RU2652902C1

RU2652902C1 - Method for stimulation of spermatogenesis

Info

Publication number: RU2652902C1
Application number: RU2016151259A
Authority: RU
Inventors: Всеволод Арсеньевич Ткачук; Жанна Алексеевна Акопян; Анастасия Юрьевна Ефименко; Армаис Альбертович Камалов; Владимир Игоревич Кирпатовский; Ольга Александровна Макаревич; Павел Игоревич Макаревич; Петр Петрович Нимирицкий; Дмитрий Александрович Охоботов; Георгий Дмитриевич Сагарадзе; Елена Владимировна Тарасова
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2018-05-03

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions refers to medicine and can be used to stimulate spermatogenesis, including the treatment of fertility disorders caused by inborn or acquired pathology of the testes tissue. Method of stimulation of spermatogenesis involves the injection subalbugineal of a biomaterial containing a mixture of the active ingredient and the base. Conditioned medium containing the secretion products of multipotent mesenchymal stromal cells of a human is used as the active component. Environment includes growth factors: GDNF at a concentration of at least 50 pg/ml, VEGF at a concentration of at least 200 pg/ml, FGF basic at a concentration of at least 0.3 pg/ml. Collagen gel is used as a basis. In this case, the mixture is injected in a dose providing a therapeutic effect. There are proposed a method for obtaining such a conditioned medium and a biomaterial for use in a method for stimulating spermatogenesis, obtained by the appropriate method.

EFFECT: method of stimulation of spermatogenesis is proposed.

22 cl, 6 ex, 4 tbl, 4 dwg

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для стимуляции восстановления мужской фертильности, в том числе при лечении нарушений фертильности, вызванной врожденным или приобретенным нарушением функции сперматогенной ткани семенников.The invention relates to medicine and can be used to stimulate the restoration of male fertility, including in the treatment of fertility disorders caused by congenital or acquired dysfunction of the spermatogenic tissue of the testes.

Уровень техникиState of the art

Наиболее типичными проявлениями дисфункции органов мужской половой сферы является импотенция и мужское бесплодие, одной из основных причин которых могут служить нарушения сперматогенеза и сниженный уровень мужских половых гормонов. Подобные нарушения могут носить первичный характер или проявляться вторично как последствия иных заболеваний, в частности простатита или венерических заболеваний. По степени тяжести неблагоприятных социальных последствий ВОЗ поставила проблему мужского бесплодия сразу вслед за проблемами онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний.The most typical manifestations of dysfunction of the organs of the male genital area are impotence and male infertility, one of the main causes of which can be disorders of spermatogenesis and a decreased level of male sex hormones. Such violations can be primary in nature or appear again as consequences of other diseases, in particular prostatitis or sexually transmitted diseases. According to the severity of adverse social consequences, WHO posed the problem of male infertility immediately after the problems of cancer and cardiovascular diseases.

Лечение нарушений мужской половой функции очень часто носит симптоматический характер. Из уровня техники известно, что наиболее распространенным способом лечения андрогенной недостаточности, связанной с нарушениями сперматогенеза, является гормонотерапия, в первую очередь, с использованием тестостерона и его синтетических аналогов. Однако в большинстве случаев гормонотерапия не приводит к полному восстановлению нормальной репродуктивной и сексуальной функций, кроме того, наблюдаемый эффект от лечения является кратковременным.The treatment of male sexual dysfunction is often symptomatic. It is known from the prior art that the most common method for treating androgen deficiency associated with impaired spermatogenesis is hormone therapy, primarily using testosterone and its synthetic analogues. However, in most cases, hormone therapy does not lead to a complete restoration of normal reproductive and sexual functions, in addition, the observed effect of treatment is short-lived.

Известен способ лечения андрогенной недостаточности при вторичном гипогонадизме путем трансплантации пациенту гипофизарно-гипоталамического комплекса (Кирпатовский И.Д., «Очерки по хирургической андрологии», М., 1989 г.). К недостаткам способа относятся высокая сложность операции и труднодоступность трупного донорского аллотрансплантата.There is a method of treating androgen deficiency in secondary hypogonadism by transplantation of a pituitary-hypothalamic complex to a patient (I. Kirpatovsky, “Essays on Surgical Andrology”, M., 1989). The disadvantages of the method include the high complexity of the operation and the inaccessibility of a cadaveric donor allograft.

Другим известным способом лечения андрогенной недостаточности методом трансплантации является пересадка донорского яичка на сосудистых связях (Хирургическая коррекция эндокринной импотенции, И.Д. Кирпатовский, Д.Л. Горбатюк). Однако сложность и травматичность оперативного вмешательства, необходимость проведения иммуносупрессивной терапии, а также необходимость использования труднодоступного трупного или донорского материала делают этот метод малоприменимым.Another well-known method for the treatment of androgen deficiency by transplantation is the transplantation of a donor testicle on vascular connections (Surgical correction of endocrine impotence, I.D. Kirpatovsky, D.L. Gorbatyuk). However, the complexity and invasiveness of surgery, the need for immunosuppressive therapy, and the need to use hard-to-reach cadaveric or donor material make this method inapplicable.

Из уровня техники известны способы лечения больных с нарушением мужской половой функции методом трансплантации клеток Лейдига через семенной канатик (Патенты РФ №№2200010, 2200012). Задачей изобретений является снижение травматичности и повышение приживаемости клеточного трансплантата. Поставленная задача достигается способом лечения больных с нарушениями мужской половой функции, заключающимся в том, что вводят 1,0 мл 2,5% суспензии гидрокортизона ацетата в толщу мошоночного отдела семенного канатика или проводят многократные инфузии озонированного физиологического раствора, а затем имплантируют не менее 2 млн. жизнеспособных клеток Лейдига эмбрионального происхождения. Недостатком этих способов является недостаточное восстановление фертильности.The prior art methods of treating patients with impaired male sexual function by transplantation of Leydig cells through the spermatic cord (RF Patents Nos. 2200010, 2200012). The objective of the invention is to reduce the morbidity and increase the survival rate of a cell transplant. The objective is achieved by a method of treating patients with impaired male sexual function, which consists in injecting 1.0 ml of a 2.5% suspension of hydrocortisone acetate into the scrotum of the spermatic cord, or conducting repeated infusions of ozonized physiological saline, and then implanting at least 2 million viable Leydig cells of embryonic origin. The disadvantage of these methods is the insufficient restoration of fertility.

Из уровня техники известен способ восстановления репродуктивных функций яичников с помощью введения мезенхимных стволовых/стромальных клеток (МСК), выделенных из кожи (CN 103816184). Однако, неизвестно, насколько этот способ может быть применен для лечения мужского бесплодия, поскольку механизмы образования женских и мужских половых клеток значительно различаются.The prior art method for restoring the reproductive functions of the ovaries by introducing mesenchymal stem / stromal cells (MSCs) isolated from the skin (CN 103816184). However, it is not known how this method can be used to treat male infertility, since the mechanisms of formation of female and male germ cells are significantly different.

Другим источником стволовых и прогениторных клеток, которые могут быть использованы для профилактики и лечения инфертильности, является плацента, для этой же цели предлагается использовать экстракт плаценты (KR 20120022327). Однако, в указанном способе описаны методы получения данных препаратов, в то время как способы их применения по заявленным показаниям не раскрыты.The placenta is another source of stem and progenitor cells that can be used to prevent and treat infertility, and placenta extract is proposed for the same purpose (KR 20120022327). However, in the specified method, methods for obtaining these drugs are described, while methods for their use according to the stated indications are not disclosed.

Наиболее близким к заявленному решению можно считать способ лечения мужского и женского бесплодия с помощью введения в системный кровоток или в репродуктивный тракт аутологичных стволовых и прогениторных клеток, выделенных из костного мозга, периферической крови или стромально-васкулярной фракции жировой ткани и секретирующих фактор роста гепатоцитов (HGF) (AU 2011100703). Введение клеток может быть дополнено приемом специфического синтетического пептидного препарата, который в дозе более 1 мкг должен связываться с HGF и активировать его. Однако, в отношении стимуляции сперматогенеза ключевая роль HGF, секретируемого вводимыми клетками, не доказана. Кроме того, не определена эффективная доза клеточного материала, в то же время с учетом предполагаемого механизма действия и путей введения клеток необходимо вводить огромное количество клеток для достижения эффекта, что связано со значительными затратами ресурсов на подготовку препарата и сопряжено с повышенным риском осложнений.The closest to the claimed solution can be considered a method of treating male and female infertility by introducing autologous stem and progenitor cells isolated from bone marrow, peripheral blood or stromal-vascular fraction of adipose tissue and secreting hepatocyte growth factor (HGF) into the systemic bloodstream or into the reproductive tract ) (AU 2011100703). The introduction of cells can be supplemented by the administration of a specific synthetic peptide preparation, which at a dose of more than 1 μg should bind to HGF and activate it. However, in relation to the stimulation of spermatogenesis, the key role of HGF secreted by the introduced cells has not been proven. In addition, an effective dose of cellular material has not been determined, at the same time, taking into account the proposed mechanism of action and ways of introducing cells, it is necessary to introduce a huge number of cells to achieve the effect, which is associated with a significant expenditure of resources on the preparation of the drug and is associated with an increased risk of complications.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей изобретения является создание нового способа лечения мужского бесплодия посредством восстановления сперматогенеза, за счет инъекционного введения биоматериала, обладающего комплексным воздействием на клетки сперматогенного эпителия и клетки яичка, поддерживающие сперматогенез.The objective of the invention is the creation of a new method for the treatment of male infertility by restoring spermatogenesis, through the injection of biomaterial with a complex effect on spermatogenous epithelial cells and testicular cells that support spermatogenesis.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является повышение эффективности восстановления сперматогенеза путем инъекционного введения в ткани яичка под белочную оболочку комбинированного биоматериала, безопасно и эффективно стимулирующего восстановление сперматогенеза за счет комплексного сбалансированного действия факторов роста и других биологически активных молекул, секретируемых мезенхимными стволовыми/стромальными клетками (МСК) человека в культуральную среду, не содержащую ксеногенных компонентов.The technical result to which the claimed invention is directed is to increase the efficiency of spermatogenesis restoration by injecting a combined biomaterial into the testicular tissue under the protein coat, which safely and effectively stimulates spermatogenesis restoration due to the complex balanced action of growth factors and other biologically active molecules secreted by mesenchymal stem cells / human stromal cells (MSCs) in xeno-free culture medium ennyh components.

Безопасность способа достигается путем использования бесклеточных низкоиммуногенных компонентов и малотравматичной процедуры введения. Эффективность способа обеспечивается за счет содержания в секретоме МСК факторов, необходимых для поддержания роста, повышения выживаемости и восстановления функции сперматогенных клеток, а также клеток, поддерживающих сперматогенез (клетки Сертоли, клетки Лейдига). Так, большое значение для жизнедеятельности сперматогенных стволовых клеток имеют такие факторы как нейротрофический фактор из глиальных клеток (GDNF), основный фактор роста фибробластов (FGF-2), фактор ингибирования лейкемии (LIF) и другие (Oatley Jon М., Brinster Ralph L., 2008; Park M.H., 2016). Например, для активации процессов дифференцировки сперматогенных стволовых клеток требуется повышение уровня FGF-2 и GDNF. Ключевым фактором, секретируемым клетками Сертоли, которые поддерживают клетки сперматогенного эпителия в семенных канальцах, является GDNF. В работах, посвященных изучению морфогенеза яичек, показано, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) не стимулирует образование семенных канальцев и новых кровеносных сосудов, однако приводит к увеличению количества канальцев, содержащих сперматогонии, что указывает на протективную роль VEGF по отношению к сперматогенным стволовым клеткам (Dores С, Dobrinski I., 2014). Таким образом, использование по отдельности факторов роста, даже обладающих положительным действием на сперматогенные стволовые клетки, не позволяет эффективно стимулировать весь процесс сперматогенеза. Предлагаемый в данном изобретении способ включает в себя введение биоматериала, обладающего комплексным воздействием на клетки сперматогенного эпителия и клетки яичка, поддерживающие сперматогенез, за счет многофункционального действия факторов роста и других биологически активных молекул, секретируемых МСК человека и входящих в состав указанного биоматериала.The safety of the method is achieved by using cell-free low immunogenic components and a less traumatic administration procedure. The effectiveness of the method is ensured by the content in the secret of MSCs of the factors necessary for maintaining growth, increasing survival and restoring the function of spermatogenic cells, as well as cells supporting spermatogenesis (Sertoli cells, Leydig cells). So, factors such as glial cell neurotrophic factor (GDNF), basic fibroblast growth factor (FGF-2), leukemia inhibition factor (LIF), and others (Oatley Jon M., Brinster Ralph L.) are of great importance for the life of spermatogenic stem cells. , 2008; Park MH, 2016). For example, to activate the processes of differentiation of spermatogenic stem cells, an increase in the level of FGF-2 and GDNF is required. The key factor secreted by Sertoli cells, which support spermatogenic epithelial cells in the seminiferous tubules, is GDNF. Studies on testicular morphogenesis have shown that vascular endothelial growth factor (VEGF) does not stimulate the formation of seminiferous tubules and new blood vessels, but leads to an increase in the number of tubules containing spermatogonia, which indicates the protective role of VEGF in relation to spermatogenic stem cells (Dores C, Dobrinski I., 2014). Thus, the use of individually growth factors, even having a positive effect on spermatogenic stem cells, does not allow to effectively stimulate the entire spermatogenesis process. The method proposed in this invention includes the introduction of a biomaterial having a complex effect on spermatogenic epithelial cells and testicular cells supporting spermatogenesis due to the multifunctional action of growth factors and other biologically active molecules secreted by human MSCs that are part of this biomaterial.

Поставленная задача решается тем, что способ стимуляции сперматогенеза включает в себя введение под белочную оболочку яичка биоматериала, содержащего смесь из активного компонента и основы, где в качестве активного компонента использована кондиционированная среда, содержащая продукты секреции мультипотентных МСК человека. При этом способ получения биоматериала включает в себя культивирование МСК человека до 4-5 пассажа в среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимных клеток человека, отмывку клеток буферным раствором, кондиционирование МСК в бессывороточной и лишенной продуктов животного происхождения среде роста, отбор среды культивирования, содержащей продукты секреции МСК человека, очистку от остатков клеток для получения кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК человека, включающие ключевые для сперматогенеза факторы роста: GDNF в концентрации не менее 50 пкг/мл, VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,3 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа, и смешивание кондиционированной среды с коллагеном.The problem is solved in that the method of stimulating spermatogenesis involves the introduction of a biomaterial under the protein membrane of the testicle containing a mixture of the active component and the base, where an air-conditioned medium containing the secretion products of multipotent human MSCs is used as the active component. The method of biomaterial production includes culturing human MSCs to passage 4-5 in an environment that supports the growth of undifferentiated human mesenchymal cells, washing the cells with buffer solution, conditioning MSCs in a serum-free and animal-free growth medium, selecting a culture medium containing secretion products Human MSCs, purification of cell debris to obtain a conditioned medium containing products of secretion of human MSCs, including the fact that is crucial for spermatogenesis growth ry: GDNF at a concentration of not less than 50 pg / ml, VEGF at a concentration of not less than 200 pg / ml, FGF basic at a concentration of not less than 0.3 pg / ml determined by ELISA, and mixing of the conditioned medium with collagen.

Культивирование может быть осуществлено в культуральных флаконах или чашках Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке с плотностью 5-15*10³/см² в среде роста в объеме 0,1-0,2 мл/см² в условиях CO₂ инкубатора при 37±1°С, 5%-ом содержании СО₂ и относительной влажности ≥95% в течение 7±1 дней. В качестве буферного раствора для отмывки клеток от компонентов среды роста используют раствор Хэнкса (фирмы ПанЭко или аналогичный), при этом отмывку клеток осуществляют трех-пятикратным размещением клеток в упомянутый раствор из расчета 0,1-0,2 мл раствора на см² клеток на 5-10 минут. Для кондиционирования используют бессывороточную и лишенную продуктов животного происхождения среду роста, в качестве последней может быть использована DMEM с низким содержанием глюкозы (HyClone, USA) или другая среда роста, поддерживающая жизнеспособность МСК человека (не ниже 70%) в течение всего срока кондиционирования и пригодная для терапевтического применения. Удаление из среды культивирования остатков клеток (клеточного дебриса) может быть реализовано центрифугированием, например, при 5000±10 об/мин, температуре 6±2°С в течение 10 минут.Cultivation can be carried out in culture bottles or Petri dishes (Corning or similar), while the cells are grown on a flat substrate with a density of 5-15 * 10 ³ / cm ² in a growth medium in a volume of 0.1-0.2 ml / cm ² under the conditions of a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity ≥95% for 7 ± 1 days. A Hanks solution (PanEco or similar) is used as a buffer solution for washing cells from the components of the growth medium, while washing the cells is carried out by three to five-fold placement of cells in the mentioned solution at the rate of 0.1-0.2 ml of solution per cm ² cells per 5-10 minutes. For conditioning, use a serum-free and devoid of animal products growth medium, the latter can be used DMEM with a low glucose content (HyClone, USA) or another growth medium that maintains the viability of human MSCs (at least 70%) throughout the entire conditioning period and is suitable for therapeutic use. Removal of cell debris (cell debris) from the culture medium can be carried out by centrifugation, for example, at 5000 ± 10 rpm, temperature 6 ± 2 ° C for 10 minutes.

Для повышения эффективности биоматериала кондиционированная среда может быть дополнительно концентрирована в 10-50 раз с помощью ультрафильтрации через мембраны из регенерированной целлюлозы с указанным отсечением 5-10 кДа в центрифужных картриджах (Millipore или аналогичные) или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences), используя ультрафильтрационные кассеты (Minimate TFF capsule, PALL, 5-10 кДа) или аналогичные.To increase the efficiency of the biomaterial, the conditioned medium can be additionally concentrated 10-50 times by ultrafiltration through regenerated cellulose membranes with the indicated cut-off of 5-10 kDa in centrifuge cartridges (Millipore or similar) or using the Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences) using ultrafiltration cassettes (Minimate TFF capsule, PALL, 5-10 kDa) or similar.

Для получения кондиционированной среды нами использованы МСК человека, отвечающие за репарацию и регенерацию тканей и органов как в норме, так и при повреждениях. Одним из наиболее богатых источников МСК у человека является жировая ткань. МСК могут быть легко выделены в результате ферментативной обработки образцов жировой ткани, полученной в результате косметической липосакции или в ходе хирургического удаления жирового отложения. Культивирование изолированных МСК ЖТ приводит к получению относительно гомогенной популяции мультипотентных стромальных фибробластоподобных клеток.To obtain a conditioned environment, we used human MSCs, which are responsible for the repair and regeneration of tissues and organs, both in the normal and in case of damage. One of the richest sources of MSCs in humans is adipose tissue. MSCs can be easily isolated as a result of enzymatic processing of adipose tissue samples obtained as a result of cosmetic liposuction or during surgical removal of body fat. The cultivation of isolated MSC in adipose tissue results in a relatively homogeneous population of multipotent stromal fibroblast-like cells.

В заявляемом изобретении могут быть использованы МСК, полученные самостоятельно по любому известному из уровня техники способу (см. Пример 1), так и в виде коммерческих препаратов МСК, имеющих сертификат качества и предназначенных, в том числе, для клинического применения, например, такие как продукт АТСС (АТСС^® PCS-500-011), представляющий собой МСК человека, выделенные из липоаспирата, культивированные до 2 пассажа и подвергнутые криоконсервации, или аналогичные.In the claimed invention can be used MSCs obtained independently by any method known from the prior art (see Example 1), and in the form of commercial preparations of MSCs with a quality certificate and intended, including, for clinical use, for example, such as ATCC product (ATCC ^® PCS-500-011), which is a human MSC isolated from lipoaspirate, cultured up to 2 passages and subjected to cryopreservation, or similar.

Ранее на моделях ишемии конечности и инфаркта миокарда и подкожно имплантированного матригеля у животных нами было показано, что локальное и системное введение МСК ЖТ способствует увеличению количества сосудов в тканях с нарушенным кровоснабжением, приводит к улучшению кровотока в этих тканях и уменьшению или исчезновению симптомов ишемии. Кроме того, нами было выявлено, что введение МСК ЖТ способствует прорастанию нервных окончаний в подкожно имплантированный матригель и улучшает восстановление периферических нервов после травматического повреждения. Согласно данным наших исследований и работ других научных коллективов, основным механизмом, лежащим в основе регенеративного эффекта МСК ЖТ, является продукция этими клетками широкого спектра биологически активных цитокинов и факторов роста, ускоряющих процессы заживления и восстановления тканей после повреждения. Нами показано, что МСК ЖТ человека продуцируют ключевые факторы, такие как GDNF, VEGF, FGF2, HGF и др., необходимые для поддержания роста, повышения выживаемости и восстановления функции сперматогенных клеток, а также клеток, поддерживающих сперматогенез (клетки Сертоли, клетки Лейдига). Каждый из этих факторов может оказывать положительное влияние на некоторые процессы, влияющие на эффективность восстановления сперматогенеза: так, GDNF необходим для поддержания пула недифференцированных ССК, FGF2 участвует в регуляции дифференцировки ССК в зрелые формы сперматозоидов, VEGF и FGF2 являются проангиогенными факторами роста и оказывают трофический эффект на клетки яичка. Однако использование этих факторов роста по отдельности не позволяет эффективно стимулировать весь процесс сперматогенеза. В то же время использование кондиционированной среды, содержащей в том числе комплекс указанных выше факторов, секретированных МСК ЖТ человека, позволяет добиться восстановления процесса дифференцировки клеток сперматогенного эпителия и их созревания в конечные формы сперматозоидов (при этом в придатках увеличивается как общее число сперматозоидов, так и их подвижная фракция), уменьшения выраженности гипотрофии крипторхированных яичек, значительного снижения числа атрофичных и склерозированных канальцев, а также положительного воздействия на клетки Сертоли и клетки Лейдига, что приводит к восстановлению уровня андрогенов. Таким образом, комплексное воздействие этих факторов обеспечивает улучшенный синергетический эффект предлагаемого способа. При этом эффективная концентрация этих факторов может быть значительно ниже, чем при использовании их по отдельности. В данном изобретении предлагается использовать для стимуляции сперматогенеза биоматериал на основе кондиционированной среды, содержащей секретируемые МСК человека GDNF в концентрации не менее 50 пкг/мл, VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,3 пкг/мл, определяемые методом иммуноферментного анализа. При этом использование в составе биоматериала концентрированной кондиционированной среды с более высокой концентрацией указанных факторов позволяет добиться лучшего клинического эффекта.Previously, on models of limb ischemia and myocardial infarction and subcutaneously implanted matrigel in animals, we showed that local and systemic administration of VT MSCs increases the number of vessels in tissues with impaired blood supply, leads to an improvement in blood flow in these tissues and a decrease or disappearance of symptoms of ischemia. In addition, we found that the introduction of MSC in the VT promotes the germination of nerve endings in the subcutaneously implanted matrigel and improves the recovery of peripheral nerves after traumatic injury. According to the data of our studies and the work of other scientific teams, the main mechanism underlying the regenerative effect of MSC in adipose tissue is the production by these cells of a wide range of biologically active cytokines and growth factors that accelerate the healing and restoration of tissues after damage. We have shown that human MSCs in human VT produce key factors, such as GDNF, VEGF, FGF2, HGF, and others, which are necessary to maintain growth, increase survival, and restore the function of spermatogenic cells, as well as cells that support spermatogenesis (Sertoli cells, Leydig cells) . Each of these factors can have a positive effect on some processes that affect the efficiency of spermatogenesis restoration: for example, GDNF is necessary to maintain a pool of undifferentiated SSCs, FGF2 is involved in the regulation of SSC differentiation into mature spermatozoa, VEGF and FGF2 are pro-angiogenic growth factors and have a trophic effect on testicular cells. However, the use of these growth factors separately does not allow to effectively stimulate the entire spermatogenesis process. At the same time, the use of an air-conditioned medium containing, among other things, a complex of factors secreted by human MSC in the gastrointestinal tract allows to restore the process of differentiation of spermatogenous epithelial cells and their maturation into final sperm forms (in this case, the total number of spermatozoa and their mobile fraction), a decrease in the severity of hypotrophy of the cryptorchidized testicles, a significant decrease in the number of atrophic and sclerotic tubules, as well as a positive actions on Sertoli cells and Leydig cells, which leads to the restoration of androgen levels. Thus, the combined effect of these factors provides an improved synergistic effect of the proposed method. Moreover, the effective concentration of these factors can be significantly lower than when using them separately. The present invention proposes the use of biomaterial based on a conditioned medium containing secreted human MSCs GDNF at a concentration of at least 50 pkg / ml, VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.3 pkg / ml for stimulating spermatogenesis determined by enzyme immunoassay. Moreover, the use of a concentrated, conditioned medium with a higher concentration of these factors as part of the biomaterial allows one to achieve a better clinical effect.

Для введения под белочную оболочку яичка используют смесь продуктов секреции МСК человека с коллагеновым гелем в качестве удобного биосовместимого носителя. Для этого неконцентрированную или концентрированную кондиционированную среду, содержащую продукты секреции МСК человека, смешивают с 2-3% коллагеновым гелем на основе коллагена I типа, источником которого могут быть ткани крупного рогатого скота, свиньи или человека. При этом на один объем геля добавляют не более одного объема кондиционированной среды. Пропорции активного компонента и коллагенового геля в смеси должны обеспечивать, с одной стороны, сохранение смеси в жидком состоянии в течение срока, достаточного для подготовки и проведения инъекции биоматериала в яички, с другой стороны, быструю (в течение 1-2 минут), полимеризацию смеси после введения в яички для формирования локального коллагенового «депо» с последующим постепенным высвобождением продуктов секреции МСК человека, содержащихся в биоматериале. В частном случае, реализуемом в данном изобретении, нами был использован 2,5% коллагеновый гель, который при смешивании с неконцентрированной кондиционированной средой в соотношении 1:1 или с концентрированной кондиционированной средой в соотношении 4:1 удовлетворял указанным требованиям. В других случаях могут быть использованы отличающиеся пропорции. Дополнительно к смеси может быть добавлен раствор фибронектина (до максимальной конечной концентрации 0,3 мг/мл) или другие компоненты (например, гепарин) для замедления высвобождения из геля факторов роста. После добавления всех нужных компонентов пробирки быстро перемешивают вортексированием, центрифугируют в течение минуты и набирают смесь в стерильный инсулиновый шприц. Полученный биоматериал хранят при температуре 2-8°С, не допуская полимеризации геля, и используют для введения под белочную оболочку яичка в течение 30 минут.For introduction under the testicle, a mixture of human MSC secretion products with collagen gel is used as a convenient biocompatible carrier. For this, an unconcentrated or concentrated conditioned medium containing the secretion products of human MSCs is mixed with 2-3% collagen gel based on type I collagen, the source of which may be tissues of cattle, pig or human. In this case, no more than one volume of conditioned medium is added to one volume of gel. The proportions of the active component and collagen gel in the mixture should ensure, on the one hand, the mixture is kept in a liquid state for a period sufficient to prepare and inject the biomaterial into the testes, on the other hand, rapid (within 1-2 minutes) polymerization of the mixture after introduction into the testes to form a local collagen “depot” with subsequent gradual release of the secretion products of human MSCs contained in the biomaterial. In the particular case, implemented in this invention, we used a 2.5% collagen gel, which when mixed with non-concentrated conditioned medium in a ratio of 1: 1 or with concentrated conditioned medium in a ratio of 4: 1 met the specified requirements. In other cases, different proportions may be used. In addition to the mixture, a fibronectin solution (up to a maximum final concentration of 0.3 mg / ml) or other components (e.g. heparin) can be added to slow the release of growth factors from the gel. After adding all the necessary components, the tubes are quickly mixed by vortexing, centrifuged for a minute and the mixture is collected in a sterile insulin syringe. The resulting biomaterial is stored at a temperature of 2-8 ° C, preventing the polymerization of the gel, and is used to introduce under the protein membrane of the testicle for 30 minutes.

Объем введения биоматериала под белочную оболочку яичка по предлагаемому способу должен быть достаточным для достижения терапевтической эффективности и в то же время не вызывать избыточной травматизации тканей яичка. В частном случае, реализуемом в данном изобретении, мы вводили 100±10 мкл биоматериала в яички экспериментальных животных (крыс), что является достаточным для достижения терапевтического эффекта и не приводит к сдавлению тканей паренхимы яичка. Для применения у человека указанная доза может быть пересчитана известным способом по соотношению масс яичек.The volume of introduction of the biomaterial under the testicle's white membrane according to the proposed method should be sufficient to achieve therapeutic efficacy and at the same time not cause excessive trauma to the testicular tissue. In the particular case implemented in this invention, we injected 100 ± 10 μl of biomaterial into the testes of experimental animals (rats), which is sufficient to achieve a therapeutic effect and does not lead to compression of the tissues of the testis parenchyma. For use in humans, the indicated dose can be recalculated in a known manner according to the ratio of testicular masses.

В результате осуществления данного изобретения получают эффективную стимуляцию сперматогенеза путем локального однократного введения в яички биоматериала на основе продуктов секреции МСК человека. Способ может быть использован для лечения мужской инфертильности.As a result of the implementation of this invention receive effective stimulation of spermatogenesis by local single injection into the testes of biomaterial based on the secretion products of human MSCs. The method can be used to treat male infertility.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Изобретение поясняется графическими материалами.The invention is illustrated in graphic materials.

Фигура 1. Фотография, демонстрирующая внешний вид нормального (слева) и крипторхированного (справа) яичка.Figure 1. A photograph showing the appearance of a normal (left) and cryptorchidized (right) testicle.

Фигура 2. Диаграмма, отражающая динамику массы крипторхированных яичек после их низведения в мошонку в различных группах экспериментальных животных. Данные представлены в виде медиана (25-, 75-процентили). * - р<0,05 (при сравнении с группой контроля Гель+ДМЕМ).Figure 2. A diagram reflecting the dynamics of the mass of cryptorchidized testicles after they are reduced to the scrotum in various groups of experimental animals. Data are presented as median (25-, 75-percentiles). * - p <0.05 (when compared with the control group Gel + DMEM).

Фигура 3. А - Атрофичные канальцы в крипторхированных яичках через 1 месяц после низведения (контрольная серия). Б - восстановление сперматогенного эпителия через 1 месяц после низведения с введением в яичко концентрированной КС МСК ЖТ. Окраска гематокислином и эозином, ув. 200х и 400х соответственно.Figure 3. A - Atrophic tubules in the cryptorchidized testes 1 month after releasing (control series). B - restoration of spermatogenic epithelium 1 month after reduction with the introduction of concentrated CS of MSC in the testicle into the testicle. Stained with hematokislin and eosin, SW. 200x and 400x, respectively.

Фигура 4. Общее количество (А) и количество подвижных сперматозоидов (Б), выделенных из придатка яичка в исследуемых группах (тыс.на 1 придаток). Данные представлены в виде медиана (25-, 75-процентили). * - р<0,05 (при сравнении с группой контроля Гель+ДМЕМ).Figure 4. The total number (A) and the number of motile spermatozoa (B) isolated from the epididymis in the study groups (thousand per 1 appendage). Data are presented as median (25-, 75-percentiles). * - p <0.05 (when compared with the control group Gel + DMEM).

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Ниже представлено подробное описание изобретения на примерах конкретного выполнения, которые демонстрируют практическую осуществимость изобретения, но не ограничивают возможность осуществления изобретения с помощью иных средств и методов.Below is a detailed description of the invention by examples of specific performance, which demonstrate the practical feasibility of the invention, but do not limit the possibility of carrying out the invention using other means and methods.

Пример 1. Получение МСК жировой ткани человека.Example 1. Obtaining MSCs of human adipose tissue.

МСК выделяют из подкожного жирового отложения здоровых доноров обоих полов. Клетки выделяют из материала, полученного при проведении малого хирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургических операций. Хирургический материал (15 г жировой ткани, взятой из околопупочной области или другой области локализации подкожного жира) помещают в одноразовую пробирку с буфером HBSS (HyClone) содержащим 5-ти кратную концентрацию антибиотика 500 ед/мл (HyClone).MSCs are isolated from subcutaneous fat deposits of healthy donors of both sexes. Cells are isolated from material obtained during minor surgery under local anesthesia or during routine surgical operations. Surgical material (15 g of adipose tissue taken from the umbilical region or another area of localization of subcutaneous fat) is placed in a single-use tube with HBSS buffer (HyClone) containing a 5-fold antibiotic concentration of 500 units / ml (HyClone).

В стерильных условиях культурального бокса биоптат фрагментируют до однородной массы, используя стерильные инструменты, после чего подвергают его ферментативной обработке в растворе, содержащем среду AdvanceSTEM™ (HyClone) /500 ед/мл антибиотика (HyClone), 200 ед/мл коллагеназы I типа и диспазы (40 ед/ml) (Worthington Biochemical) (соотношение объема ферментов и жира должно быть 1:1:1), при 37°С в течение 30-45 минут при постоянном помешивании. По окончании инкубации к образцу добавляют равный объем среды с сывороткой и фильтруют через нейлоновые мембраны с размером пор 100 мкм (BD). Профильтрованную суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 200g, после чего супернатант полностью удаляют. Осадок клеток подвергают обработке буфером для лизиса эритроцитов (BD) до покраснения раствора, после чего центрифугируют в течение 5 мин при 200g. Супернатант полностью удаляют, а осажденные клетки ресуспендируют в среде роста МСК. Для культивирования мезенхимных клеток используют среду AdvanceSTEM™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) в сочетании с добавлением 10% раствора добавок AdvanceSTEM™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) и 100 ед/мл антибиотика (HyClone). Эта среда была разработана фирмой-производителем (HyClone) для культивирования недифференцированных МСК, в частности клеток, происходящих из жировой ткани, без добавления сыворотки (http://www.thermo.com).Under sterile conditions of the culture box, the biopsy is fragmented to a homogeneous mass using sterile instruments, and then subjected to enzymatic treatment in a solution containing AdvanceSTEM ™ medium (HyClone) / 500 u / ml antibiotic (HyClone), 200 u / ml type I collagenase and dispase (40 units / ml) (Worthington Biochemical) (the ratio of the volume of enzymes and fat should be 1: 1: 1), at 37 ° C for 30-45 minutes with constant stirring. At the end of the incubation, an equal volume of serum medium is added to the sample and filtered through nylon membranes with a pore size of 100 μm (BD). The filtered suspension is centrifuged for 5 min at 200 g, after which the supernatant is completely removed. The cell pellet is subjected to treatment with erythrocyte lysis buffer (BD) until the solution becomes red, then centrifuged for 5 min at 200 g. The supernatant is completely removed, and the precipitated cells are resuspended in MSC growth medium. AdvanceSTEM ™ support expansion and maintenance of undifferentiated human MSCs (HyClone) combined with 10% AdvanceSTEM ™ Stem Cell Growth Supplement (HyClone) and 100 u / ml antibiotic (HyClone) are used to cultivate mesenchymal cells. This medium was developed by the manufacturer (HyClone) for the cultivation of undifferentiated MSCs, in particular cells derived from adipose tissue, without the addition of serum (http://www.thermo.com).

Выделенные МСК высевают в концентрации 200 тыс.в мл в чашках Петри и культивируют в среде роста в инкубаторе при 37°С и при 5%-ой концентрации СО₂. При достижении 80% монослоя МСК ЖТ (0 пассаж) замораживают в жидком азоте и хранят в мастер-банке для дальнейшего использования с целью наработки среды.The isolated MSCs are seeded at a concentration of 200 thousand per ml in Petri dishes and cultivated in a growth medium in an incubator at 37 ° C and at a 5% concentration of CO ₂ . Upon reaching 80% of the monolayer of MSC ZhT (0 passage), they are frozen in liquid nitrogen and stored in a master bank for further use in order to accumulate the medium.

Для наработки среды МСК ЖТ масштабируют. Перед снятием с поверхности культурального пластика клетки трехкратно промывают раствором Версена. Затем наносят в каждую чашку по 1 мл реагента для диссоциации клеток HyQTase (HyClone). При приобретении клетками округлой формы и откреплении их от подложки в каждую культуральную емкость вносят по 9 мл среды роста и интенсивно пипетируют клеточную суспензию. Затем клетки рассевают в соотношении 1:4.To produce the medium, MSCs of VT are scaled. Before removing from the surface of the culture plastic, the cells are washed three times with Versen's solution. Then, 1 ml of HyQTase (HyClone) cell dissociation reagent is applied to each dish. When the cells acquire a rounded shape and detach them from the substrate, 9 ml of growth medium is introduced into each culture container and the cell suspension is intensively pipetted. Then the cells are seeded in a ratio of 1: 4.

Пример 2. Получение кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.Example 2. Obtaining a conditioned medium containing the secretion products of MSCs in human adipose tissue.

Для получения кондиционированной среды МСК ЖТ наращивают до 2-5 пассажа. МСК ЖТ человека добавляют в количестве 5-15*10³/см² в культуральные емкости для выращивания эукариотических клеток, после прикрепления промывают культуральные сосуды с клетками солевым раствором Хэнкса (Панэко, Россия) (в количестве 0,1-0,2 мл/см² трижды по 10 минут) и заполняют их свежей средой роста для кондиционирования в количестве 0,1-0,2 мл/см². В качестве последней используют универсальную среду роста для разных типов клеток DMEM with Low Glucose (HyClone, USA). Затем клетки культивируют в условиях СО₂ инкубатора при 37±1°С, 5%-ом содержании СО₂ и относительной влажности ≥95% в течение 7 суток. В качестве культуральных емкостей для выращивания эукариотических клеток используют культуральные флаконы или чашки Петри (фирмы Corning или аналогичные), при этом клетки выращивают на плоской подложке плотностью 5-15*10³/см².To obtain a conditioned environment, MSCs of VT are increased to 2-5 passage. MSCs of human gastrointestinal tract are added in an amount of 5-15 * 10 ³ / cm ² in culture containers for growing eukaryotic cells, after attachment, the culture vessels with cells are washed with Hanks saline solution (Paneko, Russia) (in an amount of 0.1-0.2 ml / cm ² three times for 10 minutes) and fill them with fresh growth medium for conditioning in the amount of 0.1-0.2 ml / cm ² . As the latter, a universal growth medium for different types of DMEM with Low Glucose cells (HyClone, USA) is used. Then the cells are cultured in a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity ≥95% for 7 days. As culture containers for growing eukaryotic cells, culture bottles or Petri dishes (Corning or the like) are used, and the cells are grown on a flat substrate with a density of 5-15 * 10 ³ / cm ² .

Пример 3. Очистка и концентрирование кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека, методом ультрафильтрации.Example 3. The purification and concentration of the conditioned medium containing the secretion products of MSCs of human adipose tissue by ultrafiltration.

Кондиционированную среду, содержащую все продукты секреции МСК ЖТ человека (КС МСК ЖТ), собирают в стерильные емкости для центрифугирования, центрифугируют при (5000±10) об/мин, температуре (6±2)°С, в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса. Полученный супернатант отбирают в новые стерильные емкости объемом 250-500 мл. При необходимости кондиционированную среду концентрируют в 10-50 раз с помощью ультрафильтрации через мембраны из регенерированной целлюлозы с указанным отсечением 5-10 кДа в центрифужных картриджах (Millipore или аналогичные) или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке Minim II (Life Sciences), используя ультрафильтрационные кассеты (Minimate TFF capsule, PALL, 5-10 кДа) или аналогичные. При невозможности соблюсти стерильность при проведении ультрафильтрации очищенную среду подвергают микрофильтрации. Фильтрацию очищенной среды осуществляют через одноразовые стерильные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, обеспечивающие стерилизацию продукта. Среду подают на фильтры перистальтическим насосом. Фильтрат собирают в стерильную полипропиленовую емкость.An air-conditioned medium containing all the secretion products of human MSC in the gastrointestinal tract (KS MSC ZhT) is collected in sterile containers for centrifugation, centrifuged at (5000 ± 10) rpm, temperature (6 ± 2) ° С, for 10 minutes to remove cellular debris. The resulting supernatant is taken into new sterile containers with a volume of 250-500 ml. If necessary, the conditioned medium is concentrated 10-50 times by ultrafiltration through regenerated cellulose membranes with the indicated cut-off of 5-10 kDa in centrifuge cartridges (Millipore or the like) or using a Minim II tangential flow filtration system (Life Sciences) using ultrafiltration cartridges (Minimate TFF capsule, PALL, 5-10 kDa) or similar. If it is not possible to maintain sterility during ultrafiltration, the purified medium is subjected to microfiltration. Filtration of the purified medium is carried out through disposable sterile filters with a pore diameter of 0.22 μm, ensuring sterilization of the product. The medium is fed to the filters by a peristaltic pump. The filtrate is collected in a sterile polypropylene container.

Пример 4. Метод оценки концентрации ключевых факторов, опосредующих стимулирующие сперматогенез эффекты кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека.Example 4. A method for assessing the concentration of key factors mediating the stimulating spermatogenesis effects of an air-conditioned environment containing the secretion products of MSCs in human adipose tissue.

Оценку содержания GDNF, VEGF и FGF basic (FGFb) в КС МСК ЖТ проводят методом иммуноферментного анализа (ELISA). В растворе должны определяться VEGF в концентрации не менее 200 пкг/мл, GDNF в концентрации не менее 50 пкг/мл, FGF basic в концентрации не менее 0,3 пкг/мл.Evaluation of the content of GDNF, VEGF and FGF basic (FGFb) in the SC of MSC in the VT is carried out by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). VEGF should be determined in the solution at a concentration of at least 200 pkg / ml, GDNF at a concentration of at least 50 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.3 pkg / ml.

Оценка содержания VEGF с использованием набора фирмы R&D Systems Human VEGF Quantikine ELISA Kit.Evaluation of VEGF content using the R&D Systems Human VEGF Quantikine ELISA Kit.

Для определения концентрации VEGF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human VEGF Quantikine ELISA Kit, cat#DVE00) или аналогичный.To determine the concentration of VEGF by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human VEGF Quantikine ELISA Kit, cat # DVE00) or a similar one is used.

Используя стандартизированный раствор VEGF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл VEGF, каждая последующая содержала VEGF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора VEGF троекратно наносят в лунки 96-ти луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против VEGF человека. Через 3 часа инкубации планшеты отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера, и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectra при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized VEGF solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml VEGF, each subsequent one contains 2 times less VEGF. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. The test samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of a VEGF solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer, and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human VEGF antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plates are washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate was incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer was added to each well, and the reaction was evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectra spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. The optical density level at a wavelength of 570 nm is used as a reference. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания GDNF с использованием набора фирмы Cusabio Human GDNF ELISA Kit.Assessment of GDNF content using the Cusabio Human GDNF ELISA Kit.

Для определения концентрации GDNF методом ELISA используют коммерческий набор фирмы Cusabio или аналогичный.To determine the concentration of GDNF by ELISA, a commercial kit from Cusabio or the like is used.

Используя стандартизированный раствор GDNF, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 1000 пг/мл GDNF, каждая последующая содержала GDNF в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора GDNF троекратно наносят в лунки 96-ти луночного планшета и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против GDNF человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера, и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectra при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized GDNF solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 1000 pg / ml GDNF, each subsequent one contains 2 times less GDNF. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. The investigated samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of a GDNF solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer, and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human GDNF antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plate is washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate was incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl stop buffer was added to each well, and the reaction was evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectra spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. The optical density level at a wavelength of 570 nm is used as a reference. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Оценка содержания FGFb с использованием набора фирмы R&D Systems Human FGF basic Quantikine ELISA KitEvaluation of FGFb content using the R&D Systems Human FGF basic Quantikine ELISA Kit

Для определения концентрации FGFb методом ELISA используют коммерческий набор фирмы R&D Systems (Human FGF basic Quantikine ELISA Kit, cat#DFB50) или аналогичный.To determine the concentration of FGFb by ELISA, a commercial kit from R&D Systems (Human FGF basic Quantikine ELISA Kit, cat # DFB50) or a similar one is used.

Используя стандартизированный раствор FGFb, готовят калибровочные пробы известной концентрации так, чтобы проба №1 содержала 500 пг/мл FGFb, каждая последующая содержала FGFb в 2 раза меньше. Проба №0 должна содержать только раствор Sample Diluent. Исследуемые образцы в количестве 100 мкл, а также стандартизированные образцы раствора FGFb троекратно наносят в лунки 96-ти луночный планшет и инкубируют на шейкере в течение 12 часов при 4°С. Планшет отмывают буфером Wash Buffer, и в каждую из лунок добавляют по 100 мкл биотинилированных мышиных моноклональных антител против FGFb человека. Через 3 часа инкубации планшет отмывают, как описано выше. В каждую лунку наносят по 100 мкл раствора комплекса стрептавидин-пероксидаза хрена. Через 1 час планшет тщательно промывают и вносят в каждую лунку по 100 мкл прилагаемого к набору раствора субстрата ТМВ/Е. Планшет инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, затем в каждую из лунок добавляют по 100 мкл стоп-буфера, и оценивают реакцию на спектрофотометре ELISA READER MICROPLATE READER Spectro при длине волны 450 нм. В качестве референсного используют уровень оптической плотности при длине волны 570 нм. Работу на аппарате осуществляют в соответствии с инструкцией.Using a standardized FGFb solution, calibration samples of known concentration are prepared so that sample No. 1 contains 500 pg / ml FGFb, each subsequent one contains 2 times less FGFb. Sample No. 0 should contain only Sample Diluent. The investigated samples in an amount of 100 μl, as well as standardized samples of the FGFb solution, are applied three times to the wells of a 96-well plate and incubated on a shaker for 12 hours at 4 ° C. The plate is washed with Wash Buffer, and 100 μl of biotinylated murine monoclonal anti-human FGFb antibodies are added to each well. After 3 hours of incubation, the plate is washed as described above. In each well, 100 μl of horseradish streptavidin-peroxidase complex solution is applied. After 1 hour, the plate was washed thoroughly and 100 μl of TMB / E substrate solution supplied with the kit was added to each well. The plate was incubated at room temperature for 15 minutes, then 100 μl of a stop buffer was added to each well, and the reaction was evaluated on an ELISA READER MICROPLATE READER Spectro spectrophotometer at a wavelength of 450 nm. The optical density level at a wavelength of 570 nm is used as a reference. Work on the device is carried out in accordance with the instructions.

Пример 5. Получение биоматериала на основе кондиционированной среды, содержащей продукты секреции МСК жировой ткани человека, и коллагена I типаExample 5. Obtaining biomaterial based on a conditioned medium containing the secretion products of MSCs of human adipose tissue, and type I collagen

Все процедуры проводят в ламинарном шкафу II уровня биологической защиты с соблюдением правил асептики, сохраняя все компоненты при температуре 4°С. В стерильные 1,5 мл пробирки вносят по 50 мкл 2-3% коллагенового геля (ООО «ИМТЕК» или аналогичного), выделенного из тканей крупного рогатого скота, свиней или других источников и содержащего коллаген I типа. Затем к гелю добавляют 50 мкл неконцентрированной КС МСК ЖТ. В другом варианте изобретения к гелю добавляют 50 мкл концентрированной в 10-50 раз КС МСК ЖТ. Дополнительно к смеси может быть добавлен раствор фибронектина (до конечной концентрации 0,3 мг/мл) для замедления высвобождения из геля факторов роста. После добавления всех нужных компонентов содержимое пробирки быстро перемешивают вортексированием, центрифугируют в течение минуты и набирают смесь в стерильный инсулиновый шприц. Полученный биоматериал хранят при температуре 2-8°С, не допуская полимеризации геля, и используют для введения в течение 30 минут.All procedures are carried out in a laminar cabinet of the II level of biological protection in compliance with asepsis rules, keeping all components at a temperature of 4 ° С. In sterile 1.5 ml tubes, 50 μl of 2-3% collagen gel (IMTEC LLC or similar), isolated from cattle, pigs or other sources and containing type I collagen, is added. Then, 50 μl of non-concentrated KS MSC VT are added to the gel. In another embodiment of the invention, 50 μl of concentrated 10–50-fold concentrated KS MF VT are added to the gel. In addition to the mixture, a fibronectin solution can be added (to a final concentration of 0.3 mg / ml) to slow the release of growth factors from the gel. After adding all the necessary components, the contents of the tube are quickly mixed by vortexing, centrifuged for a minute and the mixture is collected in a sterile insulin syringe. The resulting biomaterial is stored at a temperature of 2-8 ° C, preventing the polymerization of the gel, and is used for administration within 30 minutes.

Пример 6. Использование биоматериала для стимуляции восстановления сперматогенеза на модели экспериментального крипторхизмаExample 6. The use of biomaterial to stimulate the restoration of spermatogenesis in a model of experimental cryptorchidism

Эксперименты выполняли на 40 половозрелых крысах-самцах, породной группы Wistar, в возрасте 3,5-4,0 месяца, стандартных весовых характеристик. Все эксперименты выполняли в соответствии с требованием Хельсинкского соглашения о гуманном обращении с животными. Этим животным выполняли моделирование двухстороннего абдоминального крипторхизма. Для этого яички выводили из мошонки в брюшную полость через паховый канал (что у крыс не вызывает трудностей в связи с широким просветом канала) и фиксировали к брюшной стенке в области латеральных каналов узловым швом атравматической нитью «Prolene» 4/0, проведенной через дистальный полюс яичка, чтобы избежать возможного блокирования сообщения между выносящими семенными канальцами и придатком яичка. При этом обращали особое внимание на исключение возможности захватывания швом семявыносящего протока и кровеносных сосудов. Через 2 недели производили низведение яичек в мошонку путем удаления фиксирующей лигатуры и смещения яичек в паховый канал. Известно, что при этом сроке выдерживания яичек в брюшной полости происходят выраженные, но потенциально обратимые нарушения сперматогенеза. Затем перед низведением под белочную оболочку яичек пункционно с помощью инсулинового шприца вводили образцы биоматериала, содержащие КС МСК ЖТ и коллагеновый гель. В группе «КС доза 1» для получения биоматериала к коллагеновому гелю (50 мкл) добавляли 50 мкл неконцентрированной КС МСК ЖТ, в группе «КС доза 2» - 30 мкл раствора фибронектина (1 мг/мл, ООО «ИМТЕК») и 20 мкл концентрированной в 25 раз КС МСК ЖТ. В качестве отрицательного контроля 50 мкл 2,5% бычьего коллагенового геля смешивали с 30 мкл раствора фибронектина (1 мг/мл) и 20 мкл среды DMEM-LG. Контролем также служила группа крыс без терапии. Оценку выраженности развившихся повреждений в яичках после 2-недельного пребывания в брюшной полости оценивали через 1 и 3 месяца после их низведения. Для этого удаляли яички с придатками и определяли их весовые характеристики. Также забирали образцы ткани яичек для гистологического исследования, которое проводили по стандартной методике с окраской гистологических срезом гематоксилином и эозином. Выраженность нарушения сперматогенеза оценивали по уровню его блокировки (определение наиболее зрелых клеточных форм в семенных канальцах), а также определению доли запустевших и склерозированных семенных канальцев. Придатки яичка гомогенизировали в растворе 5% глюкозы в соотношении ткань/раствор 1:10 с последующим определением в надосадочной жидкости количества активно-подвижных и неподвижных сперматозоидов в камере Горяева по стандартной методике анализа спермограммы.The experiments were performed on 40 sexually mature male rats of the Wistar breed group, aged 3.5-4.0 months, with standard weight characteristics. All experiments were performed in accordance with the requirements of the Helsinki Agreement on the Humane Treatment of Animals. These animals were simulated with bilateral abdominal cryptorchidism. To do this, the testes were removed from the scrotum into the abdominal cavity through the inguinal canal (which in rats does not cause difficulties due to the wide lumen of the canal) and were fixed to the abdominal wall in the lateral canal with a nodal suture with a proraneus suture 4/0 drawn through the distal pole testicles to avoid possible blockage of the message between the efferent seminiferous tubules and the epididymis. At the same time, special attention was paid to the exclusion of the possibility of seizure of the vas deferens duct and blood vessels. After 2 weeks, the testes were reduced to the scrotum by removal of the fixative ligature and displacement of the testicles into the inguinal canal. It is known that with this period of testicular aging, pronounced, but potentially reversible spermatogenesis disorders occur in the abdominal cavity. Then, before releasing the testicles under the membrane of the testicles, biomaterial samples containing CS CS MF VT and collagen gel were injected punctured using an insulin syringe. In the KS dose 1 group, to obtain biomaterial, 50 μl of non-concentrated KS MSC VT was added to collagen gel (50 μl), in the KS dose 2 group, 30 μl of fibronectin solution (1 mg / ml, IMTEK LLC) and 20 μl concentrated by 25 times the CS MSC ZhT. As a negative control, 50 μl of 2.5% bovine collagen gel was mixed with 30 μl of fibronectin solution (1 mg / ml) and 20 μl of DMEM-LG medium. The control was also a group of rats without therapy. Assessment of the severity of the developed lesions in the testicles after a 2-week stay in the abdominal cavity was assessed 1 and 3 months after they were reduced. For this, the testicles with appendages were removed and their weight characteristics were determined. Testicular tissue samples were also taken for histological examination, which was carried out according to a standard method with histological staining with hematoxylin and eosin. The severity of spermatogenesis disorders was assessed by the level of its blockage (determination of the most mature cell forms in the seminiferous tubules), as well as by the determination of the proportion of neglected and sclerotic seminiferous tubules. The appendages of the testis were homogenized in a solution of 5% glucose in a tissue / solution ratio of 1:10, followed by determination of the number of actively-motile and motionless spermatozoa in the Goryaev’s chamber in a supernatant according to the standard spermogram analysis technique.

Одним из негативных процессов, происходящих в крипторхированных яичках, является уменьшение их массы (гипотрофия). На использованной модели экспериментального крипторхизма после 2-недельного пребывания в брюшной полости масса яичек уменьшалась в среднем с 1,98±0,09 г до 0,82±0,06 г (р<0,001) (Фиг. 1). Через 1 месяц после низведения в контрольных сериях, а также в опытах с введением в яичко геля с неконцентрированной КС масса органов практически не изменилась, тогда как в опытах с введением концентрированной КС возросла в среднем до 1,05-1,1 г (Фиг. 2). Через 3 месяца после низведения масса яичек в контрольной серии и в опытах с неконцентрированной КС возрастала незначительно (различия с данными при низведении яичек и через 1 месяц статистически незначимы), тогда как после введения геля с концентрированной КС масса яичек продолжала возрастать достоверно, превышая значения в других опытах (р<0,05).One of the negative processes occurring in the cryptorchidized testicles is a decrease in their mass (hypotrophy). In the used model of experimental cryptorchidism, after a 2-week stay in the abdominal cavity, testicular mass decreased on average from 1.98 ± 0.09 g to 0.82 ± 0.06 g (p <0.001) (Fig. 1). 1 month after the reduction in the control series, as well as in experiments with the introduction of gel with an unconcentrated KS into the testicle, the mass of organs remained almost unchanged, while in experiments with the introduction of concentrated KS it increased on average to 1.05-1.1 g (Fig. 2). 3 months after the reduction, the testicular mass in the control series and in experiments with non-concentrated KS increased slightly (differences with the data when the testicles were reduced and after 1 month were statistically insignificant), while after administration of the gel with concentrated KS the testicular mass continued to increase significantly, exceeding the values in other experiments (p <0.05).

При гистологической оценке состояния сперматогенеза через 1 месяц после ликвидации двухстороннего абдоминального крипторхизма было установлено, что в контрольной серии (без терапии) наблюдались резко выраженные нарушения с развитием блока созревания сперматозоидов уже на ранних стадиях. Так, даже темные сперматогонии А (начальные предшественники сперматозоидов) выявлялись только в 60% случаев, а более зрелые сперматогонии Б и сперматоциты 1-го порядка обнаруживались только в 20% препаратах. Более зрелые формы (сперматоциты 2 порядка, сперматозоиды) отсутствовали во всех случаях (табл. 1). То есть, у этих животных развивался блок сперматогенеза на уровне сперматогоний или сперматоцитов 1-го порядка. В серии опытов с введением геля, содержащего неконцентрированную КС МСК ЖК, отмечалось некоторое улучшение сперматогенеза: темные сперматогонии А обнаружены во всех исследованных препаратах, но более зрелые клеточные формы встречались также редко или отсутствовали. Значительное улучшение состояния яичка отмечено в сериях, где использовали коллагеновый гель с концентрированной КС МСК ЖТ. В этих опытах выявляли завершенный сперматогенез (до стадии сперматозоидов).During the histological assessment of the state of spermatogenesis 1 month after the elimination of bilateral abdominal cryptorchidism, it was found that in the control series (without therapy), pronounced disturbances were observed with the development of the sperm maturation block already in the early stages. So, even dark spermatogonia A (initial sperm precursors) were detected only in 60% of cases, and more mature spermatogonia B and first-order spermatocytes were found in only 20% of the preparations. More mature forms (spermatocytes of the 2nd order, spermatozoa) were absent in all cases (Table 1). That is, in these animals a block of spermatogenesis developed at the level of spermatogonia or 1st order spermatocytes. In a series of experiments with the introduction of a gel containing non-concentrated KS MSCs of the LC, some improvement in spermatogenesis was noted: dark spermatogonia A were found in all the studied drugs, but more mature cell forms were also rare or absent. A significant improvement in the testis was noted in the series where a collagen gel with concentrated CS of MSC in the VT was used. In these experiments, complete spermatogenesis was detected (up to the sperm stage).

При количественном анализе распределения разных типов клеток сперматогенного эпителия (табл. 2) выявили резкое обеднение канальцев всеми видами клеток как в контрольной серии, так и в опытах с введением неконцентрированной КС (доза 1) (Фиг. 3А). В других сериях клеточная популяция в значительной степени восстанавливалась, как в отношении стволовых и прогениторных клеток (сперматогонии А), так и в отношении более дифференцированных клеточных форм, вплоть до зрелых сперматозоидов (Фиг. 3Б).A quantitative analysis of the distribution of different types of spermatogenous epithelial cells (Table 2) revealed a sharp depletion of the tubules with all types of cells both in the control series and in experiments with the introduction of non-concentrated CS (dose 1) (Fig. 3A). In other series, the cell population was significantly restored, both in relation to stem and progenitor cells (spermatogonia A), and in relation to more differentiated cell forms, up to mature spermatozoa (Fig. 3B).

В контрольной серии опытов выявляли значительное количество канальцев, полностью лишенных эпителиальной выстилки. Число пустых (атрофичных) канальцев в этой группе составило 63,24±5,16 канальцев на единицу условной площади препарата. В серии с ДМЕМ их количество было примерно таким же - 64,26±3,15. В то же время в опытах с введением геля с КС разных концентраций количество атрофичных канальцев было значительно меньше - 7,28±0,26 и 3,18±0,24, 0 канальцев на единицу условной площади соответственно.In the control series of experiments revealed a significant number of tubules, completely devoid of epithelial lining. The number of empty (atrophic) tubules in this group was 63.24 ± 5.16 tubules per unit conditional area of the drug. In the series with DMEM, their number was approximately the same - 64.26 ± 3.15. At the same time, in experiments with the introduction of gel with CS of different concentrations, the number of atrophic tubules was significantly less - 7.28 ± 0.26 and 3.18 ± 0.24, 0 tubules per unit of conventional area, respectively.

Через 3 месяца после низведения крипторхированных яичек во всех сериях отмечено улучшение сперматогенеза. Недифференцированные и малодифференцированные клеточные формы (светлые и темные сперматогонии А) практически полностью восстановились. Даже в контрольной серии в отдельных препаратах выявляли завершенный до стадии сперматозоидов сперматогенез, однако в большинстве случаев он был заблокирован на уровне сперматоцитов 1-го и 2-го порядка (табл. 3). В сериях опытов с введением геля с неконцентрированной КС и ДМЕМ ситуация мало отличалась от контрольной серии. В то же время в опытах с концентрированной КС (доза 2) выявляли завершенный сперматогенез в большинстве случаев.3 months after the cryptorchid testis was reduced, an improvement in spermatogenesis was noted in all series. Undifferentiated and poorly differentiated cell forms (light and dark spermatogonia A) have almost completely recovered. Even in the control series, spermatogenesis that was completed prior to the sperm stage was detected in separate preparations, but in most cases it was blocked at the level of spermatocytes of the 1st and 2nd order (Table 3). In a series of experiments with the introduction of a gel with non-concentrated CS and DMEM, the situation did not differ much from the control series. At the same time, in experiments with concentrated CS (dose 2), complete spermatogenesis was detected in most cases.

Количественное определение различных клеточных популяций в семенных канальцах подтвердило восстановление популяции недифференцированных и малодифференцированных клеток (табл. 4). Не выявили достоверных различий между количеством светлых и темных сперматогоний А между всеми группами опытов. В то же время степень восстановления популяции сперматогоний Б в контрольной серии оказалась достоверно ниже, чем в опытных сериях. Количество более зрелых форм также в контроле в целом было меньше, чем в других сериях.Quantitative determination of various cell populations in the seminiferous tubules confirmed the restoration of the population of undifferentiated and poorly differentiated cells (Table 4). No significant differences were found between the number of light and dark spermatogonia A between all groups of experiments. At the same time, the degree of recovery of spermatogonia B population in the control series was significantly lower than in the experimental series. The number of more mature forms in the control as a whole was less than in other series.

Статистическая значимость различий - как в табл. 2.The statistical significance of the differences is as in table. 2.

Количество атрофичных канальцев через 3 месяца в контрольной серии существенно не изменилось по сравнению со сроком 1 месяц, составив 75,26±6,17 канальцев на единицу условной площади препарата, так же, как и в опытах с ДМЕМ - 52,12±2,19. В остальных сериях их количество продолжало уменьшаться, составив в серии гель + КС доза 1 0,03±0,01 и КС доза 2 - 0,78±0,13 канальцев на единицу площади препарата.The number of atrophic tubules after 3 months in the control series did not change significantly compared to the period of 1 month, amounting to 75.26 ± 6.17 tubules per unit of the conditional area of the drug, just as in experiments with DMEM - 52.12 ± 2, 19. In the remaining series, their number continued to decrease, amounting to a dose of 1 0.03 ± 0.01 and a dose of 2 + 0.78 ± 0.13 tubules per unit area of the drug in the gel + CS series.

Было также изучено влияние исследуемого биоматериала на функцию крипторхированных яичек путем определения количества сперматозоидов, выделенных из придатка яичка, и их подвижности. Результаты показали, что у интактных крыс из придатка выделяли в среднем 61,375 (51,187; 71,562) тысяч клеток на придаток. Из них сохраняли подвижность после выделения в среднем 693 750 (534375; 853125) сперматозоидов. Через 1 месяц после низведения яичек во всех сериях выявили резкое уменьшение как общего количества, так и подвижных сперматозоидов на 88-100% (Фиг. 4). При этом при введении биоматериала с КС МСК ЖТ отмечали некоторое увеличение общего количества выделенных сперматозоидов при сравнении с контрольными опытами, тогда как в отношении подвижных клеток различий не выявили. Иная картина наблюдалась через 3 месяца после низведения крипторхированных яичек. При этом сроке наблюдения отмечено значительное возрастание как общего количества, так и подвижных сперматозоидов при введении биоматериала с КС МСК ЖТ, причем наибольший прирост этих показателей был получен в серии с использованием концентрированной КС (Фиг. 4).The effect of the studied biomaterial on the function of the cryptorchidized testicles was also studied by determining the number of spermatozoa isolated from the epididymis and their motility. The results showed that in intact rats, an average of 61.375 (51.187; 71.562) thousand cells per appendage were isolated from the appendage. Of these, mobility remained after an average of 693,750 (534375; 853125) spermatozoa were secreted. 1 month after testicular reduction in all series, a sharp decrease in both the total number and motile spermatozoa by 88-100% was revealed (Fig. 4). Moreover, with the introduction of biomaterial with CS of MSC in the VT, a slight increase in the total number of secreted spermatozoa was noted when compared with control experiments, while there were no differences with respect to motile cells. A different picture was observed 3 months after the cryptorchid testis was reduced. At this observation period, there was a significant increase in both the total number and motile spermatozoa with the introduction of biomaterial with CS of MSC in VT, and the largest increase in these indicators was obtained in the series using concentrated CS (Fig. 4).

Таким образом, предлагаемый в изобретении способ стимуляции сперматогенеза отличается безопасностью, которая достигается путем использования бесклеточных низкоиммуногенных компонентов и малотравматичной процедуры введения, и эффективностью, обеспечиваемой комплексным воздействием содержащихся в секретоме МСК факторов, необходимых для поддержания роста, повышения выживаемости и восстановления функции сперматогенных клеток, а также клеток, поддерживающих сперматогенез, комбинированных с коллагеном в качестве удобного биосовместимого носителя для формирования локального «депо» после введения под белочную оболочку яичка.Thus, the spermatogenesis stimulation method proposed in the invention is characterized by safety, which is achieved by using cell-free low-immunogenic components and a less traumatic administration procedure, and by the effectiveness provided by the combined action of the secretions of MSCs necessary for maintaining growth, increasing survival and restoring the function of spermatogenic cells, and also spermatogenesis supporting cells combined with collagen as a convenient biocompatibility an additional carrier for the formation of a local “depot” after administration under the testicle's white membrane.

Claims

1. A method of stimulating spermatogenesis, comprising introducing a biomaterial under the testicle containing a mixture of the active component and the base, where an air-conditioned medium containing the secretion products of multipotent human MSCs, including growth factors: GDNF at a concentration of not less than 50 pkg / ml, VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.3 pkg / ml, and collagen gel is used as the basis, while the mixture is administered in an amount that provides therapeutic e effect.

2. The method according to claim 1, characterized in that type I collagen is used as a collagen gel in the form of a 2-3% gel.

3. The method according to p. 1, characterized in that as collagen use collagen isolated from tissues of cattle, pigs or humans.

4. The method according to p. 1, characterized in that the mixing of the components is carried out at a temperature of 0-8 ° C.

5. The method according to p. 1, characterized in that the mixture is administered within 30 minutes after preparation.

6. The method according to p. 1, characterized in that the mixture further comprises fibronectin to a maximum final concentration of 0.3 mg / ml

7. The method according to p. 6, characterized in that the fibronectin in the mixture is contained in a concentration of 0.2-0.3 mg / ml

8. The method according to claim 1, characterized in that no more than 1 volume of conditioned medium is taken per volume of gel.

9. A method for producing a conditioned medium containing secretion products of multipotent human MSCs for stimulating spermatogenesis according to claim 1, comprising culturing human mesenchymal stromal cells (MSCs) up to passage 4-5 in an environment that supports the growth of undifferentiated human mesenchymal cells, washing the cells with buffer solution, conditioning MSCs in a serum-free and animal-free growth medium, selection of a culture medium containing the secretion products of human MSCs, purification of cell debris ok to obtain a conditioned medium containing secretion products of human MSCs, including key growth factors for spermatogenesis: GDNF at a concentration of at least 50 pkg / ml, VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.3 pkg / ml, determined by enzyme immunoassay.

10. The method according to p. 9, characterized in that they use MSCs of human adipose tissue.

11. The method according to p. 9, characterized in that the conditioning is carried out in culture bottles or Petri dishes (Corning or the like), wherein the human MSCs are placed on a flat substrate with a density of 5-15 * 10 ³ / cm ² in a conditioning medium in a volume of 0.1-0.2 ml / cm ² , then the culture containers with cells are placed for 6-8 days in a CO ₂ incubator at 37 ± 1 ° C, 5% CO ₂ and relative humidity ≥95%.

12. The method according to p. 9, characterized in that as a buffer solution for washing cells from the components of the growth medium using a Hanks solution (PanEco company or similar), while washing the cells is carried out by three to five-fold placement of cells in the said solution at a rate of 0, 1-0.2 ml of solution per cm ² cells for 5-10 minutes.

13. The method according to p. 9, characterized in that the medium for conditioning use DMEM with a low glucose content (HyClone, USA) or other growth medium that supports the viability of human MSCs for the entire period of conditioning.

14. The method according to p. 9, characterized in that the removal from the culture medium of the cell debris is carried out by centrifugation.

15. The method according to p. 14, characterized in that the centrifugation is carried out at 5000 ± 10 rpm, a temperature of 6 ± 2 ° C for 10 minutes to remove cell debris.

16. The method according to p. 9, characterized in that the conditioned medium is additionally concentrated 10-50 times using the ultrafiltration method.

17. The biomaterial for stimulating spermatogenesis by the method according to claim 1, which is a mixture of the active component and the base, where the conditioned component used is the conditioned medium obtained by the method according to claim 9 and containing human MSC secretion products, including growth factors: GDNF in concentration at least 50 pkg / ml, VEGF at a concentration of at least 200 pkg / ml, FGF basic at a concentration of at least 0.3 pkg / ml, and a collagen gel was used as the basis.

18. The biomaterial according to claim 17, characterized in that type I collagen is used as a collagen gel in the form of a 2-3% gel.

19. The biomaterial according to claim 17, characterized in that collagen is used as collagen isolated from tissues of cattle, pig or human.

20. The biomaterial according to claim 17, characterized in that the mixture further comprises fibronectin to a maximum final concentration of 0.3 mg / ml.

21. The biomaterial according to claim 20, characterized in that the fibronectin in the mixture is contained in a concentration of 0.2-0.3 mg / ml.

22. The biomaterial according to claim 17, characterized in that no more than 1 volume of conditioned medium is taken per volume of gel.