RU2651776C2 - Bispecific antibodies against cd3*cd19 - Google Patents
Bispecific antibodies against cd3*cd19 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2651776C2 RU2651776C2 RU2015151459A RU2015151459A RU2651776C2 RU 2651776 C2 RU2651776 C2 RU 2651776C2 RU 2015151459 A RU2015151459 A RU 2015151459A RU 2015151459 A RU2015151459 A RU 2015151459A RU 2651776 C2 RU2651776 C2 RU 2651776C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- cell
- igg2
- antibodies
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 15
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 13
- 208000037914 B-cell disorder Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 abstract description 33
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 23
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 22
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 19
- 229960003008 blinatumomab Drugs 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 5
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 5
- 241000251737 Raja Species 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 5
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 5
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 5
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940101815 blincyto Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032568 B-cell prolymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000023611 Burkitt leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100118093 Drosophila melanogaster eEF1alpha2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008297 Nuclear Matrix-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035916 Nuclear Matrix-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000035416 Prolymphocytic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101150058162 SGE1 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010050283 Tumour ulceration Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008228 bacteriostatic water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000018805 childhood acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000011633 childhood acute lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000011649 lymphoblastic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000007919 lymphoplasmacytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N methyl cyclopropanecarboxylate Chemical compound COC(=O)C1CC1 PKAHQJNJPDVTDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 239000013631 noncovalent dimer Substances 0.000 description 1
- 210000000299 nuclear matrix Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биспецифическим антителам против CD3*CD19, обладающим увеличенным временем полужизни в организме.The invention relates to biotechnology, in particular to bespecifically antibodies against CD3 * CD19, with an increased half-life in the body.
Биспецифические антитела (БАТ) против CD3*CD19 в настоящее время разрабатываются преимущественно для лечения злокачественных заболеваний B-клеток или истощения В-клеток, в том числе: неходжкинской лимфомы (WO 2010037835, RU 2228202), B-клеточного лейкоза (RU 2008129080), детской острой лимфобластической лейкемии (WO 20100052013) и т.д.Bispecific antibodies (BAPs) against CD3 * CD19 are currently being developed primarily for the treatment of malignant diseases of B cells or depletion of B cells, including non-Hodgkin’s lymphoma (WO 2010037835, RU 2228202), B-cell leukemia (RU 2008129080), childhood acute lymphoblastic leukemia (WO 20100052013), etc.
Ряд завершенных и проводимых в настоящее время исследований (например, J Clin Oncol, 2011, 29: 2493-8; Cancer, 2010, 116: 5568-74; Science, 2008, 321: 974-7; BLINCYTO, AmGen Recearch GmbH (NCT00560794, NCT00274742, NCT01207388, NCT01209286, NCT01471782, NCT01466179, NCT01741792); AFM11, Affimed Therapeutics AG (NCT02106091)) дают все основания полагать, что лекарственные препараты на основе биспецифических антител против CD3*CD19 обещают стать более эффективными в лечении упомянутых выше заболеваний.A number of studies completed and ongoing (e.g., J Clin Oncol, 2011, 29: 2493-8; Cancer, 2010, 116: 5568-74; Science, 2008, 321: 974-7; BLINCYTO, AmGen Recearch GmbH (NCT00560794 , NCT00274742, NCT01207388, NCT01209286, NCT01471782, NCT01466179, NCT01741792); AFM11, Affimed Therapeutics AG (NCT02106091)) give reason to believe that drugs based on bespecifically antibodies against CD3 * CD19 promise to become more effective in the treatment.
Повышенная эффективность объясняется тем, что БАТ выполняют функцию адаптеров, которые физически соединяют T-клетки с опухолевыми клетками и запускают мощный сигнальный каскад рецепторного комплекса T-клеток посредством связывания с инвариантным компонентом CD3 T-клеточного рецептора. При этом второй (целевой) антиген-специфичный фрагмент узнает CD19, т.е. БАТ может соединить T-клетку и раковую клетку за счет одновременного связывания с CD3 и антигеном-мишенью. В этом случае происходит активация и пролиферация T-клеток, образование цитолитического синапса с высвобождением цитотоксических гранул и секреция цитокинов. Направленный лизис раковых клеток включает в себя перфорацию мембраны клетки-мишени с участием перфорина и последующий апоптоз, индуцированный гранзимами. Следует отметить, что после связывания с T-клетками, БАТ распознают антигены на поверхности раковой клетки так же, как обычные моноспецифические антитела. Таким образом, удается перенаправить цитотоксическую функцию T-клеток против опухолевых клеток, причем активность БАТ наблюдается уже при относительно низких (пикомолярных) концентрациях. Связывание же БАТ только с T-клеткой в отсутствие клетки-мишени не вызывает T-клеточную активацию.The increased efficiency is explained by the fact that BAPs act as adapters that physically connect T-cells to tumor cells and trigger a powerful signaling cascade of the T-cell receptor complex by binding to the invariant component of the CD3 T-cell receptor. In this case, the second (target) antigen-specific fragment recognizes CD19, i.e. BAP can connect a T cell and a cancer cell by simultaneously binding to CD3 and the target antigen. In this case, the activation and proliferation of T cells, the formation of a cytolytic synapse with the release of cytotoxic granules, and the secretion of cytokines occur. Targeted lysis of cancer cells includes perforation of the target cell membrane involving perforin and subsequent granzyme-induced apoptosis. It should be noted that after binding to T cells, BAPs recognize antigens on the surface of the cancer cell in the same way as conventional monospecific antibodies. Thus, it is possible to redirect the cytotoxic function of T cells against tumor cells, and BAP activity is already observed at relatively low (picomolar) concentrations. Binding of BAT only to a T cell in the absence of a target cell does not cause T cell activation.
Примеры биспецифических антител, известных из уровня техники (Blood, (ASH Annual Meeting Abstracts), 2009, 114:840), свидетельствуют о том, что эффективная терапевтическая концентрация препаратов, полученных на основе использования мультивалентных антител, существенно ниже по сравнению с классическими антительными противораковыми препаратами. Это способствует хорошей переносимости, возможности осуществления длительных курсов лечения и уменьшению риска побочных эффектов. Кроме того, требуемый объем и стоимость производства биспецифических антител ниже. Поэтому создание таких антител позволит существенно сократить масштабы и расходы на производство препаратов на их основе и, что самое главное, сделать эти лекарства доступными для всех пациентов, нуждающихся в подобной терапии.Examples of bispecific antibodies known from the prior art (Blood, (ASH Annual Meeting Abstracts), 2009, 114: 840) indicate that the effective therapeutic concentration of drugs derived from the use of multivalent antibodies is significantly lower compared to classic anti-cancer antibodies drugs. This contributes to good tolerance, the possibility of implementing long-term courses of treatment and reducing the risk of side effects. In addition, the required volume and production cost of bespecifically antibodies is lower. Therefore, the creation of such antibodies will significantly reduce the scale and cost of producing drugs based on them and, most importantly, make these drugs available to all patients in need of such therapy.
В настоящее время было разработано и получено довольно много биспецифических антител против CD3*CD19. Однако наиболее перспективные из них представляют собой одноцепочечные молекулы как таковые, или нековалентные димеры, состоящие из одноцепочечных молекул. Например, блинатомумаб (антитело формата BiTE).At present, quite a few bispecific antibodies against CD3 * CD19 have been developed and obtained. However, the most promising of them are single-chain molecules as such, or non-covalent dimers consisting of single-chain molecules. For example, blinatomumab (BiTE format antibody).
Однако при производстве одноцепочечных антител могут образовываться гомо- и гетеродимеры, что приводит к усложнению процесса выделения и очистки таких антител. С другой стороны, возможен обратный процесс - нежелательная диссоциация димеров, как это было показано, например, в статье Glockshuber et al., Biochemistry, 1990, vol. 29:1362-1367. Чтобы избежать этого, были предложены антитела, стабилизированные дисульфидными связями (Cell Oncol. (2012), 35:423-434), что позволило повысить как стабильность антитела в растворе, так и терапевтическую эффективность в сравнении с одноцепочечным антителом.However, in the production of single chain antibodies, homo- and heterodimers can be formed, which complicates the process of isolation and purification of such antibodies. On the other hand, the opposite process is possible — undesired dissociation of dimers, as was shown, for example, in Glockshuber et al., Biochemistry, 1990, vol. 29: 1362-1367. To avoid this, antibodies stabilized by disulfide bonds have been proposed (Cell Oncol. (2012), 35: 423-434), which made it possible to increase both the stability of the antibody in solution and therapeutic efficacy in comparison with a single chain antibody.
Наиболее близкими по формату, предложенному в настоящем изобретении, являются одноцепочечные антитела, раскрытые в патенте US 6759518. Указанные антитела состоят из двух пар вариабельных доменов различных специфичностей (A и B), разделенных пептидом из 12-40 аминокислот и, необязательно, содержат дополнительный эффекторный домен, представляющий собой пролекарство, активирующее фермент.The closest to the format proposed in the present invention are the single-chain antibodies disclosed in US patent 6759518. These antibodies consist of two pairs of variable domains of different specificities (A and B), separated by a peptide of 12-40 amino acids and, optionally, contain additional effector an enzyme activating prodrug domain.
Однако такие антитела сохраняют указанные выше недостатки одноцепочечных антител, а наличие достаточно длинного пептида создает дополнительные степени свободы для вариабельных доменов, и, тем самым, может приводить к образованию мультимеров, что нежелательно. Кроме того, патент не содержит никакой информации о возможности получения антител против CD3*CD19 указанного типа.However, such antibodies retain the aforementioned disadvantages of single-chain antibodies, and the presence of a sufficiently long peptide creates additional degrees of freedom for variable domains, and, thus, can lead to the formation of multimers, which is undesirable. In addition, the patent does not contain any information about the possibility of obtaining antibodies against CD3 * CD19 of the specified type.
В настоящее время наиболее успешным антителом против CD3*CD19 является препарат блинатумомаб (Blincyto, MT103), поэтому именно это антитело было выбрано в качестве препарата сравнения. Блинатумомаб состоит из двух доменов: домена анти-CD19 scFv из гибридомы HD37 и домена анти-CD3 scFv из гибридомы OKT3. Для получения антитела фрагмент ДНК VLCD19-VHCD19-VHCD3-VLCD3 экспрессируют в DHFR-отрицательных СНО клетках (патент RU 2228202). Блинатумомаб, в сравнении с полноразмерными антителами, имеет относительно небольшую молекулярную массу (55 кДа против 155 кДа), из-за чего быстро элиминируется из кровотока. Поэтому для достижения стабильных концентраций препарата в крови используется непрерывное внутривенное введение препарата в течение 2-4 недель за один цикл (в режиме две недели - капельница, две недели - перерыв), что достаточно трудно переносимо для пациента.Currently, the most successful anti-CD3 * CD19 antibody is BlincytoMab (Blincyto, MT103), which is why this antibody was chosen as the reference drug. Blinatumomab consists of two domains: the anti-CD19 scFv domain from the HD37 hybridoma and the anti-CD3 scFv domain from the OKT3 hybridoma. To obtain antibodies, the VLCD19-VHCD19-VHCD3-VLCD3 DNA fragment is expressed in DHFR-negative CHO cells (patent RU 2228202). Blinatumomab, in comparison with full-sized antibodies, has a relatively small molecular weight (55 kDa versus 155 kDa), which is why it is rapidly eliminated from the bloodstream. Therefore, to achieve stable concentrations of the drug in the blood, continuous intravenous administration of the drug is used for 2-4 weeks per cycle (in a two-week regimen - an dropper, two weeks - a break), which is quite difficult for the patient to tolerate.
Задачей настоящего изобретения было получение антител против CD3*CD19 с увеличенным временем полужизни в организме человека, повышенной биодоступностью при подкожном введении, обладающих при этом достаточной эффективностью для применения в качестве лекарственных средств.The objective of the present invention was to obtain antibodies against CD3 * CD19 with increased half-life in the human body, increased bioavailability with subcutaneous administration, while having sufficient efficacy for use as drugs.
Таким образом, техническим результатом настоящего изобретения является расширение арсенала биспецифических антител против CD3*CD19 за счет создания антител, обладающих одной или несколькими из указанных выше характеристик.Thus, the technical result of the present invention is the expansion of the arsenal of bespecifically antibodies against CD3 * CD19 due to the creation of antibodies with one or more of the above characteristics.
Работа коллектива авторов настоящего изобретения над улучшением фармакокинетических характеристик антител против CD3*CD19 привела к созданию новой конструкции антитела, представляющей собой биспецифическую двуцепочечную молекулу, каждая цепь которой содержит Fc-часть обычного IgG и четыре связывающих домена, соединенных линкерами и расположенных в следующем порядке от N-конца к C-концу (см. Фиг. 1): VL(CD3)-L1-VH(CD19)-L2-VL(CD19)-L3-VH(CD3)-H-CH2-CH3(IgG2), гдеThe work of the team of the authors of the present invention to improve the pharmacokinetic characteristics of antibodies against CD3 * CD19 has led to the creation of a new antibody design, which is a bispecific double-stranded molecule, each chain of which contains the Fc part of normal IgG and four binding domains connected by linkers and arranged in the following order from N -end to the C-terminus (see Fig. 1): VL (CD3) -L1-VH (CD19) -L2-VL (CD19) -L3-VH (CD3) -H-CH2-CH3 (IgG2), where
VL(CD3), VL(CD19), VH(CD3) и VH(CD19) представляют собой вариабельные домены легкой и тяжелой цепей антител против CD3 и CD19 соответственно,VL (CD3), VL (CD19), VH (CD3) and VH (CD19) are the variable domains of the light and heavy chains of antibodies against CD3 and CD19, respectively,
L1, L2, L3 - линкерные последовательности,L1, L2, L3 - linker sequences,
H - шарнирная область иммуноглобулина IgG2 иH is the hinge region of IgG2 immunoglobulin and
CH2-CH3 (IgG2) - константная область Fc-домена иммуноглобулина IgG2. Две цепи соединены дисульфидными связями.CH2-CH3 (IgG2) is the constant region of the Fc domain of IgG2 immunoglobulin. The two chains are connected by disulfide bonds.
Обнаружилось, что такие биспецифические молекулы не только характеризуются увеличенным временем полужизни в организме в сравнении с антителом блинатомумаб (MT-103) за счет увеличенного размера самой молекулы, но также обладают усиленным цитотоксическим эффектом и неожиданно высокой биодоступностью при подкожном введении на уровне 60%. Последняя характеристика особенно важна, поскольку до настоящего времени, из-за малой биодоступности, препараты антител вводились преимущественно внутривенным путем, который более сложен и менее комфортен для пациента. Увеличенное время полувыведения, высокие эффективность и биодоступность при подкожном введении позволят уменьшить частоту введения препарата и увеличить удобство его применения.It was found that such bispecific molecules are not only characterized by an increased half-life in the body compared to the blinatomumab antibody (MT-103) due to the increased size of the molecule itself, but also have an enhanced cytotoxic effect and unexpectedly high bioavailability when administered subcutaneously at 60%. The latter characteristic is especially important, since until now, due to the low bioavailability, antibody preparations have been administered mainly via the intravenous route, which is more complex and less comfortable for the patient. The increased half-life, high efficiency and bioavailability with subcutaneous administration will reduce the frequency of administration of the drug and increase the convenience of its use.
В качестве линкеров могут быть использованы последовательности, состоящие из 5-15 аминокислот. Такая длина линкера, как подтвердили наши исследования, является наиболее оптимальной, так как позволяет вариабельным доменам антитела сохранять стабильную структуру и при этом достаточную подвижность. Полученные данные согласуются с результатами, представленными, например, в патентах RU 2228202 и US 6759518 для биспецифических одноцепочечных антител, где упоминается о длинах линкеров в 1-15 и 1-20 аминокислот, соответственно, при этом оптимальными считаются линкеры в 1-5 аминокислот.As linkers can be used sequences consisting of 5-15 amino acids. This length of the linker, as our studies have confirmed, is the most optimal, since it allows the variable domains of the antibody to maintain a stable structure and at the same time sufficient mobility. The data obtained are consistent with the results presented, for example, in patents RU 2228202 and US 6759518 for bispecific single chain antibodies, where linker lengths of 1-15 and 1-20 amino acids are mentioned, respectively, while linkers of 1-5 amino acids are considered optimal.
Предпочтительно, чтобы аминокислоты, входящие в состав линкерной последовательности предложенных антител, выбирались из глицина, серина или аланина, или включали триплеты, составленные из указанных аминокислот. Предпочтительно, чтобы линкеры имели следующую структуру:Preferably, the amino acids that make up the linker sequence of the proposed antibodies are selected from glycine, serine or alanine, or include triplets composed of these amino acids. It is preferred that the linkers have the following structure:
L1: (XXS)k, где k=2-3,L1: (XXS) k, where k = 2-3,
L2: (XXS)n, где n=4-5,L2: (XXS) n, where n = 4-5,
L3: (XXS)m, где m=2-3,L3: (XXS) m, where m = 2-3,
X=G, А.X = G, A.
Наиболее предпочтительно:Most preferably:
L1: GGSGGS,L1: GGSGGS,
L2: GGSGGSGGSGGSGGS,L2: GGSGGSGGSGGSGGS,
L3: GGSGGS.L3: GGSGGS.
Настоящее изобретение также решает задачу конструирования плазмидной ДНК, содержащей последовательность биспецифического антитела предложенного формата, например, антитела GNR-047 против CD3*CD19, подходящей для экспрессии в клетках млекопитающих.The present invention also solves the problem of constructing plasmid DNA containing a sequence of a bispecific antibody of the proposed format, for example, an anti-CD3 * CD19 antibody GNR-047 suitable for expression in mammalian cells.
Поставленная задача решается за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pRA1451 размером 11308 п.о., кодирующей антитело GNR-047, а также подбора оптимальных условий производственного процесса, позволяющих получать антитела в клетках млекопитающих со стабильно высоким выходом, достаточным для промышленного производства.The problem is solved by constructing recombinant plasmid DNA pRA1451 with a size of 11308 bp encoding the GNR-047 antibody, as well as by selecting the optimal conditions for the production process, allowing to obtain antibodies in mammalian cells with a stably high yield, sufficient for industrial production.
Еще одним объектом изобретения является фармацевтическая композиция, в качестве активного компонента содержащая эффективное количество антитела против CD3*CD19, предложенного формата, предпочтительно, антитела GNR-047, а также применение такого антитела или фармацевтической композиции для лечения B-клеточных заболеваний, истощения В-клеток или замедления развития патологических состояний, ассоциированных с B-клеточными нарушениями. Предпочтительно, композиция содержит 10-100 мкг антитела.Another object of the invention is a pharmaceutical composition containing as an active component an effective amount of an anti-CD3 * CD19 antibody of the proposed format, preferably GNR-047, as well as the use of such an antibody or pharmaceutical composition for the treatment of B-cell diseases, depletion of B-cells or slowing the development of pathological conditions associated with B-cell disorders. Preferably, the composition contains 10-100 μg of antibody.
Фармацевтические композиции по изобретению могут также включать необходимые компоненты, обычно используемые в фармацевтической химии, такие как буфер, поверхностно-активное вещество, стабилизатор и другие фармацевтически приемлемые добавки, растворители и наполнители.The pharmaceutical compositions of the invention may also include necessary components commonly used in pharmaceutical chemistry, such as a buffer, a surfactant, a stabilizer, and other pharmaceutically acceptable additives, solvents, and excipients.
Наиболее предпочтительным является использование следующих компонентов: натрий-фосфатный буфер, полисорбат 80 в качестве поверхностно-активного вещества, маннит - в качестве изотонического агента и гистидин - в качестве стабилизатора.Most preferred is the use of the following components: sodium phosphate buffer,
Фармацевтические композиции по изобретению, предназначенные для парентерального введения, дополнительно могут включать изотонические агенты, например, различные сахара, а также дополнительные стабилизаторы, например, аминокислоты, такие как аргинин, глицин, метионин, а также фармакологически совместимые консерванты и прочие целевые добавки, как это показано, например, в «Handbook of Pharmaceutical Excipients» (2ʺd ed. London: The Pharmaceutical Press; 1994).The pharmaceutical compositions of the invention intended for parenteral administration may further include isotonic agents, for example, various sugars, as well as additional stabilizers, for example, amino acids such as arginine, glycine, methionine, as well as pharmacologically compatible preservatives and other targeted additives, such as shown, for example, in the Handbook of Pharmaceutical Excipients (2 ed. London: The Pharmaceutical Press; 1994).
Фармацевтические композиции по изобретению также могут быть получены в лиофилизированной форме, и в этом случае дополнительно включать фармацевтически приемлемые растворители и разбавители, например воду, физиологический раствор и другие обычно применяемые растворители.The pharmaceutical compositions of the invention can also be prepared in lyophilized form, and in this case further include pharmaceutically acceptable solvents and diluents, for example water, saline and other commonly used solvents.
Указанные эксципиенты могут использоваться в комбинации с другими активными ингредиентами (например, противораковыми или противовоспалительными средствами) при условии, что они не вызывают нежелательных эффектов.These excipients can be used in combination with other active ingredients (for example, anti-cancer or anti-inflammatory drugs), provided that they do not cause unwanted effects.
Дозировка фармацевтических композиций по изобретению у пациентов может корректироваться в зависимости от веса, возраста, пола больного и наличия сопутствующих заболеваний.The dosage of the pharmaceutical compositions of the invention in patients can be adjusted depending on the weight, age, gender of the patient and the presence of concomitant diseases.
Механизм действия предложенного антитела против CD3*CD19 аналогичен таковому, описанному для анти-CD3/анти-CD19 антитела - препарата блинатумомаб (MT103); и заключается в активации мультиспецифичного T-клеточного цитологического ответа против CD19+ клеток лимфомы. Поэтому фармацевтические композиции на основе антител предложенного формата против CD3*CD19, например на основе антитела GNR-047, согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения всех гематологических раковых заболеваний (лимфом и лейкозов) B-клеточной природы, например, таких как B-клеточные опухоли из предшественников В-лимфоцитов, в том числе: B-лимфобластная лимфома/B-клеточный острый лимфобластный лейкоз из клеток-предшественников; B-клеточные опухоли из периферических (зрелых) B-лимфоцитов, в том числе: B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/лимфома из малых лимфоцитов (лимфоцитарная лимфома); B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз; лимфоплазмоцитарная лимфома; селезеночная лимфома маргинальной зоны; волосатоклеточный лейкоз; плазмоклеточная миелома/плазмоцитома; экстранодальная B-клеточная лимфома маргинальной зоны MALT-типа; нодальная B-клеточная лимфома маргинальной зоны; фолликулярная лимфома; лимфома из клеток мантийной зоны; диффузная B-крупноклеточная лимфома; медиастинальная диффузная B-крупноклеточная лимфома; первичная экссудативная лимфома; лимфома/лейкоз Беркитта, а также для лечения аутоиммунных заболеваний, вызванных патологической регуляцией B-клеток, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, гломерулонефрит, рассеянный склероз и миастения гравис.The mechanism of action of the proposed anti-CD3 * CD19 antibody is similar to that described for the anti-CD3 / anti-CD19 antibody, Blinatumomab preparation (MT103); and consists in the activation of a multispecific T-cell cytological response against CD19 + lymphoma cells. Therefore, pharmaceutical compositions based on antibodies of the proposed anti-CD3 * CD19 format, for example, based on the GNR-047 antibody, according to the present invention can be used to treat all hematological cancers (lymphomas and leukemia) of a B-cell nature, for example, such as B-cell tumors from precursors of B-lymphocytes, including: B-lymphoblastic lymphoma / B-cell acute lymphoblastic leukemia from progenitor cells; B-cell tumors from peripheral (mature) B-lymphocytes, including: B-cell chronic lymphocytic leukemia / lymphoma from small lymphocytes (lymphocytic lymphoma); B-cell prolymphocytic leukemia; lymphoplasmacytic lymphoma; splenic lymphoma of the marginal zone; hairy cell leukemia; plasma cell myeloma / plasmacytoma; extranodal B-cell lymphoma of the marginal zone of the MALT type; nodal B-cell lymphoma of the marginal zone; follicular lymphoma; mantle cell lymphoma; diffuse B-large cell lymphoma; mediastinal diffuse B-large cell lymphoma; primary exudative lymphoma; Burkitt’s lymphoma / leukemia, as well as for the treatment of autoimmune diseases caused by pathological regulation of B-cells, such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, glomerulonephritis, multiple sclerosis and myasthenia gravis.
Описание фигурDescription of figures
Фиг. 1. Схематическое представление конструкции антитела GNR-047.FIG. 1. Schematic representation of the design of the GNR-047 antibody.
Фиг. 2. Схема конструирования экспрессионного вектора.FIG. 2. Scheme for constructing an expression vector.
Фиг. 3. Карта экспрессионного вектора pRA1451.FIG. 3. Map of the expression vector pRA1451.
Фиг. 4. Анализ способности препарата GNR-047 и MT-103 связывать нативный рецептор CD3 на клеточной линии Jurkat и рецептор CD19 на клеточной линии Raji.FIG. 4. Analysis of the ability of the drug GNR-047 and MT-103 to bind the native CD3 receptor on the Jurkat cell line and CD19 receptor on the Raji cell line.
Фиг. 5а. Исследование фармакокинетических характеристик GNR-047 при внутривенном введении в дозировке 0,5 мг/кг.FIG. 5a. Study of the pharmacokinetic characteristics of GNR-047 when administered intravenously at a dose of 0.5 mg / kg.
Фиг. 5б. Исследование фармакокинетических характеристик MT-103 при внутривенном введении в дозировке 0,5 мг/кг.FIG. 5 B. Study of the pharmacokinetic characteristics of MT-103 when administered intravenously at a dose of 0.5 mg / kg.
Фиг. 6а. Исследование фармакокинетических характеристик GNR-047 при подкожном введении в дозировке 2,0 мг/кг.FIG. 6a. A study of the pharmacokinetic characteristics of GNR-047 when administered subcutaneously at a dose of 2.0 mg / kg.
Фиг. 6б. Исследование фармакокинетических характеристик MT-103 при подкожном введении в дозировке 2,0 мг/кг.FIG. 6b. Study of the pharmacokinetic characteristics of MT-103 when administered subcutaneously at a dose of 2.0 mg / kg.
Фиг. 7. Изменение среднего объема опухоли в процессе исследованияFIG. 7. Change in the average tumor volume during the study
Описание последовательностейDescription of sequences
SEQ ID №1 - аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи анти-CD3 антитела,SEQ ID No. 1 - amino acid sequence of the variable domain of the light chain of anti-CD3 antibodies,
SEQ ID №2 - аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи анти-CD3 антитела,SEQ ID No. 2 - amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of anti-CD3 antibodies,
SEQ ID №3 - аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи анти-CD19 антитела,SEQ ID No. 3 - amino acid sequence of the variable domain of the light chain of anti-CD19 antibodies,
SEQ ID №4 - аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи анти-CD19 антитела,SEQ ID No. 4 - amino acid sequence of the variable domain of the heavy chain of anti-CD19 antibodies,
SEQ ID №5 - аминокислотная последовательность константного домена CH2 CH3 IgG2,SEQ ID No. 5 - amino acid sequence of the constant domain of CH2 CH3 IgG2,
SEQ ID №6 - предпочтительная аминокислотная последовательность линкера L1,SEQ ID No. 6 - preferred amino acid sequence of the linker L1,
SEQ ID №7 - предпочтительная аминокислотная последовательность линкера L2,SEQ ID No. 7 is the preferred amino acid sequence of the linker L2,
SEQ ID №8 - предпочтительная аминокислотная последовательность линкера L3,SEQ ID No. 8 is the preferred amino acid sequence of the linker L3,
SEQ ID №9 - аминокислотная последовательность шарнирной области H,SEQ ID No. 9 - amino acid sequence of the hinge region H,
SEQ ID №10 - аминокислотная последовательность антитела GNR-047.SEQ ID No. 10 is the amino acid sequence of the GNR-047 antibody.
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение антитела против CD3*CD19Example 1. Obtaining antibodies against CD3 * CD19
Конструирование рекомбинантных плазмидных ДНКConstruction of recombinant plasmid DNA
Для клонирования были выбраны коммерчески доступный вектор фирмы Selexis, содержащий генетический элемент SGE1, способствующий усилению экспрессии в результате непосредственной близости целевого трансгена с высокоактивным ядерным транскрипционным комплексом.For cloning, a commercially available Selexis vector containing the SGE1 genetic element was selected to enhance expression as a result of the close proximity of the target transgene with a highly active nuclear transcription complex.
Ген GNR-047 был сконструирован в результате отжига перекрывающихся химически синтезированных олигонуклеотидов. Последовательность целевого гена GNR-047 была клонирована в коммерчески доступный вектор pUC19, в результате чего был получен вектор pAPG_GNR047, который использовали для дальнейшей работы. После обработки вектора pAPG_GNR047 эндодезоксирибонуклеазами рестрикции HindIII, XbaI (New Ingland Biolabs), образующими липкие концы, выделяли фрагмент размером 2235 п.о., который затем лигировали с линеаризованным по сайтам HindIII и XbaI экспрессионным вектором pST101. Полученная плазмида pRA1451 была верифицирована рестрикционным картированием. Схема конструирования экспрессионного вектора pRA1451 приведена на Фиг. 2.The GNR-047 gene was constructed by annealing overlapping chemically synthesized oligonucleotides. The sequence of the target gene GNR-047 was cloned into the commercially available vector pUC19, whereby the vector pAPG_GNR047 was obtained, which was used for further work. After processing the vector pAPG_GNR047 with HindIII, XbaI (New Ingland Biolabs) restriction endodesoxyribonucleases forming sticky ends, a 2235 bp fragment was isolated, which was then ligated to the HindIII and XbaI sites linearized with expression vector pST101. The resulting plasmid pRA1451 was verified by restriction mapping. The construction scheme of the expression vector pRA1451 is shown in FIG. 2.
После этого проводили последовательную двойную трансфекцию с последующей селекцией по резистентности к пуромицину с использованием стандартных методов.After that, sequential double transfection was carried out, followed by selection for puromycin resistance using standard methods.
Полученная плазмида pRA1451, кодирующая полипептид GNR-047, характеризуется следующими признаками:The resulting plasmid pRA1451 encoding the GNR-047 polypeptide is characterized by the following features:
- состоит из 11308 и.о.,- consists of 11308 acting,
- имеет молекулярную массу 6.99 МДа,- has a molecular weight of 6.99 MDa,
- кодирует полипептид биспецифического антитела против CD3*CD19, GNR-047,- encodes a polypeptide bespecifically antibodies against CD3 * CD19, GNR-047,
- обеспечивает устойчивость клеток млекопитающих, трансфицированных указанной плазмидой, к пуромицину;- provides resistance of mammalian cells transfected with the indicated plasmid to puromycin;
- содержит следующие элементы:- contains the following elements:
- CMVe/EF1a pro - энхансер вируса CMV и промотор транскрипции гена фактора элонгации альфа,- CMVe / EF1a pro - enhancer of the CMV virus and promoter of transcription of the gene for elongation factor alpha,
- BGH pA - сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста,- BGH pA - signal polyadenylation of bovine growth hormone,
- sv40 enh - энхансер вируса SV40,- sv40 enh - enhancer of the SV40 virus,
- SGE 1 - элемент прикрепления к ядерному матриксу,- SGE 1 - element of attachment to the nuclear matrix,
- Amp - ген β-лактамазы,- Amp - β-lactamase gene,
- sv40 pro - промотор вируса SV40,- sv40 pro - SV40 virus promoter,
- puro - ген устойчивости к пуромицину,- puro - puromycin resistance gene,
- pA - синтетический сигнал полиаденилирования.- pA is a synthetic polyadenylation signal.
- содержит уникальные участки узнавания следующих эндонуклеаз рестрикции: AccI (6490 п.о.), AgeI (460 п.о.), ApaI (995 п.о.), BmgBI (3270 п.о.), BsmI (7269 п.о.), EcoRV (6457 п.о.), HindIII (1590 п.о.), NotI (11146 п.о.), PfoI (11021 п.о.), Pm1I (5699 п.о.), SpeI (4622 п.о.), SwaI (6466 п.о.), Tth111I (10585 п.о.).- contains unique recognition sites for the following restriction endonucleases: AccI (6490 bp), AgeI (460 bp), ApaI (995 bp), BmgBI (3270 bp), BsmI (7269 bp) bp), EcoRV (6457 bp), HindIII (1590 bp), NotI (11146 bp), PfoI (11021 bp), Pm1I (5699 bp), SpeI (4622 bp), SwaI (6466 bp), Tth111I (10585 bp).
Генетическая конструкция экспрессионного вектора приведена на фиг. 3.The genetic construction of the expression vector is shown in FIG. 3.
Трансфекцию проводили с использованием коммерчески доступного штамма CHO-M (Selexis). Выбор линии клеток-продуцентов обусловлен необходимостью формирования оптимального профиля гликозилирования при синтезе человеческих белков, а также их стабильностью, безопасностью и возможностью применения суспензионных условий культивирования данной линии клеток, что является важнейшими параметрами для производства терапевтических антител.Transfection was performed using a commercially available strain of CHO-M (Selexis). The selection of the producer cell line is due to the need to form an optimal glycosylation profile in the synthesis of human proteins, as well as their stability, safety and the possibility of using suspension culture conditions for this cell line, which are the most important parameters for the production of therapeutic antibodies.
Культивирование проводилось в режиме fed-batch с использованием питательной среды BalanCD CHO Growth A (Irvine Scientific) и нутриентной добавки CellBoost 3 (HyClone) в течение 10 суток при температуре 37°C, 5% CO2 в газовой фазе инкубатора. После культивирования культуральная жидкость осветлялась центрифугированием и передавалась на выделение.The cultivation was carried out in fed-batch mode using BalanCD CHO Growth A nutrient medium (Irvine Scientific) and CellBoost 3 (HyClone) nutrient supplement for 10 days at 37 ° C, 5% CO 2 in the gas phase of the incubator. After cultivation, the culture fluid was clarified by centrifugation and transferred to the selection.
Для выделения и очистки целевого продукта была разработана схема, включающая аффинную стадию с использованием сорбента на основе протеина A (с выходом продукта свыше 90%) и катионообменную хроматографию на сорбенте высокого разрешения, обеспечивающую эффективное разделение целевой формы белка и его олигомерных форм (выход целевой фракции более 80%). В результате были получены биспецифические антитела в количествах, достаточных для исследования их фармакокинетических и фармакодинамических свойств.To isolate and purify the target product, a scheme was developed that included the affinity step using a protein A-based sorbent (with a product yield of over 90%) and high resolution cation exchange chromatography providing efficient separation of the target form of the protein and its oligomeric forms (yield of the target fraction more than 80%). As a result, bispecific antibodies were obtained in quantities sufficient to study their pharmacokinetic and pharmacodynamic properties.
Пример 2. Фармацевтическая композиция на основе антитела против CD3*CD19.Example 2. Pharmaceutical composition based on antibodies against CD3 * CD19.
Для проведения экспериментов на животных использовали фармацевтическую композицию следующего состава: 0,7 мг/мл антитела GNR-047, 150 мМ хлорид натрия, 1,8% маннитол, 20 мМ фосфат натрия, 0,01% полисорбат 80.For animal experiments, a pharmaceutical composition of the following composition was used: 0.7 mg / ml GNR-047 antibody, 150 mM sodium chloride, 1.8% mannitol, 20 mM sodium phosphate, 0.01
Условия очистки GNR-047 на последней хроматографической стадии процесса подобраны таким образом, что целевой белок элюируется с сорбента в виде концентрированной субстанции, содержащей все требуемые компоненты финальной формуляции. Таким образом, для приготовления готовой лекарственной формы раствор антитела с концентрацией около 5 мг/мл (концентрированный раствор, полученный в Примере 1 после хроматографической очистки) разбавляли до требуемой концентрации 0,7 мг/мл с использованием буфера готовой лекарственной формы при перемешивании. Полученный раствор подвергали стерилизующей фильтрации с использованием фильтра с диаметром пор 0,22 мкм и разливали в стерильные флаконы для хранения композиции и последующих экспериментов.The purification conditions of GNR-047 at the last chromatographic stage of the process are selected so that the target protein elutes from the sorbent in the form of a concentrated substance containing all the required components of the final formulation. Thus, to prepare the finished dosage form, an antibody solution with a concentration of about 5 mg / ml (the concentrated solution obtained in Example 1 after chromatographic purification) was diluted to the desired concentration of 0.7 mg / ml using the buffer of the finished dosage form with stirring. The resulting solution was subjected to sterilizing filtration using a filter with a pore diameter of 0.22 μm and poured into sterile vials to store the composition and subsequent experiments.
Для получения лиофилизированной композиции, раствор, содержащий антитело GNR-047 в буфере готовой формы (150 мМ хлорид натрия, 1,8% маннитол, 20 мМ фосфат натрия, 0,01% полисорбат 80), подвергали лиофилизации при стандартных условиях, включающих стадию замораживания и вакуумного обезвоживания. При этом хлорид натрия и маннит, использовали в качестве кристаллизующихся компонентов, наличие которых позволяет сформировать таблетку, а маннит также играл роль стабилизатора при лиофилизации. Полученный лиофильный препарат хранили при 4С в герметичных флаконах.To obtain a lyophilized composition, a solution containing the GNR-047 antibody in the finished buffer (150 mM sodium chloride, 1.8% mannitol, 20 mM sodium phosphate, 0.01% polysorbate 80) was lyophilized under standard conditions including a freezing step and vacuum dehydration. In this case, sodium chloride and mannitol were used as crystallizing components, the presence of which allows the formation of a tablet, and mannitol also played the role of a stabilizer during lyophilization. The resulting lyophilic preparation was stored at 4C in sealed vials.
В качестве растворителя для восстановления лиофилизированной композиции использовали воду для инъекций. Для восстановления препарата к флакону, содержащему 17 мг лиофилизированной композиции антитела, при комнатной температуре добавляли 0,5 мл растворителя и осторожно перемешивали покачиванием до полного растворения. В качестве растворителя также может выступать бактериостатическая вода для инъекций, растворение в которой позволяет многократно использовать препарат в течение 7 дней.Water for injection was used as a solvent for reconstituting the lyophilized composition. To reconstitute the preparation, 0.5 ml of the solvent was added to a vial containing 17 mg of the lyophilized antibody composition at room temperature and gently mixed by shaking until it was completely dissolved. Bacteriostatic water for injection can also serve as a solvent, dissolution in which allows the drug to be reused within 7 days.
Пример 3. Изучение биологической активностиExample 3. The study of biological activity
Биологическую активность полученного антитела оценивали путем определения констант связывания в конкурентном анализе на клетках линии Раджи CD3-/CD19+ (Raji, ATCC® CCL-86) и Джуркат CD3+/CD19- (Jurkat, ATCC® TIB-152) из коллекции ATCC.The biological activity of the obtained antibody was evaluated by determining the binding constants in a competitive analysis on cells of the Raja line CD3- / CD19 + (Raji, ATCC® CCL-86) and Jurkat CD3 + / CD19- (Jurkat, ATCC® TIB-152) from the ATCC collection.
В качестве препарата сравнения использовали антитело MT-103 (блинатомумаб). После инкубации с целевыми молекулами в последовательных 10-кратных разведениях от 100 нМ до 0,1 нМ, к клеткам добавляли конкурирующее антитело (HD37 или ОКТ3) в концентрации 6 нМ. Клетки промывали натрий-фосфатным буферным раствором с pH 7,0 и прокрашивали anti-Human-FITS антителами. Прокрашенные клетки анализировали на FACS Calibur.Antibody MT-103 (blinatomumab) was used as a reference drug. After incubation with the target molecules in successive 10-fold dilutions from 100 nM to 0.1 nM, a competing antibody (HD37 or OCT3) was added to the cells at a concentration of 6 nM. Cells were washed with pH 7.0 sodium phosphate buffer and stained with anti-Human-FITS antibodies. Stained cells were analyzed by FACS Calibur.
Результаты связывания приведены в Таблице 1 и на Фиг. 4.The binding results are shown in Table 1 and in FIG. four.
Из таблицы видно, что антитело GNR-047 связывается, как с CD3, так и с CD19, причем в обоих случаях более эффективно, чем препарат сравнения MT103. Такие низкие, в сравнении с препаратом сравнения, значения IC50 могут объясняться наличием 2x валентностей для каждой специфичности (CD3 и CD19).The table shows that the GNR-047 antibody binds to both CD3 and CD19, and in both cases it is more effective than the comparison drug MT103. Such low, in comparison with the comparison drug, IC50 values can be explained by the presence of 2x valencies for each specificity (CD3 and CD19).
Пример 4. Сравнение фармакокинетических характеристик при внутривенном и подкожном введенииExample 4. Comparison of pharmacokinetic characteristics with intravenous and subcutaneous administration
В виду того, что препарат GNR-047 показал улучшенные фармакокинетические характеристики при внутривенном введении по сравнению с MT103, целесообразным являлось определение фармакокинетических параметров при более удобном подкожном введении, при котором GNR-047 будет пролонгировано высвобождаться из депо в кровоток.In view of the fact that the GNR-047 preparation showed improved pharmacokinetic characteristics when administered intravenously compared with MT103, it was advisable to determine the pharmacokinetic parameters with more convenient subcutaneous administration, in which GNR-047 will be prolonged to be released from the depot into the bloodstream.
Для проведения эксперимента использовались крысы линии Sprague Dawley (Питомник лабораторных животных «Пущино» филиала Института биорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук) массой около 400 г, 3 крысы на группу.For the experiment, rats of the Sprague Dawley line were used (Pushchino Kennel of Laboratory Animals, a branch of the Institute of Bioorganic Chemistry named after Academicians MM Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov of the Russian Academy of Sciences) weighing about 400 g, 3 rats per group.
Каждой крысе вводили исследуемое антитело GNR-047 или MT-103 внутривенно в дозировке 0,5 мг/кг или подкожно в дозировке 2,0 мг/кг. Образцы крови отбирали через определенные промежутки времени после инъекции, начиная с 5 мин, и определяли концентрации препаратов в плазме крови при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).The test antibody GNR-047 or MT-103 was administered intravenously at a dose of 0.5 mg / kg or subcutaneously at a dose of 2.0 mg / kg to each rat. Blood samples were taken at certain intervals after injection, starting from 5 min, and the concentration of the drugs in the blood plasma was determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Полученные результаты представлены в таблице 2 и на Фиг. 5 и 6.The results obtained are presented in table 2 and in FIG. 5 and 6.
Где,Where,
T1/2 - необходимое для снижения концентрации лекарственного препарата в плазме крови на 50% в результате элиминации; Cmax - наивысшее значение концентрации лекарственного препарата в плазме крови; AUC(0-t) - площадь, ограниченная фармакокинетической кривой и осью абсцисс во временном интервале с момента введения лекарственного препарата до момента отбора последней пробы крови; AUC(0-inf) - площадь, ограниченная фармакокинетической кривой и осью абсцисс, экстраполированная во времени с момента введения лекарственного препарата до бесконечности; 
В результате было показано значительное увеличение времени полувыведения (T1/2) и экспозиция (AUC(0-inf) - площадь под фармакокинетической кривой) препарата GNR-047 в сравнении с препаратом MT103, при сохранении максимальной пиковой концентрации (Cmax) при внутривенном введении.As a result, a significant increase in half-life (T 1/2 ) and exposure (AUC (0-inf) - area under the pharmacokinetic curve) of the GNR-047 preparation was shown compared with MT103, while maintaining the maximum peak concentration (Cmax) when administered intravenously .
При подкожном введении крысам абсолютная биодоступность препарата GNR-047 составила порядка 60%, в то время как MT-103 показал очень низкую биодоступность - 6% (см. Фиг. 6б).When administered subcutaneously to rats, the absolute bioavailability of GNR-047 was about 60%, while MT-103 showed a very low bioavailability of 6% (see Fig. 6b).
Пример 5. Сравнение противоопухолевой активности GNR-047 и MT 103 на модели опухолевого ксенотрансплантата клеток линии Raji (Раджи) у мышей NOD/SCID при реконституции МКПК человека.Example 5. Comparison of the antitumor activity of GNR-047 and MT 103 on a model of a tumor xenograft of Raji cells (Raji) in NOD / SCID mice during reconstitution of human PBMC.
Цель исследования заключалась в сравнении эффективности препаратов GNR-047 и MT103 у мышей NOD/SCID (Taconic, Дания) при нескольких уровнях дозы, на модели ксенотрансплантата опухолевых клеток линии Раджи с одновременной инъекций мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) человека иммунодефицитным мышам NOD/SCID.The aim of the study was to compare the efficacy of GNR-047 and MT103 in NOD / SCID mice (Taconic, Denmark) at several dose levels, on a Raja tumor cell xenograft model with simultaneous injection of human peripheral blood mononuclear cells (MCPC) to immunodeficient NOD / SCID mice .
Клетки линии Раджи (лимфома Беркитта человека) предварительно смешивали с МКПК человека и инокулировали подкожно с последующим внутривенным или подкожным введением исследуемых препаратов. Для этого девяти экспериментальным группам иммунодефицитных мышей NOD/SCID (9 животных на группу) подкожно вводили или клетки линии Раджи лимфомы Буркитта человека, или суспензию предварительно смешанных клеток линии Раджи и МКПК человека. По три животных из каждой группы получали МКПК человека от одного из трех отдельных здоровых доноров (когорты 1,2 и 3). Через 2 часа после инокуляции клеток животным внутривенно или подкожно вводили, или НФБ (натрий-фосфатный буферный раствор), или исследуемые препараты GNR-047 или MT 103 в различных дозах. Вводимый объем составлял 200 мкл. Во всех группах в течение 45 дней (дни с 3 по 48) оценивали объем опухоли.Cells of the Raja line (human Burkitt’s lymphoma) were pre-mixed with human PBMC and inoculated subcutaneously, followed by intravenous or subcutaneous administration of the studied drugs. For this, nine experimental groups of immunodeficient NOD / SCID mice (9 animals per group) were subcutaneously injected with either human Raja line Burkitt lymphoma cells or a suspension of pre-mixed Raja line cells and human PBMC. Three animals from each group received human PBMC from one of three separate healthy donors (
Вводимые растворы готовили путем разведения раствора (композиции) GNR-047, полученного в Примере 2 (0,7 мг/мл), или MT103 (0,52 мкг/мл) в 0,9% физиологическом растворе до получения концентрации 5 мкг/мл (доза 1 мкг) или 0,5 мкг/мл (доза 0,1 мкг). Экспериментальные группы описаны в таблице 3.Injected solutions were prepared by diluting a solution (composition) of GNR-047 obtained in Example 2 (0.7 mg / ml) or MT103 (0.52 μg / ml) in 0.9% saline to obtain a concentration of 5 μg / ml (
У экспериментальных животных определяли следующие показатели: выживаемость, масса тела, объем опухоли, масса опухоли.The following indicators were determined in experimental animals: survival, body weight, tumor volume, tumor mass.
Массу тела определяли в день 0 и в последующем регистрировали три раза в неделю до дня 48. Объем опухоли контролировали 3 раза в неделю со дня 3 до окончания исследования путем измерения большого и малого диаметра опухоли штанген-циркулем. На основании диаметров вычисляли объем опухоли, используя следующую формулу:Body weight was determined on
Объем = (малый диаметр)2 × большой диаметр × 0,5Volume = (small diameter) 2 × large diameter × 0.5
В контрольной группе 1, получавшей НФБ (только клетки линии Раджи), до завершения исследования выжили 11% животных. Выживаемость у животных группы 2, получавших клетки линии Раджи и МКПК человека, не изменилась. В обеих группах смертность была обусловлена исключительно эвтаназией по этическим соображениям (вследствие большого объема опухоли).In
Введение GNR-047 и MT 103 повысило выживаемость в группах 3-9, что отражено в таблице 4, причем при большей дозе исследуемый препарат оказался более эффективным, чем препарат сравнения:The introduction of GNR-047 and MT 103 increased survival in groups 3-9, which is reflected in table 4, and with a higher dose, the studied drug was more effective than the comparison drug:
Критерии выведения экспериментальных животных из исследования: объем опухоли >10% массы тела; изъязвление опухоли; снижение массы тела >20%.Criteria for removing experimental animals from the study: tumor volume> 10% of body weight; tumor ulceration; weight loss> 20%.
Рост опухоли значительно ингибировался или подавлялся во всех исследуемых группах, получавших GNR-047 или MT 103 (группы 3-9) по сравнению с контрольной группой 2, получавшей НФБ. При этом во всех исследуемых группах, получавших GNR-047 или MT 103, ингибирование роста опухоли оказалось статистически значимым (p≤0,05).Tumor growth was significantly inhibited or suppressed in all study groups treated with GNR-047 or MT 103 (groups 3-9) compared with
В таблице 5 приведены размеры опухоли для групп 1, 2, 4, 8 и 9, а соответствующие сравнительные графики, позволяющие оценить размер опухоли при внутривенном и подкожном введении (для групп 4, 8 и 9), приведены на Фиг. 7.Table 5 shows the tumor sizes for
Claims (17)
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015151459A RU2651776C2 (en) | 2015-12-01 | 2015-12-01 | Bispecific antibodies against cd3*cd19 |
| PCT/RU2016/000827 WO2017095267A1 (en) | 2015-12-01 | 2016-11-29 | Bispecific antibodies against cd3*cd19 |
| EA201890805A EA036905B1 (en) | 2015-12-01 | 2016-11-29 | Bispecific antibodies against cd3*cd19 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015151459A RU2651776C2 (en) | 2015-12-01 | 2015-12-01 | Bispecific antibodies against cd3*cd19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015151459A RU2015151459A (en) | 2017-06-06 |
| RU2651776C2 true RU2651776C2 (en) | 2018-04-23 |
Family
ID=58797475
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015151459A RU2651776C2 (en) | 2015-12-01 | 2015-12-01 | Bispecific antibodies against cd3*cd19 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA036905B1 (en) |
| RU (1) | RU2651776C2 (en) |
| WO (1) | WO2017095267A1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021034227A1 (en) | 2019-08-21 | 2021-02-25 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" | Complementarity-determining regions for binding cd3, and bispecific antigen-binding molecule containing said cdrs |
| US11707533B2 (en) | 2019-09-04 | 2023-07-25 | Legochem Biosciences, Inc. | Antibody-drug conjugate comprising antibody against human ROR1 and use for the same |
| RU2806333C2 (en) * | 2018-05-09 | 2023-10-31 | Легокем Байосайенсиз, Инк. | Compositions and methods relating to drug conjugates with anti-cd19 antibodies |
| US11827703B2 (en) | 2018-05-09 | 2023-11-28 | Legochem Biosciences, Inc. | Compositions and methods related to anti-CD19 antibody drug conjugates |
| US11975076B2 (en) | 2015-11-25 | 2024-05-07 | Legochem Biosciences, Inc. | Antibody-drug conjugates comprising branched linkers and methods related thereto |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112010982B (en) * | 2020-08-31 | 2023-06-27 | 重庆金迈博生物科技有限公司 | anti-GPC 3/CD3 bispecific antibody and application thereof |
| JP2024506831A (en) | 2021-01-28 | 2024-02-15 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Compositions and methods for treating cytokine release syndrome |
| CA3235228A1 (en) * | 2021-10-15 | 2023-04-20 | Amgen Research (Munich) Gmbh | Subcutaneous administration of cd19-binding t cell engagers |
| AU2023254191A1 (en) | 2022-04-11 | 2024-10-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for universal tumor cell killing |
| US20240277844A1 (en) | 2023-02-17 | 2024-08-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Induced nk cells responsive to cd3/taa bispecific antibodies |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1293514A1 (en) * | 2001-09-14 | 2003-03-19 | Affimed Therapeutics AG | Multimeric single chain tandem Fv-antibodies |
| RU2228202C2 (en) * | 1998-04-21 | 2004-05-10 | Микромет Аг | Cd19 x cd3-specific polypeptides and their application |
| WO2010052014A1 (en) * | 2008-11-07 | 2010-05-14 | Micromet Ag | Treatment of acute lymphoblastic leukemia |
| RU2548746C2 (en) * | 2009-10-27 | 2015-04-20 | Эмджен Рисерч (Мьюник), ГмбХ | Dose schedule for administering cd19×cd3 bispecific antibody |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI454479B (en) * | 2007-03-06 | 2014-10-01 | Amgen Inc | Variant activin receptor polypeptides and uses thereof |
| CA2831572C (en) * | 2011-05-02 | 2019-11-26 | Immunomedics, Inc. | Ultrafiltration concentration of allotype selected antibodies for small-volume administration |
-
2015
- 2015-12-01 RU RU2015151459A patent/RU2651776C2/en active
-
2016
- 2016-11-29 WO PCT/RU2016/000827 patent/WO2017095267A1/en active Application Filing
- 2016-11-29 EA EA201890805A patent/EA036905B1/en unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2228202C2 (en) * | 1998-04-21 | 2004-05-10 | Микромет Аг | Cd19 x cd3-specific polypeptides and their application |
| EP1293514A1 (en) * | 2001-09-14 | 2003-03-19 | Affimed Therapeutics AG | Multimeric single chain tandem Fv-antibodies |
| WO2010052014A1 (en) * | 2008-11-07 | 2010-05-14 | Micromet Ag | Treatment of acute lymphoblastic leukemia |
| RU2548746C2 (en) * | 2009-10-27 | 2015-04-20 | Эмджен Рисерч (Мьюник), ГмбХ | Dose schedule for administering cd19×cd3 bispecific antibody |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11975076B2 (en) | 2015-11-25 | 2024-05-07 | Legochem Biosciences, Inc. | Antibody-drug conjugates comprising branched linkers and methods related thereto |
| RU2806333C2 (en) * | 2018-05-09 | 2023-10-31 | Легокем Байосайенсиз, Инк. | Compositions and methods relating to drug conjugates with anti-cd19 antibodies |
| US11827703B2 (en) | 2018-05-09 | 2023-11-28 | Legochem Biosciences, Inc. | Compositions and methods related to anti-CD19 antibody drug conjugates |
| RU2810924C2 (en) * | 2018-12-21 | 2024-01-09 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Antibodies binding to cd3 |
| WO2021034227A1 (en) | 2019-08-21 | 2021-02-25 | Общество с ограниченной ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" | Complementarity-determining regions for binding cd3, and bispecific antigen-binding molecule containing said cdrs |
| EP4036115A4 (en) * | 2019-08-21 | 2023-11-08 | Joint-Stock Company "Generium" | Complementarity-determining regions for binding cd3, and bispecific antigen-binding molecule containing said cdrs |
| US11707533B2 (en) | 2019-09-04 | 2023-07-25 | Legochem Biosciences, Inc. | Antibody-drug conjugate comprising antibody against human ROR1 and use for the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015151459A (en) | 2017-06-06 |
| EA036905B1 (en) | 2021-01-13 |
| EA201890805A1 (en) | 2018-08-31 |
| WO2017095267A1 (en) | 2017-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2651776C2 (en) | Bispecific antibodies against cd3*cd19 | |
| JP7014843B2 (en) | Chimeric antigen receptor and how to use it | |
| KR102609197B1 (en) | Interleukin 15 protein complex and use thereof | |
| JP7111855B2 (en) | Heterodimeric Fc-fusion cytokines and pharmaceutical compositions containing the same | |
| JP6794348B2 (en) | Humanized anti-OX40 antibody and its use | |
| JP7231553B2 (en) | TGF-B-receptor ectodomain fusion molecule and uses thereof | |
| JP6484634B2 (en) | IL-15 heterodimeric protein and use thereof | |
| CN113166220A (en) | Novel cytokine prodrugs | |
| CN110799528A (en) | Multimeric IL-15-based molecules | |
| JP2020529832A (en) | Targeted heterodimer Fc fusion protein containing IL-15 / IL-15Rα and antigen binding domain | |
| KR20200118080A (en) | Antibody variable domain targeting the NKG2D receptor | |
| WO2018233574A1 (en) | Anti-pd-l1 humanized nanobody and use thereof | |
| CN111655716A (en) | IL-15-based fusions with IL-7 and IL-21 | |
| JP2023166409A (en) | Proteins binding nkg2d, cd16 and tumor-associated antigen | |
| JP2022544771A (en) | IL-2 fusion proteins that preferentially bind to IL-2Ralpha | |
| KR20190115469A (en) | Proteins That Bind to BCMA, NKG2D, and CD16 | |
| KR20200010428A (en) | Proteins That Bind to NKG2D, CD16, and ROR1 or ROR2 | |
| TW201326214A (en) | Binding molecules for BCMA and CD3 (E3) | |
| KR20200051789A (en) | Proteins that bind NKG2D, CD16, and C-type lectin-like molecule-1 (CLL-1) | |
| CA3058427C (en) | Alt-803 in combination with anti-cd38 antibody for cancer therapies | |
| JP2022532812A (en) | Anti-IL1RAP antibody composition | |
| US10683358B2 (en) | Human TNFRSF25 antibody | |
| KR20200010430A (en) | Proteins Bind to NKG2D, CD16 and Tumor-associated Antigens | |
| KR20200033302A (en) | Proteins that bind NKG2D, CD16 and FLT3 | |
| KR20190120770A (en) | Proteins That Bind PSMA, NKG2D, and CD16 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HE9A | Changing address for correspondence with an applicant | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20220228 |