RU2654671C2

RU2654671C2 - Method of dna molecules separation

Info

Publication number: RU2654671C2
Application number: RU2016139285A
Authority: RU
Inventors: Светлана Викторовна Калиниченко; Михаил Валентинович Шепелев; Игорь Викторович Коробко
Original assignee: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2016-10-06
Publication date: 2018-05-21
Also published as: RU2016139285A

Abstract

FIELD: biology.

SUBSTANCE: invention relates to molecular biology. Method of separating DNA molecules, providing for a negative selection of target DNA molecules in solution from non-target DNA molecules, which involves the interaction of non-target DNA molecules, containing the recombinase Cre recognition site of the bacteriophage P1 LoxP, with Cre recombinase of bacteriophage P1, defective in ability to covalently modify DNA, which provides the transfer of non-target DNA molecules from the solution to the solid phase. In addition, the proposed method does not require the presence of minimal differences in the lengths of target and non-target DNA molecules for their effective separation.

EFFECT: application of the principle of negative selection makes it possible to exclude the necessity of the presence of additional nucleotide sequences in the target DNA molecules.

15 cl, 8 dwg, 5 ex

Description

Область техники, к которой относится настоящее изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии, а именно, к получению очищенных из исходного раствора смеси целевых и нецелевых двухцепочечных молекул ДНК препаратов целевых молекул ДНК. В частности, настоящее изобретение относится к способам очистки фрагментов двухцепочечной рекомбинантной ДНК, получаемых в результате расщепления плазмидной ДНК, от векторных последовательностей.The present invention relates to the field of molecular biology and genetic engineering, namely, to obtain purified from the initial solution mixture of target and non-target double-stranded DNA molecules of the preparations of the target DNA molecules. In particular, the present invention relates to methods for purification of fragments of double-stranded recombinant DNA obtained by cleavage of plasmid DNA from vector sequences.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Получение очищенных из исходного раствора смеси целевых и нецелевых двухцепочечных молекул ДНК препаратов целевых молекул ДНК является рутинной процедурой в области молекулярной биологии. Одной из областей, где часто требуется разделение и очистка целевого фрагмента ДНК, является+ генная инженерия, например, при создании рекомбинантных ДНК с заданными свойствами.The preparation of mixtures of target and non-target double-stranded DNA molecules of the target DNA molecules purified from the initial solution is a routine procedure in the field of molecular biology. One of the areas where separation and purification of the target DNA fragment is often required is + genetic engineering, for example, when creating recombinant DNA with desired properties.

Плазмидные векторы рутинно используются в генной инженерии как инструмент для манипуляций с целевыми фрагментами ДНК, обеспечивая их пропагацию в клетках E.coli. Однако векторная часть плазмиды в данном случае выполняет служебную функцию, и для манипуляций с целевыми фрагментами ДНК и их использования в некоторых приложениях требуется отделение векторных последовательностей от целевого фрагмента ДНК. Технически это реализуется с помощью ферментов (эндонуклеаз рестрикции), которые позволяют физически разделить кольцевую молекулу плазмиды на линейные фрагменты, в том числе физически отделить целевой фрагмент ДНК от вектора, с последующим разделением продуктов расщепления и очисткой целевого фрагмента ДНК от фрагмента, содержащего последовательность вектора. Очистка целевого фрагмента ДНК после расщепления плазмидной ДНК используется при проведении генно-инженерных работ, а также в области трансгенеза животных. В последнем случае при получения трансгенных животных для инъекции эмбрионов используют линейные фрагменты ДНК, содержащие трансген, свободный от векторных последовательностей, присутствие которых может негативно влиять на экспрессию трансгена (Kjer-Nielsen et al., 1992).Plasmid vectors are routinely used in genetic engineering as a tool for manipulating target DNA fragments, ensuring their propagation in E. coli cells. However, the vector part of the plasmid in this case performs a service function, and for manipulating and using target DNA fragments in some applications, it is necessary to separate vector sequences from the target DNA fragment. Technically, this is realized using enzymes (restriction endonucleases), which allow you to physically separate the circular plasmid molecule into linear fragments, including physically separate the target DNA fragment from the vector, followed by separation of the cleavage products and purification of the target DNA fragment from the fragment containing the vector sequence. Purification of the target DNA fragment after plasmid DNA cleavage is used during genetic engineering work, as well as in the field of animal transgenesis. In the latter case, when producing transgenic animals, linear DNA fragments containing a transgene free of vector sequences, the presence of which can adversely affect the expression of the transgene, are used for injection of embryos (Kjer-Nielsen et al., 1992).

Концептуально разделение гетерогенной смеси молекул ДНК на гомогенные фракции и селективный отбор целевых молекул ДНК из смеси осуществляться на основании различий в свойствах молекул ДНК в смеси. Эти свойства могут быть как эндогенными, так и привнесенными.Conceptually, the separation of a heterogeneous mixture of DNA molecules into homogeneous fractions and the selective selection of target DNA molecules from the mixture is carried out on the basis of differences in the properties of DNA molecules in the mixture. These properties can be either endogenous or introduced.

При манипуляции с молекулами ДНК in vitro, в частности, при генно-инженерных манипуляциях, селекцию целевых молекул ДНК преимущественно осуществляют на основании различий в их молекулярной массе, что эквивалентно их длине в нуклеотидах. Разделение молекул ДНК на основании их длин может осуществляться различными способами, такими как гель-фильтрационная хроматография, центрифугирование в градиенте плотности, гель-электрофорез. Разделение первыми двумя упомянутыми способами основано на различии молекулярных масс молекул ДНК различной длины, в то время как последний способ также использует различия в суммарном заряде молекул, который пропорционален длине молекулы ДНК. Общим для методов разделения молекул ДНК, основанных на различия в длинах, является отсутствие при разделении селективности в отношении нуклеотидных последовательностей разделяемых молекул ДНК, то есть две молекулы ДНК с различными последовательностями, но имеющие одинаковую длину в нуклеотидах, такими методами разделены быть не могут, а при уменьшении различий в длинах разделяемых фрагментов ДНК качество разделения будет снижаться, особенно в случае использования методов, в которых разделение происходит на основании только молекулярных масс, в то время как гель-электрофорез, в котором на процесс разделения дополнительно оказывает влияние заряд молекул, позволяет более качественно разделять молекулы ДНК различной длины, чем гель-фильтрационная хроматография или центрифугирование в градиенте плотности.When manipulating DNA molecules in vitro, in particular, during genetic engineering manipulations, the selection of target DNA molecules is mainly carried out on the basis of differences in their molecular weight, which is equivalent to their length in nucleotides. Separation of DNA molecules based on their lengths can be carried out in various ways, such as gel filtration chromatography, density gradient centrifugation, gel electrophoresis. The separation by the first two mentioned methods is based on the difference in molecular weights of DNA molecules of different lengths, while the latter method also uses differences in the total charge of the molecules, which is proportional to the length of the DNA molecule. Common to methods for separating DNA molecules based on differences in lengths is the absence of selectivity for nucleotide sequences of separated DNA molecules when separating, that is, two DNA molecules with different sequences but having the same length in nucleotides cannot be separated by such methods, but when the differences in the lengths of the separated DNA fragments are reduced, the quality of separation will decrease, especially in the case of using methods in which separation is based on only the molecule masses, while gel electrophoresis, in which the charge of molecules additionally affects the separation process, allows DNA molecules of different lengths to be separated better than gel filtration chromatography or density gradient centrifugation.

В области молекулярной биологии часто используются методы разделения молекул ДНК, основанные на наличии/отсутствии уникальных признаков. Данные методы позволяют сепарировать молекулы ДНК вне зависимости от их длины, однако требуют предварительной модификации целевых молекул ДНК, что в последующем после смешивания в рамках проведения эксперимента позволяет сепарировать их от немодифицированных молекул ДНК. Примером часто используемой для этих целей модификаций является биотин, ковалентное присоединение которого к молекулам ДНК позволяет селективно сепарировать их от немодифицированных молекул с использованием иммобилизованного на твердом носителе стрептавидина, например, после проведения гибридизации при создании библиотек вычитания (Коробко и др., 1997). Ограничением для этого способа сепарации молекул ДНК является необходимость предварительной модификации очищенных целевых молекул ДНК in vitro.In the field of molecular biology, DNA molecular separation methods are often used based on the presence / absence of unique features. These methods allow the separation of DNA molecules, regardless of their length, however, they require preliminary modification of the target DNA molecules, which subsequently after mixing as part of the experiment allows you to separate them from unmodified DNA molecules. An example of the modifications often used for these purposes is biotin, the covalent attachment of which to DNA molecules allows them to be selectively separated from unmodified molecules using streptavidin immobilized on a solid support, for example, after hybridization to create subtraction libraries (Korobko et al., 1997). A limitation for this method of separating DNA molecules is the need for preliminary modification of the purified target DNA molecules in vitro.

Перечисленные выше способы разделения молекул ДНК также различаются по необходимым процедурам по очистке целевых молекул ДНК после проведения селекции.The above methods for separating DNA molecules also differ in the necessary procedures for purification of the target DNA molecules after selection.

При разделении молекул с помощью гель-фильтрационной хроматографии целевой фрагмент находится в хроматографическом буфере и, в зависимости от его состава, может не требовать дальнейшей очистки или требовать минимальной очистки путем переосаждения ДНК и растворения в буфере необходимого состава для получения очищенного препарата ДНК с минимальным присутствием нежелательных примесей.When separating molecules using gel filtration chromatography, the target fragment is located in a chromatographic buffer and, depending on its composition, may not require further purification or require minimal purification by reprecipitation of DNA and dissolution of the required composition in the buffer to obtain a purified DNA preparation with minimal presence of undesirable impurities.

При разделении молекул с помощью центрифугирования в градиенте плотности, фракция, содержащая целевые молекулы ДНК, требует очистки от веществ, использованных для создания градиента плотности (например, часто используемого для создания градиента плотности хлорида цезия). Присутствие ионов цезия негативно влияет на многие дальнейшие аппликации препарата ДНК, что требует тщательной очистки от хлорида цезия, осуществляемого, например, с помощью повторных диализов.When separating molecules using density gradient centrifugation, the fraction containing the target DNA molecules requires purification from the substances used to create the density gradient (for example, often used to create the density gradient of cesium chloride). The presence of cesium ions negatively affects many further applications of the DNA preparation, which requires careful cleaning of cesium chloride, carried out, for example, by repeated dialysis.

При разделении молекул ДНК с помощью гель-электрофореза, который является рутинным и наиболее часто используемым для этих целей методом, целевая фракция молекул ДНК находится в физически ограниченном объеме геля, из которого ДНК должна быть экстрагирована, что может осуществляться различными способами. Одним из способов экстракции ДНК из геля является пассивная элюция из фрагмента геля. Данный способ малоэффективен и характеризуется существенными потерями материала, а также требует последующей очистки от следовых количеств компонентов геля, присутствие которых может негативно влиять на дальнейшее целевое использование изолированной ДНК. Другой способ экстракции ДНК из геля, электроэлюция, состоит в продолжении процесса гель-электрофореза после разделения смеси молекул ДНК в геле, в результате которого целевая фракция молекул ДНК сорбируется на положительно заряженный бумажный носитель (бумага DEAE), врезанный в гель перед областью, содержащей целевые молекулы ДНК; далее иммобилизованная на бумаге DEAE ДНК элюируется в раствор. Альтернативно, молекулы ДНК могут быть переведены в раствор буфера для гель-электрофореза из вырезанного фрагмента геля, помещенного в специальную камеру, объем которой ограничен диализной пленкой, препятствующей выходу молекул ДНК из камеры в ходе электрофореза. В обоих случаях, помимо трудоемкости, полученные препараты молекул целевой ДНК в растворе требуют дальнейшей очистки от примесей компонентов геля, присутствие которых может негативно влиять на дальнейшее использование изолированной целевой ДНК.When separating DNA molecules using gel electrophoresis, which is the routine and most commonly used method for these purposes, the target fraction of the DNA molecules is in a physically limited volume of the gel from which the DNA must be extracted, which can be carried out in various ways. One way to extract DNA from a gel is by passive elution from a gel fragment. This method is ineffective and is characterized by significant material losses, and also requires subsequent purification from trace amounts of gel components, the presence of which can adversely affect the further targeted use of isolated DNA. Another method for extracting DNA from a gel, electroelution, is to continue the gel electrophoresis process after separation of the mixture of DNA molecules in the gel, as a result of which the target fraction of DNA molecules is adsorbed onto a positively charged paper carrier (DEAE paper) embedded in the gel in front of the area containing the target DNA molecules DNA immobilized on paper is then eluted into the solution. Alternatively, DNA molecules can be transferred to a gel electrophoresis buffer solution from a cut out gel fragment placed in a special chamber, the volume of which is limited by a dialysis film that prevents the release of DNA molecules from the chamber during electrophoresis. In both cases, in addition to the complexity, the obtained preparations of the target DNA molecules in solution require further purification from the impurities of the gel components, the presence of which can negatively affect the further use of isolated target DNA.

Наиболее часто и рутинно используемым способом очистки молекул ДНК сегодня является экстракция ДНК из геля с использованием его химического разрушения, с последующей очисткой ДНК из полученного раствора на аффинном носителе, специфически сорбирующем молекулы ДНК. Данный способ позволяет получать препараты целевых молекул ДНК достаточной для большинства аппликаций чистоты, однако при существенной длине целевых молекул ДНК выход очищенного фрагмента после процесса очистки падает, и могут происходить физические разрывы длинных молекул ДНК в результате механического воздействия во время нахождения молекулы ДНК в связанном состоянии на сорбенте.The most frequently and routinely used method of purification of DNA molecules today is the extraction of DNA from a gel using its chemical destruction, followed by purification of DNA from the resulting solution on an affinity carrier specifically sorbing DNA molecules. This method allows to obtain preparations of target DNA molecules of sufficient purity for most applications, however, with a significant length of the target DNA molecules, the yield of the purified fragment after the cleaning process decreases, and physical breaks of long DNA molecules can occur as a result of mechanical action while the DNA molecule is in a bound state sorbent.

Существенными преимуществами перед методами, основанными на сепарации молекул ДНК на основании их размера, обладают методы, использующие модифицированные молекулы ДНК для их отделения от немодифицированных молекул, которые обладают высокой селективностью, не зависящей от длин разделяемых молекул ДНК. Эти методы позволяют избежать присутствия нежелательных примесей, таких как компоненты геля, а также - в случае негативной селекции (то есть истощения из раствора модифицированных молекул ДНК и получения раствора целевой немодифицированной ДНК) исключают риск повреждения целевой ДНК в результате механического воздействия. Однако данные методы имеют ограниченную область применения, поскольку требуют предварительной модификации пула молекул ДНК in vitro, то есть априори сначала требуют выделения молекул ДНК для их модификации.Significant advantages over methods based on the separation of DNA molecules based on their size are possessed by methods that use modified DNA molecules to separate them from unmodified molecules, which have high selectivity independent of the length of the separated DNA molecules. These methods avoid the presence of undesirable impurities, such as gel components, and also, in the case of negative selection (i.e., depletion of modified DNA molecules from a solution and obtaining a solution of the target unmodified DNA), eliminate the risk of damage to the target DNA due to mechanical stress. However, these methods have a limited scope, since they require preliminary modification of the pool of DNA molecules in vitro, that is, a priori, first require isolation of DNA molecules for their modification.

Таким образом, оптимальным методом селекции целевых фрагментов ДНК стал бы метод, позволяющий разделять молекулы ДНК по принципу наличия у них уникальных характеристик, который бы не требовал предварительных манипуляций in vitro для их внесения в молекулы ДНК. Такими характеристиками могут являться специфические последовательности ДНК, присутствие или отсутствие которых потенциально может быть использовано как основа для разделения гетерогенной смеси молекул ДНК.Thus, the optimal method for selecting target DNA fragments would be a method that allows you to separate DNA molecules according to the principle of their unique characteristics, which would not require preliminary in vitro manipulations for their introduction into DNA molecules. Such characteristics can be specific DNA sequences, the presence or absence of which could potentially be used as the basis for the separation of a heterogeneous mixture of DNA molecules.

Действительно, на сегодняшний день известно несколько подходов к практической реализации разделения или очистки молекул ДНК, основанных на присутствии в молекулах ДНК специфических нуклеотидных последовательностей. К ним относятся методы, основанные на образовании последовательность-специфичных триплексных структур с иммобилизованным на твердом носителе олигонуклеотиде (Ito et al., 1992), или основанные на аффинном взаимодействии белков со специфическими последовательностями в целевой ДНК - Lac-penpeccopa (или его ДНК-связывающего фрагмента) с включенной во фрагмент ДНК нуклеотидной последовательностью оператора LacO (Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), домена цинковых пальцев фактора транскрипции со специфической последовательностью для его узнавания (Woodgate et al., 2002) или металлорегуляторного бактериального белка MerR с его сайтом узнавания, включенным в молекулы ДНК (Kostal et al., 2004). При использовании белков для селекции молекул ДНК за счет связывания специфической последовательности ДНК, белок, как и олигонуклеотид, может быть иммобилизован на твердом носителе, что позволяет отбирать связавшиеся молекулы ДНК из раствора. В частности, для иммобилизации белка на твердом носителе возможно использование носителя с ковалентно связанным глутатионом, в случае, когда сам белок представляет собой химеру специфически взаимодействующего с ДНК белка (или его части, достаточной для такого взаимодействия) с глутатион-S-трансферазой, которая, за счет взаимодействия с глутатионом, обеспечивает иммобилизацию на твердом носителе (Woodgate et al., 2002).Indeed, today there are several approaches to the practical implementation of the separation or purification of DNA molecules based on the presence of specific nucleotide sequences in DNA molecules. These include methods based on the formation of sequence-specific triplex structures with an oligonucleotide immobilized on a solid support (Ito et al., 1992), or based on the affinity interaction of proteins with specific sequences in the target DNA - Lac-penpeccopa (or its DNA-binding fragment) with the LacO operator nucleotide sequence included in the DNA fragment (Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), a zinc finger domain of a transcription factor with a specific sequence for its recognition (Woodgate et al., 2002) or a metal-regulatory bacterial protein MerR with its recognition site included in DNA molecules (Kostal et al., 2004). When using proteins for the selection of DNA molecules by binding a specific DNA sequence, the protein, like the oligonucleotide, can be immobilized on a solid carrier, which allows you to select the bound DNA molecules from the solution. In particular, to immobilize a protein on a solid carrier, it is possible to use a carrier with covalently bound glutathione, in the case when the protein itself is a chimera of a protein specifically interacting with DNA (or a portion thereof sufficient for such an interaction) with glutathione S-transferase, which, through interaction with glutathione, provides immobilization on a solid support (Woodgate et al., 2002).

Метод очистки, основанный на образовании триплексных структур, использует способность гомопиримидиновых нуклеотидов формировать такие структуры с гомопуриновыми последовательностями двухцепочечной ДНК (Ito et al., 1992). Очевидно, что присутствие гомопуриновых последовательностей часто может не являться специфическим признаком одного пула молекул ДНК, который необходимо сепарировать от другого, из-за случайного присутствия сходных по составу последовательностей в молекулах ДНК другого пула, вероятность чего возрастает с увеличением длины молекул ДНК. Кроме того, данный метод характеризуется медленной кинетикой образования комплексов, что непосредственно влияет на его эфективность.The purification method based on the formation of triplex structures uses the ability of homopyrimidine nucleotides to form such structures with homopurine double-stranded DNA sequences (Ito et al., 1992). Obviously, the presence of homopurine sequences often may not be a specific feature of one pool of DNA molecules, which must be separated from another, due to the random presence of sequences of similar composition in the DNA molecules of another pool, the probability of which increases with increasing length of DNA molecules. In addition, this method is characterized by slow kinetics of complex formation, which directly affects its efficiency.

Использование Lac-репрессора для аффинной очистки молекул ДНК, содержащих узнаваемую им нуклеотидную последовательность LacO-оператора, было предложено как способ очистки свободной от вектора ДНК - суперспирализованных мини-кольцевых молекул с целью их применения в области генной терапии (Mayrhofer et al., 2008). Однако для целей сепарации линейных или кольцевых релаксированных молекул ДНК данный подход не является оптимальным, поскольку аффинность Lac-penpeccopa к ZacO-сайтам ослабляется при нахождении ДНК в релаксированном, а не сверхскрученном состоянии (Whitson et al., 1987а; Whitson et al., 1987b), что будет негативно сказываться на эффективности аффинной сорбции.The use of a Lac repressor for the affinity purification of DNA molecules containing the nucleotide sequence of the LacO operator that it recognizes has been proposed as a method of purification of DNA-free, supercoiled mini-ring molecules with the aim of their application in the field of gene therapy (Mayrhofer et al., 2008) . However, for the separation of linear or circular relaxed DNA molecules, this approach is not optimal, since the affinity of Lac-penpeccopa to ZacO sites is weakened when the DNA is in a relaxed rather than supercoiled state (Whitson et al., 1987a; Whitson et al., 1987b ), which will adversely affect the efficiency of affinity sorption.

Два других упомянутых выше известных подхода, в которых используются домен цинковых пальцев и белок MerR, также основаны на принципе селекции молекул ДНК при наличии в их составе специфических нуклеотидных последовательностей, узнаваемых этими транскрипционными факторами. Оба метода были разработаны для очистки интактных молекул плазмидной ДНК из клеток E.coli по принципу положительной селекции, когда специфические последовательности включены в состав последовательности вектора.The two other known approaches mentioned above, which use the zinc finger domain and the MerR protein, are also based on the principle of selection of DNA molecules in the presence of specific nucleotide sequences recognized by these transcription factors. Both methods have been developed for the purification of intact plasmid DNA molecules from E. coli cells according to the principle of positive selection, when specific sequences are included in the sequence of the vector.

Следует отметить, что все вышеперечисленные методы основаны на принципе положительной селекции и требуют присутствия в целевых молекулах ДНК специфических нуклеотидных последовательностей. В то же время, включение таких последовательностей в целевые молекулы ДНК для возможности их селекции при очистке может потенциально оказывать влияние на их целевые функции, и присутствие таких дополнительных последовательностей в целом является нежелательным.It should be noted that all of the above methods are based on the principle of positive selection and require the presence of specific nucleotide sequences in the target DNA molecules. At the same time, the inclusion of such sequences in target DNA molecules for the possibility of their selection during purification can potentially affect their target functions, and the presence of such additional sequences is generally undesirable.

Как изложено выше, для основанной на принципе присутствия специфической нуклеотидной последовательности очистке молекул ДНК в качестве лиганда возможно применение белков, способных узнавать такие последовательности. В частности, приведенные примеры включают использование белков-регуляторов транскрипции (транскрипционных факторов), которые специфически узнают определенные последовательности ДНК, вводимые в целевые молекулы ДНК. Помимо факторов транскрипции, к белкам, способным узнавать определенные последовательности ДНК и связываться с ними, относятся эндонуклеазы рестрикции и сайт-специфические рекомбиназы. Однако, в отличие от факторов транскрипции, которые не модифицируют молекулу ДНК при связывании, взаимодействие эндонуклеаз рестрикции и сайт-специфических рекомбиназ с ДНК приводит к расщеплению ДНК в месте связывания или рекомбинационному событию, соответственно, ковалентно изменяя структуру молекулы ДНК.As described above, for the purification of DNA molecules as a ligand based on the principle of the presence of a specific nucleotide sequence, proteins capable of recognizing such sequences can be used. In particular, examples include the use of transcriptional regulatory proteins (transcription factors) that specifically recognize specific DNA sequences introduced into target DNA molecules. In addition to transcription factors, proteins capable of recognizing certain DNA sequences and binding to them include restriction endonucleases and site-specific recombinases. However, unlike transcription factors that do not modify the DNA molecule upon binding, the interaction of restriction endonucleases and site-specific recombinases with DNA leads to DNA cleavage at the binding site or recombination event, respectively, covalently changing the structure of the DNA molecule.

Cre является одной из известных сайт-специфических рекомбиназ, кодируемой геномом бактериофага Р1. Сайт рекомбинации для рекомбиназы Cre, LoxP, представляет собой последовательность из двух инвертированных повторов длинною 13 пар нуклеотидов (п.н.), разделенных спейсером в 8 п. н. (Sadowski, 1986). Cre-рекомбиназа связывается с ZoxP-сайтом, после чего за счет белок-белковых взаимодействий формируется структура, называемая синапсом, состоящая из двух сближенных LoxP-сайтов со связанными с ними молекулами Cre, после чего происходит расщепление цепей ДНК и обмен одной или двумя цепями с последующей диссоциацией молекул рекомбиназы с ДНК (Ghosh et al., 2007; Ringrose et at., 1998). Существенным отличием рекомбиназы Cre от ряда других рекомбиназ является то, что ее эффективное связывание с сайтами узнавания не зависит от наличия сверхспирализации в молекуле ДНК (Sadowski, 1986), что позволяет эффективно взаимодействовать с ZoxP-сайтом не только в замкнутых кольцевых сверхспирализованных молекулах ДНК, но и в релаксированных кольцевых и линейных молекулах ДНК, в которых отсутствует сверхспирализация.Cre is one of the known site-specific recombinases encoded by the bacteriophage P1 genome. The recombination site for Cre recombinase, LoxP, is a sequence of two inverted repeats of 13 nucleotide pairs long (bp) separated by an 8 bp spacer. (Sadowski, 1986). Cre recombinase binds to the ZoxP site, after which, through protein-protein interactions, a structure called a synapse is formed, consisting of two close LoxP sites with associated Cre molecules, after which DNA chains are split and one or two chains are exchanged with subsequent dissociation of recombinase molecules with DNA (Ghosh et al., 2007; Ringrose et at., 1998). A significant difference between Cre recombinase and a number of other recombinases is that its effective binding to recognition sites does not depend on the presence of supercoiling in the DNA molecule (Sadowski, 1986), which allows one to efficiently interact with the ZoxP site not only in closed circular supercoiled DNA molecules, but and in relaxed ring and linear DNA molecules in which there is no supercoiling.

Раскрытие настоящего изобретенияDisclosure of the present invention

Настоящее изобретение относится к новому способу разделения молекул ДНК, позволяющему проводить очистку целевых молекул ДНК от нецелевых молекул ДНК из их смеси в растворе. В частности, настоящее изобретение позволяет осуществлять очистку целевых двухцепочечных молекул ДНК от иных молекул двухцепочечной ДНК, как кольцевых, так и линейных, непосредственно в растворе, что исключает необходимость проведения дополнительных манипуляций, таких как рутинно используемое для этих целей разделение продуктов расщепления с использованием гель-электрофореза.The present invention relates to a new method for the separation of DNA molecules, which allows purification of target DNA molecules from non-target DNA molecules from their mixture in solution. In particular, the present invention allows the purification of target double-stranded DNA molecules from other double-stranded DNA molecules, both circular and linear, directly in solution, which eliminates the need for additional manipulations, such as the separation of cleavage products using the gel electrophoresis.

В настоящем изобретении, в отличие от иных способов очистки целевых молекул ДНК, селекция молекул ДНК реализуется не на основании различия в их длинах. Отсутствие необходимости селекции целевых молекул ДНК от нецелевых на основании различий в их размерах, в частности, позволяет исключить невозможность (при использовании, например, гель-электрофореза) очистки целевого фрагмента при его длине, равной или близкой к длине нецелевого фрагмента. При необходимости очистки фрагмента-вставки плазмидного вектора после расщепления плазмиды в случае, когда длина вектора мала по сравнению с длинной целевого фрагмента, предложенный способ также позволяет исключить контаминацию целевого фрагмента линейными продуктами неполного расщепления плазмидной ДНК, содержащей последовательности целевого фрагмента и вектора, из-за невозможности их качественного разделения в результате гель-электрофореза или иными методами, основанными на различиях в длинах молекул ДНК, что обусловлено малыми различиями в их длинах. Ситуации, в которых затруднительно или невозможно получение неконтаминированного иными продуктами расщепления целевого фрагмента ДНК после расщепления плазмидной ДНК с помощью разделения на основании различий в длинах молекул ДНК, проиллюстрированы на фиг. 1.In the present invention, unlike other methods of purification of target DNA molecules, the selection of DNA molecules is not implemented on the basis of differences in their lengths. The absence of the need to select target DNA molecules from non-target ones on the basis of differences in their sizes, in particular, eliminates the impossibility (when using, for example, gel electrophoresis) of purification of the target fragment at a length equal to or close to the length of the non-target fragment. If it is necessary to clean the insert fragment of the plasmid vector after plasmid digestion in the case when the vector is small in comparison with the long target fragment, the proposed method also allows to exclude contamination of the target fragment by linear products of incomplete cleavage of plasmid DNA containing the sequences of the target fragment and vector, due to the impossibility of their qualitative separation as a result of gel electrophoresis or other methods based on differences in the lengths of DNA molecules, due to small differences in their lengths. Situations in which it is difficult or impossible to obtain a cleavage of the target DNA fragment non-contaminated with other products after cleavage of the plasmid DNA by separation based on differences in the lengths of the DNA molecules is illustrated in FIG. one.

В настоящем изобретении для разделения молекул ДНК используется принцип негативной селекции. Это позволяет избежать необходимости иммобилизации целевого фрагмента ДНК на твердом носителе в процессе очистки, на чем основаны многие традиционные методы разделения и очистки молекул ДНК и что может приводить к механическим повреждениям длинных молекул ДНК (разрывам). Кроме того, исключение процесса электрофореза в геле, широко используемого при разделении молекул ДНК, исключает риск контаминации целевого фрагмента ДНК компонентами геля, что может негативно влиять на результаты его дальнейшего использования.In the present invention, the principle of negative selection is used to separate DNA molecules. This avoids the need to immobilize the target DNA fragment on a solid support during the purification process, which is the basis for many traditional methods of separation and purification of DNA molecules and that can lead to mechanical damage to long DNA molecules (breaks). In addition, the exclusion of gel electrophoresis, which is widely used in the separation of DNA molecules, eliminates the risk of contamination of the target DNA fragment with gel components, which can negatively affect the results of its further use.

В настоящем изобретении, как и в известных из уровня техники аналогах (Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), (Woodgate et al., 2002), (Kostal et al., 2004), (Ito et al., 1992), разделение молекул ДНК осуществляется с использованием агента, способного взаимодействовать и связывать молекулы ДНК, имеющие в своем составе специфические нуклеотидные последовательности. Благодаря способности агента быть иммобилизованным на твердой фазе или быть переведенным в твердую фазу, становится возможным иммобилизация таких молекулы ДНК, связанных с агентом, из жидкой фазы на твердую фазу, тем самым осуществляя разделение молекул ДНК, имеющих в своем составе специфическую нуклеотидную последовательность, и не имеющую ее. Однако в приведенных выше существующих аналогах целевые молекулы ДНК должны содержать в своем составе дополнительную последовательность нуклеотидов, обеспечивающих их селективное взаимодействие с агентом для связывания ДНК. В отличие от существующих аналогов, в настоящем изобретении описан способ разделения целевых и нецелевых молекул ДНК, не требующий внесения дополнительных последовательностей в целевые молекулы ДНК, что достигается за счет использования принципа негативной селекции. Для этого специфическая нулеотидная последовательность, обеспечивающая селективное взаимодействие с агентом для перевода фрагмента ДНК на твердую фазу из раствора, включается в последовательность нецелевых молекул ДНК, что позволяет селективно деплицировать такие молекулы из исходного раствора ДНК, содержащего смесь целевых и нецелевых молекул ДНК, тем самым позволяя получить раствор, содержащий только целевые молекулы ДНК без примеси нецелевых молекул ДНК. Реализованный в настоящем изобретении принцип очистки целевых молекул ДНК проиллюстрирован на фиг. 2.In the present invention, as in prior art analogues (Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), (Woodgate et al., 2002), (Kostal et al., 2004 ), (Ito et al., 1992), the separation of DNA molecules is carried out using an agent capable of interacting and binding DNA molecules with specific nucleotide sequences. Due to the ability of the agent to be immobilized on the solid phase or to be converted to the solid phase, it becomes possible to immobilize such DNA molecules bound to the agent from the liquid phase to the solid phase, thereby separating DNA molecules having a specific nucleotide sequence and not having her. However, in the above existing analogues, the target DNA molecules must contain an additional sequence of nucleotides to ensure their selective interaction with the DNA binding agent. Unlike existing analogues, the present invention describes a method for the separation of target and non-target DNA molecules, which does not require the introduction of additional sequences in the target DNA molecules, which is achieved by using the principle of negative selection. For this, a specific nullotide sequence, which provides selective interaction with an agent for transferring a DNA fragment to a solid phase from a solution, is included in the sequence of non-target DNA molecules, which allows selective selection of such molecules from the initial DNA solution containing a mixture of target and non-target DNA molecules, thereby allowing get a solution containing only the target DNA molecules without the admixture of non-target DNA molecules. The principle of purification of target DNA molecules realized in the present invention is illustrated in FIG. 2.

Агент, способный связываться с нецелевыми молекулами ДНК, должен обеспечивать их перевод из жидкой фазы на твердую фазу. Специалисту в данной области очевидно, что это может быть реализовано двумя способами - до проведения связывания агента с молекулами ДНК или после него. При этом при иммобилизации на твердой фазе агента до связывания с ДНК, иммобилизация может обеспечиваться как с помощью ковалентной сшивки молекул агента с твердым носителем (в качестве примера можно привести ковалентную кросс-сшивку агента, являющегося белковой молекулой, с CNBr-активированной сефарозой; специалисту в данной области очевидно, что приведенный пример не является единственным и не исчерпывает все возможные способы ковалентной иммобилизации агентов различной природы на твердом носителе) или обеспечиваться за счет нековалентного взаимодействия (в качестве примера можно привести взаимодействие агента, в состав которого входит биотин, с предварительно иммобилизованным на твердой фазе белком стрептавидином; специалисту в данной области очевидно, что приведенный пример не является единственным и не исчерпывает все возможные способы нековалентной иммобилизации агентов различной природы на твердом носителе). Специалисту также очевидно, что технически процесс сорбции нецелевых молекул ДНК на твердой фазе может осуществляться как в формате batch, так и в форме хроматографии на колонке с аффинным носителем. Также из существующего уровня техники известно, что перевод агента в твердую фазу может достигаться за счет присоединения к нему специфических белковых последовательностей, обеспечивающих фазовый переход при изменении температуры (Kostal et al., 2004). Возможные принципиальные варианты иммобилизации агента и связанных с ним молекул ДНК на твердой фазе проиллюстрированы на фиг. 3.An agent capable of binding to non-target DNA molecules must ensure their transfer from the liquid phase to the solid phase. It will be apparent to those skilled in the art that this can be done in two ways - before or after binding of the agent to the DNA molecules. In this case, upon immobilization of the agent on the solid phase prior to binding to DNA, immobilization can be achieved both by covalent crosslinking of the agent molecules with a solid support (as an example, covalent crosslinking of an agent, which is a protein molecule, with CNBr-activated sepharose; to a specialist in In this area, it is obvious that the above example is not the only one and does not exhaust all possible methods of covalent immobilization of agents of various nature on a solid support) or is provided at the expense of interaction (an example is the interaction of an agent containing biotin with a streptavidin protein previously immobilized on a solid phase; it is obvious to a person skilled in the art that this example is not the only one and does not exhaust all possible methods of non-covalent immobilization of agents of various nature on solid media). It will also be apparent to one skilled in the art that, technically, the sorption process of non-target DNA molecules on the solid phase can be carried out both in batch format and in the form of chromatography on an affinity-supported column. It is also known from the prior art that the transfer of an agent to the solid phase can be achieved by attaching specific protein sequences to it, which provide a phase transition with a change in temperature (Kostal et al., 2004). Possible principal options for the immobilization of the agent and its associated DNA molecules on the solid phase are illustrated in FIG. 3.

В качестве агентов, обеспечивающих взаимодействие с молекулами ДНК, имеющими в своем составе специфические нуклеотидные последовательности, могут быть использованы белки, обладающие способностью узнавать и связываться с такими последовательностями. Из существующего уровня техники известно, что роль таких белков могут играть белки, являющиеся транскрипционными факторами, которые участвуют в регуляции транскрипции и специфически взаимодействуют со своими цис-действующими элементами, или домены таких белков, достаточные для такого взаимодействия ((Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), (Woodgate et al., 2002), (Kostal et al., 2004)). Данный тип агентов, способных связывать специфические последовательности ДНК, не приводит к модификации ДНК, и позволяет реализовать эффективное связывание молекул ДНК, имеющих в своем составе последовательности, узнаваемые транскрипционным фактором, как это известно из существующего уровня техники. Соответственно, в одном из своих воплощений в настоящем изобретении для специфического связывания ДНК могут использоваться в качестве агентов белки из числа транскрипционных факторов, а также их части, способные специфически взаимодействовать со своими цис-действующими элементами, и специфические нуклеотидные последовательности, узнаваемые транскрипционным фактором, которые включены в состав нецелевых молекул ДНК.As agents that provide interaction with DNA molecules that have specific nucleotide sequences in their composition, proteins with the ability to recognize and bind to such sequences can be used. It is known from the prior art that the role of such proteins can be played by proteins, which are transcription factors that participate in the regulation of transcription and specifically interact with their cis-acting elements, or the domains of such proteins are sufficient for such an interaction ((Darby & Hine, 2005; Darby et al., 2007; Mayrhofer et al., 2008), (Woodgate et al., 2002), (Kostal et al., 2004)). This type of agent capable of binding specific DNA sequences does not lead to DNA modification, and allows for the efficient binding of DNA molecules containing sequences recognized by a transcription factor, as is known from the prior art. Accordingly, in one of its embodiments in the present invention, proteins from a number of transcription factors, as well as parts thereof capable of specifically interacting with their cis-acting elements, and specific nucleotide sequences recognized by a transcription factor, which can be used as agents for specific DNA binding, can be used as agents included in non-target DNA molecules.

Помимо транскрипционных факторов, еще некоторые типы белков способны узнавать специфические нуклеотидные последовательности. Однако, в отличие от известных их настоящего уровня техники примеров реализации разделения молекул ДНК, основанных на взаимодействии белков со специфическими нуклеотидными последовательностями, в которых используются белки, не способные к внесению изменений в ковалентную структуру ДНК после связывания, эти белки после связывания вносят ковалентные изменения в ДНК, после чего диссоциируют с молекулы ДНК. Очевидно, что использование таких белков в качестве агента может быть неэффективно из-за процесса диссоциации. Кроме того, при использовании таких агентов, на эффективность истощения нецелевых молекул ДНК может негативно влиять происходящие в процессе разделения ковалентные модификации молекул ДНК. Поэтому настоящее изобретение в одном из своих воплощений предусматривает возможность использование в качестве агентов белков, способных узнавать специфические нуклеотидные последовательности и вносить ковалентных модификации в ДНК, которые, однако, несут мутации, не влияющие на их способность связывать специфические нуклеотидные последовательности, но нарушающие их энзиматическую активность в отношении внесения ковалентных модификаций в ДНК. Применение таких мутантных версий останавливает цикл работы фермента «связывание - модификация - диссоциация» на стадии связывания, обеспечивая эффективное взаимодействие агента с ДНК и исключая потенциальное влияние появления ковалентных модификаций ДНК на этот процесс.In addition to transcription factors, some other types of proteins are able to recognize specific nucleotide sequences. However, in contrast to examples of the separation of DNA molecules based on the interaction of proteins with specific nucleotide sequences, which use proteins that are not capable of modifying the covalent structure of DNA after binding, these proteins, after binding, make covalent changes in DNA, after which they dissociate from the DNA molecule. Obviously, the use of such proteins as an agent may be ineffective due to the process of dissociation. In addition, when using such agents, the covalent modifications of DNA molecules that occur during the separation process can negatively affect the efficiency of depletion of non-targeted DNA molecules. Therefore, the present invention in one of its embodiments provides the possibility of using as agents agents of proteins that can recognize specific nucleotide sequences and make covalent modifications to DNA, which, however, carry mutations that do not affect their ability to bind specific nucleotide sequences, but disrupt their enzymatic activity regarding the introduction of covalent modifications in DNA. The use of such mutant versions stops the binding – modification – dissociation enzyme cycle at the binding stage, ensuring the effective interaction of the agent with DNA and eliminating the potential effect of the appearance of covalent DNA modifications on this process.

Известно, что ДНК-связывающие белки, обладающие способностью взаимодействовать со специфическими нуклеотидными последовательностями, могут изменять свою аффинность при изменении степени сверхспирализации ДНК. Примером такого белка, использованного для последовательность-специфичной очистки молекул ДНК, является Lac-репрессор, аффинность которого к LacO-сайтам ослабляется при нахождении ДНК в релаксированном, а не сверхспирализованном состоянии (Whitson et al., 1987а; Whitson et al., 1987b). В одном из применений настоящего изобретения может возникать необходимость очистки целевых молекул ДНК из смеси, содержащей как релаксированные кольцевые, линейные, так и сверхспирализованные нецелевые молекулы ДНК. Примером такого применения является очистка целевого фрагмента ДНК после расщепления плазмидной ДНК, которая должна обеспечивать истощение всех возможных продуктов расщепления плазмиды, в том числе и продуктов неполного расщепления, которые, в том числе, могут содержать сверхспирализованные кольцевые молекулы ДНК (см. фиг. 4). Поэтому предпочтительно, чтобы используемый агент, обеспечивающий опосредованной специфической нуклеотидной последовательностью взаимодействие с молекулами ДНК, обладал неизменной аффинностью к ДНК вне зависимости от состояния ее сверхспирализации, что обеспечит одинаково эффективное связывание всех возможных нецелевых молекул ДНК.It is known that DNA-binding proteins with the ability to interact with specific nucleotide sequences can change their affinity when changing the degree of DNA supercoiling. An example of such a protein used for sequence-specific purification of DNA molecules is the Lac repressor, whose affinity for LacO sites weakens when the DNA is in a relaxed rather than supercoiled state (Whitson et al., 1987a; Whitson et al., 1987b) . In one application of the present invention, it may be necessary to purify target DNA molecules from a mixture containing both relaxed ring, linear, and supercoiled non-target DNA molecules. An example of such an application is the purification of a target DNA fragment after plasmid DNA cleavage, which should ensure the depletion of all possible plasmid cleavage products, including products of incomplete cleavage, which may also include supercoiled circular DNA molecules (see Fig. 4) . Therefore, it is preferable that the agent used, providing mediated specific nucleotide sequence interaction with DNA molecules, has a constant affinity for DNA regardless of its state of supercoiling, which will provide equally effective binding of all possible non-target DNA molecules.

Настоящее изобретение предполагает присутствие в составе нецелевых молекул ДНК, от которых осуществляется очистка, специфической нуклеотидной последовательности, обеспечивающей взаимодействие с агентом. В одном из своих воплощений настоящее изобретение предусматривает включение одной копии такой последовательности в одну молекулу ДНК, что будет обеспечивать ее взаимодействие с агентом. При этом каждая конкретная пара «агент - специфическая нуклеотидная последовательность» характеризуется определенной константой связывания, которая определяет, в зависимости от их концентраций, остаточную концентрацию нецелевых молекул ДНК в растворе в равновесном состоянии. Специалисту в данной области очевидно, что включение в состав молекулы ДНК более чем одной копии специфической нуклеотидной последовательности при прочих равных условиях будет сдвигать равновесное состояние в сторону уменьшения концентрации предназначенных для сорбции и истощения молекул ДНК, тем самым обеспечивая более полную и эффективную очистку от нецелевых молекул ДНК. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает включение в нецелевые молекулы ДНК, от которых производится отделение целевых молекул ДНК, более чем одной копии специфической нуклеотидной последовательности, с которой взаимодействует агент.The present invention assumes the presence in the composition of non-target DNA molecules from which the purification is carried out, a specific nucleotide sequence that provides interaction with the agent. In one of its embodiments, the present invention provides for the inclusion of one copy of such a sequence in one DNA molecule, which will ensure its interaction with the agent. Moreover, each specific pair of "agent - specific nucleotide sequence" is characterized by a specific binding constant, which determines, depending on their concentration, the residual concentration of non-target DNA molecules in solution in equilibrium. It is obvious to a person skilled in the art that the inclusion of more than one copy of a specific nucleotide sequence in a DNA molecule, ceteris paribus, will shift the equilibrium state towards a decrease in the concentration of DNA molecules intended for sorption and depletion, thereby providing a more complete and efficient purification from non-target molecules DNA Thus, in a preferred embodiment, the present invention provides for the inclusion in non-target DNA molecules from which the target DNA molecules are separated, more than one copy of the specific nucleotide sequence with which the agent interacts.

В одном из своих воплощений в настоящем изобретений в качестве агента для связывания ДНК может использоваться сайт-специфическая рекомбиназа Cre, специфически взаимодействующая с достаточно высокой константой связывания (Ringrose et al., 1998) с последовательностью нуклеотидов, называемой LoxP-сайтом, представляющую собой последовательность из 34 нуклеотидов (нт), состоящую из двух инвертированных повторов длинною 13 нт, разделенных спейсером в 8 нт. Поскольку рекомбиназа Cre относится к ДНК-связывающим белкам, ковалентно модифицирующим ДНК (в результате процесса рекомбинации), то для применения рекомбиназы Cre в настоящем изобретении возникает необходимость использования ее мутантов, сохраняющих способность специфически взаимодействовать с ZoxP-сайтами, но дефектных по рекомбинационной активности.In one of its embodiments in the present invention, a site-specific recombinase Cre, specifically interacting with a sufficiently high binding constant (Ringrose et al., 1998) with a nucleotide sequence called the LoxP site, which is a sequence of 34 nucleotides (nt), consisting of two inverted repeats 13 nt long, separated by a spacer of 8 nt. Since Cre recombinase refers to DNA-binding proteins that covalently modify DNA (as a result of the recombination process), the use of Cre recombinase in the present invention necessitates the use of its mutants that retain the ability to specifically interact with ZoxP sites, but which are defective in recombination activity.

Процесс рекомбинации, опосредованный Cre-рекомбиназой, включает в себя несколько стадий. Первой является взаимодействие молекул рекомбиназы с ZoxP-сайтами в составе молекулы ДНК. Далее происходит образование синаптических структур, или синапсов, состоящих из двух ZoxP-сайтов, за счет взаимодействия между субъединицами рекомбиназы Cre, что предшествует процессу рекомбинации и последующей диссоциации молекул Cre с ДНК (Ghosh et al., 2007). Известно, что мутанты рекомбиназы Cre, дефектные по рекомбинационной активности, но сохраняющие способность взаимодействовать с ZoxP-сайтами, могут как сохранять способность образовывать синапсы, так и быть лишенной этой способности. Поскольку ключевым требованием к агенту является сохранение способности взаимодействовать со специфической нуклеотидной последовательностью, оба типа мутантов могут быть использованы при практической реализации настоящего изобретения. В одном из своих воплощений, такими мутантами могут быть белки Cre, содержащие замену аминокислотного остатка лизина в позиции 201 полипептидной цепи на аланин (Cre(К201 А)) или замену аминокислотного остатка тирозина в позиции 324 полипептидной цепи на фенилаланин (Cre(Y324F). При этом известно, что мутант Cre(К201А) сохраняет способность образовывать синапсы, в то время как второй мутант, Cre(Y324F), дефектен не только по каталитической активности, но и по способности образовывать синаптические структуры (Ghosh et al., 2007). Специалисту в настоящей области очевидно, что потенциально возможно получение других мутантов белка Cre, сохраняющих способность специфически взаимодействовать с LoxP-сайтами, но дефектных по рекомбинационной активности, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения.The recombination process mediated by Cre recombinase involves several steps. The first is the interaction of recombinase molecules with ZoxP sites as part of a DNA molecule. Next, the formation of synaptic structures, or synapses, consisting of two ZoxP sites, due to the interaction between the Cre recombinase subunits, which precedes the process of recombination and subsequent dissociation of Cre molecules with DNA (Ghosh et al., 2007). It is known that Cre recombinase mutants that are defective in recombination activity but retain the ability to interact with ZoxP sites can both retain the ability to form synapses and be deprived of this ability. Since the key requirement for the agent is to maintain the ability to interact with a specific nucleotide sequence, both types of mutants can be used in the practical implementation of the present invention. In one of its embodiments, such mutants may be Cre proteins containing a substitution of the amino acid residue of the lysine at position 201 of the polypeptide chain with alanine (Cre (K201 A)) or a replacement of the amino acid residue of tyrosine at position 324 of the polypeptide chain with phenylalanine (Cre (Y324F). It is known that the Cre mutant (K201A) retains the ability to form synapses, while the second mutant, Cre (Y324F), is defective not only in its catalytic activity, but also in its ability to form synaptic structures (Ghosh et al., 2007). It will be apparent to those skilled in the art that it is potentially possible to obtain other Cre protein mutants retaining the ability to specifically interact with LoxP sites, but defective in recombination activity, which can be used in the practice of the present invention.

Специалисту в настоящей области очевидно, что при практической реализации настоящего изобретения при применении в качестве ДНК-связывающего агента мутантных версий рекомбиназы Cre в качестве узнаваемой ими последовательностей ДНК могут быть использованы не только ZoxP-сайты, но и их измененные версии, сохраняющие способность взаимодействовать с рекомбиназой Cre, например, описанные в (Kolb, 2001; Langer et al., 2002).It will be apparent to one skilled in the art that when practicing the present invention, when mutant versions of Cre recombinase are used as a DNA binding agent, not only ZoxP sites, but also their modified versions retaining the ability to interact with recombinase can be used as DNA sequences recognized by them. Cre, for example, described in (Kolb, 2001; Langer et al., 2002).

Специалисту в настоящей области также очевидно, что при практической реализации настоящего изобретения могут быть использованы варианты рекомбиназы Cre, специфичность взаимодействия которых с молекулами ДНК изменена в результате мутаций, в совокупности с ZoxP-сайтами с соответствующими нуклеотидными заменами, обеспечивающими взаимодействия с измененным белком Cre, например, описанные в (Hartung М & Kisters-Woike, 1998).It will also be apparent to a person skilled in the art that, in the practical implementation of the present invention, Cre recombinase variants can be used, the specificity of the interaction of which with DNA molecules is changed as a result of mutations, in conjunction with ZoxP sites with corresponding nucleotide substitutions that provide interactions with the altered Cre protein, for example described in (Hartung M & Kisters-Woike, 1998).

В одном из своих воплощений, для иммобилизации взаимодействующего с молекулами ДНК, содержащих ZoxP-сайты, белка Cre на твердой фазе могут использоваться химерные белки, полипептидные цепи которых включают в себя полипептидную цепь мутантного белка Cre и полипептидную цепь белка глутатион-S-трансферазы, обеспечивающего нековалентную сорбцию на твердом носителе глутатион-сефарозе.In one of its embodiments, for the immobilization of a Cre protein interacting with DNA molecules containing ZoxP sites, chimeric proteins can be used, the polypeptide chains of which include the Cre mutant protein polypeptide chain and the glutathione S-transferase protein polypeptide chain, which provides non-covalent sorption on a solid carrier of glutathione-sepharose.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает выбор агента из числа белков, взаимодействие которых со специфической последовательностью ДНК не зависит от наличия сверхспирализации в молекуле ДНК. В варианте осуществления изобретения, предусматривающем использование мутантных вариантов белка Cre в качестве ДНК-связывающего агента, это предпочтение выполняется, поскольку известно, что взаимодействие Cre с ДНК не зависит от наличия сверхспирализации ДНК (Hoess et al., 1984).In one preferred embodiment, the present invention provides for the selection of an agent from among proteins whose interaction with a specific DNA sequence is independent of the presence of supercoiling in the DNA molecule. In an embodiment of the invention involving the use of mutant variants of the Cre protein as a DNA binding agent, this preference is fulfilled since it is known that the interaction of Cre with DNA is independent of the presence of DNA supercoiling (Hoess et al., 1984).

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные фигуры.The invention will now be described in more detail with reference to separate illustrative figures.

На фиг. 1 проиллюстрированы ситуации, в которых затруднительно или невозможно получение неконтаминированного иными продуктами расщепления целевого фрагмента ДНК после расщепления плазмидной ДНК с помощью их разделения на основании различия длин молекул ДНК. На панеле А в результате расщепления плазмидной ДНК целевой фрагмент ДНК (полоса белого цвета) по своей длине существенно отличается от нецелевого фрагмента ДНК (полоса серого цвета), что позволяет эффективно разделить их в результате гель-электрофореза (внизу). На панеле Б целевой и нецелевой фрагменты ДНК имеют незначительное различие в длинах, что не позволяет эффективно разделить их в результате гель-электрофореза. На панеле В проиллюстрирована ситуация, когда нецелевой фрагмент ДНК существенно меньше по длине целевого фрагмента, что не позволяет отделить целевой фрагмент от продукта неполного расщепления плазмидной ДНК (полоса со штриховкой на схематическом изображении геля внизу).In FIG. 1 illustrates situations in which it is difficult or impossible to obtain a non-contaminated with other products cleavage of the target DNA fragment after cleavage of plasmid DNA by their separation based on the difference in the lengths of the DNA molecules. In panel A, as a result of plasmid DNA cleavage, the target DNA fragment (white strip) in length differs significantly from the non-target DNA fragment (gray strip), which allows them to be effectively separated by gel electrophoresis (bottom). On panel B, the target and non-target DNA fragments have a slight difference in lengths, which does not allow to effectively separate them as a result of gel electrophoresis. Panel B illustrates the situation when a non-target DNA fragment is significantly smaller in length of the target fragment, which does not allow to separate the target fragment from the product of incomplete cleavage of plasmid DNA (a strip with a hatch in the schematic image of the gel below).

На фиг. 2 представлена принципиальная схема очистки целевых фрагментов ДНК (полоса белого цвета) от нецелевых фрагментов ДНК (полоса серого цвета), имеющих в своем составе специфическую нуклеотидную последовательность (круг черного цвета), получаемых в результате расщепления плазмидной ДНК (а)). К раствору фрагментов ДНК, получаемых в результате расщепления плазмиды, добавляется иммобилизованный на твердом носителе агент (полукольцо серого цвета на схеме), способный взаимодействовать со специфической нуклеотидной последовательностью (б)). После опосредованного специфической нуклеотидной последовательностью связывания нецелевых фрагментов ДНК агентом носитель с иммобилизованными на твердой фазе комплексами агента и нецелевых фрагментов ДНК удаляется (в)), оставляя в растворе только целевой фрагмент ДНК (г)).In FIG. Figure 2 presents a schematic diagram of the purification of target DNA fragments (white band) from non-target DNA fragments (gray band), which contain a specific nucleotide sequence (black circle) obtained by cleavage of plasmid DNA (a)). An agent immobilized on a solid support is added to the solution of DNA fragments obtained as a result of plasmid cleavage (a gray half-ring in the scheme) capable of interacting with a specific nucleotide sequence (b)). After the binding of non-target DNA fragments by an agent mediated by a specific nucleotide sequence, the carrier with complexes of the agent and non-target DNA fragments immobilized on the solid phase is removed (c)), leaving only the target DNA fragment in solution (g)).

На фиг. 3 проиллюстрированы возможные принципиальные варианты иммобилизации агента (полукольцо серого цвета) и связанных с ним нецелевых молекул ДНК (полоса серого цвета), содержащих специфическую нуклеотидную последовательность (круг черного цвета) на твердой фазе (обозначена штриховкой). А - агент может быть изначально иммобилизован на твердом носителе, который добавляется к раствору смеси нецелевых и целевых (полоса белого цвета) молекул ДНК, после чего происходит связывание агентом нецелевых молекул ДНК и их иммобилизация на твердой фазе. Связывание нецелевых молекул ДНК может осуществляться агентом, находящимся в растворе, после чего иммобилизация комплекса агента с нецелевым фрагментом ДНК на твердой фазе осуществляется за счет специфического взаимодействия агента с добавляемым твердым носителем (Б) или за счет индуцируемого внешним воздействием (молния на схеме) фазового перехода агента (В).In FIG. Figure 3 illustrates possible principal options for the immobilization of an agent (half ring of gray color) and related non-target DNA molecules (gray strip) containing a specific nucleotide sequence (black circle) on the solid phase (indicated by hatching). A - the agent can be initially immobilized on a solid carrier, which is added to the solution of a mixture of non-target and target (white band) DNA molecules, after which the agent binds the non-target DNA molecules and immobilizes them on the solid phase. The binding of non-target DNA molecules can be carried out by the agent in solution, after which the complex of the agent with the non-target DNA fragment on the solid phase is immobilized due to the specific interaction of the agent with the added solid carrier (B) or due to the phase transition induced by external action (lightning in the diagram) agent (B).

На фиг. 4 схематически изображены возможные нецелевые молекулы ДНК после расщепления плазмиды, содержащей целевой фрагмент ДНК (полоса белого цвета): продукт полного расщепления - линейный фрагмент ДНК, содержащий векторную последовательность (полоса серого цвета) (а)), и продукты неполного расщепления - расщепление только по одному сайту (б)), кольцевые релаксированная (без штриховки) (в)) и сверхспирализованная (со штриховкой) (г)) молекулы плазмидной ДНК.In FIG. Figure 4 schematically shows possible non-targeted DNA molecules after cleavage of a plasmid containing the target DNA fragment (white band): the product of complete cleavage is a linear DNA fragment containing the vector sequence (gray band) (a)), and the products of incomplete cleavage are only cleaved according to one site (b)), ring relaxed (without hatching) (c)) and supercoiled (with hatching) (d)) plasmid DNA molecules.

На фиг. 5 представлены репрезентативные результаты очистки и иммобилизации на глутатион-сефарозе рекомбинантного белка GST-Cre(Y324F). Суммарные лизаты клеток E.coli, трансформированных плазмидой pGEX-4T-1 с клонированной в нее кДНК мутантного варианта рекомбиназы Cre, Cre(Y324F), для экспрессии химерного белка GST-Cre(Y324F)) до (дорожка 2) и после (дорожка 3) индукции экспрессии рекомбинантного белка, полученные в результате обработки ультразвуком лизаты тех же клеток E.coli после индукции экспрессии рекомбинантного белка до (дорожка 4) и после (дорожка 5) сорбции рекомбинантного белка на глутатион-сефарозе, и белки, элюированные с помощью кипячения в буфере для нанесения белков на гель с 1 мкл глутатион-сефарозы после сорбции рекомбинантного белка (дорожка 6), разделяли в 10% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. После разделения белки в геле окрашивались красителем Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad,). Положение рекомбинантного белка GST-Cre(Y324F) в геле показано стрелкой. В дорожке 1 нанесены маркеры молекулярных масс белков, с указанием молекулярных масс компонентов маркера (в кДа) слева.In FIG. Figure 5 shows representative results of purification and immobilization of the recombinant GST-Cre protein (Y324F) on glutathione-sepharose. Total lysates of E. coli cells transformed with pGEX-4T-1 plasmid with the cDNA of the mutant variant of Cre, Cre (Y324F) recombinase cloned into it, for expression of the GST-Cre chimeric protein (Y324F) before (lane 2) and after (lane 3 ) induction of expression of the recombinant protein obtained by sonication of the lysates of the same E. coli cells after induction of expression of the recombinant protein before (lane 4) and after (lane 5) sorption of the recombinant protein on glutathione-sepharose, and proteins eluted by boiling in gel protein buffer with 1 μl g utation sepharose after sorption of the recombinant protein (lane 6) were separated on a 10% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate. After separation, the proteins in the gel were stained with Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad,). The position of the recombinant protein GST-Cre (Y324F) in the gel is shown by the arrow. Lane 1 contains the molecular weight markers of the proteins, indicating the molecular weights of the marker components (in kDa) on the left.

На фиг. 6 приведены схематические изображения модельных плазмид pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR и pBl-LoxP-NeoR-LoxP и продуктов их расщепления эндонуклеазами рестрикции EcoRI и SalI. Векторная последовательность плазмиды pBluescript SKII(-) длинною около 3 тысяч пар оснований изображена белым цветом, кДНК неомицин фосфотрансферазы II (~1000 пар нуклеотидов) изображена серым цветом. ZoxP-сайты в плазмидах pBl-LoxP-NeoR, pBl-LoxP-NeoR-LoxP и продуктах их расщепления изображены в виде кругов черного цвета. В плазмидах также отмечены положения сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и SalI.In FIG. Figure 6 shows schematic representations of model plasmids pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR and pBl-LoxP-NeoR-LoxP and their cleavage products with restriction endonucleases EcoRI and SalI. The vector sequence of plasmid pBluescript SKII (-) with a length of about 3 thousand base pairs is shown in white, the cDNA of neomycin phosphotransferase II (~ 1000 nucleotides) is shown in gray. ZoxP sites in plasmids pBl-LoxP-NeoR, pBl-LoxP-NeoR-LoxP and their cleavage products are shown as black circles. The plasmids also marked the position of the recognition sites of restriction endonucleases EcoRI and SalI.

На фиг. 7 приведены результаты агарозного гель-электрофореза указанных плазмидных ДНК (pBl-NeoR и pBl-LoxP-NeoR), присутствующих в растворе до (дорожки 7) и после первой (дорожки 2), второй (дорожки 3) и третьей (дорожки 4) инкубации с глутатион-сефарозой с иммобилизованными белками GST-Cre(K201A) (Cre (201А)) или GST-Cre(Y324F) (Cre(Y324F)).In FIG. 7 shows the results of agarose gel electrophoresis of the indicated plasmid DNAs (pBl-NeoR and pBl-LoxP-NeoR) present in the solution before (lane 7) and after the first (lane 2), second (lane 3) and third (lane 4) incubation with glutathione-sepharose with immobilized proteins GST-Cre (K201A) (Cre (201A)) or GST-Cre (Y324F) (Cre (Y324F)).

На фиг. 8 приведены результаты агарозного гель-электрофореза продуктов расщепления указанных плазмидных ДНК (pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR и pBl-LoxP-NeoR-LoxP) рестрикционными эндонуклеазами EcoRI и SalI, присутствующих в растворе до (дорожки 1) и после первой (дорожки 2), второй (дорожки 3) и третьей (дорожки 4) инкубации с глутатион-сефарозой с иммобилизованными белками GST-Cre(K201 А) (Cre(201А)) или GST-Cre(Y324F) (Cre(Y324F)). Фрагмент ДНК, являющийся кДНК NeoR, отмечен звездочкой; стрелкой показан фрагмент ДНК, соответствующий вектору.In FIG. Figure 8 shows the results of agarose gel electrophoresis of the cleavage products of the indicated plasmid DNAs (pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR and pBl-LoxP-NeoR-LoxP) with restriction endonucleases EcoRI and SalI present in the solution before (lane 1) and after the first (lane) 2), second (lanes 3) and third (lanes 4) incubations with glutathione-sepharose with immobilized proteins GST-Cre (K201 A) (Cre (201A)) or GST-Cre (Y324F) (Cre (Y324F)). The DNA fragment, which is NeoR cDNA, is marked with an asterisk; the arrow shows the DNA fragment corresponding to the vector.

Описание конкретных примеров осуществления изобретенияDescription of specific embodiments of the invention

Пример 1. Получение иммобилизованных на твердой фазе дефектных по рекомбинационной активности белков CreExample 1. Obtaining immobilized on a solid phase defective in recombination activity of Cre proteins

кДНК рекомбиназы Cre была амплифицирована на матрице плазмиды pBl-hTERT-Surv269-Cre-3DNMT1 с праймерами 5'-agaattcgagctccccaagaagaagaggaag-3' and 5'-agtcgacctaatcgccatcttccag-3', содержащими сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и SalI, соответственно, и клонирована в вектор для клонирования ПЦР-продуктов pJET1 (Fermentas).Cre recombinase cDNA was amplified on the pBl-hTERT-Surv269-Cre-3DNMT1 plasmid matrix with 5'-agaattcgagctccccaagaagaagaggaag-3 'and 5'-agtcgacctaatcgccatcttccag-3' primers containing Salon recognition and EcoRon recognition sites and for cloning PCR products pJET1 (Fermentas).

Для получения мутантных версий рекомбиназы Cre, дефектных по рекомбинационной активности (замена лизина-201 на аланин, К201 А, и замена тирозина-324 на фенилаланин, Y324F (Ghosh et al., 2007)), в кДНК Cre в векторе pJET1 были внесены соответствующие нуклеотидные замены с использованием набора QuickChange site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) и олигонуклеотидов 5'-atccatattggcagaacggcaacgctggttagcaccgc-3' и 5'-gcggtgctaaccagcgttgccgttctgccaatatggat-3' для мутанта K201 А, и 5'-caatgtaaatattgtcatgaactttatccgtaacctggatagtgaaa-3, and 5'-tttcactatccaggttacggataaagttcatgacaatatttacattg-31 для мутанта Y324F в соответствии с протоколом производителя. Полученные кДНК мутантных вариантов рекомбиназы Cre были клонированы в вектор pGEX-4T-1 (GE Healthcare) для экспрессии мутантов Cre как химер с глутатион-S-трансферазой (GST) (белки GST-Cre(K201 А) и GST-Cre(Y324F)).To obtain mutant versions of Cre recombinase that are defective in recombination activity (replacing lysine-201 with alanine, K201 A, and replacing tyrosine-324 with phenylalanine, Y324F (Ghosh et al., 2007)), the corresponding pJET1 vectors were introduced into Cre cDNA nucleotide substitutions using a set QuickChange site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies) and oligonucleotide 5'-atccatattggcagaacggcaacgctggttagcaccgc-3 'and 5'-gcggtgctaaccagcgttgccgttctgccaatatggat-3' a mutant K201 and 5'-caatgtaaatattgtcatgaactttatccgtaacctggatagtgaaa-3, and 5'-tttcactatccaggttacggataaagttcatgacaatatttacattg -31 for mutant Y324F according to the manufacturer's protocol. The resulting cDNA of mutant Cre recombinase variants were cloned into pGEX-4T-1 vector (GE Healthcare) for expression of Cre mutants as glutathione S-transferase (GST) chimeras (GST-Cre (K201 A) and GST-Cre (Y324F) proteins )

Рекомбинантные белки GST-Cre(K201A), GST-Cre(Y324F) и GST экспрессировали в клетках E.coli, штамм Rosetta-gami DE3pLysS, и очищали на глутатион-сефарозе (GE Healthcare) в соответствии с протоколом производителя, причем инкубацию глутатион-сефарозы с клеточным лизатом, содержащим рекомбинантный белок, проводили в избытке рекомбинантного белка по отношению к емкости носителя для насыщения сайтов связывания глутатион-сефарозы белком GST, GST-Cre(K201A) или GST-Cre(Y324F). Глутатион-сефарозу со связавшимся белком промывали фосфатно-солевым буфером и хранили в фосфатно-солевым буфером с добавлением азида натрия (0.02%) при температуре +4°С. На фиг. 5 представлены репрезентативные результаты очистки и иммобилизации на глутатион-сефарозе рекомбинантных белков на примере белка GST-Cre(Y324F).Recombinant proteins GST-Cre (K201A), GST-Cre (Y324F) and GST were expressed in E. coli cells, strain Rosetta-gami DE3pLysS, and purified on glutathione-sepharose (GE Healthcare) according to the manufacturer's protocol, and incubation of glutathione Sepharose with a cell lysate containing the recombinant protein was carried out in excess of the recombinant protein relative to the capacity of the carrier to saturate the glutathione-Sepharose binding sites with GST, GST-Cre (K201A) or GST-Cre (Y324F) protein. Glutathione-sepharose with bound protein was washed with phosphate-buffered saline and stored in phosphate-buffered saline with sodium azide (0.02%) at + 4 ° С. In FIG. Figure 5 presents representative results of purification and immobilization of recombinant proteins on glutathione-sepharose using the example of GST-Cre protein (Y324F).

Пример 2. Получение модельных молекул ДНКExample 2. Obtaining model DNA molecules

Фрагмент ДНК, содержащий LoxP-стт, был вырезан из плазмиды pCI-CMV-LoxP-NeoR-LoxP-FCU1 с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI и XhoI и субклонирован в вектор pBK-CMV (Stratagene) по сайтам узнавания рестрикционных эндонуклеаз EcoRI и XhoI, после чего сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы EcoRI был нарушен в результате расщепления плазмиды рестрикционной эндонуклеазы EcoRI с последующей обработкой продуктов расщепления фрагментом Кленова и лигированием (плазмида рВК-LoxP). Плазмида pBK-LoxP была использована в качестве матрицы для амплификации фрагмента ДНК с Z-oxP-сайтом с использованием праймеров 5'-agaattcccgataatattcaa-3' и 5'-aagatctaaactcctcttcagacc-3' с его последующим клонированием в вектор pJET1 (Fermentas) (плазмида pJET1-LoxP). Для получения плазмиды pBl-LoxP, EcoRI-BglII фрагмент ДНК из плазмиды pJET1-LoxP, содержащий LoxP-сайт, был субклонирован в вектор pBluescript SKII(-) (Stratagene) по сайтам узнавания рестрикционных эндонуклеаз EcoRI и BamHI. Для получения плазмиды pBl-LoxP-NeoR, кДНК неомицин фосфотрансферазы II (~1000 пар нуклеотидов) была субклонирована из плазмиды pCI-CMV-LoxP-NeoR-LoxP-FCU1 в плазмиду pBl-LoxP между сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и SalI. Для получения плазмиды pBl-LoxP-NeoR-LoxP, KpnI-SalI фрагмент из плазмиды pBK-LoxP, содержащий ZoxP-сайт, был субклонирован между сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции KpnI и SalI в плазмиду pBl-LoxP-NeoR. Для получения контрольной плазмиды pBl-NeoR, содержащей кДНК неомицин фосфотрансферазы II без ZoxP-сайтов, EcoRI-SalI фрагмент ДНК из плазмиды pCI-CMV-LoxP-NeoR-LoxP-FCU1, содержащий кДНК неомицин фосфотрансферазы II, был клонирован в вектор pBluescript SKII(-) между сайтами узнавания соответствующих эндонуклеаз рестрикции.The DNA fragment containing LoxP-CTT was excised from the plasmid pCI-CMV-LoxP-NeoR-LoxP-FCU1 using EcoRI and XhoI restriction endonucleases and subcloned into the pBK-CMV (Stratagene) vector at EcoRI and XhoI restriction endonuclease recognition sites after whereby the EcoRI restriction endonuclease recognition site was disrupted by digestion of the EcoRI restriction endonuclease plasmid, followed by treatment of the cleavage products with a Klenov fragment and ligation (plasmid pBC-LoxP). The plasmid pBK-LoxP was used as a template for amplification of a DNA fragment with a Z-oxP site using primers 5'-agaattcccgataatattcaca-3 'and 5'-aagatctaaactcctcttcagacc-3' with subsequent cloning into pJET1 vector (Fermentas) (plasmid -LoxP). To obtain the pBl-LoxP plasmid, the EcoRI-BglII DNA fragment from the pJET1-LoxP plasmid containing the LoxP site was subcloned into the pBluescript SKII (-) vector (Stratagene) at the restriction endonuclease recognition sites EcoRI and BamHI. To obtain the pBl-LoxP-NeoR plasmid, the neomycin phosphotransferase II cDNA (~ 1000 nucleotide pairs) was subcloned from the pCI-CMV-LoxP-NeoR-LoxP-FCU1 plasmid into the pBl-LoxP plasmid between the EcoRI and SalI restriction endonuclease recognition sites. To obtain the plasmid pBl-LoxP-NeoR-LoxP, the KpnI-SalI fragment from the plasmid pBK-LoxP containing the ZoxP site was subcloned between the recognition sites of the restriction endonucleases KpnI and SalI into the plasmid pBl-LoxP-NeoR. To obtain a control plasmid pBl-NeoR containing neomycin phosphotransferase II cDNA without ZoxP sites, an EcoRI-SalI DNA fragment from plasmid pCI-CMV-LoxP-NeoR-LoxP-FCU1 containing neomycin phosphotransferase II cDNA was cloned into SKII pBluescript vector -) between recognition sites of the corresponding restriction endonucleases.

Эндонуклеазы рестрикции EcoRI и SalI использовались для расщепления плазмид pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR и pBl-LoxP-NeoR-LoxP с получением фрагмента кДНК неомицин фосфотрансферазы II, длинною около 1000 пар нуклеотидов, не содержащей в своем составе последовательности ZoxP-сайта, и фрагмента вектора pBluescript SKII(-) длинною около 3000 пар оснований, не содержащего, содержащего один или два LoxP-сайта, соответственно.The restriction endonucleases EcoRI and SalI were used to cleave plasmids pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR and pBl-LoxP-NeoR-LoxP to obtain a neomycin phosphotransferase II cDNA fragment of about 1000 nucleotide lengths that did not contain a ZoxP site sequence and a pBluescript SKII (-) vector fragment of about 3,000 base pairs in length, not containing one or two LoxP sites, respectively.

Схематические изображения модельных плазмид pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR и pBl-LoxP-NeoR-LoxP и продуктов их расщепления эндонуклеазами рестрикции EcoRI и SalI приведены на фиг. 6.Schematic representations of the model plasmids pBl-NeoR, pBl-LoxP-NeoR and pBl-LoxP-NeoR-LoxP and their cleavage products with restriction endonucleases EcoRI and SalI are shown in FIG. 6.

Пример 3. Селективная сорбция иммобилизованными на твердой фазе дефектными по рекомбинационной активности белков Cre сверхспирализованных молекул ДНК, содержащих последовательность LoxP-сайтаExample 3. Selective sorption of immobilized on a solid phase defects in the recombination activity of Cre proteins of supercoiled DNA molecules containing the sequence of the LoxP site

Для связывания с иммобилизованными на глутатион-сефарозе мутантами белка Cre готовили раствор плазмидных ДНК pBl-NeoR или pBl-LoxP-NeoR в концентрации 50 нг/мкл в буфере для связывания, содержащим 10 мМ Tris-HCl, рН8.0, 400 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂ и 1 мМ дитиотриэтола (DTT). Глутатион-сефарозу с иммобилизованным рекомбинантным белком GST, GST-Cre(K201 А) или GST-Cre(Y324F) два раза промывали буфером для связывания, затем к 20 мкл (объем носителя) глутатион-сефарозы с иммобилизованным рекомбинантным белком добавляли 25 мкл раствора плазмидной ДНК и инкубировали с перемешиванием в течение 30 мин. при комнатной температуре. После инкубации носитель осаждали центрифугированием (1000 об./мин., 1 мин.) на дно пробирки. Далее связывание повторяли для супернатанта с новой аликвотой глутатион-сефарозы с иммобилизованным рекомбинантным белком, оставив 2 мкл супернатанта для последующего анализа. Суммарно для каждого образца проводили 3 последовательные инкубации с аликвотами глутатион-сефарозы с иммобилизованным рекомбинантным белком.For binding to Cre protein mutants immobilized on glutathione-Sepharose, a solution of plasmid DNA pBl-NeoR or pBl-LoxP-NeoR at a concentration of 50 ng / μl in binding buffer containing 10 mM Tris-HCl, pH8.0, 400 mM NaCl was prepared 10 mM MgCl ₂ and 1 mM dithiotriethol (DTT). Glutathione-Sepharose with immobilized recombinant protein GST, GST-Cre (K201 A) or GST-Cre (Y324F) was washed twice with binding buffer, then 25 μl of plasmid solution was added to 20 μl (carrier volume) of glutathione-sepharose with immobilized recombinant protein DNA and incubated with stirring for 30 minutes at room temperature. After incubation, the carrier was besieged by centrifugation (1000 rpm./min., 1 min.) To the bottom of the tube. Next, binding was repeated for the supernatant with a new aliquot of glutathione-sepharose with an immobilized recombinant protein, leaving 2 μl of the supernatant for subsequent analysis. In total, for each sample, 3 consecutive incubations with aliquots of glutathione-sepharose with immobilized recombinant protein were performed.

Исходный раствор плазмидной ДНК (2 мкл), а также аликвоты супернатанта после каждой инкубации анализировали в агарозном геле в присутствии бромистого этидия. В результате было установлено, что инкубация с глутатион-сефарозы с иммобилизованным рекомбинантным белком GST не приводит к истощению плазмидной ДНК (данные не приведены), что свидетельствует об отсутствии неспецифического связывания ДНК с глутатион-сефарозой и белком GST в выбранных условиях.The initial plasmid DNA solution (2 μl), as well as aliquots of the supernatant after each incubation, were analyzed on an agarose gel in the presence of ethidium bromide. As a result, it was found that incubation with glutathione-sepharose with an immobilized recombinant GST protein does not lead to depletion of plasmid DNA (data not shown), which indicates the absence of nonspecific binding of DNA to glutathione-sepharose and GST protein under selected conditions.

При инкубации плазмиды pBl-LoxP-NeoR, имеющей в своей последовательности ZoxP-сайт, с иммобилизованным на глутатион-сефарозе рекомбинантном белке GST-Cre(К201 А) или GST-Cre(Y324F) наблюдалось выраженное истощение плазмидной ДНК из раствора, вплоть до практически полного отсутствия ДНК в растворе после третьей инкубации (фиг. 7). В то же время, при инкубации с идентичной плазмидой pBl-NeoR, в которой, однако, отсутствует ZoxP-сайт, истощение плазмидной ДНК было существенно менее выражено (для мутанта К201А) или практически отсутствовало (для мутанта Y324F) (фиг. 7). Полученные результаты свидетельствуют о специфическом взаимодействии плазмидной ДНК с ZoxP-сайтом с иммобилизованными на твердом носителе белками GST-Cre(K201A) и GST-Cre(Y324F), которое опосредуется ZoxP-сайтом в составе плазмидной ДНК.Upon incubation of the plasmid pBl-LoxP-NeoR, which has a ZoxP site in its sequence, with the recombinant protein GST-Cre (K201 A) or GST-Cre (Y324F) immobilized on glutathione-Sepharose, a pronounced depletion of plasmid DNA from the solution was observed, up to almost the complete absence of DNA in solution after the third incubation (Fig. 7). At the same time, during incubation with the identical plasmid pBl-NeoR, in which, however, the ZoxP site is absent, depletion of plasmid DNA was significantly less pronounced (for the K201A mutant) or practically absent (for the Y324F mutant) (Fig. 7). The results indicate a specific interaction of plasmid DNA with the ZoxP site with the GST-Cre (K201A) and GST-Cre (Y324F) proteins immobilized on a solid support, which is mediated by the ZoxP site in the plasmid DNA.

Данный пример наглядно демонстрирует, что используемые в качестве агента иммобилизованные на твердой фазе дефектные по рекомбинационной активности белки Cre, в частности, мутанты К201А и Y324F, иммобилизованные на глутатион-сефарозе при экспрессии в виде химер с белком GST, способны селективно взаимодействовать с кольцевыми сверхспирализованными молекулами ДНК, содержащими последовательность LoxP-сайта, и, соответственно, могут применяться для очистки целевых молекул ДНК от таких молекул.This example clearly demonstrates that Cre proteins, immobilized on a solid phase, which are defective in recombination activity, used as an agent, in particular K201A and Y324F mutants immobilized on glutathione-sepharose when expressed as chimeras with GST protein, are able to selectively interact with ring supercoiled molecules DNA containing the sequence of the LoxP site, and, accordingly, can be used to purify target DNA molecules from such molecules.

Пример 4. Использование иммобилизованных на твердой фазе дефектных по рекомбинационной активности белков Cre для очистки целевого фрагмента ДНК, полученного в результате расщепления плазмидной ДНК, от фрагмента вектораExample 4. The use of immobilized on a solid phase defective in recombination activity of Cre proteins for purification of the target DNA fragment obtained by cleavage of plasmid DNA from a fragment of the vector

Плазмиды pBl-NeoR и идентичная ей плазмида pBl-LoxP-NeoR, имеющая в своем составе LoxP-сайт, были подвергнуты расщеплению эндонуклеазами рестрикции EcoRI и SalI, в результате чего образовывается фрагмент ДНК, представляющий собой кДНК NeoR, не имеющий в своем составе ZoxP-сайта и одинаковый в случае расщепления обоих плазмид, и линейный фрагмент вектора pBluescript SKII(-), который в случае расщепления плазмиды pBl-LoxP-NeoR имеет в своем составе LoxP-сайт (см. фиг. 6). Расщепление проводили в реакции объемом 30 мкл, содержащей 2 мкг плазмидной ДНК в 1х буфере «О» для эндонуклеаз рестрикции (Fermentas). После расщепления к реакции добавляли 10 мкл раствора, содержащего 10 мМ MgCl₂, 1.27 М NaCl и 4 мМ DTT для получения 40 мкл раствора расщепленной плазмидной ДНК в концентрации 50 нг/мкл в буфере для связывания (см. Пример 3). Инкубацию расщепленной плазмидной ДНК с иммобилизованными на глутатион-сефарозе мутантами белка Cre проводили, как описано в Примере 3.The plasmids pBl-NeoR and the identical plasmid pBl-LoxP-NeoR, containing the LoxP site, were digested with restriction endonucleases EcoRI and SalI, resulting in the formation of a DNA fragment representing NeoR cDNA that does not contain ZoxP- the site and the same in the case of cleavage of both plasmids, and a linear fragment of the vector pBluescript SKII (-), which in the case of cleavage of the plasmid pBl-LoxP-NeoR incorporates a LoxP site (see Fig. 6). Cleavage was carried out in a 30 μl reaction containing 2 μg of plasmid DNA in 1x O buffer for restriction endonucleases (Fermentas). After digestion, 10 μl of a solution containing 10 mM MgCl ₂ , 1.27 M NaCl and 4 mM DTT was added to the reaction to obtain 40 μl of a solution of cleaved plasmid DNA at a concentration of 50 ng / μl in binding buffer (see Example 3). The incubation of cleaved plasmid DNA with Cre protein mutants immobilized on glutathione-sepharose was performed as described in Example 3.

В результате анализа фрагментов ДНК, остающихся в растворе после инкубации, было установлено, что при наличии в составе фрагмента ДНК вектора ZoxP-сайта происходит его селективная сорбция из раствора, в то время как фрагмент вставки, не имеющий в своей последовательности ZoxP-сайта, остается в растворе. В то же время, в контрольных инкубациях с продуктами расщепления плазмиды pBl-NeoR, которые не имеют в своих последовательностях ZoxP-сайта, селективного истощения одного из фрагментов не наблюдалось (фиг. 8).As a result of the analysis of DNA fragments remaining in the solution after incubation, it was found that if the DNA fragment contains a ZoxP site vector, it selectively sorbes from the solution, while the insert fragment that does not have a ZoxP site in its sequence remains in solution. At the same time, in control incubations with pBl-NeoR plasmid cleavage products that do not have a ZoxP site in their sequences, selective depletion of one of the fragments was not observed (Fig. 8).

Данный пример наглядно демонстрирует, что иммобилизованные на твердой фазе дефектные по рекомбинационной активности белки Cre, в частности, мутанты К201А и Y324F, иммобилизованные на глутатион-сефарозе при экспрессии в виде химер с белком GST, могут применяться для очистки целевых молекул ДНК от нецелевых молекул ДНК, имеющих в своем составе ZoxP-сайт, в частности, для очистки фрагмента ДНК, полученного в результате расщепления плазмидной ДНК, от фрагмента вектора, последовательность которого содержит ZoxP-сайт.This example clearly demonstrates that Cre proteins immobilized on a solid phase with defects in recombination activity, in particular, K201A and Y324F mutants immobilized on glutathione-sepharose when expressed as chimeras with GST protein, can be used to purify target DNA molecules from non-target DNA molecules containing a ZoxP site, in particular, for purification of a DNA fragment obtained by cleavage of plasmid DNA from a vector fragment whose sequence contains a ZoxP site.

Пример 5. Увеличение числа ZaxP-сайтов увеличивает эффективность сорбции содержащих их молекул ДНК на твердую фазу с иммобилизованными дефектными по рекомбинационной активности белками CreExample 5. The increase in the number of ZaxP sites increases the efficiency of sorption of DNA molecules containing them on the solid phase with immobilized Cre proteins defective in recombination activity

Помимо очистки фрагмента кДНК NeoR, получаемого в результате расщепления плазмиды pBl-LoxP-NeoR, от фрагмента вектора, имеющего в своем составе один ZoxP-сайт (см. Пример 4), нами была проведена очистка фрагмента кДНК NeoR, получаемого в результате расщепления плазмиды pBl-LoxP-NeoR-LoxP, от фрагмента вектора, идентичному получаемому при расщеплении плазмиды pBl-LoxP-NeoR, но имеющего в своем составе не один, а два ZoxP-сайта (см. фиг. 6). Расщепление плазмидных ДНК и инкубации с иммобилизованными на глутатион-сефарозе мутантами белка Cre проводили, как описано в Примере 4.In addition to purification of the NeoR cDNA fragment obtained by cleavage of the pBl-LoxP-NeoR plasmid, from the vector fragment containing one ZoxP site (see Example 4), we also cleared the NeoR cDNA fragment obtained by cleavage of the pBl plasmid -LoxP-NeoR-LoxP, from a fragment of a vector identical to that obtained by cleavage of the plasmid pBl-LoxP-NeoR, but containing not one but two ZoxP sites (see Fig. 6). Plasmid DNA digestion and incubation with Cre protein mutants immobilized on glutathione-sepharose were performed as described in Example 4.

В результате анализа фрагментов ДНК, остающихся в растворе после инкубаций, было установлено, что при наличии в составе фрагмента ДНК вектора двух, а не одного ZoxP-сайта полное истощение по фрагменту вектора в случае мутанта Cre(Y324F) происходит уже после второй инкубации, в то время как присутствие одной копии ZoxP-сайта в последовательности фрагмента вектора обеспечивает аналогичный результат только после третьей инкубации, а после второй инкубации наблюдается присутствие остаточных количеств фрагмента вектора в растворе (фиг. 8). При использовании мутанта Cre(К201А) наличие одного ZoxP-сайта в последовательности фрагмента вектора не позволило добиться его полного истощения в результате трех последовательных инкубации, однако введение второго ZoxP-сайта позволило полностью сорбировать из раствора фрагмент вектора в таких же условиях (фиг. 8).As a result of the analysis of DNA fragments remaining in the solution after incubation, it was found that if a vector fragment contains two rather than one ZoxP site, complete depletion of the vector fragment in the case of the Cre mutant (Y324F) occurs after the second incubation, in while the presence of one copy of the ZoxP site in the sequence of the vector fragment provides a similar result only after the third incubation, and after the second incubation, the presence of residual amounts of the vector fragment in the solution is observed (Fig. 8). When using the Cre mutant (K201A), the presence of one ZoxP site in the sequence of the vector fragment did not allow its complete depletion as a result of three consecutive incubations, however, the introduction of the second ZoxP site completely sorbed the vector fragment from the solution under the same conditions (Fig. 8) .

Настоящий пример наглядно демонстрирует, что увеличения числа копий специфически узнаваемых ДНК-связывающим агентом нуклеотидных последовательностей в нецелевых молекулах ДНК, в частности, числа копий ZoxP-сайтов при использовании дефектных по рекомбинационной активности белков Cre в качестве агента, в частности, мутантов Cre К201А и Y324F, иммобилизованных на глутатион-сефарозе при экспрессии в виде химер с белком GST, увеличивает эффективность перевода нецелевых молекул ДНК на твердую фазу, тем самым увеличивая эффективность очистки целевых фрагментов ДНК.This example clearly demonstrates that the increase in the number of copies of nucleotide sequences specifically recognized by the DNA-binding agent in non-target DNA molecules, in particular, the number of copies of ZoxP sites when using Cre proteins with defective recombination activity as an agent, in particular, Cre K201A and Y324F mutants immobilized on glutathione-sepharose when expressed as chimeras with the GST protein increases the efficiency of the transfer of non-target DNA molecules to the solid phase, thereby increasing the purification efficiency of target DNA frame range.

Список цитированной литературыList of references

1. Коробко ИВ, Кабишев АА, Киселев СЛ. Идентификация новой протеинкиназы, специфически транскрибирующейся в опухолях мыши с высоким метастатическим потенциалом. Докл. Акад. Наук, 1997, 354: 554-556.1. Korobko IV, Kabishev AA, Kiselev SL. Identification of a new protein kinase specifically transcribed in mouse tumors with high metastatic potential. Doc. Acad. Nauk, 1997, 354: 554-556.

2. Darby RA, Forde GM, Slater NK, Hine AV. Affinity purification of plasmid DNA directly from crude bacterial cell lysates. Biotechnol Bioeng. 2007 Dec 1; 98(5):1103-8.2. Darby RA, Forde GM, Slater NK, Hine AV. Affinity purification of plasmid DNA directly from crude bacterial cell lysates. Biotechnol Bioeng. 2007 Dec 1; 98 (5): 1103-8.

3. Darby RA, Hine AV. LacI-mediated sequence-specific affinity purification of plasmid DNA for therapeutic applications. FASEB J. 2005 May; 19(7):801-3.3. Darby RA, Hine AV. LacI-mediated sequence-specific affinity purification of plasmid DNA for therapeutic applications. FASEB J. 2005 May; 19 (7): 801-3.

4. Ghosh K, Guo F, Van Duyne GD. Synapsis of loxP sites by Cre recombinase. J Biol Chem. 2007 Aug 17; 282(33):24004-16.4. Ghosh K, Guo F, Van Duyne GD. Synapsis of loxP sites by Cre recombinase. J Biol Chem. 2007 Aug 17; 282 (33): 24004-16.

5. Hartung M, Kisters-Woike B. Cre mutants with altered DNA binding properties. J Biol Chem. 1998 Sep 4; 273(36):22884-91.5. Hartung M, Kisters-Woike B. Cre mutants with altered DNA binding properties. J Biol Chem. 1998 Sep 4; 273 (36): 22884-91.

6. Hoess R, Abremski K, Sternberg N. The nature of the interaction of the PI recombinase Cre with the recombining site loxP. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1984; 49:761-8.6. Hoess R, Abremski K, Sternberg N. The nature of the interaction of the PI recombinase Cre with the recombining site loxP. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1984; 49: 761-8.

7. Ito T, Smith CL, Cantor CR. Sequence-specific DNA purification by triplex affinity capture. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jan 15; 89(2):495-8.7. Ito T, Smith CL, Cantor CR. Sequence-specific DNA purification by triplex affinity capture. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jan 15; 89 (2): 495-8.

8. Kjer-Nielsen L, Holmberg K, Perera JD, McCluskey J. Impaired expression of chimaeric major histocompatibility complex transgenes associated with plasmid sequences. Transgenic Res. 1992 Jul; 1(4): 182-7.8. Kjer-Nielsen L, Holmberg K, Perera JD, McCluskey J. Impaired expression of chimaeric major histocompatibility complex transgenes associated with plasmid sequences. Transgenic Res. 1992 Jul; 1 (4): 182-7.

9. Kolb AF. Selection-marker-free modification of the murine beta-casein gene using a lox2272 [correction of lox2722] site. Anal Biochem. 2001 Mar; 290(2):260-71.9. Kolb AF. Selection-marker-free modification of the murine beta-casein gene using a lox2272 [correction of lox2722] site. Anal Biochem. 2001 Mar; 290 (2): 260-71.

10. Kostal J, Mulchandani A, Chen W. Affinity purification of plasmid DNA by temperature-triggered precipitation. Biotechnol Bioeng. 2004 Feb 5; 85(3):293-7.10. Kostal J, Mulchandani A, Chen W. Affinity purification of plasmid DNA by temperature-triggered precipitation. Biotechnol Bioeng. 2004 Feb 5; 85 (3): 293-7.

11. Langer SJ, Ghafoori AP, Byrd M, Leinwand L. A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites. Nucleic Acids Res. 2002 Jul 15; 30(14):3067-77.11. Langer SJ, Ghafoori AP, Byrd M, Leinwand L. A genetic screen identifies novel non-compatible loxP sites. Nucleic Acids Res. 2002 Jul 15; 30 (14): 3067-77.

12. Mayrhofer P, Blaesen M, Schleef M, Jechlinger W. Minicircle-DNA production by site specific recombination and protein-DNA interaction chromatography. J GeneMed. 2008 Nov; 10(11):1253-69.12. Mayrhofer P, Blaesen M, Schleef M, Jechlinger W. Minicircle-DNA production by site specific recombination and protein-DNA interaction chromatography. J GeneMed. 2008 Nov; 10 (11): 1253-69.

13. Ringrose L, Lounnas V, Ehrlich L, Buchholz F, Wade R, Stewart AF. Comparative kinetic analysis of FLP and cre recombinases: mathematical models for DNA binding and recombination. J Mol Biol. 1998 Nov 27; 284(2):363-84.13. Ringrose L, Lounnas V, Ehrlich L, Buchholz F, Wade R, Stewart AF. Comparative kinetic analysis of FLP and cre recombinases: mathematical models for DNA binding and recombination. J Mol Biol. 1998 Nov 27; 284 (2): 363-84.

14. Sadowski P. Site-specific recombinases: changing partners and doing the twist. J Bacteriol. 1986 Feb; 165(2):341-7.14. Sadowski P. Site-specific recombinases: changing partners and doing the twist. J Bacteriol. 1986 Feb; 165 (2): 341-7.

15. Whitson PA, Hsieh WT, Wells RD, Matthews KS. Influence of supercoiling and sequence context on operator DNA binding with lac repressor. J Biol Chem. 1987a Oct 25; 262(30): 14592-9.15. Whitson PA, Hsieh WT, Wells RD, Matthews KS. Influence of supercoiling and sequence context on operator DNA binding with lac repressor. J Biol Chem. 1987a Oct 25; 262 (30): 14592-9.

16. Whitson PA, Hsieh WT, Wells RD, Matthews KS. Supercoiling facilitates lac operator-repressor-pseudooperator interactions. J Biol Chem. 1987b Apr 15; 262(11):4943-6.16. Whitson PA, Hsieh WT, Wells RD, Matthews KS. Supercoiling facilitates lac operator-repressor-pseudooperator interactions. J Biol Chem. 1987b Apr 15; 262 (11): 4943-6.

17. Woodgate J, Palfrey D, Nagel DA, Hine AV, Slater NK. Protein-mediated isolation of plasmid DNA by a zinc finger-glutathione S-transferase affinity linker. Biotechnol Bioeng. 2002 Aug 20; 79(4):450-6.17. Woodgate J, Palfrey D, Nagel DA, Hine AV, Slater NK. Protein-mediated isolation of plasmid DNA by a zinc finger-glutathione S-transferase affinity linker. Biotechnol Bioeng. 2002 Aug 20; 79 (4): 450-6.

Claims

1. The method of separation of DNA molecules, providing for the negative selection of target DNA molecules in solution from non-target DNA molecules, involving the interaction of non-target DNA molecules containing a Cre recombinase recognition site of bacteriophage P1 LoxP, with Cre recombinase bacteriophage P1, defective in the ability to covalently modify DNA, which provides transfer of non-targeted DNA molecules from solution to the solid phase.

2. The method according to p. 1, in which the specific nucleotide sequence is retaining the ability to interact with recombinase Cre LoxP site with a modified nucleotide sequence.

3. The method according to p. 1, in which the recombinase Cre bacteriophage P1, defective in its ability to covalently modify DNA, contains amino acid substitutions that alter the specificity of its interaction with the LoxP site (Cre recombinase variant), and the specific nucleotide sequence is the LoxP site with nucleotide substitutions providing specific interaction with the Cre recombinase variant.

4. The method according to one of paragraphs. 1, 2 or 3, in which the target DNA fragment, which is an insert in the plasmid vector and obtained by digesting the plasmid, is purified from the DNA fragment, which is a vector and contains the Cre recombinase recognition site of bacteriophage P1 LoxP or LoxP site with nucleotide substitutions, providing specific interaction with the Cre recombinase variant, providing its negative selection, as well as negative selection of products of incomplete plasmid DNA cleavage.

5. The method according to one of paragraphs. 1, 2 or 3, in which non-target DNA molecules interact with Cre recombinase (a variant of Cre recombinase), which is defective in its ability to covalently modify DNA, previously immobilized on the solid phase.

6. The method according to one of paragraphs. 1, 2 or 3, in which non-target DNA molecules interact with Cre recombinase (a variant of Cre recombinase), which is defective in its ability to covalently modify DNA, in solution, followed by transfer of Cre recombinase (a variant of Cre recombinase), which is defective in its ability to covalently modify DNA, to solid phase.

7. The method according to claim 5, wherein the Cre recombinase (a variant of Cre recombinase), defective in its ability to covalently modify DNA, is covalently bound to a solid phase.

8. The method according to claim 5, wherein the Cre recombinase (a variant of Cre recombinase), defective in its ability to covalently modify DNA, is immobilized on the solid phase due to non-covalent interactions.

9. The method according to claim 6, wherein the Cre recombinase (a variant of Cre recombinase), defective in its ability to covalently modify DNA, is transferred to the solid phase as a result of specific non-covalent interaction with a solid carrier.

10. The method according to one of paragraphs. 1, 2 or 3, in which each non-target DNA molecule contains more than one copy of the Cre recombinase recognition site of the bacteriophage P1 LoxP or LoxP site with nucleotide substitutions providing specific interaction with Cre recombinase.

11. The method according to one of paragraphs. 1, 2 or 3, in which Cre recombinase (a variant of Cre recombinase), defective in its ability to covalently modify DNA, is used as a chimera with glutathione-8-transferase, and a solid carrier with immobilized glutathione is used to immobilize it on the solid phase.

12. The method according to one of paragraphs. 1, 2 or 3, in which Cre recombinase (a variant of Cre recombinase), defective in its ability to covalently modify DNA, retains the ability to form synapses.

13. The method of claim 12, wherein the K201A mutant is used as a Cre recombinase defective in its ability to covalently modify DNA, replacing the lysine-201 residue with an alanine residue.

14. The method according to one of paragraphs. 1, 2 or 3, in which Cre recombinase, defective in its ability to covalently modify DNA, is not able to form synapses.

15. The method according to p. 14, in which, as a recombinase Cre, defective in its ability to covalently modify DNA, a mutant Y324F is used with the replacement of the tyrosine-324 residue with a phenylalanine residue.