RU2653103C2 - Калебин А для лечения остеопороза - Google Patents
Калебин А для лечения остеопороза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2653103C2 RU2653103C2 RU2016132669A RU2016132669A RU2653103C2 RU 2653103 C2 RU2653103 C2 RU 2653103C2 RU 2016132669 A RU2016132669 A RU 2016132669A RU 2016132669 A RU2016132669 A RU 2016132669A RU 2653103 C2 RU2653103 C2 RU 2653103C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- rankl
- osteoclastogenesis
- induced
- osteoporosis
- Prior art date
Links
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 116
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 32
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 claims abstract description 5
- UYEWRTKHKAVRDI-UHFFFAOYSA-N Calebin A Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)COC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 UYEWRTKHKAVRDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- UYEWRTKHKAVRDI-ASVGJQBISA-N Calebin A Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)COC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 UYEWRTKHKAVRDI-ASVGJQBISA-N 0.000 claims description 38
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 2
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 abstract description 80
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 abstract description 80
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 20
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000007591 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 26
- 108010032050 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 26
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 16
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 15
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 14
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 14
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 14
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 10
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 9
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 9
- 102100034404 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 9
- 101710151542 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 9
- 102100035100 Transcription factor p65 Human genes 0.000 description 9
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 5
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 5
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 210000001721 multinucleated osteoclast Anatomy 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 4
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 4
- 102000004171 Cathepsin K Human genes 0.000 description 4
- 108090000625 Cathepsin K Proteins 0.000 description 4
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 4
- 102100022219 NF-kappa-B essential modulator Human genes 0.000 description 4
- 101710090077 NF-kappa-B essential modulator Proteins 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 4
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108091006084 receptor activators Proteins 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 244000163122 Curcuma domestica Species 0.000 description 2
- 235000003392 Curcuma domestica Nutrition 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000009287 biochemical signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 235000003373 curcuma longa Nutrition 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 235000013976 turmeric Nutrition 0.000 description 2
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010027452 Metastases to bone Diseases 0.000 description 1
- 108010014632 NF-kappa B kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 1
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001599 osteoclastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/12—Ketones
- A61K31/122—Ketones having the oxygen directly attached to a ring, e.g. quinones, vitamin K1, anthralin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
- A61K31/222—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin with compounds having aromatic groups, e.g. dipivefrine, ibopamine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/67—Vitamins
- A61K8/671—Vitamin A; Derivatives thereof, e.g. ester of vitamin A acid, ester of retinol, retinol, retinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
- A61K31/05—Phenols
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
- A61K31/201—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having one or two double bonds, e.g. oleic, linoleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Birds (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине, в частности к способу ингибирования остеокластогенеза у млекопитающих; способу ингибирования экспрессиина на уровне генов и белков, связанных с повышающей регуляцией остеокластогенеза у млекопитающих; а также к применению калебина А в терапевтическом лечении остеопороза у млекопитающих, у которых остеопороз является результатом остеокластогенеза или результатом индуцированной раком дифференциации клеток-предшественников остеокластов в остеокласты. Раскрыт терапевтический потенциал калебина А для лечения остеопороза млекопитающих, который вызван передачей сигнала лиганда рецептора-активатора ядерного фактора (NF)-κB (RANKL), а также дифференциацией клеток-предшественников остеокластов, индуцированной раком. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 пр., 7 ил.
Description
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Область изобретения
Изобретение в целом относится к остеопорозу и терапевтическим вмешательствам при нем у млекопитающих. Более конкретно, настоящее изобретение относится к терапевтическому потенциалу калебина А для лечения остеопороза, где показано, что калебин А в терапевтически эффективных количествах ингибирует остеокластогенез у млекопитающих посредством подавления биохимического пути передачи сигнала лиганда рецептора-активатора ядерного фактора (NF)-κB (RANKL), что, таким образом, убедительно демонстрирует терапевтический потенциал в отношении остеопороза.
Описание предшествующего уровня техники
Согласно оценкам, к 2020 г. 61 млн. человек в возрасте 50 лет или старше в США будут склонны к риску переломов вследствие заболеваний костей, обусловленных остеокластами, таких как остеопороз или низкая костная масса, из-за недоступности широко применимого на практике и эффективного лечения. По данным Американской академии ортопедических хирургов проектная стоимость лечения остеопороза в течение двух следующих десятилетий будет составлять приблизительно 474 млрд. долларов (Z. Jin, X. Li, Y. Wan, Mol. Endocrinol. 29 (2015) 172-186).
Костный метастаз является частым осложнением множественной миеломы или распространенного рака молочной железы, карцином предстательной железы, легкого, ободочной кишки, почки, щитовидной железы и желудка (R.E. Coleman, Cancer Treat. Rev. 27 (2001) 165-176 и R.E. Coleman, Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc). Вовлеченность цитокина, принадлежащего к семейству фактора некроза опухоли (TNF), называемого лигандом-активатором рецептора ядерного фактора (NF)-κB (RANKL), при таком метастазе описана в данной области техники (Т. Onishi, N. Hayashi, R.L. Theriault, G.N. Hortobagyi, NT. Ueno, Nat. Rev. Clin. Oncol. 7 (2010) 641-651). Продемонстрировано, что RANKL обладает остеокластогенной активностью, посредством которой RANKL направляет дифференциацию костных моноцитов в остеокласты, которые стимулируют резорбцию кости (D.L. Lacey, Е. Timms, H.L. Tan, M.J. Kelley, C.R. Dunstan, T. Burgess, R. Elliott, A. Colombero, G. Elliott, S. Scully, H. Hsu, J. Sullivan, N. Hawkins, E. Davy, C. Capparelli, A. Eli, Y.X. Qian, S. Kaufman, I. Sarosi, V. Shalhoub, G. Senaldi, J. Guo, J. Delaney, W.J. Boyle, Cell 93 (1998) 165-176 и S.L. Teitelbaum, Science 289 (2000) 1504-1508).
Согласно сообщениям, куркумин также подавляет остеокластогенез (А.С. Bharti, Y. Takada, В.В. Aggarwal, J. Immunol. (2004) 172, 5940-5947). Другие натуральные ингредиенты для борьбы с остеокластогенезом, индуцированным остеопорозом и раком, еще остаются неисследованными. Калебин А как натуральный ингредиент известен в данной области техники благодаря его противораковым свойствам (Li Y et al, "Calebin-A induces apoptosis and modulates МАРК family activity in drug resistant human gastric cancer cells", Eur J Pharmacol. 2008 Sep 4; 591 (1-3): 252-258 и Aggarwal BB et al, "Curcumin-free turmeric exhibits anti-inflammatory and anticancer activities: Identification of novel components of turmeric", Mol Nutr Food Res. 2013 Sep; 57 (9): 1529-42). В настоящем изобретении исследуется способность калебина А к подавлению остеокластогенеза у млекопитающих.
Основная цель изобретения состоит в раскрытии терапевтического потенциала калебина А для лечения остеопороза млекопитающих, где показано, что калебин А ингибирует как RANKL-индуцированный, так и индуцированный раком остеокластогенез.
В настоящем изобретении выполнена указанная выше цель, а также представлена соответствующие преимущества.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении раскрыт терапевтический потенциал калебина А для лечения остеопороза (потери костной массы), вызванного старением или хроническими болезненными состояниями, такими как рак. Показано, что калебин А осуществляет понижающее модулирование остеокластогенеза, индуцированного передачей сигнала лигандом рецептора-активатора ядерного фактора (NF)-κB (RANKL), и, следовательно, обладает терапевтическим потенциалом для лечения остеопороза. Другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из последующего более подробного описания, рассматриваемого в сочетании с сопроводительными графическими материалами, которые иллюстрируют на примерах принципа изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1а показана структура калебина А.
На фиг. 1b показана экспрессия TRAP (тартрат-резистентной кислой фосфатазы) (TRAP-положительные клетки) в макрофагах мыши RAW264.7 (5×103 клеток/мл), окрашенных для выявления остеокластогенеза. Клетки инкубировали с RANKL (5 нМ) или RANKL с добавлением калебина А концентраций 0, 1, 2, 5 мМ в течение 5 суток. Исходное увеличение - 100×.
На фиг. 1с показано количественное определение многоядерных остеокластов (≥3 или более ядер) после обработки одним RANKL (5 нМ) или RANKL с добавлением калебина А концентраций 0, 1, 2, 5 мМ в течение 5 суток. Значения выражены в виде среднего 3 измерений ± стандартное отклонение (SD).
На фиг. 1d показана пролиферация макрофагов мыши согласно оценке методом МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиум бромид). Клетки RAW 264.7 (3×103 клеток на 100 мл) инкубировали только со средой (контроль) или с 1, 2 или 5 мМ концентрациями калебина А в течение 1, 3 и 5 суток.
На фиг. 2а показано схематическое изображение графика обработки для валидации ингибирования RANKL-индуцированного остеокластогенеза калебином А.
На фиг. 2b показана экспрессия TRAP в окрашенных макрофагах мыши - RAW264.7 (5×103 клеток/мл), проинкубированных с 5 нМ RANKL, 5 мМ калебином А или с обоими веществами в течение 3, 4 и 5 суток. Исходное увеличение - 100×.
На фиг. 2с показано количество многоядерных остеокластов (≥3 ядер) RAW264.7 (5×103 клеток/мл), проинкубированных либо со средой (С), либо с RANKL (5 нМ) вместе с указанными концентрациями калебина А в течение 3, 4 и 5 суток, окрашенных для выявления экспрессии TRAP. Значения представляют собой среднее 3 измерений ± SD.
На фиг. 3а показано схематическое изображение графика обработки для выявления ингибирования RANKL-индуцированного остеокластогенеза калебином А, 24 ч после стимуляции.
На фиг. 3b показана экспрессия TRAP в окрашенных клетках RAW264.7 (5×103 клеток/мл) после 5 суток инкубации со средой, RANKL (5 нМ), калебином А (5 мМ) или RANKL и калебином А.
На фиг. 3с показано количество многоядерных остеокластов (≥3 ядер). С обозначает клетки, проинкубированные только со средой. Значения представляют собой среднее 3 измерений ± SD.
На фиг. 4а показана экспрессия TRAP в окрашенных клетках RAW 264.7 (5×103 клеток/мл), проинкубированных в присутствии клеток MDA-MB-231 (клетки аденокарциномы молочной железы человека) (1×103 клеток/мл) под действием калебина А (5 мМ) в течение 5 суток, и соответствующее количество многоядерных остеокластов (среднее ± SD).
На фиг. 4b показана экспрессия TRAP в окрашенных клетках RAW 264.7 (5×103 клеток/мл), проинкубированных в присутствии клеток U266 (клетки множественной миеломы) (1×103 клеток/мл, под действием калебина А (5 мМ) в течение 5 суток, и соответствующее количество многоядерных остеокластов (среднее ± SD).
На фиг. 4с показан анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA) для определения активности ядерного фактора-кВ (NFκB) в клетках RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), проинкубированных в присутствии кондиционированной среды клеток MDA-MB-231 или U266 в течение 24 ч.
На фиг. 5а показан анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA) для определения активности ядерного фактора-кВ (NFκB) в ядерных экстрактах клеток RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), проинкубированных с 50 мМ калебина А в течение 8 ч и обработанных 10 нМ RANKL в течение 30 мин.
На фиг. 5b показан анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA) для активности ядерного фактора-κВ (NFκB) в клетках RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), обработанных указанными концентрациями калебина А в течение 8 ч и обработанных 10 нМ RANKL в течение 30 мин.
На фиг. 5с показано репрезентативное изображение анализа методом Вестерн-блоттинга распада и фосфорилирования lκВα в цитоплазматических экстрактах клеток RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), проинкубированных с 50 мМ калебина А в течение 8 ч, а затем обработанных 10 нМ RANKL в течение указанного времени (мин). β-актин использовали в качестве контроля нанесения.
На фиг. 5d показано репрезентативное изображение анализа методом Вестерн-блоттинга экспрессии фосфо-lκκВα в цитоплазматических экстрактах клеток RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), проинкубированных с 50 мМ калебина А в течение 8 ч, а затем проинкубированных с ALLN (N-ацетиллейцил-лейцил-норлейциналь) (50 мг/мл) в течение 30 мин и, наконец, обработанных RANKL (10 нМ) в течение 15 мин. Ту же мембрану снова гибридизовали с антителами к lκВα и к β-актину.
На фиг. 5е показано репрезентативное изображение анализа методом Вестерн-блоттинга экспрессии фосфорилированной регулируемой внеклеточными сигналами киназы (p-ERK) в цельноклеточных экстрактах клеток RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), предварительно проинкубированных с калебином А в течение 8 ч, а затем подвергнутых воздействию RANKL (10 нМ) в течение указанного времени. ERK 1/2 использовали в качестве контроля нанесения.
На фиг. 6а показана экспрессия TRAP в окрашенных клетках RAW 264.7 (5×103 клеток/мл), предварительно обработанных 100 мМ пептида NEMO-связывающего домена (NBP) в течение 2 ч и проинкубированных с RANKL (5 нМ) в течение 5 суток. Исходное увеличение - 100×.
На фиг. 6b показано количество многоядерных остеокластов (≥3 ядер). Значения представляют собой среднее 3 измерений ± SD.
На фиг. 6с показан анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) для определения активности ядерного фактора-κВ (NFκB) в клетках RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), проинкубированных со 100 мМ NBP в течение 2 ч и с 10 нМ RANKL в течение 30 мин.
На фиг. 6d показаны сниженные ингибиторные воздействия калебина А на RANKL-индуцированный остеокластогенез в результате гиперэкспрессии NFκB/p65. Клетки RAW 264.7 (5×103 клеток/лунка) сначала трансфицировали контрольной плазмидой и плазмидой р65. Через 24 ч клетки обрабатывали 5 мМ калебина А и 5 нМ RANKL в течение 5 суток, а затем окрашивали для выявления экспрессии TRAP. Исходное увеличение - 100×.
На фиг. 7а показано изображение иммуноблоттинга экспрессии RANK и М-CSF в клеточных лизатах RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), проинкубированных с 50 мМ калебина А в течение 8 ч и обработанных 20 нг/мл M-CSF в течение 24 ч. В-актин использовали в качестве контроля нанесения.
На фиг. 7b показан анализ методом Вестерн-блоттинга экспрессии различных генов, связанных с остеокластогенезом, клеток RAW 264.7 (1,5×103 клеток на лунку), проинкубированных с 50 мМ калебином А в течение 8 ч и обработанных 10 нМ RANKL в течение 24 ч. В-актин использовали в качестве контроля нанесения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАИБОЛЕЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ ИЗОБРЕТЕНИЯ
(Фиг. 1b, 1с, 1d, 2а, 2b, 2с, 3а, 3b, 3с, 4а, 4b, 4с, 5а, 5b, 5с, 5d, 5е, 6а, 6b, 6с, 6d, 7а, 7b)
В наиболее предпочтительных воплощениях изобретение относится к описанному ниже.
Способ ингибирования остеокластогенеза у млекопитающих, где указанный способ включает стадии приведения в контакт клеток-предшественников остеокластов млекопитающих с эффективной концентрацией калебина А, чтобы вызвать ингибирование дифференциации указанных клеток-предшественников в остеокласты. В предпочтительном воплощении изобретения указанная клетка-предшественник представляет собой макрофаг.
Способ ингибирования экспрессии на уровне генов и белков, связанных с повышающей регуляцией остеокластогенеза у млекопитающих, где указанный способ включает стадию приведения в контакт клеток-предшественников остеокластов млекопитающих с эффективной концентрацией калебина А, чтобы вызвать понижающую регуляцию указанной экспрессии на уровне генов и белков в клетках-предшественниках млекопитающих.
Калебин А для применения в терапевтическом лечении остеопороза у млекопитающих, у которых остеопороз является результатом остеокластогенеза.
Композиции, содержащие калебин А, для применения в терапевтическом лечении остеопороза у млекопитающих, у которых остеопороз является результатом остеокластогенеза.
Способ терапевтического лечения остеопороза, индуцированного остеокластогенезом, у млекопитающих, включающий стадию введения млекопитающим, нуждающимся в таком терапевтическом лечении, терапевтически эффективных количеств калебина А, чтобы вызвать действие ингибирования остеокластогенеза.
Способ терапевтического лечения у млекопитающих остеопороза, являющегося результатом индуцированной раком дифференциации клеток-предшественников остеокластов в остеокласты, где указанный способ включает стадию приведения в контакт эффективной концентрации калебина А, указанных клеток-предшественников и указанных раковых клеток, чтобы вызвать ингибирование остеокластогенеза.
Конкретные примеры, включенные в настоящий документ ниже, иллюстрируют наиболее предпочтительные воплощения настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Материалы и методы
Реагенты
Готовили 50 мМ раствор калебина A (Sabinsa Corporation, штат Нью-Джерси, США) в диметилсульфоксиде и хранили небольшими аликвотами при -20°С. Перед применением его соответствующим образом разводили в культуральной среде. Модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM), DMEM/F-12, RPMI 1640, фетальная бычья сыворотка (ФБС), смесь антибиотиков и противогрибковых средств и прижизненный краситель 0,4% трипановый синий приобретали у компании Mediatech, Inc. (г. Манассас, штат Вирджиния). Рекомбинантный белок RANKL был предоставлен д-ром Bryant Darnay Онкологического центра им. М.Д. Андерсона в Техасском университете (г. Хьюстон, штат Техас). Антитела к lκκα, lκκβ и lκВα приобретали у компании Imgenex (г. Сан-Диего, штат Калифорния). Антитела к фосфо-lκВα (Ser32/36), cFms, TRAP, катепсину K и кальцитонину R приобретали у компании Cell Signalling Technology (г. Денвер, штат Массачусетс). Антитела к RANK, регулируемой внеклеточными сигналами киназе 2 (ERK2) и фocфo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) были получены от компании Santa Cruz Biotechnology (г. Санта-Крус, штат Калифорния). Антитело к NFATc1 было получено от компании Addgene (г. Кембридж, штат Массачусетс, США), M-CSF был получен от компании R&D Systems (г. Миннеаполис, штат Миннесота, США). Конъюгаты антител коза против кролика и коза против мыши с пероксидазой хрена приобретали у компании Bio-Rad (г. Геркулес, штат Калифорния). Антитело к 3-актину и набор лейкоцитарной кислой фосфатазы (387-А) для окрашивания тартрат-резистентной кислой фосфатазы (TRAP) приобретали у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури). Трансмембранный, незаменимый модулятор NFκB (NEMO; также называемый lκκg)-связывающий домен пептид (NBP) приобретали у компании Imgenex. [g-32Р]АТФ приобретали у компании MP Biomedicals (г. Солон, штат Огайо).
Линии клеток
Макрофаги мыши RAW264.7 были получены от д-ра Bryant Darnay. Клетки культивировали в среде DMEM/F-12 с добавлением 10% ФБС и антибиотиков. Показано, что линия клеток RAW 264.7 экспрессирует RANK и дифференцируется в функциональные TRAP-положительные остеокласты при культивировании с растворимым RANKL. Кроме того, показано, что RANKL активирует NFκB в клетках RAW264.7. Клетки MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы человека) и U266 (множественной миеломы человека) были получены из Американской типовой коллекции культур клеток (г. Манассас, штат Вирджиния). Клетки MDA-MB-231 культивировали в среде DMEM, а клетки U266 - в RPMI 1640 с 10% ФБС.
Количественный анализ дифференциации остеокластов
Чтобы определить действия калебина А на RANKL-индуцированную дифференциацию остеокластов, клетки RAW264.7 культивировали при плотности 5×103 клеток на лунку в 24-луночных планшетах и давали возможность прикрепиться в течение ночи. Затем среду заменяли, и клетки обрабатывали 5 нМ RANKL в течение 5 суток. После инкубации клетки подвергали окрашиванию на TRAP, используя набор лейкоцитарной щелочной фосфатазы. Для экспериментов по совместному культивированию с раковыми клетками клетки RAW 264.7 высевали при плотности 5×103 клеток на лунку и давали возможность прикрепиться в течение ночи. На следующий день к клеткам RAW 264.7 добавляли клетки U266 или MDA-MB-231 при плотности 1×103. Лунки обрабатывали калебином А и совместно культивировали в течение 5 суток, после чего подвергали окрашиванию на TRAP. Для экспериментов с кондиционированной средой клетки RAW 264.7 высевали при плотности 5×103 клеток на лунку и давали возможность прикрепиться в течение ночи. На следующий день среду заменяли 4/5 среды RAW 264.7 (DMEM/F12) и 1/5 кондиционированной среды из клеток MDA-MB-231 или U266. Для этой процедуры использовали супернатант культивированных раковых клеток, осажденных центрифугированием. Наконец, клетки RAW264.7 культивировали в течение 5 суток и подвергали окрашиванию TRAP и анализу изменения электрофоретической подвижности (EMSA).
Анализ пролиферации клеток
Действия калебина А на пролиферацию клеток RAW 264.7 определяли путем измерения активности митохондриальной дегидрогеназы по отношению к 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолиум бромиду (МТТ) в качестве субстрата, как описано В. Sung, S. Prasad, V.R. Yadav, S.C. Gupta, S. Reuter, N. Yamamoto, A. Murakami, B.B. Aggarwal, PloS One 8 (2013) e64118. Кратко, 3000 клеток RAW264.7 (в 0,1 мл среды) на лунку инкубировали с различными концентрациями калебина А в трех повторах в 96-луночных планшетах при 37°С в течение 1, 3 или 5 суток. На каждом интервале в каждую лунку добавляли раствор МТТ, и планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Добавляли буфер экстракции (100 мМ), состоящий из 20% додецилсульфата натрия (ДСН) и 50% диметилформамида, и клетки инкубировали в течение ночи при 37°С для растворения формазана, образующегося в процессе реакции. Затем измеряли поглощение окрашенного продукта при 570 нм, используя 96-луночный мультисканер (MRX Revelation, Dynex Technologies, г. Чантили, штат Вирджиния).
Анализ с помощью Вестерн-блоттинга
Для определения уровней экспрессии белка получали цитоплазматические и цельноклеточные экстракты и фракционировали их с использованием электрофореза в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ). После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, подвергали блоттингу с релевантными антителами и определяли с помощью усиленной люминесцентной метки (GE Healthcare, г. Пискатавэй, штат Нью-Джерси).
Анализ измерения электрофоретической подвижности для определения NFκB
Для оценки активации NFκB в ядерных экстрактах проводили EMSA, используя процедуру, описанную в Y. Li, S. Li, Y. Han, J. Liu, J. Zhang, F. Li, Y. Wang, X. Liu, L. Yao, Eur. J. Pharmacol. 591 (2008) 252-258. Кратко, ядерные экстракты из необработанных и RANKL-обработанных клеток RAW 264.7 инкубировали с меченым 32Р-концевой меткой 45-мерным двунитевым олигонуклеотидом NFκB (15 мг белка с 16 фемтомоль (фМ) ДНК) из длинного концевого повтора HIV, 5'-TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGGGAGGCGTGG-3' (жирным шрифтом показаны сайты связывания NFκB) в течение 30 мин при 37°С. Образовавшийся комплекс ДНК-белок отделяли от свободных олигонуклеотидов на 6,6% нативных полиакриламидных гелях. Высушенные гели визуализировали с помощью устройства для молекулярной визуализации Storm 820 (Amersham, г. Пискатавэй, штат Нью-Джерси, США), и радиоактивные полосы определяли количественно с использованием денситометра и программного обеспечения Image Quant (программа ImageJ, Национальный институт здоровья (NIH), США).
Трансфекция плазмидой р65
Чтобы определить роль экспрессии NF-κB/p65 в калебин А-индуцированном ингибировании остеокластогенеза, клетки RAW 264.7 (5×105 клеток/лунка) высевали в 6-луночные планшеты и транзитно трансфицировали плазмидной ДНК pNF-κВ (0,5 мг) и контрольной плазмидной ДНК pCMVFLAG1 кальцийфосфатным методом в течение 24 ч. Затем среду заменяли, и клетки обрабатывали RANKL (5 нМ) и/или калебином А (5 мМ) в течение 5 суток. Все клетки подвергали окрашиванию TRAP с использованием набора лейкоцитарной кислой фосфатазы.
Статистический анализ
Данные анализировали с использованием программы ImageJ (NIH, США) и представляли в виде среднего ± стандартное отклонение (SD). Статистическую значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения Р менее 0,05 считали статистически значимыми.
Пример 2: Результаты
Калебин А ингибирует RANKL-индуцированный остеокластогенез
Для валидации потенциала ингибирования RANKL-индуцированного остеокластогенеза калебином А клетки RAW 264.7 обрабатывали различными концентрациями калебина А в присутствии RANKL. Затем клеткам давали возможность дифференцироваться в остеокласты. Наблюдали морфологические признаки клеток, позволяющие четко выявить дифференциацию клеток в остеокласты (Фиг. 1b). Тем не менее при воздействии возрастающих концентраций калебина А наблюдалось понижающееся RANKL-индуцированное образование остеокластов, измеренное путем подсчета количества TRAP-положительных остеокластов на лунку (Фиг. 1с). При тех же концентрациях калебина А оценивали пролиферацию клеток на 1, 3 и 5 сутки. Обработка калебином А не оказывала значимого влияния на пролиферацию клеток RAW 264.7, что исключает возможность связать наблюдаемое уменьшение количества TRAP-положительных остеокластов со снижением пролиферации клеток в результате обработки калебином А (Фиг. 1d).
Чтобы определить, зависит ли ингибиторное воздействие калебина А на остеокластогенез от времени, клетки RAW 264.7 обрабатывали RANKL и калебином А и инкубировали в течение 3, 4 или 5 суток до дифференциации в остеокласты (Фиг. 2а). Морфологическое наблюдение позволило выявить, что клетки RAW 264.7, обработанные RANKL, дифференцировались в остеокласты, и добавление калебина А ингибировало эту дифференциацию (Фиг. 2b). Кроме того, наблюдали, что RANKL-индуцированная дифференциация зависит от времени, при этом максимальное число TRAP-положительных остеокластов на лунку достигалось на 5 сутки (Фиг. 2b). Тем не менее, под действием калебина А число TRAP-положительных остеокластов дозозависимо уменьшалось, при этом во все моменты времени самое сильное ингибирование достигалось при дозе 5 мМ (Фиг. 2с).
Калебин А действует на ранней стадии биохимического пути RANKL-индуцированного остеокластогенеза
Полная RANKL-индуцированная дифференциация остеокласта в клетках RAW 264.7 обычно занимает около 5 суток. Чтобы определить момент, в который калебин А действует на биохимический путь дифференциации, клетки RAW 264.7 обрабатывали RANKL, и калебин А добавляли на 0, 1, 2, 3 и 4 сутки. Действия на образование остеокластов измеряли на 5 сутки (Фиг. 3а). Наблюдение под микроскопом (Фиг. 3d) и подсчет количества TRAP-положительных остеокластов на лунку (Фиг. 3с) показали, что воздействие калебина А существенно ингибирует образование остеокластов на 1-2 сутки после стимуляции RANKL. Тем не менее, калебин А уже не предотвращал образование остеокласта на сутки 3 и 4 после воздействия RANKL (Фиг. 3b и Фиг. 3c), что указывает на то, что он, вероятно, действует на ранней стадии в биохимическом пути дифференциации.
Калебин А ингибирует индуцированный раковыми клетками остеокластогенез
Поскольку повышенный остеокластогенез часто связан с раком молочной железы и множественной меланомой, исследовали, модулирует ли калебин А остеокластогенез клеток RAW264.7, индуцированный этими раковыми клетками. Клетки RAW264.7 и клетки рака молочной железы MDA-MB-231 или множественной миеломы U266 инкубировали совместно и давали возможность дифференцироваться в течение 5 суток. Наблюдали, что клетки MDA-MB-231 индуцировали дифференциацию клеток RAW264.7 в остеокласты, и калебин А ингибировал их дифференциацию (Фиг. 4а). Подобный паттерн наблюдали для клеток U266 (Фиг. 4b), что указывает на то, что калебин А подавляет процесс остеокластогенеза, индуцированный раковыми клетками. Одним из основных механизмов, связанных с остеокластогенезом, является биохимический путь активации NF-κВ. Поэтому исследовали, индуцирует ли кондиционированная среда от клеток MDA-MB-231 и U266 активацию NF-κВ в клетках RAW 264.7. Результаты позволили выявить, что кондиционированная среда действительно эффективно активировала NF-κВ (Фиг. 4с) в клетках RAW 264.7. Эти результаты указывают на то, что фактор транскрипции NF-κВ вовлечен в дифференциацию остеокластов, индуцированную раковыми клетками. В настоящем исследовании показано, что калебин А ингибирует остеокластогенез, индуцированный клетками MDA-MB-231 и U266, что позволяет предположить, что калебин А является привлекательным потенциальным средством лечения пациентов с костными метастазами.
Калебин А нейтрализует RANKL-индуцированную активацию NF-κB
Для дальнейшего исследования модулирования RANKL-индуцированной активации NF-κВ калебином А клетки RAW 264.7 предварительно обрабатывали либо различными концентрациями калебина А в течение 8 ч (Фиг. 5а, левая панель), либо калебином А (50 мМ) в течение различных периодов времени (Фиг. 5а, правая панель), а затем подвергали воздействию RANKL в течение 30 мин (Фиг.5а). Активацию NF-κВ количественно определяли, используя EMSA. Результаты указывают на то, что RANKL активирует NF-κВ; тем не менее, калебин А полностью нейтрализует RANKL-индуцированную активацию NF-κB (Фиг. 5а). Для определения воздействия дозы калебина А на активацию NF-κВ в клетках, подвергнутых воздействию RANKL, клетки RAW 264.7 предварительно обрабатывали различными концентрациями калебина А в течение 8 ч, а затем подвергали воздействию RANKL в течение 30 мин. Наблюдали, что калебин А полностью подавлял активацию NF-κВ при дозе 50 мМ (Фиг. 5b). Воздействие на активацию NF-κВ не наблюдали, когда клетки обрабатывали 50 мМ калебином А, но без RANKL, в течение 8 ч.
Калебин А ингибирует RANKL-индуцированное фосфорилирование и распад lκВα
Поскольку для ядерной транслокации NF-κВ требуется протеолитический распад lκВα, исследовали, было ли подавление NF-κВ калебином А вызвано ингибированием распада lκВα. Для количественного определения распада цитоплазматического lκВα после стимуляции RANKL в диапазоне временных интервалов использовали Вестерн-блоттинг (Фиг. 5с). RANKL индуцировал распад lκВα в необработанных контрольных клетках в пределах 10 мин, но уровни lκВα возвращались к нормальным в пределах 60 мин. Напротив, клетки, предварительно обработанные калебином А, проявляли полное ингибирование распада lκВα (Фиг. 5с).
Фосфорилирование lκВα необходимо для распада lκВα. Следовательно, исследовали, влияет ли калебин А на фосфорилирование lκВα. Наблюдали, что RANKL индуцировал фосфорилирование lκВα в пределах 5 мин. Тем не менее фосфорилирование полностью ингибировалось предварительной обработкой калебином А. Воздействие калебина А на фосфорилирование lκВα также исследовали путем использования ингибитора протеасом N-ацетиллейцил-лейцил-норлейциналя (ALLN), который предотвращает RANKL-индуцированный распад lκВα (Фиг. 5d). Анализ с помощью Вестерн-блоттинга указывает на то, что совместная обработка RANKL и ALLN индуцирует фосфорилирование lκВα при серинах 32 и 36 в клетках RAW264.7. Предварительная обработка калебином А ингибировала индукцию фосфорилирования. Один калебин А не индуцировал фосфорилирование lκВα (Фиг. 5d). Фосфорилирование, убиквитинирование и опосредованный протеасомами распад lκВα в ответ на RANKL представляет собой быстрый процесс. Эти результаты указывают на то, что калебин А ингибирует RANKL-индуцированную активацию NF-κВ посредством подавления распада и фосфорилирования lκВα.
Ингибирование остеокластогенеза калебином А является NF-κB-специфичным
Поскольку RANKL-индуцированный остеокластогенез запускается 2 основными биохимическими путями передачи сигнала, а именно биохимическими путями NF-κВ и митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК), наблюдали, влияет ли предварительная обработка калебином А также и на биохимический путь МАРК. Исследовали действие калебина А на активацию ERK1/2. RANKL индуцировал фосфорилирование ERK1/2 в клетках-предшественниках остеокластов RAW 264.7 (Фиг. 5е). Тем не менее предварительная обработка клеток калебином А не ингибировала RANKL-индуцированную активацию фосфорилирования ERK, что указывает на то, что индуцированное калебином А ингибирование остеокластогенеза не опосредовано биохимическим путем МАРК.
Ингибирование NF-κВ нейтрализует остеокластогенез
Дополнительно исследовали, вызван ли RANKL-индуцированный остеокластогенез активацией NF-κВ, используя специфичный ингибитор регуляторной субъединицы комплекса IKK, который также известен как незаменимый модулятор NF-κВ (NEMO). NEMO-связывающий пептид (NBP) блокирует активацию NF-κВ. Чтобы определить действие NBP на RANKL-индуцированный остеокластогенез, клетки RAW264.7 предварительно обрабатывали 100 мМ NBP в течение 2 ч, а затем RANKL в течение 5 суток. Результаты показали, что RANKL индуцировал остеокластогенез, и что NBP ингибировал его (Фиг. 6а и Фиг. 6b). Кроме того, наблюдали, что ядерные экстракты из клеток RAW 264.7, обработанные 100 мМ NBP в течение 2 ч, а затем RANKL в течение 30 мин, полностью ингибировали активацию NF-κВ (Фиг. 6с). Эти результаты подтверждают, что активация NF-κВ была ответственна за дифференциацию остеокластов в клетках RAW 264.7 и что ингибирование NF-κB либо калебином А, либо NBP предотвращало остеокластогенез.
Гиперэкспрессия NF-κВ/p65 устраняет ингибиторные действия калебина А на остеокластогенез
Чтобы определить, ингибирует ли калебин А RANKL-индуцированный остеокластогенез, опосредованный активацией NF-κВ, осуществляли гиперэкспрессию р65 в клетках, а затем изучали действие калебина А на RANKL-индуцированный остеокластогенез. В клетках RAW 264.7, трансфицированных р65, наблюдали минимальное ингибирование RANKL-индуцированного остеокластогенеза калебином А, тем не менее, почти полное его ингибирование происходило в клетках, трансфицированных контрольной плазмидой (Фиг.6d). Этот результат указывает на то, что р65 играет роль в RANKL-индуцированном остеокластогенезе, и, следовательно, ингибирование NF-κВ/p65 калебином А ингибирует остеокластогенез.
Калебин А нейтрализует маркеры M-CSF-индуцированной дифференциации остеокластов
Кроме того, для исследования возможной роли калебина А в регуляции дифференциации остеокластов на ранней стадии клетки RAW 264.7 предварительно обрабатывали калебином А и индуцировали клетками M-CSF в течение 24 ч. Экспрессия RANK претерпевала повышающую регуляцию M-CSF, и наблюдали, что калебин А осуществляет понижающее модулирование M-CSF-индуцированной экспрессии RANK (Фиг. 7а). Значительные изменения экспрессии c-Fms, обработанного как M-CSF, так и калебином А, отсутствовали. Таким образом, сделали вывод, что калебин А ингибирует M-CSF-индуцированную экспрессию RANK.
Калебин А ингибирует RANKL-индуцированную экспрессию NFATc1 и других маркерных генов, связанных с остеокластогенезом
NFATc1 играет основную роль в регуляции остеокластогенеза. Следовательно, исследовали действие калебина А на RANKL-индуцированную экспрессию NFATc1. Результаты показали, что экспрессия NFATc1 претерпевает повышающую регуляцию под действием RANKL, а предварительная обработка калебином А нейтрализовала RANKL-индуцированную экспрессию NFATc1 (Фиг. 7b). В сущности, активация и ядерная транслокация NFATc1 и дифференциация остеокластов опосредованы регулируемой NFATc1 экспрессией большого числа маркерных генов, включая TRAP, катепсин K и кальцитонин R. Эти гены активируются RANKL-опосредованным биохимическим путем передачи сигнала. Следовательно, также исследовали действие калебина А на экспрессию маркерных генов, относящихся к RANKL-индуцированному остеокластогенезу. Наблюдали, что RANKL индуцировал экспрессию TRAP, катепсина K и кальцитонина R. Однако действие одного калебина А на экспрессию этих маркерных белков не отмечено (Фиг. 7b). Эти результаты указывают на то, что калебин А ингибирует RANKL-индуцированную экспрессию NFATc1, TRAP, катепсина K и кальцитонина R.
Хотя изобретение описано со ссылкой на предпочтительное воплощение, специалистам в данной области техники очевидно, что изобретение не ограничено ими. Вероятнее, объем изобретения следует интерпретировать только в сочетании с прилагаемой формулой изобретения.
Claims (5)
1. Способ ингибирования остеокластогенеза у млекопитающих, включающий стадии приведения в контакт клеток-предшественников остеокластов млекопитающих с эффективной концентрацией калебина А, чтобы вызвать ингибирование дифференциации указанных клеток-предшественников в остеокласты.
2. Способ по п. 1, где указанная клетка-предшественник представляет собой макрофаг.
3. Способ ингибирования экспрессии на уровне генов и белков, связанных с повышающей регуляцией остеокластогенеза у млекопитающих, включающий стадии приведения в контакт клеток-предшественников остеокластов млекопитающих с эффективной концентрацией калебина А, чтобы вызвать понижающую регуляцию указанной экспрессии на уровне генов и белков в клетках-предшественниках млекопитающих.
4. Применение калебина А в терапевтическом лечении остеопороза у млекопитающих, у которых остеопороз является результатом остеокластогенеза.
5. Применение калебина А для терапевтического лечения у млекопитающих остеопороза, являющегося результатом индуцированной раком дифференциации клеток-предшественников остеокластов в остеокласты.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15228142 | 2016-08-04 | ||
| US15/228,142 US9539232B1 (en) | 2016-08-04 | 2016-08-04 | Calebin A for osteoporosis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016132669A RU2016132669A (ru) | 2018-02-14 |
| RU2653103C2 true RU2653103C2 (ru) | 2018-05-07 |
Family
ID=57705908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016132669A RU2653103C2 (ru) | 2016-08-04 | 2016-08-09 | Калебин А для лечения остеопороза |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9539232B1 (ru) |
| CA (1) | CA2941050C (ru) |
| RU (1) | RU2653103C2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070167510A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Suzanne Lentzsch | Methods for inhibiting osteoclastogenesis |
| RU2543334C1 (ru) * | 2011-01-10 | 2015-02-27 | Мухаммед Маджид | Потенциал калебина а в качестве средства против ожирения |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9328330B2 (en) * | 2011-01-10 | 2016-05-03 | Sami Labs Limited | Anti-obesity potential of Calebin A |
| US9737502B2 (en) * | 2011-01-10 | 2017-08-22 | Sami Labs Limited | Calebin A for hepatic steatosis |
| US9220703B2 (en) * | 2014-01-10 | 2015-12-29 | Muhammed Majeed | Composition and method for the protection of articular cartilage |
| US9668999B2 (en) * | 2014-04-23 | 2017-06-06 | Semi Labs Limited | Method for the treatment of hypercholesterolemia |
-
2016
- 2016-08-04 US US15/228,142 patent/US9539232B1/en active Active
- 2016-08-09 RU RU2016132669A patent/RU2653103C2/ru active
- 2016-09-02 CA CA2941050A patent/CA2941050C/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070167510A1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-07-19 | Suzanne Lentzsch | Methods for inhibiting osteoclastogenesis |
| RU2543334C1 (ru) * | 2011-01-10 | 2015-02-27 | Мухаммед Маджид | Потенциал калебина а в качестве средства против ожирения |
Non-Patent Citations (2)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9539232B1 (en) | 2017-01-10 |
| CA2941050A1 (en) | 2018-02-04 |
| RU2016132669A (ru) | 2018-02-14 |
| CA2941050C (en) | 2019-02-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schauber et al. | Histone acetylation in keratinocytes enables control of the expression of cathelicidin and CD14 by 1, 25-dihydroxyvitamin D3 | |
| Kim et al. | Icariin abrogates osteoclast formation through the regulation of the RANKL-mediated TRAF6/NF-κB/ERK signaling pathway in Raw264. 7 cells | |
| Xue et al. | 7, 8-Dihydroxyflavone modulates bone formation and resorption and ameliorates ovariectomy-induced osteoporosis | |
| Trump et al. | Anti-tumor activity of calcitriol: pre-clinical and clinical studies | |
| Li et al. | Maslinic acid suppresses osteoclastogenesis and prevents ovariectomy‐induced bone loss by regulating RANKL‐mediated NF‐κB and MAPK signaling pathways | |
| Tsubaki et al. | Blockade of the Ras/MEK/ERK and Ras/PI3K/Akt pathways by statins reduces the expression of bFGF, HGF, and TGF-β as angiogenic factors in mouse osteosarcoma | |
| Su et al. | The effects of curcumin on proliferation, apoptosis, invasion, and NEDD4 expression in pancreatic cancer | |
| Xu et al. | (-)-Epigallocatechin-3-gallate inhibits osteoclastogenesis by blocking RANKL–RANK interaction and suppressing NF-κB and MAPK signaling pathways | |
| Zhao et al. | Wogonin inhibits LPS-induced tumor angiogenesis via suppressing PI3K/Akt/NF-κB signaling | |
| Song et al. | Atractylenolide I stimulates intestinal epithelial repair through polyamine-mediated Ca2+ signaling pathway | |
| Wang et al. | Wnt/β-catenin signaling pathway: proteins' roles in osteoporosis and cancer diseases and the regulatory effects of natural compounds on osteoporosis | |
| Yang et al. | The cationic host defense peptide rCRAMP promotes gastric ulcer healing in rats | |
| Zhang et al. | The role and function of CLU in cancer biology and therapy | |
| Lin et al. | Fisetin inhibits epidermal growth factor–induced migration of ARPE-19 cells by suppression of AKT activation and Sp1-dependent MMP-9 expression | |
| Khuda et al. | Astrocyte elevated gene‐1 (AEG‐1) is induced by lipopolysaccharide as toll‐like receptor 4 (TLR4) ligand and regulates TLR4 signalling | |
| Liu et al. | Satb1 promotes Schwann cell viability and migration via activation of PI3K/AKT pathway | |
| Maeda et al. | Mineral trioxide aggregate induces osteoblastogenesis via Atf6 | |
| Mora et al. | Rhodiola crenulata inhibits Wnt/β-catenin signaling in glioblastoma | |
| Kuppusamy et al. | 4-hydroxy-3-methoxy cinnamic acid accelerate myoblasts differentiation on C2C12 mouse skeletal muscle cells via AKT and ERK 1/2 activation | |
| Qiang et al. | Inhibition of TPL2 by interferon-α suppresses bladder cancer through activation of PDE4D | |
| Yeon et al. | Gomisin G improves muscle strength by enhancing mitochondrial biogenesis and function in disuse muscle atrophic mice | |
| Masuda et al. | Chemokine (C‐X‐C motif) ligand 1 is a myokine induced by palmitate and is required for myogenesis in mouse satellite cells | |
| Hwang et al. | Protective effects of a polysaccharide BLE0 isolated from barley leaf on bone loss in ovariectomized mice | |
| Xiang et al. | Niclosamide, an anti-helminthic molecule, downregulates the retroviral oncoprotein Tax and pro-survival Bcl-2 proteins in HTLV-1-transformed T lymphocytes | |
| Wang et al. | Dual targeting of retinoid X receptor and histone deacetylase with DW22 as a novel antitumor approach |