptide nature and method of its use

Info

Publication number: RU2656188C1
Application number: RU2017115564A
Authority: RU
Inventors: Алексей Игоревич Федюшкин
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Анкрим" (ООО "Анкрим")
Priority date: 2017-05-03
Filing date: 2017-05-03
Publication date: 2018-06-04

Abstract

FIELD: pharmaceuticals.

SUBSTANCE: invention relates to pharmaceuticals, medicine and veterinary medicine, in particular to the development of a synthetic analgesic of peptide nature and a method of pain relief with it.

EFFECT: peptide compound is proposed which is Ac-RERR-NH₂, having an analgesic effect, a pharmaceutical composition comprising said peptide compound, and a method for pain management.

12 cl, 2 dwg, 5 tbl, 4 ex

Description

Область техникиTechnical field

Заявляемое изобретение относится к фармацевтике, медицине и ветеринарии, в частности, к разработке синтетического анальгетика пептидной природы и способу купирования боли с его помощью.The claimed invention relates to pharmaceuticals, medicine and veterinary medicine, in particular, to the development of a synthetic peptide analgesic and a method for relieving pain with its help.

Заявляемое изобретение в части, касающейся состава анальгетического средства, может быть использовано для производства анальгетиков пептидной природы. Заявляемое изобретение может быть применено в медицине и в ветеринарии для терапии болевого синдрома различной этиологии.The invention in the part regarding the composition of the analgesic agent can be used for the production of peptide analgesics. The claimed invention can be applied in medicine and in veterinary medicine for the treatment of pain of various etiologies.

Уровень техникиState of the art

Анальгетическими средствами, или анальгетиками (от греч. algos - боль и an - без), называют лекарственные средства, обладающие специфической способностью ослаблять или устранять чувство боли [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 14 издание. М.: Новая волна, 2003, т. 1, с. 145].Analgesics, or analgesics (from the Greek. Algos - pain and an - without), are medicines that have a specific ability to weaken or eliminate the feeling of pain [Mashkovsky M. D. Medicines 14th edition. M .: New wave, 2003, v. 1, p. 145].

Анальгетическое (болеутоляющее) действие могут оказывать не только собственно анальгетики, но и другие вещества, относящиеся к разным фармакологическим группам. Так, анальгетическим эффектом могут обладать препараты, применяемые для наркоза (общего обезболивания), и некоторые из них в соответствующих концентрациях и дозах (например, трихлорэтилен, закись азота) используются специально для анальгезии.An analgesic (analgesic) effect can be exerted not only by the analgesics themselves, but also by other substances belonging to different pharmacological groups. So, the drugs used for anesthesia (general anesthesia) may have an analgesic effect, and some of them in appropriate concentrations and doses (for example, trichlorethylene, nitrous oxide) are used specifically for analgesia.

Местные анестетики также являются анальгетическими средствами, особенно при периферических болях. При резорбтивном действии местных анестетиков они могут влиять на ЦНС: это проявляется в беспокойстве, треморе, судорогах, а в более высоких дозах они негативно влияют на дыхательный и сосудодвигательный центры. Местные анестетики, оказывая блокирующее влияние на потенциалочувствительные натриевые каналы, угнетают сократимость миокарда, расширяют кровеносные сосуды, угнетающе влияют на симпатическую иннервацию, снижают артериальное давление. Наиболее важным свойством местных анестетиков является их способность блокировать ноцицепторы и чувствительные нервные волокна других модальностей. В связи с этим их используют для местного обезболивания (местной анестезии), в частности, при хирургических операциях.Local anesthetics are also analgesic, especially for peripheral pain. With the resorptive effect of local anesthetics, they can affect the central nervous system: this is manifested in anxiety, tremors, convulsions, and at higher doses they negatively affect the respiratory and vasomotor centers. Local anesthetics, having a blocking effect on voltage-sensitive sodium channels, inhibit myocardial contractility, dilate blood vessels, inhibit sympathetic innervation, and lower blood pressure. The most important property of local anesthetics is their ability to block nociceptors and sensitive nerve fibers of other modalities. In this regard, they are used for local anesthesia (local anesthesia), in particular, during surgical operations.

Под анальгетическими в собственном смысле слова подразумеваются средства, доминирующим эффектом которых является анальгезия, не сопровождающаяся в терапевтических дозах выключением сознания и выраженным нарушением двигательных функций.In the proper sense of the word, analgesic means drugs whose dominant effect is analgesia, which is not accompanied in therapeutic doses by turning off consciousness and a pronounced violation of motor functions.

Усиливать обезболивающий эффект могут дополнительные препараты (адъюванты), которые, оказывая косвенное влияние на ноцицептивную систему мозга, ослабляют негативное влияние патологического состояния клеток тканей или органов, вызывающих боль. Болеутоляющее действие, например, могут оказать спазмолитические и холинолитические средства.Additional drugs (adjuvants) can enhance the analgesic effect, which, having an indirect effect on the nociceptive system of the brain, weaken the negative impact of the pathological state of tissue cells or organs that cause pain. Analgesic and anticholinergic drugs, for example, can have an analgesic effect.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) утвердила трехступенчатый подход к лечению онкологической боли, который широко применяется в настоящее время. Он подразумевает использование анальгетиков перорально по часам, в зависимости от длительности действия препарата. На первом этапе используются неопиоидные анальгетики, такие как парацетамол (ацетаминофен), или нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП). При недостаточном эффекте добавляются слабые опиоиды, например, кодеин, декстропропоксифен или трамадол, (вторая ступень). Если и это не позволяет купировать боль, то на последнем этапе слабый опиоид меняется на сильный, подобный морфину (например, морфин, гидроморфон, оксикодон или фентанил).The World Health Organization (WHO) has adopted a three-step approach to the treatment of cancer pain, which is now widely used. It involves the use of analgesics orally by the hour, depending on the duration of the drug. At the first stage, non-opioid analgesics are used, such as paracetamol (acetaminophen), or non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs). With insufficient effect, weak opioids are added, for example, codeine, dextropropoxyphene or tramadol, (second stage). If this does not stop the pain, then at the last stage the weak opioid changes to a strong one similar to morphine (for example, morphine, hydromorphone, oxycodone or fentanyl).

Эта «лестница лечения боли ВОЗ» применяется с 1986 года. Данный подход затем был экстраполирован на неонкологическую боль, в том числе для лечения хронической боли различной этиологии и локализации. Дополнительные препараты используются при этом и для снижения тревожности и других негативных побочных эффектов.This “WHO pain treatment ladder” has been used since 1986. This approach was then extrapolated to non-cancer pain, including for the treatment of chronic pain of various etiologies and localizations. Additional drugs are used in this case and to reduce anxiety and other negative side effects.

По химической природе, характеру и механизмам фармакологической активности современные анальгетики делятся на две группы.According to the chemical nature, nature and mechanisms of pharmacological activity, modern analgesics are divided into two groups.

Основными представителями анальгетиков первой группы являются производные салициловой кислоты (натрия салицилат, ацетилсалициловая кислота, салициламид и др.), производные пиразолона - антипирин, амидопиприн, анальгин, производные пара-аминофенола (или анилина) - фенацетин, парацетамол [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 14 издание. М.: Новая волна, 2003, т. 1, с. 146]. Указанные анальгетики являются синтетическими лекарственными средствами.The main representatives of the first group of analgesics are salicylic acid derivatives (sodium salicylate, acetylsalicylic acid, salicylamide, etc.), pyrazolone derivatives - antipyrine, amidopiprine, analgin, para-aminophenol (or aniline) derivatives - phenacetin, paracetamol [Mashkovsky M. D. Medicines 14th edition. M .: New wave, 2003, v. 1, p. 146]. These analgesics are synthetic drugs.

Анальгезирующая активность лекарственных средств, относящихся к первой группе, проявляется при определенных видах болевых ощущений, главным образом при невралгических, мышечных, суставных болях, при головной и зубной боли. При сильной боли, связанной с травмами, полостными оперативными вмешательствами и т.п., они практически неэффективны.The analgesic activity of drugs belonging to the first group is manifested in certain types of pain, mainly in neuralgic, muscle, joint pain, with headache and toothache. With severe pain associated with injuries, abdominal surgery, etc., they are practically ineffective.

Указанные средства проявляют жаропонижающее действие при лихорадочных состояниях, и противовоспалительное действие, выраженное в разной степени у разных анальгетиков этой группы.These drugs exhibit antipyretic effect in febrile conditions, and anti-inflammatory effect, expressed to varying degrees in different analgesics of this group.

При применении этих анальгетиков отсутствуют угнетающее влияние на дыхательный и кашлевой центры, а также явлений эйфории, психической и физической зависимости.When using these analgesics, there is no inhibitory effect on the respiratory and cough centers, as well as the phenomena of euphoria, mental and physical dependence.

В механизме действия анальгетиков первой группы определенную роль играет влияние на таламические центры, которое приводит к торможению проведения болевых импульсов к коре головного мозга. В механизме действия салицилатов важную роль играют ингибирование биосинтеза простагландинов, а также стимулирующее влияние на «ось» гипофиз - надпочечники, способствующее высвобождению кортикостероидов. Существенное значение в действии анальгетиков первой группы имеет их влияние на кининовую систему (антагонизм с альгезирующим действием брадикинина и др.).In the mechanism of action of the analgesics of the first group, a certain role is played by the effect on the thalamic centers, which leads to inhibition of the conduct of pain impulses to the cerebral cortex. An important role in the mechanism of action of salicylates is played by the inhibition of prostaglandin biosynthesis, as well as the stimulating effect on the pituitary gland, the adrenal glands, which promotes the release of corticosteroids. Of significant importance in the action of the analgesics of the first group is their effect on the kinin system (antagonism with the allergic effect of bradykinin, etc.).

Анальгетики второй группы включают природные соединения - морфин и близкие к нему алкалоиды (опиаты), и синтетические соединения, обладающие опиатоподобными свойствами (опиоиды). Для них характерна сильная анальгезирующая активность, обеспечивающая возможность их использования при травмах (операционные вмешательства, ранения и др.) и при заболеваниях, сопровождающихся выраженным болевым синдромом (злокачественные новообразования, инфаркт миокарда, наркотическая «ломка» и др.). Поэтому их также называют большими анальгетиками.Analgesics of the second group include natural compounds - morphine and related alkaloids (opiates), and synthetic compounds with opiate-like properties (opioids). They are characterized by strong analgesic activity, providing the possibility of their use in injuries (surgical interventions, wounds, etc.) and in diseases accompanied by severe pain (malignant neoplasms, myocardial infarction, narcotic “breaking”, etc.). Therefore, they are also called large analgesics.

По источникам получения и химическому строению к анальгетикам второй группы относятся природные алкалоиды - морфин и кодеин, содержащиеся в снотворном маке; полусинтетические соединения, полученные путем химической модификации молекулы морфина (этилморфин); синтетические соединения (промедол, фентанил, пентазоцин, налбуфин, буторфанол, трамадол и др.). Большинство синтетических препаратов получено по принципу воспроизведения упрощенной структуры морфина. Путем химической модификации молекулы морфина получены также соединения, являющиеся его фармакологическими антагонистами (налоксон, налтрексон). Для уменьшения побочных явлений часто назначают вместе с морфином атропин, метацин или другие холинолитики [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 14 издание. М.: Новая волна, 2003, т. 1, с. 145].According to the sources of production and chemical structure, the analgesics of the second group include natural alkaloids - morphine and codeine, contained in sleeping pills; semisynthetic compounds obtained by chemical modification of a morphine molecule (ethyl morphine); synthetic compounds (promedol, fentanyl, pentazocine, nalbuphine, butorphanol, tramadol, etc.). Most synthetic drugs are obtained by reproducing the simplified structure of morphine. By chemical modification of the morphine molecule, compounds are also obtained that are its pharmacological antagonists (naloxone, naltrexone). To reduce side effects, atropine, metacin, or other anticholinergics are often prescribed together with morphine [Mashkovsky M.D. Medicines 14th edition. M .: New wave, 2003, v. 1, p. 145].

Указанные средства обладают особым влиянием на центральную нервную систему человека, выражающимся в развитии эйфории и появлении при повторном применении синдромов психической и физической зависимости (лекарственной зависимости), что ограничивает возможность длительного применения этих препаратов. У пациентов с развившимся синдромом физической зависимости при лишении их анальгетического препарата может развиться болезненное состояние - абстинентный синдром.These drugs have a special effect on the central nervous system of a person, expressed in the development of euphoria and the appearance of psychic and physical dependence syndromes (drug dependence) during repeated use, which limits the possibility of prolonged use of these drugs. In patients with advanced physical dependence syndrome, depriving them of an analgesic drug may develop a painful condition - withdrawal symptoms.

Анальгетики второй группы вызывают острые токсические явления, такие как угнетение дыхания, нарушение сердечной деятельности. Для их снятия применяются специальные лекарственные средства -антагонисты, например, налоксон или налтрексон.Analgesics of the second group cause acute toxic effects, such as respiratory depression, impaired cardiac activity. To remove them, special antagonist drugs are used, for example, naloxone or naltrexone.

При повторном применении больших анальгетиков обычно развивается толерантность, то есть ослабление действия назначенной текущей дозы препарата, когда для получения анальгезирующего эффекта требуются все более высокие дозы препарата.With the repeated use of large analgesics, tolerance usually develops, that is, a weakening of the prescribed current dose of the drug, when ever higher doses of the drug are required to obtain the analgesic effect.

Действие указанных анальгетиков не ограничивается болеутоляющим эффектом. В той или иной степени, они оказывают снотворное действие, угнетают дыхание и кашлевой рефлекс, повышают тонус кишечника и мочевого пузыря.The action of these analgesics is not limited to the analgesic effect. To one degree or another, they have a sleeping pill, inhibit breathing and a cough reflex, increase the tone of the intestines and bladder.

В то же время они могут вызвать тошноту, понос и другие побочные явления.At the same time, they can cause nausea, diarrhea, and other side effects.

В связи с выраженным наркогенным потенциалом анальгетики второй группы подлежат хранению, назначению и отпуску из аптек согласно особым правилам. В последние годы ряд применявшихся больших анальгетиков, обладающих выраженным наркогенным потенциалом (текодин, гидрокодона фосфат, фенадон, некоторые готовые лекарственные формы, содержащие опий и кодеин), исключен из номенклатуры лекарственных средств в Российской Федерации [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 14 издание. М.: Новая волна, 2003, т. 1, с. 145].In connection with the expressed narcogenic potential, the analgesics of the second group are subject to storage, prescription and release from pharmacies in accordance with special rules. In recent years, a number of large analgesics used that have a pronounced narcogenic potential (tecodine, hydrocodone phosphate, phenadone, some finished dosage forms containing opium and codeine) are excluded from the list of medicines in the Russian Federation [Mashkovsky M. D. Medicines 14th edition. M .: New wave, 2003, v. 1, p. 145].

Нейрофизиологические исследования свидетельствуют об угнетении указанными анальгетиками таламических центров болевой чувствительности и блокировании передачи болевых импульсов к коре головного мозга. Однако по своему действию эти анальгетики отличаются от представителей первой группы, так как влияют на способность центральной нервной системы к суммации подпороговых импульсов.Neurophysiological studies indicate inhibition of the thalamic centers of pain sensitivity by the indicated analgesics and blocking the transmission of pain impulses to the cerebral cortex. However, in their effect, these analgesics differ from representatives of the first group, since they affect the ability of the central nervous system to summarize subthreshold impulses.

В последнее время получены данные о наличии в мозге и других органах специфических «опиатных» рецепторов [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 14 издание. М.: Новая волна, 2003, т. 1, с. 146]. Эндогенными лигандами, то есть связывающимися с этими рецепторами специфическими, образующимися в организме физиологически активными соединениями, являются нейропептиды - прежде всего, энкефалины и эндорфины и недавно открытые в США проф. Д. Задиной эндоморфины [Zadina J.E., Hackler L., Ge L., Kastin A. A potent and selective endogenous agonist for the μ-opiate receptor // Nature 1997, V. 386. Р. 499-502]. Эндогенные лиганды оказывают анальгетическое действие и их эффект блокируется специфическими антагонистами опиатов. Связывание морфина с этими рецепторами обеспечивается тем, что определенная часть его молекулы имеет структурное, в том числе и конформационное, сходство с тирозиновым остатком энкефалинов и эндорфинов. Таким образом, экзогенный анальгетик морфин (так же как и другие близкие к нему по структуре опиаты и опиоиды) при введении в организм взаимодействует с теми же рецепторами, которые предназначены для связывания эндогенных лигандов. Кроме того, не исключено, что действие экзогенных анальгетиков связано также со стабилизацией эндогенных лигандов путем инактивации разрушающих энкефалины ферментов - энкефалиназ.Recently, data have been obtained on the presence of specific “opiate” receptors in the brain and other organs [Mashkovsky M. D. Medicines 14th edition. M .: New wave, 2003, v. 1, p. 146]. Endogenous ligands, that is, specific physiologically active compounds that bind to these receptors that are formed in the body, are neuropeptides - primarily enkephalins and endorphins and recently discovered prof. D. Back endomorphins [Zadina J.E., Hackler L., Ge L., Kastin A. A potent and selective endogenous agonist for the μ-opiate receptor // Nature 1997, V. 386. P. 499-502]. Endogenous ligands have an analgesic effect and their effect is blocked by specific opiate antagonists. The binding of morphine to these receptors is ensured by the fact that a certain part of its molecule has structural, including conformational, similarities with the tyrosine residue of enkephalins and endorphins. Thus, exogenous analgesic morphine (like other opiates and opioids close in structure to it), when introduced into the body, interacts with the same receptors that are designed to bind endogenous ligands. In addition, it is possible that the action of exogenous analgesics is also associated with the stabilization of endogenous ligands by inactivation of enkephalin-degrading enzymes - enkephalinases.

Показано, что опиатные рецепторы существуют в виде разных субпопуляций (подгрупп): μ (мю) (или ОР₃ по системе IUPHAR),

(каппа) (ОР₂), σ (сигма), δ (дельта) (OP₁), имеющих различную функциональную значимость. Полагают, что мю-рецепторы опосредуют супраспинальную анальгезию, эйфорию, угнетение дыхания и физическую зависимость, каппа-рецепторы опосредуют спинальную анальгезию, миоз, седативный эффект. Разные эндогенные лиганды и большие анальгетики могут связываться преимущественно с той или иной подгруппой рецепторов, что может определять особенности их фармакологического действия.It was shown that opiate receptors exist in the form of different subpopulations (subgroups): μ (mu) (or OP ₃ according to the IUPHAR system),

(kappa) (OP ₂ ), σ (sigma), δ (delta) (OP ₁ ) having different functional significance. It is believed that mu receptors mediate supraspinal analgesia, euphoria, respiratory depression and physical dependence, kappa receptors mediate spinal analgesia, miosis, sedation. Different endogenous ligands and large analgesics can bind predominantly to one or another subgroup of receptors, which can determine the characteristics of their pharmacological action.

Разнообразные большие анальгетики различаются также по характеру связывания с опиатными рецепторами. Одни из них (морфин, промедол, фентанил и др.) являются «чистыми» полными агонистами; связываясь с рецепторами, они оказывают характерное для эндогенных лигандов физиологическое (фармакологическое) действие. Другие являются «чистыми» антагонистами (налоксон, налтрексон). Связываясь с рецепторами, они блокируют действие эндогенных лигандов и экзогенных опиатов. В третью группу входят препараты смешанного типа действия (агонисты-антагонисты), по-разному связывающиеся с разными подгруппами опиатных рецепторов и оказывающие в связи с этим по одним видам действия агонистический эффект, по другим - антагонистический (трамадол, налорфин, пентазоцин, нальбуфин и др.).A variety of large analgesics also differ in the nature of binding to opiate receptors. Some of them (morphine, promedol, fentanyl, etc.) are “pure” complete agonists; binding to receptors, they exert a physiological (pharmacological) effect characteristic of endogenous ligands. Others are “pure” antagonists (naloxone, naltrexone). By binding to receptors, they block the action of endogenous ligands and exogenous opiates. The third group includes drugs of a mixed type of action (antagonist agonists) that bind differently to different subgroups of opiate receptors and therefore have an agonistic effect on one type of action and an antagonistic effect on the other (tramadol, nalorphine, pentazocine, nalbuphine, etc. .).

Действие больших анальгетиков на периферические органы (кишечник и др.) также связано с взаимодействием с локализующимися в них опиатными рецепторами.The action of large analgesics on peripheral organs (intestines, etc.) is also associated with interaction with the opiate receptors localized in them.

Выраженного местноанестезирующего действия у большинства опиатов не отмечается. Вместе с тем в последние годы обнаружено, что они оказывают сильное обезболивающее действие при эпидуральном и субарахноидальном введении. Этот эффект связан с непосредственным воздействием на нейрональные системы спинного мозга, участвующие в формировании болевого потока импульсов. Этот способ введения опиатов находит применение для купирования тяжелых острых и хронических болей.A pronounced local anesthetic effect is not observed in most opiates. However, in recent years it has been found that they have a strong analgesic effect with epidural and subarachnoid administration. This effect is associated with a direct effect on the neural systems of the spinal cord, which are involved in the formation of pain flow of impulses. This method of administering opiates is used to relieve severe acute and chronic pain.

Из сказанного выше следует, что, с точки зрения современных воззрений на механизм действия больших анальгетиков, наиболее эффективными из них являются представители агонистов. Однако из-за вызываемых ими побочных эффектов, прежде всего сильной лекарственной (по сути наркотической) зависимости и интоксикации организма, их применение строго ограничено в зарубежных странах и запрещено в Российской Федерации. В настоящее время не известны синтетические аналоги агонистов, прежде всего, морфина, которые не вызывали бы указанных побочных эффектов.From the foregoing it follows that, from the point of view of modern views on the mechanism of action of large analgesics, the most effective of them are representatives of agonists. However, due to the side effects caused by them, especially strong drug (essentially drug) dependence and intoxication of the body, their use is strictly limited in foreign countries and is prohibited in the Russian Federation. At present, synthetic analogs of agonists, primarily morphine, are not known that would not cause these side effects.

Синтетический анальгетик последнего поколения, относящийся к группе агонистов-антагонистов опиатных рецепторов, - трамадол (tramadol), представляет собой ±-транс-2-[(диметиламино)метил]-1-(м-метоксифенил)циклогексанола гидрохлорид [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 14 издание. М.: Новая волна, 2003, т. 1, с. 157]. Препарат обладает высокой анальгетической активностью, дает быстрый и длительный эффект. Трамадол уступает по активности морфину, поэтому применяется соответственно в больших дозах. Трамадол относительно хорошо переносится, не вызывает в обычных дозах выраженного угнетения дыхания и существенно не влияет на кровообращение и желудочно-кишечный тракт. Трамадол, однако, может вызывать тошноту, рвоту, головокружение, потливость; повышенное артериальное давление может несколько снижаться.The latest generation synthetic analgesic belonging to the group of opiate receptor antagonist agonists, tramadol, is ± trans-2 - [(dimethylamino) methyl] -1- (m-methoxyphenyl) cyclohexanol hydrochloride [Mashkovsky MD Medicines 14th edition. M .: New wave, 2003, v. 1, p. 157]. The drug has a high analgesic activity, gives a quick and lasting effect. Tramadol is inferior in activity to morphine, therefore it is used, respectively, in large doses. Tramadol is relatively well tolerated, does not cause pronounced respiratory depression in usual doses and does not significantly affect blood circulation and the gastrointestinal tract. Tramadol, however, may cause nausea, vomiting, dizziness, sweating; high blood pressure may decrease slightly.

Недостатком известного средства является то, что трамадол не является «чистым» агонистом, поэтому по эффективности объективно уступает морфину. Так же, как и морфин, при повторных приемах он вызывает привыкание и интоксикацию организма у большинства пациентов.A disadvantage of the known drug is that tramadol is not a "pure" agonist, therefore, it is objectively inferior in effectiveness to morphine. Like morphine, with repeated doses it causes addiction and intoxication in most patients.

Из уровня техники известно применение соединений пептидной природы в качестве анальгетических средств.The use of peptide compounds as analgesic agents is known in the art.

Так в патенте RU 2286169 (приоритет от 18.04.2005, дата публикации 27.10.2006) раскрыто получение и применение пептидов формулы (I), обладающих анальгетической активностью, для создания новых лекарственных препаратов. Пептиды обладают повышенной активностью по сравнению с пентальгином, анальгином, морфином, не токсичны.So in the patent RU 2286169 (priority from 04/18/2005, publication date 10/27/2006) disclosed is the preparation and use of peptides of the formula (I) having analgesic activity to create new drugs. Peptides have increased activity compared to pentalgin, analgin, morphine, non-toxic.

где А - О, - Ala, -Asp, -Glu, -Phe, -Gly, -His, -He, -Lys, -Leu, -Met, -Pro, -Arg, -Ser, -Thr, -Val, -Trp, -Tyr; Б - О, - Ala, -Asp, -Glu, -Phe, -Gly, -His, -He, -Lys, -Leu, -Met, -Pro, -Arg, -Ser, -Thr, -Val, -Trp, -Tyr; В - О, - Ala, -Asp, -Glu, -Phe, -Gly, -His, -He, -Lys, -Leu, -Met, -Pro, -Arg, -Ser, -Thr, -Val, -Trp, -Tyr; X - OH, -OCH₃, -NH₂ where A - O, - Ala, -Asp, -Glu, -Phe, -Gly, -His, -He, -Lys, -Leu, -Met, -Pro, -Arg, -Ser, -Thr, -Val, -Trp, -Tyr; B - O, - Ala, -Asp, -Glu, -Phe, -Gly, -His, -He, -Lys, -Leu, -Met, -Pro, -Arg, -Ser, -Thr, -Val, - Trp, -Tyr; B - Oh, - Ala, -Asp, -Glu, -Phe, -Gly, -His, -He, -Lys, -Leu, -Met, -Pro, -Arg, -Ser, -Thr, -Val, - Trp, -Tyr; X is OH, -OCH ₃ , -NH ₂

Однако в материалах данного патента не представлен молекулярный механизм связывания указанных субстанций со специфической мишенью - мембранным рецептором. Скорее всего анальгетический эффект указанных агентов пептидной природы обусловлен их воздействием на один из классов опиоидных рецепторов. В таком случае их действие не может быть абсолютно безопасным, поскольку все агонисты опиоидных рецепторов, как было отмечено выше, вызывают большое количество негативных побочных эффектов в организме человека. Следует отметить, что в описании изобретения данные, указывающие на безопасность применения указанных агентов, отсутствуют. В первую очередь это относится к таким негативным побочным эффектам, как привыкание и токсичность.However, the materials of this patent do not present the molecular mechanism of binding of these substances to a specific target - the membrane receptor. Most likely, the analgesic effect of these peptide agents is due to their effect on one of the classes of opioid receptors. In this case, their effect cannot be absolutely safe, since all opioid receptor agonists, as noted above, cause a large number of negative side effects in the human body. It should be noted that in the description of the invention, data indicating the safety of the use of these agents are absent. This primarily refers to such negative side effects as addiction and toxicity.

Наиболее близким к заявляемому решению является трипептид Ac-RER-NH₂, [Молекулярный механизм модуляции трипептидом возбудимости мембраны ноцицептивного нейрона, авт. Шелых Т.Н., Рогачевский И.В., Ноздрачев А.Д., Веселкина О.С., Подзорова С.А., Крылов Б.В., Плахова В.Б., доклады академии наук, Том 466, №6, 2016, с. 734]. В данной работе указано, что механизм действия данного трипептида обусловлен модуляцией каналов Na_V1.8. Кроме того, описана способность аргининсодержащих пептидов Ac-RER-NH₂, Ac-RR-NH₂ и свободной молекулы Arg модулировать возбудимость мембраны ноцицепторов. Внеклеточный Ac-RER-NH₂ при взаимодействии с наружной мембраной ноцицептивного нейрона вызывает незначительное снижение величины Z_eff активационной воротной системы каналов Na_V1.8, что позволило в данной публикации предложить использование трипептида Ас-RER-NH₂ в качестве анальгетического средства.Closest to the claimed solution is the tripeptide Ac-RER-NH ₂ , [Molecular Mechanism of Modulation of the Tripeptide of the Excitability of the Membrane of a Nociceptive Neuron, ed. Shelykh T.N., Rogachevsky I.V., Nozdrachev A.D., Veselkina O.S., Podzorova S.A., Krylov BV, Plakhova VB, reports of the Academy of Sciences, Volume 466, No. 6, 2016, p. 734]. In this work, it is indicated that the mechanism of action of this tripeptide is due to the modulation of channels Na _V 1.8. In addition, the ability of arginine-containing peptides Ac-RER-NH ₂ , Ac-RR-NH ₂ and the free Arg molecule to modulate the excitability of a nociceptor membrane has been described. Extracellular Ac-RER-NH ₂ interacting with the outer membrane of a nociceptive neuron causes a slight decrease in the Z _eff value of the activation portal portal system Na _V 1.8, which allowed us to propose the use of Ac-RER-NH ₂ tripeptide as an analgesic in this publication.

Однако, в настоящее время существуют указания на то, что трипептиды могут взаимодействовать непосредственно с ДНК живой клетки благодаря своим малым размерам и способности проникать через цитоплазматическую и ядерную мембраны [Khavinson V, Linkova N, Kukanova E, et al. Neuroprotective Effect of EDR Peptide in Mouse Model of Huntington Disease. J Neurol, and Neurosci. 2016, 8: 1-10]. Следствием этого могут стать негативные нарушения функционирования генетического аппарата, что, в свою очередь, может проявляться в отложенных во времени негативных действиях испытываемого препарата.However, there is currently evidence that tripeptides can interact directly with living cell DNA due to their small size and ability to penetrate the cytoplasmic and nuclear membranes [Khavinson V, Linkova N, Kukanova E, et al. Neuroprotective Effect of EDR Peptide in Mouse Model of Huntington Disease. J Neurol, and Neurosci. 2016, 8: 1-10]. The consequence of this can be negative disturbances in the functioning of the genetic apparatus, which, in turn, can manifest itself in the time-delayed negative effects of the test drug.

Актуальной является задача синтеза новых пептидов, обладающих анальгетическими свойствами для разработки на их основе эффективных и безопасных лекарственных препаратов, лишенных недостатков, характеризующих перечисленных выше аналоги.An urgent task is the synthesis of new peptides with analgesic properties for the development of effective and safe drugs based on them, devoid of the disadvantages characterizing the above analogues.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей настоящей группы изобретений является создание нового высокоэффективного синтетического пептида, обладающего анальгетическим свойством, не вызывающего негативных побочных клинических эффектов, прежде всего интоксикации и привыкания, присущих известным аналогам, новой фармацевтической композиции, включающей данный пептид, и способа купирования хронической и острой боли.The objective of this group of inventions is to create a new highly effective synthetic peptide with an analgesic property that does not cause negative clinical side effects, especially intoxication and addiction inherent in known analogues, a new pharmaceutical composition comprising this peptide, and a method for relieving chronic and acute pain.

Поставленная задача решается созданием пептидного соединения, обладающего анальгетическим свойством, общей формулы:The problem is solved by creating a peptide compound having an analgesic property of the general formula:

гдеWhere

- Ra представляет собой N-концевую первичную аминную группу аминокислоты R1, либо свободную, либо замещенную аминозащитной группой,- Ra represents the N-terminal primary amine group of amino acid R1, either free or substituted by an amino protecting group,

- Rb представляет собой гидроксильную группу С-концевой карбоксильной группы аминокислоты R⁴, либо свободную, либо замещенную гидроксизащитной группой, и- Rb represents a hydroxyl group of the C-terminal carboxyl group of amino acid R ⁴ , either free or substituted with a hydroxy protecting group, and

- последовательность R¹-R²-R³-R⁴ представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы: RERR, RERK, REKR, REKK, KERR, KEKR, KERK, KEKK, RDRR, RDRK, RDKR, RDKK, KDRR, KDRK, KDKR, KDKK, RRER, KRER, RKER, KKER, RREK, RKEK, KREK, KKEK, RRDR, KRDR, RKDR, KKDR, RRDK, KRDK, RKDK, KKDK.- the sequence R ¹ -R ² -R ³ -R ⁴ is an amino acid sequence selected from the group: RERR, RERK, REKR, REKK, KERR, KEKR, KERK, KEKK, RDRR, RDRK, RDKR, RDKK, KDRR, KDRK, KDKR, KDKK, RRER, KRER, RKER, KKER, RREK, RKEK, KREK, KKEK, RRDR, KRDR, RKDR, KKDR, RRDK, KRDK, RKDK, KKDK.

Аминокислоты, входящие в состав последовательности R¹-R²-R³-R⁴, являются левовращающими или правовращающими. При этом пептидное соединение может представлять собой водный раствор, или лиофилизат.Amino acids included in the sequence R ¹ -R ² -R ³ -R ⁴ are levorotatory or dextrorotatory. In this case, the peptide compound may be an aqueous solution, or a lyophilisate.

Поставленная задача решается также созданием фармацевтической композиции, обладающей анальгетическим действием, включающей активный компонент - пептидное соединение указанной формулы в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.The problem is also solved by the creation of a pharmaceutical composition having an analgesic effect, including an active component - a peptide compound of the specified formula in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.

Активный компонент и носитель могут быть взяты в следующем соотношении компонентов, мас. %: активный компонент - 1-95, носитель - остальное. Содержание активного компонента в однократной дозе может составлять составляет 10 - 400 мг.The active component and the carrier can be taken in the following ratio of components, wt. %: active component - 1-95, carrier - the rest. The content of the active component in a single dose may be 10 to 400 mg.

Композиция может быть выполнена в форме для внутривенного, внутримышечного, спинального, эпидурального, мукозального, чрескожного, парентерального, перорального, энтерального, интраназального или ректального введения, например, в форме порошка, пластыря, свечи, раствора, суспензии, крема, мази, таблетированной или капсулированной форме.The composition may be in the form for intravenous, intramuscular, spinal, epidural, mucosal, transdermal, parenteral, oral, enteral, intranasal or rectal administration, for example, in the form of a powder, patch, suppository, solution, suspension, cream, ointment, tablet or encapsulated form.

Носитель может быть выбран из группы: вода, этанол, глицерол, физиологический раствор. Носитель дополнительно может содержать эмульгирующий агент и/или буферный агент. Носитель может быть выбран из группы: полиэтиленгликоль, лактоза, магнезиум карбонат, тальк.The carrier may be selected from the group: water, ethanol, glycerol, saline. The carrier may further comprise an emulsifying agent and / or a buffering agent. The carrier can be selected from the group: polyethylene glycol, lactose, magnesium carbonate, talc.

Поставленная задача решается также созданием способа купирования болевого синдрома, включающего введение фармацевтической композиции в терапевтически приемлемом количестве. Композиция может быть использована в разовой дозировке с содержанием активного компонента не более 400 мг, при этом суточная дозировка активного компонента составляет не более 600 мг для пациентов с массой тела 50-100 кг.The problem is also solved by creating a method of stopping pain, including the introduction of a pharmaceutical composition in a therapeutically acceptable amount. The composition can be used in a single dosage with an active component content of not more than 400 mg, while the daily dosage of the active component is not more than 600 mg for patients with a body weight of 50-100 kg.

Совокупность существенных признаков заявляемого синтетического пептида и анальгетического средства на его основе позволяет достичь следующего технического результата. Создано высокоэффективное синтетическое анальгетическое средство типа большого анальгетика, способного к применению в замещающей терапии, при этом не вызывающее вредных побочных фармакологических эффектов, прежде всего, интоксикации и привыкания. Поскольку нет привыкания и побочных вредных действий, в отличие, например, от трамадола, а также отсутствует вероятность возникновения отложенных негативных эффектов из-за воздействия на геном, как это могло бы иметь место при действии трипептидов (RER), то заявляемое средство, можно начинать принимать в максимальных для данного средства однократных дозах (от 1 до 60 мг в сутки) и практически сразу снимать острую боль (1 фаза), а затем и тоническую (2 фаза). Указанный эффект достигается в результате тонкого механизма специфического воздействия указанной субстанции пептидной природы на ее молекулярную мишень - медленные натриевые каналы (Na_V1.8), ответственные за импульсное кодирование болевых сигналов и неожиданного проявления коротким пептидом уникальной способности обеспечить купирование хронической боли в течение длительного периода времени (не менее четырех-шести часов при однократном воздействии), сравнимого по своей длительности с эффектом больших анальгетиков.The set of essential features of the claimed synthetic peptide and an analgesic agent based on it allows you to achieve the following technical result. A highly effective synthetic analgesic has been created, such as a large analgesic, which can be used in replacement therapy, while not causing harmful side pharmacological effects, primarily intoxication and addiction. Since there is no addiction and adverse side effects, unlike, for example, tramadol, and there is no likelihood of delayed negative effects due to exposure to the genome, as could be the case with tripeptides (RER), the claimed drug can be started take in single doses maximum for this remedy (from 1 to 60 mg per day) and relieve acute pain almost immediately (phase 1), and then tonic (phase 2). The indicated effect is achieved as a result of the subtle mechanism of the specific effect of this substance of a peptide nature on its molecular target - slow sodium channels (Na _V 1.8), which are responsible for impulse coding of pain signals and the unexpected manifestation by a short peptide of the unique ability to provide relief of chronic pain over a long period of time ( at least four to six hours with a single exposure), comparable in duration to the effect of large analgesics.

Удлинение аминокислотной последовательности до уровня тетрапептидов позволяет обойти проблему потери специфичности действия разрабатываемого анальгетика. Ее решение было осуществлено следующим образом. В процессе исследования методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp method) в конфигурации целой клетки (whole cell) была изучена возможность проявления положительно заряженными аргининсодержащими тетрапептидами способности модулировать функционирование медленных натриевых каналов Na_V1.8, ответственных за кодирование и передачу в центральную нервную систему ноцицептивной информации. Из литературных данных известно [Молекулярный механизм модуляции трипептидом возбудимости мембраны ноцицептивного нейрона, авт. Шелых Т.Н., Рогачевский И.В., Ноздрачев А.Д., Веселкина О.С., Подзорова С.А., Крылов Б.В., Плахова В.Б., доклады академии наук, Том 466, №6, 2016, с. 734], что свободная молекула аргинина (R) и молекула дипептида RR не оказали влияния на электрофизиологические характеристики каналов Na_V1.8, в то время как молекула трипептида RER, приложенная в форме Ac-RER-NH₂ в концентрации 1 мкмоль/л, вызывала достоверное снижение величины эффективного заряда их активационного воротного устройства от Z_eff=6.6±0.3 (n=24) до Z_eff=4.6±0.4 (n=14). По-видимому, данный пептид связывается непосредственно с аминокислотной последовательностью этого канала.The extension of the amino acid sequence to the level of tetrapeptides circumvents the problem of loss of specificity of action of the developed analgesic. Her decision was implemented as follows. In the process of studying the method of local fixation of the potential (patch-clamp method) in the configuration of the whole cell (whole cell), the possibility of the manifestation by positively charged arginine-containing tetrapeptides of the ability to modulate the functioning of the slow sodium channels Na _V 1.8, responsible for coding and transmission of nociceptive information to the central nervous system, was studied . From the literature data it is known [The molecular mechanism of modulation by the tripeptide of the excitability of the membrane of a nociceptive neuron, ed. Shelykh T.N., Rogachevsky I.V., Nozdrachev A.D., Veselkina O.S., Podzorova S.A., Krylov BV, Plakhova VB, reports of the Academy of Sciences, Volume 466, No. 6, 2016, p. 734] that the free arginine (R) molecule and the RR dipeptide molecule did not affect the electrophysiological characteristics of Na _V 1.8 channels, while the RER tripeptide molecule, applied in the form of Ac-RER-NH ₂ at a concentration of 1 μmol / L, caused a significant decrease in the effective charge of their activation gate device from Z _eff = 6.6 ± 0.3 (n = 24) to Z _eff = 4.6 ± 0.4 (n = 14). Apparently, this peptide binds directly to the amino acid sequence of this channel.

Однако, как было отмечено выше, действие этого трипептида может вызвать негативные побочные эффекты из-за прямого (неспецифического) воздействия на геном. Для устранения этого недостатка были проведены соответствующие исследования.However, as noted above, the effect of this tripeptide can cause negative side effects due to direct (non-specific) effects on the genome. To eliminate this drawback, relevant studies have been conducted.

Указанный трипептид был заменен на тетрапептид путем добавления к аминокислотной последовательности еще одного аргинильного остатка. В результате было обнаружено, что тетрапептид Ac-RERR-NH₂, характеризующийся увеличенной длиной аминокислотной последовательности атакующего пептида до четырех аминокислот, вызывает достоверное снижение величины Z_eff до 4.6±0.3 (n=23) в концентрации 100 нмоль/л, что на порядок эффективнее, чем действие Ac-RER-NH₂. Это свидетельствует о более высокой специфичности действия заявляемого тетрапептида при связывании со своей молекулярной мишенью (каналами Na_V1.8) по сравнению с молекулой Ac-RER-NH₂. Очевидно, что чем ниже действующая концентрация атакующей молекулы, тем менее вероятно ее взаимодействие с другими белками, активация которых может стать причиной негативных побочных эффектов.The indicated tripeptide was replaced by a tetrapeptide by adding another arginyl residue to the amino acid sequence. As a result, it was found that the Ac-RERR-NH ₂ tetrapeptide, characterized by an increased amino acid sequence length of the attacking peptide to four amino acids, causes a significant decrease in the Z _eff value to 4.6 ± 0.3 (n = 23) at a concentration of 100 nmol / L, which is an order of magnitude more effective than the action of Ac-RER-NH ₂ . This indicates a higher specificity of the action of the claimed tetrapeptide upon binding to its molecular target (Na _V 1.8 channels) as compared with the Ac-RER-NH ₂ molecule. Obviously, the lower the active concentration of the attacking molecule, the less likely it is to interact with other proteins, the activation of which can cause negative side effects.

Таким образом, возможно использование тетрапептида в более низких концентрациях при сохранении терапевтического эффекта, что в свою очередь снижает вероятность его взаимодействия с геном, поскольку он уже задействован в связывании со своей мишенью - ионным каналом.Thus, it is possible to use the tetrapeptide at lower concentrations while maintaining the therapeutic effect, which in turn reduces the likelihood of its interaction with the gene, since it is already involved in binding to its target - the ion channel.

Помимо этого, удлинение аминокислотной последовательности делает невозможным прямое действие на геном указанной молекулы в примененной концентрации. В отличие от эффектов трипептидов, в мировой литературе отсутствуют доказательства изменения экспрессии генов или фенотипа клетки, вызванных механизмами, обусловленными действием тетрапептидов на последовательности ДНК.In addition, lengthening the amino acid sequence makes it impossible to directly affect the genome of the indicated molecule in the applied concentration. In contrast to the effects of tripeptides, there is no evidence in the world literature of changes in gene expression or cell phenotype caused by mechanisms due to the action of tetrapeptides on the DNA sequence.

Аргинильные остатки в составе молекулы Ac-RERR-NH₂ непосредственно ответственны за высокоспецифическое связывание атакующей молекулы с ее молекулярной мишенью (каналом Na_V1.8) за счет ион-ионных взаимодействий. Остаток глутаминовой кислоты отвечает за поддержание продуктивной конформации тетрапептида. Это означает, что замена любого из аргининов (R) на лизин (K), несущий положительный заряд в боковой цепи на сравнимом расстоянии от пептидного скелета, равно как и замена глутаминовой кислоты (Е) на также отрицательно заряженную аспарагиновую кислоту (D) приводит к получению тетрапептида, проявляющего эффект, аналогичный наблюдаемому для Ac-RERR-NH₂. Инверсия аминокислотной последовательности тетрапептида с одновременной заменой составляющих его аминокислот на их правовращающие стереоизомеры также сохраняет проявляемый эффект. К тому же, природа защитных групп на N- и С-концах короткого пептида не влияет на его способность модулировать функционирование каналов Na_V1.8, если эти группы не обладают большим объемом и, тем самым, не препятствуют образованию лиганд-рецепторного комплекса. Основной вклад в энергетику образования лиганд-рецепторного комплекса вносят высокоэнергетические ион-ионные связи между положительно заряженными гуанидиновыми группами боковых цепей двух аргинильных остатков молекулы Ac-RERR-NH₂ и отрицательно заряженными нуклеофильными группами в составе молекулярной мишени - указанного ионного канала. Поскольку свободная молекула аргинина и дипептид Ac-RR-NH₂ не проявили эффекта при исследовании методом локальной фиксации потенциала, можно сделать вывод, что для связывания с каналом Na_V1.8 необходимо наличие как минимум двух положительно заряженных групп в составе атакующей молекулы, причем данные группы должны быть соответствующим образом ориентированы и располагаться на определенном расстоянии друг от друга для обеспечения возможности наиболее энергетически выгодного связывания тетрапептида по условной модели «вилка-розетка». Трипептид Ac-RER-NH₂, удовлетворяет этому требованию, но не самым оптимальным образом, что проявляется в необходимости применения указанного агента в относительно высокой концентрации для достижения анальгетического эффекта. Эта высокая концентрация является причиной того, что трипептид Ac-RER-NH₂ может преодолеть все мембранные барьеры и осуществить взаимодействие с молекулой ДНК, вызывая негативные побочные эффекты. Тетрапептид Ac-RERR-NH₂ лишен этого недостатка благодаря своей молекулярной структуре.The arginine residues in the Ac-RERR-NH ₂ molecule are directly responsible for the highly specific binding of the attacking molecule to its molecular target (channel Na _V 1.8) due to ion-ion interactions. The glutamic acid residue is responsible for maintaining the productive conformation of the tetrapeptide. This means that replacing any of the arginines (R) with lysine (K), which carries a positive charge in the side chain at a comparable distance from the peptide skeleton, as well as replacing glutamic acid (E) with also negatively charged aspartic acid (D) leads to obtaining a tetrapeptide exhibiting an effect similar to that observed for Ac-RERR-NH ₂ . Inversion of the amino acid sequence of the tetrapeptide with the simultaneous replacement of its constituent amino acids with their dextrorotatory stereoisomers also retains the manifested effect. Moreover, the nature of the protective groups at the N- and C-ends of the short peptide does not affect its ability to modulate the functioning of Na _V 1.8 channels, if these groups do not have a large volume and, thus, do not prevent the formation of a ligand-receptor complex. The main contribution to the energy of formation of the ligand-receptor complex is made by high-energy ion-ion bonds between the positively charged guanidine groups of the side chains of two arginyl residues of the Ac-RERR-NH ₂ molecule and the negatively charged nucleophilic groups in the molecular target - the specified ion channel. Since the free arginine molecule and the Ac-RR-NH ₂ dipeptide did not show an effect when investigated by local potential fixation, it can be concluded that at least two positively charged groups in the attacking molecule are required for binding to the Na _V 1.8 channel, and these groups should be properly oriented and located at a certain distance from each other to ensure the possibility of the most energy-efficient binding of the tetrapeptide according to the conditional plug-socket model. The tripeptide Ac-RER-NH ₂ satisfies this requirement, but not in the most optimal way, which is manifested in the need to use the specified agent in a relatively high concentration to achieve an analgesic effect. This high concentration is the reason that the Ac-RER-NH ₂ tripeptide can overcome all membrane barriers and interact with the DNA molecule, causing negative side effects. The tetrapeptide Ac-RERR-NH _{2 is} free from this drawback due to its molecular structure.

Анализ структуры молекулы Ac-RERR-NH₂ позволяет предположить, что указанное расстояние, за которое было принято расстояние между центральными атомами углерода гуанидиновых групп, находится в интервале 14±6.

. Такая модель «вилка-розетка» с указанным интервалом расстояний между центральными атомами углерода гуанидиновых групп является неочевидной, не следующей из уровня техники.Analysis of the structure of the Ac-RERR-NH ₂ molecule suggests that the indicated distance, for which the distance between the central carbon atoms of the guanidine groups was taken, is in the range of 14 ± 6.

. Such a “plug-socket” model with a specified interval of distances between the central carbon atoms of the guanidine groups is not obvious, not the following from the prior art.

Обобщая вышеприведенные данные, можно заключить, что анальгетическими свойствами обладают следующие тетрапептиды, характеризующиеся набором защитных групп на N- и С-концах, а также незащищенных концевых групп:Summarizing the above data, we can conclude that the following tetrapeptides, characterized by a set of protective groups at the N- and C-ends, as well as unprotected end groups, possess analgesic properties:

1. RERR, RERK, REKR, REKK, KERR, KEKR, KERK, KEKK, RDRR, RDRK, RDKR, RDKK, KDRR, KDRK, KDKR, KDKK.1. RERR, RERK, REKR, REKK, KERR, KEKR, KERK, KEKK, RDRR, RDRK, RDKR, RDKK, KDRR, KDRK, KDKR, KDKK.

2. также инвертированные цепочки, состоящие из D-аминокислот: RRER, KRER, RKER, KKER, RREK, RKEK, KREK, KKEK, RRDR, KRDR, RKDR, KKDR, RRDK, KRDK, RKDK, KKDK.2. also inverted chains consisting of D-amino acids: RRER, KRER, RKER, KKER, RREK, RKEK, KREK, KKEK, RRDR, KRDR, RKDR, KKDR, RRDK, KRDK, RKDK, KKDK.

Заявляемая композиция (средство) с использованием тетрапептида может быть выполнена в любой форме для систематического приема - как для наружного, так и внутреннего применения в виде раствора, порошка, крема, геля, капсулы, пластыря, свечей. Средство может быть использовано для парентерального, орального, инвазивного (в том числе пролонгированного) приема, ингаляций, распыления на кожу и т.д. Заявляемое средство способно воздействовать однократно (одномоментно) и может быть приготовлено в форме для пролонгированного действия (пластырь, свеча, имплантат).The inventive composition (agent) using tetrapeptide can be made in any form for systematic administration - both for external and internal use in the form of a solution, powder, cream, gel, capsule, patch, candles. The tool can be used for parenteral, oral, invasive (including prolonged) administration, inhalation, spraying on the skin, etc. The inventive tool is able to act once (simultaneously) and can be prepared in a form for prolonged action (patch, candle, implant).

Заявляемое средство нетоксично, так как нетоксично его активное начало, имеющее эндогенную пептидную природу. Активное начало для заявляемого средства технологически доступно. Его синтез из аминокислот является рутинной процедурой. Кроме того, возможен более дешевый микробиологический способ получения тетрапептида.The inventive tool is non-toxic, since its active principle, having an endogenous peptide nature, is non-toxic. The active principle for the inventive tool is technologically available. Its synthesis from amino acids is a routine. In addition, a cheaper microbiological method for producing the tetrapeptide is possible.

Заявляемое средство отличается от известных аналогов, прежде всего морфина и трамадола, существенными признаками, связанными с эндогенной природой активного начала (короткий пептид). Способность короткого пептида к анальгетической активности была открыта автором изобретения случайно. Уникальный механизм его действия, который по сути, отрицает привыкание к препарату, раскрыт так же автором изобретения. Следует подчеркнуть, что исследователям до сих пор не удавалось разработать большие анальгетики, которые сами по себе не вызывают привыкания.The inventive tool differs from known analogues, primarily morphine and tramadol, with significant features associated with the endogenous nature of the active principle (short peptide). The ability of a short peptide to analgesic activity was discovered by the inventor by chance. The unique mechanism of its action, which, in fact, denies addiction to the drug, is also disclosed by the author of the invention. It should be emphasized that the researchers have so far failed to develop large analgesics, which in themselves are not addictive.

Заявляемый способ купирования боли позволяет достичь абсолютно безопасного эффекта долговременного облегчения хронической и острой боли, длящегося в течении 4-6 часов после однократного введения действующей субстанции, что сравнимо с известными эффектами действия опиатов. Заявляемый способ купирования боли является щадящим, так как используемое в нем средство безопасно, а механизм его воздействия сугубо избирателен. Использование средства не вызывает привыкания и, следовательно, необходимости постоянного увеличения дозы лекарства. Заявляемый способ отличается от известного рядом существенных признаков: использованием нового анальгетического средства в определенных дозах, универсальными возможностями применения лекарства - при самых разных видах приема: наружно, в том числе в виде крема (геля), имплантатов (подшитых капсул), пластырей, и в виде приема внутрь (порошки, таблетки, уколы, ингаляции). Из уровня техники не известно способов лечения хронической боли, при реализации которых происходит подобное тонкое избирательное воздействие на соответствующие каналы и активация сигнального пути передачи ноцицептивной информации, приводящая к купированию хронической боли без интоксикации, привыкания.The inventive method of pain relief allows you to achieve an absolutely safe effect of long-term relief of chronic and acute pain, lasting for 4-6 hours after a single injection of the active substance, which is comparable with the known effects of opiates. The inventive method of stopping pain is gentle, since the tool used in it is safe, and the mechanism of its effect is purely selective. The use of the drug is not addictive and, therefore, the need for a constant increase in the dose of the drug. The inventive method differs from the known significant features: the use of a new analgesic in certain doses, the universal possibilities of using the drug for a variety of methods: externally, including in the form of cream (gel), implants (hemmed capsules), plasters, and oral administration (powders, tablets, injections, inhalations). The prior art does not know how to treat chronic pain, the implementation of which there is a similar subtle selective effect on the corresponding channels and activation of the signaling pathway for the transmission of nociceptive information, leading to the relief of chronic pain without intoxication, addiction.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг. 1 представлены результаты формалинового теста, а именно интенсивность паттернов вылизывания, подтверждающие достижение анальгетического эффекта.In FIG. 1 presents the results of the formalin test, namely the intensity of the licking patterns, confirming the achievement of the analgesic effect.

На фиг. 2 представлены результаты формалинового теста, а именно паттернов сгибаний + встряхиваний, подтверждающие достижение анальгетического эффекта.In FIG. 2 presents the results of the formalin test, namely the patterns of flexion + shaking, confirming the achievement of the analgesic effect.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Синтез заявляемого синтетического тетрапептида из аминокислот является рутинной процедурой. Также возможен более дешевый микробиологический способ получения тетрапептидов.The synthesis of the claimed synthetic tetrapeptide from amino acids is a routine procedure. A cheaper microbiological method for producing tetrapeptides is also possible.

Для приготовления фармацевтической композиции (средства), пептид формулы (I) смешивают, по крайней мере, с одним фармацевтически пригодным наполнителем (носителем). Подходящие наполнители и носители хорошо известны в данной области техники (см., например, ''Handbook of Pharmaceutical Excipients''' 5th Edition by Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, Sian C. Owen (2005), APhA Publications).To prepare a pharmaceutical composition (agent), a peptide of formula (I) is mixed with at least one pharmaceutically acceptable excipient (carrier). Suitable excipients and carriers are well known in the art (see, for example, Handbook of Pharmaceutical Excipients 5th Edition by Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, Sian C. Owen (2005), APhA Publications).

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть представлена в твердой или жидкой форме, например, в виде таблеток, капсул, жидкостей, инфузий и суппозиториев, изготовленных по известной технологии (см., например, "Pharmaceutical Formulation Development of Compounds" by Sven Frokjaer (1999), CRC; "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations" by Sarfaraz K. Niazi (2004), CRC.The pharmaceutical composition in accordance with the present invention can be presented in solid or liquid form, for example, in the form of tablets, capsules, liquids, infusions and suppositories made by known technology (see, for example, "Pharmaceutical Formulation Development of Compounds" by Sven Frokjaer (1999), CRC; "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations" by Sarfaraz K. Niazi (2004), CRC.

Для приготовления твердых форм композиций активное начало соединяют с, по меньшей мере, одним наполнителем, выбранным из группы: лактоза, магнезиум карбонат, целлюлоза и ее производные (например, микрокристаллическая целлюлоза); полиолы (лактоза и ее производные, сахароза, мальтоза, фруктоза); сорбит; маннит; поливинилпирролидон и его сополимеры; соли неорганических соединений (например, кальция карбонат); кальция фосфат, кальция дигидрофосфат, кальция гидрофосфат дигидрат, кальция сульфат дигидрат) и т.д. При приготовлении твердых форм могут быть использованы вспомогательные вещества с сорбционной способностью: коллоидный кремний (аэросил, Syloid® (Grace, США)), алюмометасиликат магния (Neusilin®, Fuji, Япония).To prepare solid forms of compositions, the active principle is combined with at least one filler selected from the group: lactose, magnesium carbonate, cellulose and its derivatives (for example, microcrystalline cellulose); polyols (lactose and its derivatives, sucrose, maltose, fructose); sorbitol; mannitol; polyvinylpyrrolidone and its copolymers; salts of inorganic compounds (e.g. calcium carbonate); calcium phosphate, calcium dihydrogen phosphate, calcium hydrogen phosphate dihydrate, calcium sulfate dihydrate), etc. When preparing solid forms, excipients with sorption ability can be used: colloidal silicon (Aerosil, Syloid® (Grace, USA)), magnesium aluminum metasilicate (Neusilin®, Fuji, Japan).

В качестве связывающего вещества может быть использовано, по меньшей мере, одно, выбранное из группы: крахмальный клейстер, растворы: карбоксиметилцеллюлозы, оксиэтилцеллюлозы, оксипропилметилцеллюлозы; поливинилового спирта, поливинилпирролидона, натрия альгината, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы. В качестве растворителя для приготовления раствора связывающего вещества может быть использовано, по меньшей мере, одно, выбранное из группы: вода очищенная, спирт этиловый, хлороформ.At least one selected from the group can be used as a binder: starch paste, solutions: carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose; polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium alginate, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose. As a solvent for the preparation of a binder solution, at least one selected from the group can be used: purified water, ethyl alcohol, chloroform.

В случае необходимости добавляют разрыхляющие вещества. В качестве разрыхляющего вещества может быть использовано, по меньшей мере, одно, выбранное из группы: крахмал (пшеничный, картофельный, кукурузный); пектин, натрий карбоксиметилцеллюлоза; поливинилпирролидон, кроскармеллоза натрия, крахмал прежелатизированный, карбоксиметилированный).If necessary, add loosening substances. At least one selected from the group may be used as a loosening agent: starch (wheat, potato, corn); pectin, sodium carboxymethyl cellulose; polyvinylpyrrolidone, croscarmellose sodium, pregelatized starch, carboxymethylated).

В качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) может быть использовано, по меньшей мере, одно, выбранное из группы: олеат натрия, лаурилсульфат натрия.At least one selected from the group: sodium oleate, sodium lauryl sulfate can be used as a surfactant.

В качестве вспомогательного вещества, предотвращающего налипание и обеспечивающего выталкивание из матрицы (антифрикционное вещество), может быть использовано, по меньшей мере, одно, выбранное из группы: стеариновая кислота и/или ее соли, коллоидный кремний (аэросил).At least one selected from the group: stearic acid and / or its salts, colloidal silicon (aerosil) can be used as an auxiliary substance that prevents sticking and ensures ejection from the matrix (antifriction substance).

Фармацевтическая композиция в ТЛФ в виде таблеток или капсул, получают методом прямого прессования, влажного и сухого гранулирования, а также пеллетизацией.The pharmaceutical composition in TLF in the form of tablets or capsules is obtained by direct compression, wet and dry granulation, as well as pelletization.

Жидкую композицию приготавливают растворением или суспендированием активного начала в воде, физиологическом растворе, глицероле, этаноле и т.д. с добавлением при необходимости эмульгирующих агентов, рН буферных агентов. Как правило, используют 1-95%-ный водный раствор активного начала.A liquid composition is prepared by dissolving or suspending the active principle in water, physiological saline, glycerol, ethanol, etc. with the addition of, if necessary, emulsifying agents, pH buffering agents. As a rule, use 1-95% aqueous solution of the active principle.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения композиция может дополнительно включать, по крайней мере, один дополнительный фармацевтически активный компонент. Например, антиоксиданты, такие как витамины, могут рассматриваться как дальнейшие активные компоненты, поскольку антиоксиданты ингибируют окисление или подавляют реакции, стимулируемые кислородом, свободными радикалами кислорода, реакционноспособными формами кислорода, включая пероксиды. Антиоксиданты, пригодные в настоящем изобретении, предпочтительно являются антиоксидантными витаминами, которые могут быть выбраны из группы, состоящей из всех форм витамина А, включая ретиналь и 3,4-дидегидроретиналь, все формы каротина, такие как α-каротин, β-каротин, γ-каротин, δ-каротин, все формы витамина С (D-аскорбиновую кислоту, L-аскорбиновую кислоту), все формы токоферола, такие как витамин Е (α-токоферол, 3,4-дигидро-2,5,7,8-тетраметил-2-(4,8,12-триметилтридецил)-2Н-1-бензопиран-6-ол), β-токоферол, γ-токоферол, δ-токоферол, токохинон, токотриенол и эфиры витамина Е, которые легко подвергаются гидролизу до витамина Е, такие как витамин Е ацетат и витамин Е сукцинат, и фармацевтически пригодные соли витамина Е, такие как витамин Е фосфат, пролекарства витамина А, каротина, витамина С и витамина Е, фармацевтически приемлемые соли витамина А, каротина, витамина С и витамина Е и т.п. и их смесей.In accordance with a preferred embodiment of the present invention, the composition may further include at least one additional pharmaceutically active component. For example, antioxidants, such as vitamins, can be considered as further active ingredients, since antioxidants inhibit oxidation or suppress reactions stimulated by oxygen, free oxygen radicals, reactive forms of oxygen, including peroxides. The antioxidants useful in the present invention are preferably antioxidant vitamins that can be selected from the group consisting of all forms of vitamin A, including retinal and 3,4-didehydroretinal, all forms of carotene, such as α-carotene, β-carotene, γ -carotene, δ-carotene, all forms of vitamin C (D-ascorbic acid, L-ascorbic acid), all forms of tocopherol, such as vitamin E (α-tocopherol, 3,4-dihydro-2,5,7,8- tetramethyl-2- (4,8,12-trimethyltridecyl) -2H-1-benzopyran-6-ol), β-tocopherol, γ-tocopherol, δ-tocopherol, tocoquinone, tocotrienol Vitamin E esters that are easily hydrolyzed to Vitamin E, such as Vitamin E acetate and Vitamin E succinate, and pharmaceutically acceptable salts of Vitamin E, such as Vitamin E phosphate, prodrugs of Vitamin A, carotene, Vitamin C and Vitamin E, pharmaceutically acceptable salts vitamin A, carotene, vitamin C and vitamin E, etc. and mixtures thereof.

Для подтверждения анальгетического действия заявляемого синтетического пептида и отсутствия побочных фармакологических эффектов, прежде всего интоксикации и привыкания были проведены эксперименты, где в качестве тестируемого тетрапептида использовалось соединение формулы Ac-RERR-NH₂.To confirm the analgesic effect of the claimed synthetic peptide and the absence of side pharmacological effects, primarily intoxication and addiction, experiments were carried out where a compound of the formula Ac-RERR-NH _{2 was} used as the tested tetrapeptide.

Для подтверждения соответствия заявляемого решения требованию «промышленная применимость», а также для лучшего понимания сущности изобретения ниже представлены примеры его конкретной реализации, которые не ограничивают заявляемое изобретение.To confirm the conformity of the proposed solution to the requirement of "industrial applicability", as well as to better understand the essence of the invention, examples of its specific implementation are presented below, which do not limit the claimed invention.

Пример 1. Способ получения тетрапептида формулы Ac-RERR-NH₂.Example 1. A method of obtaining a tetrapeptide of the formula Ac-RERR-NH ₂ .

Пептид заявляемой формулы был получен методом классического пептидного синтеза (Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт. Аминокислоты. Пептиды. Белки. Москва, Мир, 1985. 339 с.) с применением реактивов и производных аминокислот фирм "Sigma Chemical Co." (США), "Iris Biotech GmbH" (Германия), растворителей производства компаний "Экос-1" и "Криохром" (Россия). Конечный продукт характеризовали с помощью аналитической ВЭЖХ (чистота >95%) и масс-спектрометрии.The peptide of the claimed formula was obtained by the classical peptide synthesis method (H.-D. Yakubke, X. Escherkite. Amino acids. Peptides. Proteins. Moscow, Mir, 1985. 339 pp.) Using reagents and amino acid derivatives of Sigma Chemical Co. (USA), "Iris Biotech GmbH" (Germany), solvents produced by the companies "Ecos-1" and "Cryochrom" (Russia). The final product was characterized by analytical HPLC (purity> 95%) and mass spectrometry.

Пример 2. Способ получения фармацевтической композиций, содержащей в качестве активного компонента тетрапептид формулы Ac-RERR-NH₂, представленной в форме крема, и подтверждение его анальгетического действия.Example 2. A method of obtaining pharmaceutical compositions containing, as an active component, a tetrapeptide of the formula Ac-RERR-NH ₂ , presented in the form of a cream, and confirmation of its analgesic effect.

Для чрезкожной доставки действующей пептидной субстанций был подобран оптимальный состав кремовой основы с учетом совместимости ее компонентов. Пептиды способны проникнуть через эпидермис, если помещены в амфифильную базу. Стандартная эмульсия является амфифильной базой и работает как система доставки пептида к глубоким слоям рогового слоя эпидермиса. Использование осмолитиков, таких как увлажнители (карбопол, гиалуроновая кислота), может обеспечить проникновение пептида до зернистого слоя эпидермиса. Здесь использован компонент Карбопол, который является проводником активных компонентов через эпидермис и не оказывает влияния на свойства активного компонента (тетрапептида), в сочетании с Триэтаноламином. Сначала была замешана кремовая основа, проверена ее стабильность в течение 1 (Одного) месяца (отсутствие изменения показателя рН более чем на 0,3 единицы, проверка коллоидной и термической стабильности и микробиологической чистоты). Затем в кремовую основу был введен тетрапептид (в количестве 1.0%). Никаких изменений внешнего вида рецептуры не произошло. Кремовая композиция, содержащая тетрапептид, была использована для получения клинических впечатлений после получения разрешительных документов (исходя из требований Технического Регламента Таможенного Союза 009/2011) на использование кремовой композиции в качестве косметического средства. Разработанная рецептура представлена в таблице 1.For the transdermal delivery of the active peptide substances, the optimal composition of the cream base was selected taking into account the compatibility of its components. Peptides are able to penetrate the epidermis if placed in an amphiphilic base. The standard emulsion is an amphiphilic base and works as a system for delivering the peptide to the deep layers of the stratum corneum of the epidermis. The use of osmolytics, such as humectants (carbopol, hyaluronic acid), can ensure the penetration of the peptide to the granular layer of the epidermis. Here we used the component Carbopol, which is a conductor of active components through the epidermis and does not affect the properties of the active component (tetrapeptide), in combination with Triethanolamine. First, a cream base was kneaded, its stability was checked for 1 (One) month (no change in pH by more than 0.3 units, verification of colloidal and thermal stability and microbiological purity). Then a tetrapeptide (in an amount of 1.0%) was introduced into the cream base. No change in the appearance of the formulation has occurred. The cream composition containing the tetrapeptide was used to obtain clinical impressions after obtaining permits (based on the requirements of the Technical Regulation of the Customs Union 009/2011) on the use of the cream composition as a cosmetic product. The developed formulation is presented in table 1.

Физико-химические параметры рецептуры крема-геля с пептидной субстанцией приведены в таблице 2.Physico-chemical parameters of the formulation of a cream gel with a peptide substance are shown in table 2.

После проверки стабильности и значения водородного показателя рецептуры в кремовую основу был введен тетрапептид (в количестве 1.0%). При введении тетрапептида не произошло изменения внешнего вида и значения водородного показателя.After checking the stability and the pH value of the formulation, a tetrapeptide was introduced into the cream base (in an amount of 1.0%). With the introduction of the tetrapeptide, there was no change in the appearance and value of the hydrogen index.

В клинических подразделениях было проведено исследования анальгетического эффекта тетрапептида Ac-RERR-NH₂. Тетрапептид поступил для клинической апробации в виде стерильного 1% геля. Изучение его анальгетических свойств было выполнено на модели боли, связанной с травмой кожных покровов, а именно разреза кожи (послеоперационная боль). После обработки раны 70% раствором этилового спирта гель объемом около 1 мл втирали в рану семи пациентам после получения их информированного согласия. Все семь испытуемых отметили положительный эффект разной степени выраженности, т.е. интенсивность боли в ответ на давление на края раны становилась ниже после применения тетрапептида, чем до втирания его в рану, на 1-2 единицы (5-балльная вербальная шкала оценки боли (Frank A. J. М., Moll J. М. Н., Hort J.F., A comparison of three ways of measuring pain. Rheumatology and Rehabilitation 21, 211-217, 1982). В контрольной группе, состоящей из такого же числа испытуемых, интенсивность боли снизилась на единицу лишь у двух пациентов в ответ на воздействие стерильного геля, не содержащего активный компонент (тетрапептид).In the clinical units, the analgesic effect of the tetrapeptide Ac-RERR-NH _{2 was} studied. The tetrapeptide was received for clinical testing in the form of a sterile 1% gel. The study of its analgesic properties was performed on a model of pain associated with an injury to the skin, namely a skin incision (postoperative pain). After treating the wound with a 70% ethyl alcohol solution, a gel of about 1 ml was rubbed into seven patients after receiving their informed consent. All seven subjects noted a positive effect of varying severity, i.e. the intensity of pain in response to pressure on the edges of the wound became lower after applying the tetrapeptide than before rubbing it into the wound, by 1-2 units (5-point verbal scale for assessing pain (Frank AJ M., Moll J. M. N., Hort JF, A comparison of three ways of measuring pain (Rheumatology and Rehabilitation 21, 211-217, 1982). In a control group of the same number of subjects, the pain intensity decreased by one in only two patients in response to a sterile gel, not containing an active component (tetrapeptide).

Таким образом, полученный результат говорит о явном анальгетическом эффекте тетрапептида Ac-RERR-NH₂.Thus, the result indicates a clear analgesic effect of the tetrapeptide Ac-RERR-NH ₂ .

Пример 3. Фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного компонента тетрапептиды формул, представленные в различных фармацевтических формах.Example 3. Pharmaceutical compositions containing, as an active component, tetrapeptides of the formulas presented in various pharmaceutical forms.

1. Порошок, включающий активное начало - короткий пептид - в количестве от 10 мг (1 мас. %) и наполнитель - лактозу.1. A powder comprising an active principle - a short peptide - in an amount of 10 mg (1 wt.%) And a filler - lactose.

2. Порошок, включающий активное начало - короткий пептид - в количестве 100 мг (95 мас. %) и наполнитель - лактозу.2. A powder comprising an active principle — a short peptide — in an amount of 100 mg (95 wt.%) And a filler — lactose.

3. Порошок, включающий активное начало - короткий пептид - в количестве 50 мг (10 мас. %) и наполнитель - лактозу.3. A powder comprising an active principle - a short peptide - in an amount of 50 mg (10 wt.%) And a filler - lactose.

4. Порошок, включающий активное начало - короткий пептид - в количестве 10 мг (1 мас.%) и наполнитель - полиэтиленгликоль.4. A powder comprising an active principle - a short peptide - in an amount of 10 mg (1 wt.%) And a filler is polyethylene glycol.

5. Порошок, включающий активное начало - короткий пептид - в количестве от 100 мг (90 мас. %) и наполнитель - магнезиум карбонат.5. Powder, including the active principle - a short peptide - in an amount of 100 mg (90 wt.%) And filler - magnesium carbonate.

6. Таблетированная форма, включающая активное начало - короткий пептид - в количестве от 100 мг (80 мас. %) и наполнитель - магнезиум карбонат.6. The tablet form, including the active principle - a short peptide - in an amount of 100 mg (80 wt.%) And filler - magnesium carbonate.

7. Пластырь, с нанесенным на него заявляемым средством, включающим активное начало - короткий пептид - в количестве 400 мг (70 мас. %).7. A patch with the claimed agent applied thereon, including the active principle — a short peptide — in an amount of 400 mg (70 wt.%).

8. Капсула, включающая активное начало - короткий пептид - в количестве от 400 мг (70 мас. %).8. The capsule, including the active principle - a short peptide - in an amount of 400 mg (70 wt.%).

9. 0,5%-ный водный раствор для инъекций, включающий активное начало - короткий пептид - в количестве от 100 мг.9. 0.5% aqueous solution for injection, including the active principle - a short peptide - in an amount of 100 mg.

10. 0,5%-ный раствор в физиологическом растворе для ингаляций, включающий активное начало - короткий пептид - в количестве 100 мг.10. 0.5% solution in saline for inhalation, including the active principle - a short peptide - in the amount of 100 mg.

11. 0,5%-ную суспензию в глицероле для опрыскивания, включающую активное начало - короткий пептид - в количестве 100 мг.11. A 0.5% suspension in glycerol for spraying, including the active principle - a short peptide - in an amount of 100 mg.

Указанные составы испытаны на животных - крысах в однократных дозах и суточных дозах, определенных в приведенных выше экспериментах. Аллергических реакций не наблюдалось.These formulations were tested on animal rats in single doses and daily doses determined in the above experiments. Allergic reactions were not observed.

Эффект снятия боли после каждого применения длился не менее 4-6 часов, до 24 часов.The effect of pain relief after each application lasted at least 4-6 hours, up to 24 hours.

Показано, что устойчивый эффект купирования боли наблюдался после применения заявляемого средства в течение месяца - 50 дней и даже более - без возникновения лекарственной зависимости.It was shown that the steady effect of pain relief was observed after application of the claimed drug for a month - 50 days or more - without the occurrence of drug dependence.

При лечении заявляемыми средствами у животных не наблюдалась присущая аналогам интоксикация организма, они не испытывают рвоты.In the treatment of the claimed means in animals, the intoxication of the body inherent in analogs was not observed, they do not experience vomiting.

Эффективная суточная доза заявляемого средства была пересчитана по итогам опытов на крысах в соответствии с методикой, описанной в [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Министерство здравоохранения РФ. Фармкомитет РФ. М., 2000]. Так, суточную дозу, использованную для крысы массой 250 г, для перевода в дозу для человека массой 70 кг следует разделить на коэффициент, равный 7. Как указывалось выше, в эксперименте с крысами была использована оптимальная суточная_доза от 34 до 40 мг короткого пептида/кг массы крысы. Пересчет показывает верхний предел суточной дозы (позволяет ввести начальную безопасную по опыту работы с другими анальгетиками точку отсчета для человека для проведения дальнейших доклинических испытаний по действию и концентрациям в ту или другую сторону) для человека - до 6 мг короткого пептида/кг. Этот подход коррелирует с данными по анальгетикам, полученными в работе [Leeling J.L., Evans J.V., Helms R.J., Ryerson B.A. Disposition and metabolism of codorphone in the rat, dog, and man // Drug Metab Dispos. 1982. Nov-Dec. V. 10(6) P. 649-653], где показаны дозы для человека в 10 раз меньшие, чем у животных, из-за более быстрого метаболизма животных.The effective daily dose of the claimed drug was recalculated based on the results of experiments on rats in accordance with the method described in [Guide to experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. Ministry of Health of the Russian Federation. Pharmaceutical Committee of the Russian Federation. M., 2000]. Thus, the daily dose used for a rat weighing 250 g should be divided by a factor of 7 to be converted to a human dose of 70 kg. As indicated above, in the experiment with rats, the optimal daily dose of 34 to 40 mg of short peptide / kg was used rat mass. Recalculation shows the upper limit of the daily dose (allows you to enter an initial reference point safe for the person working with other analgesics for further preclinical tests on the effect and concentrations in one direction or another) for a person - up to 6 mg of short peptide / kg. This approach correlates with data on analgesics obtained in [Leeling J.L., Evans J.V., Helms R.J., Ryerson B.A. Disposition and metabolism of codorphone in the rat, dog, and man // Drug Metab Dispos. 1982. Nov-Dec. V. 10 (6) P. 649-653], where the doses for humans are shown to be 10 times lower than in animals, due to the faster metabolism of animals.

Таким образом, эффективная суточная доза для человека составляет до 6 мг активного начала на 1 кг живой массы, что обеспечивает терапевтический эффективный ее уровень в крови. Предпочтительная доза составляет от 4,8 до 5,7 мг на 1 кг живой массы в один или несколько дневных приемов. Определяемая врачом доза может быть получена пациентом за один прием или за несколько, а также в виде продолжительного применения.Thus, the effective daily dose for a person is up to 6 mg of active principle per 1 kg of live weight, which ensures its effective therapeutic level in the blood. The preferred dose is from 4.8 to 5.7 mg per 1 kg of live weight in one or more daily doses. The dose determined by the doctor can be received by the patient at one time or in several, as well as in the form of long-term use.

При использовании для лечения людей с массой 50-100 кг дневной прием с учетом массы тела может составлять до 300-600 мг заявляемого средства, что решается сугубо индивидуально в зависимости от состояния пациента.When used for the treatment of people weighing 50-100 kg, the daily intake, taking into account body weight, can be up to 300-600 mg of the claimed drug, which is decided purely individually depending on the condition of the patient.

Оптимальная суточная доза для постоянного применения в виде уколов каждодневно может составлять до 4-6 мг на 1 кг массы.The optimal daily dose for continuous use in the form of injections daily can be up to 4-6 mg per 1 kg of weight.

Прием заявляемого средства может быть прописан пациенту в любом виде и в любой форме: орально, ректально и т.д.Admission of the claimed funds can be prescribed to the patient in any form and in any form: orally, rectally, etc.

Возможно лечение при имплантации лекарственной субстанции внутрь организма или через кожные покровы.Treatment is possible with the implantation of a drug substance into the body or through the skin.

Возможен прием лекарства в виде порошка - назально, или в виде ингаляций аэрозолей.It is possible to take medication in the form of a powder - nasal, or in the form of aerosol inhalations.

Следует подчеркнуть, что дозы заявляемого средства не превосходят дозы известного препарата - трамадола. Суточные дозы в рамках заявленных могут назначаться в широких пределах в соответствии с индивидуальными особенностями и рекомендациями врачей.It should be emphasized that the dose of the claimed drug does not exceed the dose of the well-known drug - tramadol. Daily doses within the claimed can be prescribed in a wide range in accordance with individual characteristics and recommendations of doctors.

Возможность реализации изобретения не ограничивается приведенными выше примерами.The possibility of implementing the invention is not limited to the above examples.

Согласно результатам испытаний, получено высокоэффективное синтетическое анальгетическое средство, не вызывающее побочных фармакологических эффектов, прежде всего интоксикации и привыкания, присущих известным аналогам (морфину, трамадолу), и метод лечения хронической боли, а также метод реабилитации при наркотической и лекарственной зависимости с помощью этого средства, протекающий быстрее, чем у аналогов, и приводящий к долговременному купированию хронической боли, а также к снятию абстинентного синдрома и к значительному уменьшению рецидивов и летальных исходов.According to the test results, a highly effective synthetic analgesic agent was obtained that does not cause side pharmacological effects, especially the intoxication and addiction inherent in known analogues (morphine, tramadol), and a method for treating chronic pain, as well as a rehabilitation method for drug and drug dependence using this drug , proceeding faster than that of analogues, and leading to a long-term relief of chronic pain, as well as to relieve withdrawal symptoms and significantly reduced th recurrence and death.

Многократное повторение экспериментов показало хорошую воспроизводимость результатов.Repeated experiments showed good reproducibility of the results.

Нижние рамки интервальных параметров допустимых концентраций короткого пептида распространяются и на гомеопатические дозы; выход за верхние рамки доз возможен, но не целесообразен с точки зрения передозировки.The lower limits of the interval parameters of the permissible concentrations of the short peptide extend to homeopathic doses; going beyond the upper dose range is possible, but not advisable in terms of overdose.

Пример 4. Подтверждение анальгетического эффекта заявляемого пептида.Example 4. Confirmation of the analgesic effect of the claimed peptide.

4.1 Измерение эффективного заряда активационной воротной системы каналов Na_V1.8 методом локальной фиксации потенциала.4.1 Measurement of the effective charge of the activation gate system of channels Na _V 1.8 by the method of local potential fixation.

Эксперименты выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев новорожденных крысят линии Wistar. Для выделения нейронов был применен модифицированный метод краткосрочного культивирования (Elliott A.A., Elliott J.R. Characterization of TTX-sensitive and TTX-resistant sodium currents in small cells from adult rat dorsal root ganglia // J. Physiol. (Lond.) 1993. V. 463. P. 39-56.), обеспечивающий высокий выход жизнеспособных клеток. В работе использовались следующие стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л). Внеклеточный раствор: NaCl - 65, CaCl₂ - 2, MgCl₂ - 2, Choline Cl - 70, HEPES-Na - 10, TTX (тетродотоксин) -0.0001, рН=7.4. Внутриклеточный раствор: CsF - 100, NaCl - 10, CsCl - 40, MgCl₂ - 2, HEPES-Na - 10, pH=7.2. Исключение из вне- и внутриклеточного растворов ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование кальциевых токов (Kostyuk P.G., Krishtal О.A., Pidoplichko V.I. Effect of internal fluoride and phosphate on membrane currents during intracellular dialysis of nerve cells // Nature. 1975. V. 257. N 5528. P. 691-693). Наличие во внеклеточном растворе ионов тетродотоксина в низкой концентрации обеспечивало блокирование быстрых тетродотоксинчувствительных каналов, что делало возможным регистрировать характеристики только одной популяции натриевых каналов - медленных (тетродотоксиннечувствительных) каналов Na_V1.8. В работе использованы реактивы фирмы "Sigma". Все опыты проведены при комнатной температуре 22-24°С.The experiments were performed on cultured isolated neurons of the spinal ganglia of newborn rat pups of the Wistar strain. A modified method of short-term cultivation was used to isolate neurons (Elliott AA, Elliott JR Characterization of TTX-sensitive and TTX-resistant sodium currents in small cells from adult rat dorsal root ganglia // J. Physiol. (Lond.) 1993. V. 463 . P. 39-56.), Providing a high yield of viable cells. The following standard solutions were used in the work (concentrations are presented in mmol / l). Extracellular solution: NaCl - 65, CaCl ₂ - 2, MgCl ₂ - 2, Choline Cl - 70, HEPES-Na - 10, TTX (tetrodotoxin) -0.0001, pH = 7.4. Intracellular solution: CsF - 100, NaCl - 10, CsCl - 40, MgCl ₂ - 2, HEPES-Na - 10, pH = 7.2. The exclusion of potassium ions from the extra- and intracellular solutions made it possible to get rid of all the components of the potassium current, and the fluorine ions in the intracellular solution blocked calcium currents (Kostyuk PG, Krishtal O.A., Pidoplichko VI Effect of internal fluoride and phosphate on membrane currents during intracellular dialysis of nerve cells // Nature. 1975. V. 257. N 5528. P. 691-693). The presence of tetrodotoxin ions in an extracellular solution at a low concentration ensured the blocking of fast tetrodotoxin-sensitive channels, which made it possible to record the characteristics of only one population of sodium channels - slow (tetrodotoxin-insensitive) channels Na _V 1.8. Reagents of the Sigma company were used in the work. All experiments were carried out at room temperature 22-24 ° C.

Трансмембранные ионные токи регистрировали с помощью метода фиксации потенциала на целой клетке (Hamill О.P., Marty A., Neher Е., Sakmann В., and Sigworth F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches // Pfliigers Arch. 1981. V. 391. N 1. P. 85-100) в условиях плотного контакта (метод patch-clamp в конфигурации «whole-cell»). Эксперименты проводили с использованием аппаратно-программного комплекса на основе усилителя «L/М ЕРС-7», ПЭВМ и системы автоматизации. Система автоматизации предназначена для выполнения следующих функций. Она включает в себя формирование программы эксперимента, генерацию ступенек напряжения, подаваемых на мембрану в соответствии с указанной программой, регистрацию ионных токов, визуальный контроль ионных токов, их экспресс-обработку, уточнение программы в ритме эксперимента в зависимости от характеристик исследуемого нейрона. Регистрация семейств натриевых токов и их дальнейшая обработка проводилась общепринятым методом (Hodgkin A. L., Huxley A. F. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo // J. Physiol. 1952. V. 116. N 4. P. 449-472).Transmembrane ion currents were recorded using the whole cell potential fixation method (Hamill O.P., Marty A., Neher E., Sakmann B., and Sigworth F. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell -free membrane patches // Pfliigers Arch. 1981. V. 391. N 1. P. 85-100) in close contact conditions (patch-clamp method in the “whole-cell” configuration). The experiments were carried out using a hardware-software complex based on the L / M EPC-7 amplifier, a personal computer and an automation system. The automation system is designed to perform the following functions. It includes the formation of the experimental program, the generation of voltage steps applied to the membrane in accordance with the specified program, registration of ion currents, visual control of ion currents, their express processing, refinement of the program in the rhythm of the experiment depending on the characteristics of the neuron under study. Families of sodium currents were registered and further processed using the generally accepted method (Hodgkin AL, Huxley AF Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo // J. Physiol. 1952. V. 116. N 4. P. 449-472).

С помощью метода локальной фиксации потенциала в конфигурации регистрации активности целой клетки была исследована способность молекулы Ac-RERR-NH₂ модулировать возбудимость мембраны ноцицепторов благодаря снижению потенциалочувствительности ответственных за кодирование болевых сигналов медленных натриевых каналов Na_V1.8.Using the method of local potential fixation in the configuration of recording the activity of a whole cell, we studied the ability of the Ac-RERR-NH ₂ molecule to modulate the excitability of the nociceptor membrane due to a decrease in the potential sensitivity of slow sodium channels Na _V 1.8, which are responsible for the coding of pain signals.

Наиболее важным стационарным параметром, определяющим процесс первичного кодирования ноцицептивной информации, служит эффективный заряд Z_eff активационной воротной системы каналов Na_V1.8. Было обнаружено снижение величины Z_eff было при воздействии тетрапептида Ac-RERR-NH₂ в концентрации 100 нмоль/л. Этот параметр снижался с контрольного значения Z_eff=6.41±0.31 (n=17) до нмоль/л и до 4.63±0.32 (n=23) при приложении тетрапептида в концентрации 100 нмоль/л.The most important stationary parameter determining the process of primary coding of nociceptive information is the effective charge Z _{eff of the} activation gate system of channels Na _V 1.8. It was found that the decrease in the Z _eff value was upon exposure to the tetrapeptide Ac-RERR-NH ₂ at a concentration of 100 nmol / L. This parameter decreased from the control value Z _eff = 6.41 ± 0.31 (n = 17) to nmol / L and to 4.63 ± 0.32 (n = 23) when tetrapeptide was applied at a concentration of 100 nmol / L.

4.2 Формалиновый тест проведен по известной методике (Dubuisson D., Dennis S.G. The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats // Pain. 1977. V. 4. P. 161-174; Tjolsen A., Berge O.-G., Hunskaar S., Rosland J.H., Hole K. The formalin test: an evaluation of the method // Pain. 1992. V. 51. P. 5-17, а также Henry J.L., Yashpal K., Pitcher G.M., Coderre T.J. Physiological evidence that the "interphase" in the formalin test is due to active inhibition // Pain. 1999. V. 89. P. 57-63; Dallel R., Raboisson P., Clavelou P. Evidence for a peripheral origin of the tonic nociceptive response to subcutaneous formalin // Pain. 1995. V. 61. P. 11-16; Abbott F.V., Melzack R, Samuel C. Morphine analgesia in the tail-test and formalin pain tests is mediated by different neural systems // Exp. Neurol. 1982. V. 75. P. 644-651; Abbott F.V., Ocvirk R., Najafee R. et al. Improving the efficiency of the formalin test // Pain. 1999. V. 83. P. 561-569). Опыты проведены на 7 опытных и 7 контрольных взрослых самцах крыс линии Вистар (средний вес животных 210 г). Введение тетрапептида опытным крысам в дозе 1,4 мг/кг (в растворе Хенкса) и физиологического раствора контрольным крысам в объеме 1 мл производили внутрибрюшинно за 5 мин до инъекции раствора формалина (2.5%, 50 мкл, подкожно) в подошву задней конечности.4.2 The formalin test was carried out according to the well-known method (Dubuisson D., Dennis SG The formalin test: a quantitative study of the analgesic effects of morphine, meperidine, and brain stem stimulation in rats and cats // Pain. 1977. V. 4. P. 161-174; Tjolsen A., Berge O.-G., Hunskaar S., Rosland JH, Hole K. The formalin test: an evaluation of the method // Pain. 1992. V. 51. P. 5-17, as well as Henry JL, Yashpal K., Pitcher GM, Coderre TJ Physiological evidence that the "interphase" in the formalin test is due to active inhibition // Pain. 1999. V. 89. P. 57-63; Dallel R., Raboisson P., Clavelou P. Evidence for a peripheral origin of the tonic nociceptive response to subcutaneous formalin // Pain. 1995. V. 61. P. 11-16; Abbott FV, Melzack R, Samuel C. Morphine analgesia in the tail -test and formalin pain tests is mediated by different neural systems // Exp. Neurol. 1982. V. 75. P. 644-651; Abbott FV, Ocvirk R., Najafee R. et al. Imp roving the efficiency of the formalin test // Pain. 1999. V. 83. P. 561-569). The experiments were conducted on 7 experimental and 7 control adult male Wistar rats (average animal weight 210 g). The tetrapeptide was administered to experimental rats at a dose of 1.4 mg / kg (in Hanks solution) and physiological saline to control rats in a volume of 1 ml was performed intraperitoneally 5 minutes before injection of formalin solution (2.5%, 50 μl, subcutaneously) in the sole of the hind limb.

В стандартных условиях эксперимента в контрольной и экспериментальной группах наблюдают два вида боли: 1) острая боль - первая фаза, обычно длящаяся менее 5 минут, 2) тоническая боль - вторая фаза, наблюдающаяся в течение 90 минут. Между первой и второй фазами существует интерфаза, продолжающаяся ~ 10 минут, во время которой ответов животного не наблюдается.Under standard experimental conditions, two types of pain are observed in the control and experimental groups: 1) acute pain - the first phase, usually lasting less than 5 minutes, 2) tonic pain - the second phase, observed for 90 minutes. Between the first and second phases there is an interphase lasting ~ 10 minutes, during which no animal responses are observed.

В протоколе отражали количество и продолжительность «вылизываний», «сгибаний», «встряхиваний» левой больной лапой. Оценивали межфазные интервалы и поведенческие реакции: исследовательское поведение, груминг, реакцию избегания, реакцию привыкания, реакцию интоксикации. В контрольных экспериментах вся последовательность событий соблюдалась: после введения формалина животное в течение 5 либо 7 минут находилось в темноте под колпаком. Интенсивность паттернов сгибаний + встряхиваний определяется их числом - это спинальный уровень ответа на формалин. Интенсивность паттернов вылизывания, определяемая их продолжительностью в секундах, отражает супраспинальный уровень ответа. Продолжительность первой и второй фазы, а также межфазного интервала отражали в минутах.The protocol reflected the number and duration of "licking", "flexion", "shaking" of the left sore paw. Interphase intervals and behavioral reactions were evaluated: research behavior, grooming, avoidance reaction, habituation reaction, intoxication reaction. In control experiments, the entire sequence of events was observed: after the introduction of formalin, the animal was in the dark under a hood for 5 or 7 minutes. The intensity of the flexion + shake patterns is determined by their number - this is the spinal level of response to formalin. The intensity of the licking patterns, determined by their duration in seconds, reflects the supraspinal level of response. The duration of the first and second phases, as well as the interphase interval, was reflected in minutes.

Регистрацию специфических паттернов ответа на инъекцию формалина - сгибание + встряхивание (спинальный уровень) и вылизывание (супраспинальный уровень) - проводили в течение часа после инъекции ноцицептивного химического раздражителя.Specific response patterns for formalin injection — bending + shaking (spinal level) and licking (supraspinal level) — were recorded within an hour after injection of a nociceptive chemical stimulus.

Данные формалинового теста. Фаза I (острая фаза).Formalin test data. Phase I (acute phase).

Полученные данные показали в паттернах вылизывания тенденцию к снижению длительности вылизывания у всех экспериментальных животных (19,4±4,3) по сравнению с контрольными (37,3±7,4) (фиг. 1).The data obtained showed in the licking patterns a tendency to a decrease in the duration of licking in all experimental animals (19.4 ± 4.3) compared with the control (37.3 ± 7.4) (Fig. 1).

t=2,0715 р=0,05946 (тенденция),t = 2.0715 p = 0.05946 (trend),

при значении р=0.5 значения не различаются статистически достоверно.when p = 0.5, the values do not differ statistically significantly.

В паттернах сгибание + встряхивание обнаружена значительная тенденция к снижению длительности острой фазы ответов, однако статистически достоверных различий не выявлено: длительность ответов опытных животных сократилась (46,6±14,0) по сравнению с длительностью ответов контрольных животных (68,7±7,2) (фиг. 2).The bending + shaking patterns showed a significant tendency to decrease the duration of the acute phase of responses, but no statistically significant differences were found: the duration of responses of experimental animals decreased (46.6 ± 14.0) compared with the duration of responses of control animals (68.7 ± 7, 2) (Fig. 2).

t=2,60961 р=0,17527t = 2.60961 p = 0.17527

при значении р=0.5 значения не различаются статистически достоверноwhen p = 0.5, the values do not differ statistically significantly

Фаза II (тоническая)Phase II (tonic)

Полученные данные показали достоверные различия в паттернах вылизывания у всех экспериментальных животных (68,5±23,9) по сравнению с контрольными (197,3±45,6).The data obtained showed significant differences in licking patterns in all experimental animals (68.5 ± 23.9) compared with the control (197.3 ± 45.6).

t=2,61084 р=0,02737t = 2.61084 p = 0.02737

при значении р=0.5 значения различаются статистически достоверноwhen p = 0.5, the values differ statistically significantly

В паттернах сгибание + встряхивание также выявлены достоверные различия: у опытных животных (248,3±40,4), у контрольных (490,3±66,2).Significant differences were also revealed in the flexion + shaking patterns: in experimental animals (248.3 ± 40.4), in control animals (490.3 ± 66.2).

t=3,19432 р=0,00886t = 3,19432 p = 0,00886

Проведенные поведенческие эксперименты позволяют сделать следующие выводы:Conducted behavioral experiments allow us to draw the following conclusions:

1. Инъекция тетрапептида крысам в дозе 1,4 мг/кг вызывает статистически достоверный анальгетический эффект на супраспинальном уровне. На спинальном уровне наблюдается тенденция к снижению болевого эффекта.1. Injection of the tetrapeptide to rats at a dose of 1.4 mg / kg causes a statistically significant analgesic effect at the supraspinal level. At the spinal level, there is a tendency to decrease the pain effect.

2. Наблюдения за экспериментальными животными показали, что ни в одном случае не наблюдалась реакция привыкания к действию исследуемой субстанции.2. Observations of experimental animals showed that in no case was an addiction reaction to the action of the test substance observed.

Пример 5. Подтверждение безопасности применения заявляемого пептида. Метод органотипической культуры ткани.Example 5. Confirmation of the safety of the claimed peptide. The method of organotypic tissue culture.

С помощью метода органотипической культуры ткани исследовали влияние тетрапептида Ac-RERR-NH₂ на рост нейритов сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов. Культивирование эксплантатов осуществляли в соответствии со стандартной методикой (Чалисова Н.И., Мелькишев В.Ф., Акоев Г.Н., Людыно М.И., Куренкова Т.К. Стимулирующее влияние пролактина на рост нейритов чувствительных нейронов в органотипической культуре. // Цитология. - 1991. - Т. 33, №2. - С. 29-31).Using the method of organotypic tissue culture, the effect of Ac-RERR-NH ₂ tetrapeptide on the growth of sensory ganglia neurites of 10-12-day-old chicken embryos was studied. The explants were cultured in accordance with the standard methodology (Chalisova N.I., Melkishev V.F., Akoyev G.N., Lyudino M.I., Kurenkova T.K. Stimulating effect of prolactin on the growth of sensitive neurites in organotypic culture. // Cytology. - 1991.- T. 33, No. 2. - S. 29-31).

Эксперименты были выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс линии Wistar. Дорзальные ганглии выделяли из областей L₅ - S₁ спинного мозга и помещали в раствор Хенкса. Ферментативную обработку [10] проводили в течение 5-12 мин. (в зависимости от возраста крыс) при 37°С в растворе следующего состава: 1 мл раствора Хенкса, 1 мл среды Игла, 2 мг/мл коллагеназы (тип 1А), 1 мг/мл проназы-Е. В качестве буфера использовали 10 ммоль/л Hepes Na (рН 7.4). После ферментативной обработки ганглии тщательно отмывали путем центрифугирования (1 мин., 900 об/мин.) и последующей сменой надосадочной жидкости. Для отмывки и культивирования использовалась среда на основе среды Игла (ЕМЕМ) с добавлением глютамина (2 ммоль/л), эмбриональной сыворотки коровы (10%), глюкозы (0.6%), гентамицина 40 ед./мл. Механическую диссоциацию производили путем пипетирования. К полученной клеточной суспензии добавляли культуральную среду до достижения соответствующей плотности клеток в объеме чашки Петри. Культуру клеток, состоящую преимущественно из нейронов спинальных ганглиев, получали с помощью предварительного осаждения нейрональных клеток (шванновских клеток и фибробластов) на пластиковой поверхности 90-мм чашки Петри в течение 25 мин. при 37°С. Далее клетки культивировали на покрытой коллагеном поверхности 40-мм чашек Петри. Коллаген получали из хвостов крыс. Регистрацию электрической активности нейронов производили спустя 1-2 часа после завершения культивирования. Клетки использовали в опытах в течение одних суток.The experiments were performed on cultured isolated neurons of the spinal ganglia of Wistar rats. Dorsal ganglia were isolated from areas of the L ₅ - S ₁ spinal cord and placed in a Hanks solution. Enzymatic treatment [10] was carried out for 5-12 minutes. (depending on the age of the rats) at 37 ° C in a solution of the following composition: 1 ml of Hanks solution, 1 ml of Needle medium, 2 mg / ml of collagenase (type 1A), 1 mg / ml of pronase-E. As a buffer, 10 mmol / L Hepes Na (pH 7.4) was used. After enzymatic treatment, the ganglia were thoroughly washed by centrifugation (1 min, 900 rpm) and subsequent change of the supernatant. For washing and cultivation, a medium based on Eagle’s medium (EMEM) with the addition of glutamine (2 mmol / L), fetal bovine serum (10%), glucose (0.6%), and gentamicin 40 units / ml was used. Mechanical dissociation was carried out by pipetting. The culture medium was added to the obtained cell suspension until the corresponding cell density in the volume of the Petri dish was reached. A cell culture, consisting mainly of neurons of the spinal ganglia, was obtained by preliminary deposition of neuronal cells (Schwann cells and fibroblasts) on the plastic surface of a 90-mm Petri dish for 25 min. at 37 ° C. Next, the cells were cultured on the collagen-coated surface of 40 mm Petri dishes. Collagen was obtained from rat tails. The electrical activity of neurons was recorded 1-2 hours after the completion of cultivation. Cells were used in experiments for one day.

Тетрапептид был применен в концентрациях 0,1 пкМ, 10 пкМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ и 100 нМ. В концентрациях 0,1 пкМ и 10 пкМ исследуемый агент практически не влиял на рост нервной ткани. Индекс площади (ИП) эксплантатов спинальных ганглиев не отличался от своего контрольного значения. В концентрации 0,1 нМ исследуемый тетрапептид проявлял нейрит-стимулирующее действие. Его введение в питательную среду в этой концентрации вызывало достоверную стимуляцию роста нейритов в среднем на 34% по отношению к контрольным значениям. При добавлении в культуральную среду тетрапептида в концентрации 1 нМ наблюдали недостоверную стимуляцию роста нейритов. ИП экспериментальных эксплантатов был выше на 20% по сравнению с контролем. В концентрациях 10 нМ и 100 нМ он практически не влиял на рост нейритов спинальных ганглиев. ИП экспериментальных эксплантатов не отличался от контроля. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что тетрапептид Ac-RERR-NH₂ обладает выраженными нейрит-стимулирующими свойствами в очень низкой концентрации (0,1 нМ).The tetrapeptide was used at concentrations of 0.1 pM, 10 pM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM and 100 nM. At concentrations of 0.1 pcM and 10 pcM, the studied agent practically did not affect the growth of nerve tissue. The area index (PI) of spinal ganglia explants did not differ from its control value. At a concentration of 0.1 nM, the studied tetrapeptide showed a neurite-stimulating effect. Its introduction into the nutrient medium at this concentration caused a significant stimulation of neurite growth by an average of 34% in relation to the control values. When tetrapeptide was added to the culture medium at a concentration of 1 nM, an unreliable stimulation of neurite growth was observed. The PI of the experimental explants was 20% higher compared to the control. At concentrations of 10 nM and 100 nM, he practically did not affect the growth of neurites of the spinal ganglia. PI of experimental explants did not differ from control. Thus, the data obtained indicate that the tetrapeptide Ac-RERR-NH ₂ has pronounced neurite-stimulating properties in a very low concentration (0.1 nM).

Отсутствие эффекта ингибирования роста нейритов позволяет сделать важнейший вывод о том, что тетрапептид Ac-RERR-NH₂ не имеет нейротоксических свойств и является безопасным агентом, воздействующим на нервные клетки живого организма.The absence of the effect of inhibiting the growth of neurites allows us to make the most important conclusion that the tetrapeptide Ac-RERR-NH ₂ does not have neurotoxic properties and is a safe agent that acts on the nerve cells of a living organism.

По аналогии были проведены исследования и с другими тетрапептидами, выбранными из перечисленной выше группы с получением сопоставимых результатов.By analogy, studies have been conducted with other tetrapeptides selected from the above group with obtaining comparable results.

Claims

1. The peptide compound representing Ac-RERR-NH ₂ .

2. A pharmaceutical composition having an analgesic effect, comprising the active component — the peptide compound of claim 1 in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.

3. The composition according to p. 3, characterized in that the active component and the carrier are taken in the following ratio of components, wt. %:

active component - 1-95,

the carrier is the rest.

4. The composition according to p. 3, characterized in that the content of the active component in a single dose is 10-400 mg.

5. The composition according to p. 3, characterized in that it is made in the form for intravenous, intramuscular, spinal, epidural, mucosal, transdermal, parenteral, oral, enteral, intranasal or rectal administration.

6. The composition according to p. 3, characterized in that it is made in the form of a powder, patch, suppository, solution, suspension, cream, ointment, tablet capsule form.

7. The composition according to p. 3, characterized in that the carrier is selected from the group: water, ethanol, glycerol, saline.

8. The composition according to p. 3, characterized in that the carrier further comprises an emulsifying agent and / or a buffering agent.

9. The composition according to p. 3, characterized in that the carrier is selected from the group: polyethylene glycol, lactose, magnesium carbonate, talc.

10. A method of relieving pain, comprising administering a pharmaceutical composition according to claim 3 in a therapeutically acceptable amount.

11. The method according to p. 10, characterized in that the composition is used in the form for intravenous, intramuscular, spinal, epidural, mucosal, transdermal, parenteral, oral, enteral, intranasal or rectal administration.

12. The method according to p. 10, characterized in that the composition is administered in a single dosage with an active component content of not more than 400 mg, while the daily dosage of the active component is not more than 600 mg for patients with a body weight of 50-100 kg