RU2652876C1 - Recombinant antibody specific to tumor nucleus factor and myeloid immune cell marker - Google Patents
Recombinant antibody specific to tumor nucleus factor and myeloid immune cell marker Download PDFInfo
- Publication number
- RU2652876C1 RU2652876C1 RU2016150445A RU2016150445A RU2652876C1 RU 2652876 C1 RU2652876 C1 RU 2652876C1 RU 2016150445 A RU2016150445 A RU 2016150445A RU 2016150445 A RU2016150445 A RU 2016150445A RU 2652876 C1 RU2652876 C1 RU 2652876C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tnf
- domain
- antibodies
- recombinant antibody
- cd11b
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
Abstract
Description
Изобретение относится к области иммунологии, а именно к выделенным биспецифическим аффинным реагентам, таким как антитела или фрагменты антител, которые связываются с фактором некроза опухоли (ФНО) и маркером молекул макрофагов и/или нейтрофилов, и может быть использовано для лечения аутоиммунных заболеваний, например, таких, как ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, псориаз и др.The invention relates to the field of immunology, namely to isolated bispecific affinity reagents, such as antibodies or antibody fragments that bind to tumor necrosis factor (TNF) and a marker of macrophage and / or neutrophil molecules, and can be used to treat autoimmune diseases, for example, such as rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, psoriasis, etc.
Открытие важной роли ФНО в патогенезе аутоиммунных заболеваний привело к разработке новых лекарственных средств, представляющих собой моноклональные антитела, блокирующие физиологическую активность этого цитокина.The discovery of the important role of TNF in the pathogenesis of autoimmune diseases has led to the development of new drugs, which are monoclonal antibodies that block the physiological activity of this cytokine.
Блокировка ФНО моноклональными терапевтическими антителами при таких аутоиммунных заболеваниях, как ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, болезнь Крона, псориаз и др., приводит к прерыванию порочного круга активации иммунной системы, эффективному контролю симптомов патологического воспалительного процесса, замедлению разрушения суставов и вызывает у пациентов стойкую ремиссию даже после отмены приема анти-ФНО препаратов.TNF blocking by monoclonal therapeutic antibodies in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, Crohn’s disease, psoriasis, etc., leads to an interruption of the vicious circle of activation of the immune system, effective control of the symptoms of the pathological inflammatory process, slowed joint destruction and causes stable remission in patients even after canceling anti-TNF drugs.
Хотя данные ингибиторы ФНО доказали свою эффективность в лечении аутоиммунных заболеваний, применение данных средств требует тщательной оценки соотношения польза/риск для конкретного больного. Это определяется частотой негативных последствий, таких как развитие множественного склероза, тромбоэмболии, инфекции верхних дыхательных путей, развитие латентных оппортунистических инфекций, в том числе туберкулеза, и т.д.Although these TNF inhibitors have proven effective in the treatment of autoimmune diseases, the use of these agents requires a careful assessment of the benefit / risk ratio for a particular patient. This is determined by the frequency of negative consequences, such as the development of multiple sclerosis, thromboembolism, upper respiratory tract infection, the development of latent opportunistic infections, including tuberculosis, etc.
Поэтому перед исследователями по-прежнему стоит задача поиска новых более эффективных технических решений для решения проблемы побочных эффектов ингибиторов и обеспечения минимального влияния на физиологические механизмы функционирования иммунной системы.Therefore, the researchers still face the challenge of finding new, more effective technical solutions to solve the problem of side effects of inhibitors and ensure minimal impact on the physiological mechanisms of the functioning of the immune system.
Одним из перспективных подходов в анти-ФНО терапии, потенциально позволяющим избежать большинства побочных эффектов, является применение антител, избирательно удерживающих этот цитокин на поверхности ФНО-продуцирующих клетки миелоидного ряда, не препятствуя при этом его высвобождению из других клеточных источников.One of the promising approaches to anti-TNF therapy, potentially avoiding most side effects, is the use of antibodies that selectively hold this cytokine on the surface of TNF-producing cells of the myeloid series, without interfering with its release from other cellular sources.
Известны технические решения по созданию антител, включающие использование неприродных биоинженерных белков на основе антител верблюдовых, в частности их единственного антиген-распознающего домена VHH, малый размер которых обеспечивает лучшее проникновение в ткани и позволяет узнавать необычные, «скрытые», для классических антител конформационные эпитопы.Known technical solutions for the creation of antibodies, including the use of non-natural bioengineered proteins based on camelid antibodies, in particular their only antigen-recognizing VHH domain, whose small size provides better penetration into tissues and allows recognition of unusual, “hidden” conformational epitopes for classical antibodies.
Примеры антител-специфичных к ФНО на основе VHH, отражены в следующих патентах: RU 2530553 С2, RU 2455312 С2.Examples of antibody-specific anti-TNF based on VHH are reflected in the following patents: RU 2530553 C2, RU 2455312 C2.
Однако данные антитела блокируют системный ФНО и по характеру действия сходны с препаратами, представляющими собой классические моноклональные антитела.However, these antibodies block systemic TNF and are similar in nature to drugs that are classic monoclonal antibodies.
Наиболее близким к заявляемому является техническое решение, выбранное авторами предлагаемого изобретения в качестве прототипа и описанное в заявке на выдачу патента (US 20150284460 А1, дата публикации 8.10.15 г.).Closest to the claimed is a technical solution selected by the authors of the invention as a prototype and described in the patent application (US 20150284460 A1, publication date 8.10.15,).
Изобретение-прототип относится к рекомбинантным биспецифическим аффинным реагентам, таким как антитела или фрагменты антител, которые связываются с ФНО и маркером молекул макрофагов и/или нейтрофилов.The prototype invention relates to recombinant bispecific affinity reagents, such as antibodies or antibody fragments that bind to TNF and a marker of macrophage and / or neutrophil molecules.
Использование биспецифических аффинных реагентов согласно изобретению позволяют нейтрализовать патогенную субпопуляцию ФНО, в то время как субпопуляция ФНО, выполняющая защитную функцию, не затрагивается.The use of the bispecific affinity reagents according to the invention makes it possible to neutralize the pathogenic subpopulation of TNF, while the subpopulation of TNF performing a protective function is not affected.
В заявке на патент, поставленной задачей является получение рекомбинантных биспецифических антител против ФНО и маркера иммунных клеток миелоидного ряда F4/80.In the patent application, the task is to obtain recombinant bespecifically antibodies against TNF and a marker of immune cells of the myeloid series F4 / 80.
При этом домен против ФНО представляет собой биоинженерный белок на основе антиген-распознающего домена верблюдовых VHH, а домен против F4/80 представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) классического антитела.Moreover, the anti-TNF domain is a bioengineered protein based on the antigen-recognizing domain of camelid VHH, and the anti-F4 / 80 domain is a single-chain variable fragment (scFv) of a classical antibody.
Основным недостатком прототипа является то, что маркер F4/80 характерен для клеток миелоидного ряда мышей, а у человека он экспрессируется лишь на эозинофилах, что ограничивает применение данного биспецифического антитела в лечении заболеваний человека.The main disadvantage of the prototype is that the F4 / 80 marker is characteristic of the cells of the myeloid series of mice, and in humans it is expressed only on eosinophils, which limits the use of this bispecific antibody in the treatment of human diseases.
Кроме этого, из-за своего относительно большого размера (~48 кДа) данный белок экспрессируется в бактериальных системах в малых количествах и преимущественно в нерастворимом виде.In addition, due to its relatively large size (~ 48 kDa), this protein is expressed in bacterial systems in small quantities and mainly in insoluble form.
Задачей, на решение которой направленно предлагаемое изобретение, является создание антител против ФНО и маркера иммунных клеток миелоидного ряда, способных нейтрализовать патогенную субпопуляцию ФНО при одновременном сохранении защитной популяции в организме человека.The task to which the invention is directed is the creation of antibodies against TNF and a marker of immune cells of the myeloid series, capable of neutralizing the pathogenic subpopulation of TNF while preserving the protective population in the human body.
Поставленная задача решается тем, что рекомбинантное биспецифическое антитело против ФНО и маркера иммунных клеток миелоидного ряда, содержащее биоинженерные белки на основе антиген-распознающего домена верблюдовых VHH, состоит из двух однодоменных антител, специфичных к ФНО и к гликопротеину CD11b, соединенных между собой белковым линкером. При этом домен специфичный к ФНО имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO. 1); домен, специфичный к маркеру иммунных клеток миелоидного ряда CD11b, имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO. 2); линкер имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO.3).The problem is solved in that a recombinant bispecific antibody against TNF and a marker of immune cells of the myeloid series containing bioengineered proteins based on the antigen-recognizing domain of camelid VHH consists of two single domain antibodies specific for TNF and to CD11b glycoprotein linked by a protein linker. Moreover, the domain specific to TNF has an amino acid sequence (SEQ ID NO. 1); the domain specific for the marker of immune cells of the myeloid series CD11b has the amino acid sequence (SEQ ID NO. 2); the linker has an amino acid sequence (SEQ ID NO.3).
Сущность изобретения состоит в том, что создано биспецифическое антитело, состоящее из двух однодоменных антител разной специфичности. Одно из этих антител способно специфично связываться с ФНО человека, блокируя его физиологическую активность (SEQ ID NO: 1), второе специфично связывается с гликопротеином CD11b, экспрессирующимся на поверхности миелоидных клеток (SEQ ID NO: 2). Антитела соединены между собой «жестким» линкером (SEQ ID NO. 3).The essence of the invention lies in the fact that a bispecific antibody is created consisting of two single-domain antibodies of different specificity. One of these antibodies is able to specifically bind to human TNF, blocking its physiological activity (SEQ ID NO: 1), the second specifically binds to CD11b glycoprotein expressed on the surface of myeloid cells (SEQ ID NO: 2). Antibodies are interconnected by a “rigid” linker (SEQ ID NO. 3).
Для этого однодоменное антитело VHH, специфично связывающееся с ФНО человека, имеет следующую аминокислотную последовательность:For this, a single-domain VHH antibody that specifically binds to human TNF has the following amino acid sequence:
Второе антитело, специфично связывающееся с гликопротеином CD11b, экспрессирующемся на поверхности миелоидных клеток, имеет следующую аминокислотную последовательность:The second antibody that specifically binds to the CD11b glycoprotein expressed on the surface of myeloid cells has the following amino acid sequence:
Линкер, связывающий антитела, имеет следующую аминокислотную последовательность:The antibody linker has the following amino acid sequence:
Перечень последовательностей представлен в таблице на Фиг. 1.The sequence listing is presented in the table in FIG. one.
Техническим результатом изобретения является уменьшение размера антитела в 2 раза и способность блокировать ФНО на клетках миелоидного ряда человека, включая моноциты и гранулоциты, и экспрессироваться в бактериальной системе в растворимом виде.The technical result of the invention is to reduce the size of the antibody by 2 times and the ability to block TNF on cells of the myeloid series of a person, including monocytes and granulocytes, and expressed in the bacterial system in a soluble form.
Новизна заявляемого изобретения подтверждается тем, что по доступной научной и практической информации для решения поставленной задачи предлагаемое техническое решение не использовалось, а так как предлагаемое решение обеспечивает наличие свойств, не совпадающих со свойствами известных решений, то оно обладает изобретательским уровнем.The novelty of the claimed invention is confirmed by the fact that according to available scientific and practical information, the proposed technical solution was not used to solve the problem, and since the proposed solution provides properties that do not match the properties of the known solutions, it has an inventive step.
Существенность отличительных признаков изобретения состоит в том, что достигается новый положительный эффект, а именно новые антитела имеют специфичность к маркеру человеческих клеток миелоидного ряда и характеризуются меньшим размером (~25 кДа).The significance of the distinguishing features of the invention lies in the fact that a new positive effect is achieved, namely, new antibodies have specificity for the marker of human cells of the myeloid series and are characterized by a smaller size (~ 25 kDa).
Созданное биспецифическое антитело способно распознавать ФНО на поверхности продуцирующих его человеческих клеток миелоидного ряда, удерживать его, блокируя его физиологическую активность, в то же время не препятствуя высвобождению ФНО, продуцируемого другими клеточными источниками, и, предположительно, играющих защитную роль.The created bispecific antibody is capable of recognizing TNF on the surface of the myeloid series of human cells producing it, retaining it, blocking its physiological activity, at the same time without interfering with the release of TNF produced by other cellular sources, and, presumably, playing a protective role.
Кроме этого, данное биспецифическое антитело успешно продуцируется в бактериальной системе экспрессии в растворимом виде.In addition, this bispecific antibody is successfully produced in the bacterial expression system in soluble form.
Научно-технический уровень изобретения обусловлен научно-исследовательскими опытными и экспериментальными работами по объединению двух однодоменных антител разной специфичности в одно, что потребовало:The scientific and technical level of the invention is due to scientific research and experimental work on combining two single-domain antibodies of different specificity into one, which required:
- проведения субклонирования;- carrying out subcloning;
- проведения генно-инженерных манипуляций с кодирующими последовательностями однодоменных антител с целью их эффективной наработки в бактериальной системе экспрессии и последующей эффективной очистки (в качестве продуцента действующего вещества использовали бактериальные культуры E.coli);- carrying out genetic engineering manipulations with coding sequences of single-domain antibodies with the aim of their effective production in the bacterial expression system and subsequent effective purification (bacterial cultures of E. coli were used as the producer of the active substance);
- выбора оптимального белкового линкера, связывающего две последовательности однодоменных антител;- selection of the optimal protein linker linking two sequences of single domain antibodies;
- разработки протокола получения биспецифического белка;- development of a protocol for the preparation of a bispecific protein;
- оценки функциональной характеристики полученного белка, включающей в себя оценку связывания биспецифического антитела с CD11b и ФНО и оценку его блокирующих свойств.- evaluation of the functional characteristics of the obtained protein, including the evaluation of the binding of a bispecific antibody to CD11b and TNF and the assessment of its blocking properties.
В результате было получено рекомбинантное биспецифическое антитело, решающее поставленную задачу.The result was a recombinant bispecific antibody that solves the problem.
Осуществление настоящего изобретенияThe implementation of the present invention
Стадия 1. Получение генетического конструкта биспецифического антитела, специфично связывающего CD11b и человеческий ФНО.
Методом полимеразной цепной реакции получены кДНК, кодирующие человеческий антиФНО и антиCD11b. В качестве матрицы используют синтетические последовательности, кодирующие искомые белки (SEQ ID NO. 1 и SEQ ID NO. 2 соответственно).Using polymerase chain reaction, cDNAs encoding human anti-TNF and anti-CD11b were obtained. As a matrix, synthetic sequences encoding the desired proteins are used (SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2, respectively).
кДНК, кодирующую анти-CD1lb, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции NcoI и NotI.cDNA encoding anti-CD1lb is treated with restriction endonucleases NcoI and NotI.
кДНК, кодирующую антитело против ФНО, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции NotI и XhoI.cDNA encoding an anti-TNF antibody is treated with NotI and XhoI restriction endonucleases.
Для клонирования используют вектор pET28b, обработанный рестриктазами NcoI и XhoI.For cloning, the vector pET28b treated with restriction enzymes NcoI and XhoI is used.
Т.о. получают конечную генетическую конструкцию следующей структуры: анти-CD1lb-линкер-анти-ФНО-гексагистидиновый модуль. Транскрипция мРНК, кодирующей «химерный» белок, находится под контролем Lac-оператора E.coli, промотора и терминатора бактериофага Т7.T.O. get the final genetic construct of the following structure: anti-CD1lb-linker-anti-TNF-hexahistidine module. Transcription of mRNA encoding a "chimeric" protein is controlled by the E. coli Lac operator, T7 bacteriophage promoter and terminator.
Стадия 2. Продукция биспецифических антител
Продукцию однодоменных антител проводят в Е. coli (штамм Rosetta 2 (DE3) pLysS). Экспрессию белка индуцируют добавлением 0,5 мМ индолил-бета-D-галактопиранозида и клетки инкубируют при интенсивном перемешивании в течение 6 часов при 25°C. Биспецифическое антитело выделяют из лизата бактериальных клеток с использованием металлхелатной хроматографии с помощью колонок Poly-Prep gravity-flow column (BioRad, Франция), содержащих смолу на сефарозной матрице, заряженную Со2+ (Invitrogen, кат. № R 90115).The production of single domain antibodies is carried out in E. coli (strain Rosetta 2 (DE3) pLysS). Protein expression is induced by the addition of 0.5 mM indolyl-beta-D-galactopyranoside and the cells are incubated with vigorous stirring for 6 hours at 25 ° C. A bispecific antibody was isolated from the bacterial cell lysate using metal chelate chromatography using Poly-Prep gravity-flow columns (BioRad, France) containing a Co2 + charged resin on a sepharose matrix (Invitrogen, Cat. No. R 90115).
Макрофаги, выделенные из бедренной кости гуманизированных по гену ФНО мышей линии 750huTNFKI, культивируют в течение 10 дней при температуре 37°C в СО2-инкубаторе на кондиционной среде клеток линии L929 (АТСС® CCL-1™). Затем в концентрации 100000 кл/мл клетки переносят в 96-луночные микропланшеты (Eppendorf, 30730127) и культивируют в течение суток. Затем в культуру макрофагов добавляют полученные биспецифические антитела в диапазоне концентраций от 2 пг/мл до 20 мг/мл, культивируют в течение 30 мин при температуре 37°C в присутствии 5% СО2. После этого культуру макрофагов отмывают от среды, содержащей биспецифические антитела, и добавляют к ней липополисахарид в концентрации 100 нг/мл. Затем культуру макрофагов культивируют в течение 4 часов при температуре 37°C в присутствии 5% СО2 и собирают надосадочную жидкость.Macrophages isolated from the femur of TNF gene humanized 750huTNFKI strain mice were cultured for 10 days at 37 ° C in a CO 2 incubator on conditioned medium of the L929 cell line (ATCC® CCL-1 ™). Then, at a concentration of 100,000 cells / ml, the cells were transferred to 96-well microplates (Eppendorf, 30730127) and cultured for 24 hours. Then, the obtained bispecific antibodies are added to the macrophage culture in the concentration range from 2 pg / ml to 20 mg / ml, cultured for 30 min at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 . After this, the macrophage culture is washed from a medium containing bispecific antibodies, and a lipopolysaccharide at a concentration of 100 ng / ml is added to it. Then the macrophage culture was cultured for 4 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 and the supernatant was collected.
Полученную в результате описанной процедуры надосадочную жидкость используют для оценки эффективности связывания ФНО на поверхности макрофагов биспецифическими антителами с помощью метода иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ проводят с помощью набора реагентов Human TNF alpha ELISA (Affymetrix, кат. №88-7346-88).The supernatant obtained as a result of the described procedure is used to evaluate the efficiency of TNF binding on the surface of macrophages with bispecific antibodies using enzyme-linked immunosorbent assay. Enzyme-linked immunosorbent assay is carried out using a set of reagents Human TNF alpha ELISA (Affymetrix, cat. No. 88-7346-88).
Эффективность нового рекомбинантного антитела подтверждена приводимыми ниже данными.The effectiveness of the new recombinant antibodies is confirmed by the following data.
На Фиг. 2 представлена электрофореграмма полиакриламидного геля с образцами. полученными в ходе очистки биспецифических антител (БАТ), по сравнению с прототипом, где М - маркер молекулярных масс; 1 - лизат клеточной биомассы; 2 - несвязавшаяся с колонкой фракция белков; 3 - очищенный биспецифический белок (растворимая фракция); 4 - очищенный прототип (растворимая фракция).In FIG. 2 shows an electrophoregram of a polyacrylamide gel with samples. obtained during the purification of bispecific antibodies (BAP), in comparison with the prototype, where M is a molecular weight marker; 1 - cell biomass lysate; 2 - protein fraction not bound to the column; 3 - purified bispecific protein (soluble fraction); 4 - purified prototype (soluble fraction).
Чистота полученных биспецифических антител составила более 95%.The purity of the bispecific antibodies obtained was more than 95%.
На Фиг. 3 представлены результаты иммуноферментного анализа, из которых следует, что созданное биспецифическое антитело эффективно связывается с макрофагами и блокирует высвобождение макрофагального ФНО.In FIG. 3 presents the results of an enzyme immunoassay, from which it follows that the created bispecific antibody effectively binds to macrophages and blocks the release of macrophage TNF.
Величина столбцов на чертеже соответствует количеству ФНО в образцах, рассчитанных согласно калибровочной кривой. ЛПС - высвобождение ФНО из макрофагов после стимуляции их липополисахаридом. ЛПС+БАТ - высвобождение ФНО из макрофагов после их стимуляции ЛПС и блокировки биспецифическим антителом. ЛПС+КАТ - высвобождение ФНО из макрофагов после их стимуляции ЛПС и блокировки контрольным антителом. В качестве контрольного антитела использовалось биспецифическое антитело, один домен которого связывается с белком, экспрессирующимся на поверхности макрофагов F4/80, а второй домен связывается с ФНО, не блокируя его физиологических функций.The size of the columns in the drawing corresponds to the number of TNF in the samples calculated according to the calibration curve. LPS is the release of TNF from macrophages after stimulation with their lipopolysaccharide. LPS + BAT - release of TNF from macrophages after their stimulation with LPS and blocking with a bispecific antibody. LPS + CAT — TNF release from macrophages after their stimulation with LPS and blocking with a control antibody. As a control antibody, a bispecific antibody was used, one domain of which binds to a protein expressed on the surface of F4 / 80 macrophages, and the second domain binds to TNF without blocking its physiological functions.
На Фиг. 4 представлены результаты оценки способности и эффективности блокировки человеческого ФНО in vitro на клетках линии WEHI 164, из которых следует, что разработанное биспецифическое антитело (5) способно блокировать биологическую активность человеческого ФНО более эффективно по сравнению с прототипом (6). В качестве контроля (7) были использованы контрольные антитела (КАТ).In FIG. 4 presents the results of evaluating the ability and efficiency of blocking human TNF in vitro on cells of the WEHI 164 line, from which it follows that the developed bispecific antibody (5) is able to block the biological activity of human TNF more efficiently in comparison with the prototype (6). As a control (7), control antibodies (CAT) were used.
Для оценки способности биспецифического антитела блокировать человеческий ФНО использовали колориметрический МТТ-тест на вторичной культуре эукариотических клеток мышиной фибросаркомы WEHI 164 (АТСС® CRL-1751™), чувствительной к ФНО человека, а также рекомбинантный ФНО человека, предоставленный лабораторией молекулярных механизмов иммунитета ИМБ им. Энгельгардта РАН (Москва).To assess the ability of a bispecific antibody to block human TNF, a MTT colorimetric test was used on a secondary culture of WEHI 164 mouse fibrosarcoma eukaryotic cells (ATCC® CRL-1751 ™) sensitive to human TNF and a recombinant human TNF provided by the Laboratory of Molecular Mechanisms of Immunity of IMB. Engelhardt RAS (Moscow).
Клетки WEHI 164 культивировали в концентрации 100000 кл/мл на 96-луночных микропланшетах (Eppendorf, 30730127), затем добавляли биспецифическое антитело в диапазоне концентраций от 10 пМ до 100 мМ с рекомбинантным человеческим ФНО в летальной концентрации, инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°C в присутствии 5% CO2. Количество погибших клеток оценивали колориметрически с помощью планшетного фотометра Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США) на длине волны 570 нм.WEHI 164 cells were cultured at a concentration of 100,000 cells / ml in 96-well microplates (Eppendorf, 30730127), then a bispecific antibody was added in a concentration range from 10 pM to 100 mM with recombinant human TNF in a lethal concentration, incubated for 24 hours at 37 ° C in the presence of 5% CO2. The number of dead cells was evaluated colorimetrically using a Multiskan FC flatbed photometer (Thermo Fisher Scientific, USA) at a wavelength of 570 nm.
На Фиг. 5 представлена диаграмма выживаемости экспериментальных животных в модели острой гепатотоксичности, индуцированной введением летальной дозы ЛПС (400 нг/г веса животного) и Д-галактозамина (800 мкг/г веса животного), где 8 - выживаемость мышей при введении физ. раствора; 9 - выживаемость мышей при введении 1,5 мкг/г веса БАТ; 10 - выживаемость мышей при введении 7,5 мкг/г веса БАТ; 11 - выживаемость мышей при введении 15 мкг/г веса БАТ. Из этих данных следует, что введение биспецифического антитела в дозе 15 мкг/г веса мыши обеспечивает 100% выживаемость животных.In FIG. Figure 5 shows the survival chart of experimental animals in the model of acute hepatotoxicity induced by the administration of a lethal dose of LPS (400 ng / g animal weight) and D-galactosamine (800 μg / g animal weight), where 8 is the survival of mice with the introduction of physical. solution; 9 - the survival of mice with the introduction of 1.5 μg / g weight BAT; 10 - the survival of mice with the introduction of 7.5 μg / g weight BAT; 11 - the survival of mice with the introduction of 15 μg / g weight BAT. From these data it follows that the introduction of bespecifically antibodies at a dose of 15 μg / g of mouse weight provides 100% survival of animals.
Эти данные свидетельствуют об эффективной блокировке ФНО биспецифическими антителами в концентрации 15 мкг/г веса.These data indicate effective blocking of TNF by bispecific antibodies at a concentration of 15 μg / g weight.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016150445A RU2652876C1 (en) | 2016-12-21 | 2016-12-21 | Recombinant antibody specific to tumor nucleus factor and myeloid immune cell marker |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016150445A RU2652876C1 (en) | 2016-12-21 | 2016-12-21 | Recombinant antibody specific to tumor nucleus factor and myeloid immune cell marker |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2652876C1 true RU2652876C1 (en) | 2018-05-03 |
Family
ID=62105573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016150445A RU2652876C1 (en) | 2016-12-21 | 2016-12-21 | Recombinant antibody specific to tumor nucleus factor and myeloid immune cell marker |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2652876C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757489C2 (en) * | 2015-06-12 | 2021-10-18 | Маккэй Медикл Фаундэйшн Зе Пресбайтериэн Чёч Ин Тайвэнь Маккэй Мемориал Хоспитэл | Methods and antibodies for immune response modulation |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100297111A1 (en) * | 2005-05-21 | 2010-11-25 | Els Anna Alice Beirnaert | Nanobodies against tumor necrosis factor-alpha |
| CN103333253A (en) * | 2013-06-14 | 2013-10-02 | 南京瑞必得生物科技有限公司 | Nano antibody fusion protein, and preparation method and application thereof |
| RU2012147173A (en) * | 2012-11-07 | 2014-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | RECOMBINANT SINGLE-DOMAIN ANTIBODY, ABLE TO SPECIFICALLY BIND HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR, AND ITS DERIVATIVES |
| US9371381B2 (en) * | 2002-11-08 | 2016-06-21 | Ablynx, N.V. | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor-alpha and uses therefor |
-
2016
- 2016-12-21 RU RU2016150445A patent/RU2652876C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9371381B2 (en) * | 2002-11-08 | 2016-06-21 | Ablynx, N.V. | Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor-alpha and uses therefor |
| US20100297111A1 (en) * | 2005-05-21 | 2010-11-25 | Els Anna Alice Beirnaert | Nanobodies against tumor necrosis factor-alpha |
| RU2012147173A (en) * | 2012-11-07 | 2014-05-20 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | RECOMBINANT SINGLE-DOMAIN ANTIBODY, ABLE TO SPECIFICALLY BIND HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR, AND ITS DERIVATIVES |
| CN103333253A (en) * | 2013-06-14 | 2013-10-02 | 南京瑞必得生物科技有限公司 | Nano antibody fusion protein, and preparation method and application thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| EFIMOV GA et al. "Cell-type-restricted anti-cytokine therapy: TNF inhibition from one pathogenic source" Proc Natl Acad Sci U S A, 15.03.2016; 113(11): 3006-11. MARTIN A ROSSOTTI et al. "Increasing the potency of neutralizing single-domain antibodies by functionalization with a CD11b/CD18 binding domain", MAbs. 2015 Sep-Oct; 7(5): 820-828. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2757489C2 (en) * | 2015-06-12 | 2021-10-18 | Маккэй Медикл Фаундэйшн Зе Пресбайтериэн Чёч Ин Тайвэнь Маккэй Мемориал Хоспитэл | Methods and antibodies for immune response modulation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bae et al. | Contradictory functions (activation/termination) of neutrophil proteinase 3 enzyme (PR3) in interleukin-33 biological activity | |
| MX2009002151A (en) | Antagonistic human light-specific human monoclonal antibodies. | |
| RU2010132647A (en) | ANTI-MIF ANTIBODIES | |
| JP2017518748A (en) | Specific binding polypeptides and uses thereof | |
| JP6974874B2 (en) | Peptides with high affinity for human PD-L1 protein and their use | |
| JP5462623B2 (en) | High affinity antagonist of ELR-CXC chemokine | |
| CN106957366A (en) | A kind of C5aR antibody and its preparation method and application | |
| Jonsson et al. | Generation of tumour‐necrosis‐factor‐α‐specific affibody 1 molecules capable of blocking receptor binding in vitro | |
| Hayashi et al. | Lupus antibodies to the HMGB1 chromosomal protein: epitope mapping and association with disease activity | |
| RU2652876C1 (en) | Recombinant antibody specific to tumor nucleus factor and myeloid immune cell marker | |
| Łupicka-Słowik et al. | Development of adenosine deaminase-specific IgY antibodies: Diagnostic and inhibitory application | |
| CA2371421A1 (en) | Method for inhibiting cell functioning for use in anti-inflammatory and anti-tumour therapies | |
| Fazekas-Singer et al. | AllergoOncology: Generating a canine anticancer IgE against the epidermal growth factor receptor | |
| Calderón-Pérez et al. | The Plasmodium falciparum translationally controlled tumor protein (TCTP) is incorporated more efficiently into B cells than its human homologue | |
| KR101934578B1 (en) | Fusion protein comprising Fc domain from mouse antibody linked to hagfish VLRB protein with deleted hydrophobic tail domain and uses thereof | |
| Wiegand et al. | Epitope Identification and Affinity Determination of an Inhibiting Human Antibody to Interleukin IL8 (CXCL8) by SPR-Biosensor–Mass Spectrometry Combination | |
| Moricoli et al. | Blocking monocyte transmigration in in vitro system by a human antibody scFv anti-CD99. Efficient large scale purification from periplasmic inclusion bodies in E. coli expression system | |
| CN113234152B (en) | Programmed death receptor-ligand 1 (PD-L1) specific binding polypeptide and application thereof | |
| Wang et al. | A human anti-toll like receptor 4 Fab fragment inhibits lipopolysaccharide-induced pro-inflammatory cytokines production in macrophages | |
| CN108300725A (en) | Soluble single-chain antibody super antigen fusion and albumen and its preparation and application | |
| KR20130121601A (en) | Human anti-cxcl-10 antibodis and rheumatoid arthritis-treating composition thereof | |
| Sadeghian-Rizi et al. | Optimization of anti-CXCL10 nanobody expression using response surface methodology and evaluation of its anti-metastatic effect on breast cancer cells | |
| JPWO2016159181A1 (en) | Peptide for immunization, method for producing immunity peptide, pharmaceutical composition for immune disease including the same, and method for treating immune disease | |
| Sato et al. | Novel TLR2xTLR4 bispecific antibody inhibits bacterial sepsis | |
| Feghhi-Najafabadi et al. | Recombinant production of a mutant form of soluble IL-6 receptor with inhibitory effects against interleukin-6 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201222 |