RU2651488C2 - Pis s 3 pea allergen for diagnostics and therapy of food allergy and method of its release from natural raw materials - Google Patents
Pis s 3 pea allergen for diagnostics and therapy of food allergy and method of its release from natural raw materials Download PDFInfo
- Publication number
- RU2651488C2 RU2651488C2 RU2016129502A RU2016129502A RU2651488C2 RU 2651488 C2 RU2651488 C2 RU 2651488C2 RU 2016129502 A RU2016129502 A RU 2016129502A RU 2016129502 A RU2016129502 A RU 2016129502A RU 2651488 C2 RU2651488 C2 RU 2651488C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pea
- allergen
- pis
- polypeptide
- seq
- Prior art date
Links
- 239000013566 allergen Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 title claims abstract description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims abstract description 37
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 37
- 241000219843 Pisum Species 0.000 claims abstract description 26
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 15
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims abstract description 13
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 abstract description 9
- 238000005352 clarification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 19
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 4
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 101710196023 Vicilin Proteins 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101710091838 Convicilin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 235000021403 cultural food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000004460 silage Substances 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к области аллергологии, а именно к идентификации нового пищевого аллергена, способу его получения из природного сырья и использования для диагностики пищевой аллергии и терапии аллергических заболеваний.The present invention relates to the field of allergology, in particular to the identification of a new food allergen, a method for its production from natural raw materials and use for the diagnosis of food allergies and the treatment of allergic diseases.
Уровень техникиState of the art
Для проведения аллергодиагностики традиционно используются суммарные аллергенные экстракты, часто дающие ложные и плохо воспроизводимые результаты. Причиной этого является сложность стандартизации суммарных экстрактов, вариабельность их состава и изменение содержания в них различных белков и небелковых компонентов, способных вызывать аллергическую реакцию. Нередко мажорный аллерген присутствует в экстракте лишь в небольших количествах, и его биологическая активность сильно зависит от других компонентов экстракта. Кроме того, аллергодиагностика с использованием суммарных экстрактов не позволяет выявить индивидуальные аллергены, вызывающие развитие аллергических реакций. Существенную проблему при серологической диагностике аллергии представляют также перекрестные аллергические реакции.For allergy diagnostics, total allergenic extracts are often used, often giving false and poorly reproducible results. The reason for this is the difficulty in standardizing the total extracts, the variability of their composition and the change in their content of various proteins and non-protein components that can cause an allergic reaction. Often, a major allergen is present in the extract only in small quantities, and its biological activity is highly dependent on other components of the extract. In addition, allergic diagnostics using total extracts does not allow to identify individual allergens that cause the development of allergic reactions. Cross-allergic reactions are also a significant problem in the serological diagnosis of allergies.
Современным направлением развития аллергодиагностики является замена суммарных экстрактов индивидуальными аллергенами, хорошо охарактеризованными как биохимически, так и иммунологически. Индивидуальные аллергены могут быть использованы для составления молекулярного профиля чувствительности пациента, изучения перекрестной реактивности, а также для проведения безопасной и эффективной аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ). Использование индивидуальных аллергенов снижает риск возникновения перекрестных аллергических реакций.A modern direction in the development of allergic diagnostics is the replacement of total extracts with individual allergens that are well characterized both biochemically and immunologically. Individual allergens can be used to compile the molecular profile of patient sensitivity, study cross-reactivity, and to conduct safe and effective allergen-specific immunotherapy (ASIT). The use of individual allergens reduces the risk of cross-allergic reactions.
Горох Pisum sativum - основная зернобобовая продовольственная культура, используемая также в виде фуражного зерна, зеленого корма для сельскохозяйственных животных, силоса и сена. Широкое распространение гороха обусловлено высоким содержанием белка в зерне (в среднем 20-27%), сбалансированностью его аминокислотного состава, отличными вкусовыми качествами и хорошей урожайностью в зонах возделывания. Однако массовое пищевое применение гороха ограничено его сравнительно высокой аллергизирующей способностью. В настоящее время идентифицировано и охарактеризовано всего два аллергена (вицилин и конвицилин) данной продовольственной культуры, являющихся фрагментами одного белка-предшественника, которые занесены в международную базу данных по аллергенам Международного союза иммунологических обществ (WHO/IUIS) (www.allergen.org) [Sanchez-Monge R., 
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение по сравнению с предшествующим уровнем техники, по меньшей мере, частично удовлетворяет потребность в расширении ассортимента известных пищевых аллергенов, так как касается нового аллергена гороха для применения в диагностике и лечении IgE-опосредованной аллергии у людей, а также способа его выделения из природного сырья.The present invention, compared with the prior art, at least partially satisfies the need to expand the range of known food allergens, as it relates to a new pea allergen for use in the diagnosis and treatment of IgE-mediated allergies in humans, as well as a method for its isolation from natural raw materials .
В первом аспекте изобретение относится к полипептиду, представляющему собой новый пищевой аллерген Pis s 3 гороха, а также к его фрагментам или аналогам, имеющим эпитопы, распознаваемые антителами на этот пищевой аллерген. Аллерген Pis s 3 представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No. 1.In a first aspect, the invention relates to a polypeptide representing a new food allergen Pis s 3 of peas, as well as fragments or analogs thereof having epitopes recognized by antibodies to this food allergen. The Pis s 3 allergen is a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID No. one.
Во втором аспекте изобретение относится к способу выделения полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 1, из природного сырья, включающему гомогенизацию семян гороха и экстракцию полипептида из семян гороха буферным раствором, осветление полученного экстракта центрифугированием, термическую обработку экстракта, диализ, последовательную ультрафильтрацию, катионообменную и высокоэффективную жидкостную хроматографии.In a second aspect, the invention relates to a method for isolating a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID No. 1, from natural raw materials, including homogenization of pea seeds and extraction of the polypeptide from pea seeds with a buffer solution, clarification of the obtained extract by centrifugation, heat treatment of the extract, dialysis, sequential ultrafiltration, cation exchange and high performance liquid chromatography.
В третьем аспекте изобретение относится к полипептиду, обладающему идентичностью с SEQ ID No. 1 либо антигенными детерминантами, присущими SEQ ID No. 1, для применения в терапии или диагностике, предпочтительно в терапии или диагностике IgE-опосредованной аллергии, такой как пищевая аллергия на горох.In a third aspect, the invention relates to a polypeptide having identity with SEQ ID No. 1 or antigenic determinants inherent in SEQ ID No. 1, for use in therapy or diagnosis, preferably in therapy or diagnosis of an IgE-mediated allergy, such as pea food allergy.
В еще одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид, обладающий идентичностью с SEQ ID No. 1 либо антигенными детерминантами, присущими SEQ ID No. 1, или к его гипоаллергенной форме, модифицированной для того, чтобы отменить или ослабить связывание с IgE-антителами. Гипоаллергенная форма полипептида, обладающего идентичностью с SEQ ID No. 1 либо антигенными детерминантами, присущими SEQ ID No. 1, может быть получена посредством фрагментации, укорочения молекулы или делеции ее внутренних участков, перестановки доменов, замены аминокислотных остатков, разрушения дисульфидных мостиков, образования олигомерных и гибридных молекул и др.In yet another aspect, the invention relates to a pharmaceutical composition comprising a polypeptide having identity with SEQ ID No. 1 or antigenic determinants inherent in SEQ ID No. 1, or its hypoallergenic form, modified in order to cancel or weaken binding to IgE antibodies. Hypoallergenic form of a polypeptide that is identical with SEQ ID No. 1 or antigenic determinants inherent in SEQ ID No. 1, can be obtained by fragmentation, shortening of a molecule or deletion of its internal regions, rearrangement of domains, replacement of amino acid residues, destruction of disulfide bridges, formation of oligomeric and hybrid molecules, etc.
Изобретение, кроме того, относится к способу in vitro диагностики аллергии, опосредованной антителами класса IgE, включающему стадии анализа образца физиологической жидкости, например крови, плазмы или сыворотки человека, у которого предполагается наличие IgE-опосредованной аллергии, такой как пищевая аллергия на горох, путем контакта с полипептидом, обладающим идентичностью с SEQ ID No. 1 либо антигенными детерминантами, присущими SEQ ID No. 1, и выявления присутствия в образце IgE-антител, которые специфично связываются с полипептидом, его фрагментами или аналогами, защищаемыми формулой изобретения. Присутствие таких антител, специфично связывающихся с полипептидом, его фрагментами или аналогами, обладающим идентичностью с SEQ ID No. 1 либо антигенными детерминантами, присущими SEQ ID No. 1, является показателем IgE-опосредованной аллергии.The invention further relates to an in vitro method for diagnosing an allergy mediated by IgE antibodies, comprising the steps of analyzing a sample of a physiological fluid, for example, blood, plasma or human serum, which is suspected of having an IgE-mediated allergy, such as pea food allergy, by contact with a polypeptide having identity with SEQ ID No. 1 or antigenic determinants inherent in SEQ ID No. 1, and detecting the presence in the sample of IgE antibodies that specifically bind to the polypeptide, its fragments or analogs protected by the claims. The presence of such antibodies that specifically bind to the polypeptide, its fragments or analogs, which are identical with SEQ ID No. 1 or antigenic determinants inherent in SEQ ID No. 1 is an indicator of IgE-mediated allergy.
В следующем аспекте изобретение относится к способу лечения IgE-опосредованной аллергии у человека, такой как пищевая аллергия на горох. В одном варианте способ включает введение пациенту, чувствительному к такому лечению, полипептида, обладающего идентичностью с SEQ ID No. 1, либо его фрагмента, или аналога, обладающего антигенными детерминантами, присущими SEQ ID No. 1 Другой вариант способа лечения включает введение пациенту, чувствительному к такому лечению, фармацевтической композиции согласно одному из предыдущих аспектов.In a further aspect, the invention relates to a method for treating an IgE-mediated allergy in humans, such as a pea food allergy. In one embodiment, the method comprises administering to a patient sensitive to such treatment a polypeptide identical with SEQ ID No. 1, or a fragment thereof, or an analogue having antigenic determinants inherent in SEQ ID No. 1 Another embodiment of a treatment method comprises administering to a patient sensitive to such treatment a pharmaceutical composition according to one of the preceding aspects.
ОпределенияDefinitions
Следует считать, что аналоги и фрагменты полипептида, защищенного формулой изобретения, означают белки или пептиды разной длины, идентичные по аминокислотной последовательности с указанным полипептидом, или гомологичные ему по меньшей мере на 80%, а в случае укороченных вариантов по меньшей мере на 80% совпадающие по первичной структуре с соответствующими фрагментами пептида с последовательностью SEQ ID No. 1.It should be considered that the analogues and fragments of the polypeptide protected by the claims mean proteins or peptides of different lengths, identical in amino acid sequence with the specified polypeptide, or homologous to it by at least 80%, and in the case of shortened variants, by at least 80% matching on the primary structure with the corresponding fragments of the peptide with the sequence SEQ ID No. one.
Модифицированный аналог полипептида в контексте настоящего изобретения следует толковать как полипептид, который был химически или генетически модифицирован для того, чтобы изменить его иммунологические свойства, например, чтобы отменить или ослабить связывание с IgE-антителами.A modified analog of a polypeptide in the context of the present invention should be construed as a polypeptide that has been chemically or genetically modified in order to change its immunological properties, for example, to cancel or weaken binding to IgE antibodies.
Аналоги или фрагменты полипептида, имеющие общие с указанным полипептидом эпитопы, распознаваемые антителами на этот пищевой аллерген, следует толковать как такие фрагменты и аналоги, связывание которых с IgE-антителами из образца сыворотки пациента, сенсибилизированного пищевыми аллергенами гороха, может быть в значительной степени ингибировано полипептидом с последовательностью SEQ ID No. 1.Analogs or fragments of a polypeptide that have epitopes common to the polypeptide recognized by antibodies to this food allergen should be interpreted as fragments and analogues whose binding to IgE antibodies from a patient serum sample sensitized with pea food allergens can be substantially inhibited by the polypeptide with the sequence SEQ ID No. one.
Гипоаллергенный модифицированный полипептид или его аналог или фрагмент полипептида следует толковать как модифицированный полипептид или его аналог или фрагмент полипептида, который не способен или обладает значительно менее выраженной способностью связывать антитела класса IgE, реактивные к указанному полипептиду, из образца сыворотки пациента, сенсибилизированного пищевыми аллергенами гороха, либо не проявляет или проявляет гораздо более низкую аллергизирующую способность, которую определяют с использованием анализа активации клеток, например анализа высвобождения гистамина базофилами.A hypoallergenic modified polypeptide or its analogue or fragment of a polypeptide should be interpreted as a modified polypeptide or its analogue or fragment of a polypeptide that is not capable or has a significantly less pronounced ability to bind IgE antibodies reactive to the specified polypeptide from a patient serum sample sensitized with pea food allergens, either does not show or exhibits a much lower allergenic ability, which is determined using analysis of activation cells, for example, histamine release analysis by basophils.
Изобретение иллюстрируют следующие фигуры.The invention is illustrated by the following figures.
На фиг. 1 отображена хроматограмма разделения белков из экстракта семян гороха Pisum sativum на катионообменной колонке HiTrap SP FF и электрофореграмма фракции 2 после катионообменной хроматографии; М - смесь белков-стандартов молекулярных масс.In FIG. 1 shows a chromatogram of the separation of proteins from Pisum sativum pea seed extract on a HiTrap SP FF cation exchange column and an electrophoregram of
На фиг. 2 отображена хроматограмма ОФ-ВЭЖХ очистки Pis s 3 на колонке Vydac С4 (Pis s 3 присутствует в пике 1).In FIG. Figure 2 shows an RP-HPLC chromatogram of Pis s 3 purification on a Vydac C 4 column (Pis s 3 is present at peak 1).
Фиг. 3 иллюстрирует масс-спектрометрический анализ: (А) - Pis s 3; (Б) - Pis s 3 в присутствии йодацетамида; (В) - восстановленный Pis s 3 в присутствии йодацетамида.FIG. 3 illustrates mass spectrometric analysis: (A) Pis s 3; (B) Pis s 3 in the presence of iodoacetamide; (B) - reduced Pis s 3 in the presence of iodoacetamide.
На фиг. 4 отображена электрофореграмма очищенного природного Pis s 3.In FIG. 4 shows an electrophoregram of purified natural Pis s 3.
Фиг. 5 отображает спектр КД природного Pis s 3 из семян гороха Pisum sativum.FIG. 5 shows the CD spectrum of natural Pis s 3 from pea seeds of Pisum sativum.
Фиг. 6 иллюстрирует моделирование расщепления Pis s 3 в желудочно-кишечном тракте под действием пищеварительных ферментов: желудочного пепсина (слева), кишечных трипсина и химотрипсина (справа).FIG. Figure 6 illustrates the modeling of Pis s 3 cleavage in the gastrointestinal tract under the influence of digestive enzymes: gastric pepsin (left), intestinal trypsin and chymotrypsin (right).
Фиг. 7 отображает результаты ELISA с использованием сывороток пациентов с пищевой аллергией (разведение 1:2); в скобках под номерами сывороток указано значение общего уровня IgE (kU/L)FIG. 7 displays ELISA results using sera of patients with food allergies (1: 2 dilution); in parentheses, the serum numbers indicate the total IgE level (kU / L)
Изобретение иллюстрируют следующие примеры:The invention is illustrated by the following examples:
Пример 1.Example 1
Выделение природного аллергена Pis s 3 из семян гороха посевного Pisum sativum.Isolation of the natural allergen Pis s 3 from the seeds of pea inoculum Pisum sativum.
100 г сортовых семян гороха (сорт «Сахарный 2», семена ГОСТ 3 52171-2003) гомогенизируют в 300 мл буферного раствора [0,15 М ацетат аммония, 0,2 М NaCl, 2 мМ ЭДТА, 1,5% поливилполипирролидон, коктейль ингибиторов протеаз (Sigma)] и проводят экстракцию при температуре 4°С в течение 2 ч при постоянном перемешивании. Осветленный методом центрифугирования (40000 g, 50 мин, 4°С) экстракт подвергают тепловой обработке в течение 20 мин при 80°С в твердотельном термостате. Выпавший осадок отделяют центрифугированием (15000 g, 20 мин). После повторного центрифугирования полученный экстракт подвергают диализу (Spectra/Por 1 Dialysis Tubing) против 100-кратного объема 50 мМ ацетата аммония (рН 5,3) в течение ночи при 4°С при постоянном перемешивании. Полученный диализат фильтруют через фильтр TYPE GVPP 0,22 мкм и проводят ультрафильтрацию полученного фильтрата в среде инертного газа (Amicon 0850). Сначала ультрафильтрацию осуществляют с использованием мембраны YM100 (Millipore), а затем с помощью РМ30 (Millipore). Полученный фильтрат наносят на катионообменную колонку нормального давления HiTrap SP FF (GE Healthcare), уравновешенную 50 мМ ацетатом аммония (рН 5,3). Элюцию проводят, используя линейный градиент концентрации NaCl от 0 до 500 мМ за 72 мин при скорости потока 0,7 мл/мин. Детектирование ведут при длине волны 280 нм (фиг. 1). Очистку Pis s 1 проводят методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) на колонке Vydac С4 (Grace) при скорости потока 0,5 мл/мин, используя градиент концентрации ацетонитрила от 5 до 65% за 45 мин в присутствии 0,1% ТФУ. Детектирование ведут при длине волны 214 нм (фиг. 2). Степень очистки полипептида может быть повышена путем повторной хроматографии методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Гомогенность полученного полипептида устанавливают методами МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрии (фиг. 3А) и SDS-электрофореза в ПААГ (фиг. 4). Спектры кругового дихроизма измеряют при комнатной температуре с помощью спектрополяриметра J-810 (Jasco) в кювете с длиной оптического пути 0,01 см в диапазоне длин волн 180-250 нм с шагом 1 нм. Исследуют конформацию полипептида, растворенного в воде в концентрации 1 мг/мл (фиг. 5).100 g of varietal pea seeds (
Пример 2.Example 2
Определение числа цистеиновых остатков и дисульфидных связей в Pis s 3.Determination of the number of cysteine residues and disulfide bonds in
Число цистеиновых остатков и дисульфидных связей в Pis s 3 определяют с помощью реакции алкилирования йодацетамидом до и после восстановления белка дитиотреитолом (ДТТ). Навески Pis s 3 (по 10 мкг) растворяют в 90 мкл буфера 50 мМ NH4HCO3, рН 8,0 с добавлением 2 мМ ДТТ и без него, после чего пробирки с образцами инкубируют в течение 2 ч при 37°С. Затем в каждый образец добавляется по 10 мкл йодацетамида до конечной концентрации 20 мМ, после чего реакционные смеси инкубируют без доступа света при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем образцы подвергают ОФ-ВЭЖХ очистке и исследуют методом МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрии (фиг. 3Б, В).The number of cysteine residues and disulfide bonds in Pis s 3 is determined by the alkylation reaction with iodoacetamide before and after protein reduction with dithiothreitol (DTT). Samples of Pis s 3 (10 μg each) were dissolved in 90 μl of 50 mM NH 4 HCO 3 buffer, pH 8.0 with and without 2 mM DTT, after which the sample tubes were incubated for 2 hours at 37 ° C. Then, 10 μl of iodoacetamide was added to each sample to a final concentration of 20 mM, after which the reaction mixtures were incubated without light at room temperature for 1 h. Then, the samples were subjected to RP-HPLC purification and examined by MALDI-time-of-flight mass spectrometry (Fig. 3B, C).
Алкилирование Pis s 3 йодацетамидом после предварительного восстановления приводит к изменению молекулярной массы белка на 464 Да, что свидетельствует о наличии 8 остатков цистеина. Алкилирование полипептида без предварительного восстановления не приводит к изменению его молекулярной массы и свидетельствовует о том, что 8 остатков цистеина в Pis s 3 вовлечены в образование 4 дисульфидных связей.Alkylation of Pis s 3 with iodoacetamide after preliminary reduction leads to a change in the molecular weight of the protein by 464 Da, which indicates the presence of 8 cysteine residues. Alkylation of the polypeptide without preliminary reduction does not change its molecular weight and suggests that 8 cysteine residues in Pis s 3 are involved in the formation of 4 disulfide bonds.
Пример 3.Example 3
Моделирование переваривания Pis s 3 in vitro ферментами пищеварительного тракта.Simulation of digestion of Pis s 3 in vitro by digestive tract enzymes.
Для моделирования пищеварения в желудке используют пепсин (Sigma) при соотношении фермент-субстрат 1:20 (w/w). Ферментативную реакцию проводят в 0,1 М HCl (рН 2,0) при 37°С в течение 2 ч. Затем рН смеси доводят до 8,0 с помощью NH4HCO3, добавляют 2,5 нг трипсина (Promega) и 10 нг α-химотрипсина (Sigma) на каждый мкг субстрата и продолжают инкубировать в течение следующих 24 ч, моделируя кишечное пищеварение. В качестве контроля расщепления используют чувствительный к протеолизу субстрат - α-казеин коровьего молока (Sigma-Aldrich), который полностью расщепляется в первые 5 мин обработки пепсином. Pis s 3 обладает очень высокой устойчивостью к перевариванию желудочным пепсином (расщепление на ~19% за 2 ч) и смесью кишечных ферментов (расщепление на ~47% после инкубирования в течение еще 24 ч) (фиг. 6).To model digestion in the stomach, pepsin (Sigma) is used with an enzyme-substrate ratio of 1:20 (w / w). The enzymatic reaction is carried out in 0.1 M HCl (pH 2.0) at 37 ° C for 2 hours. Then the pH of the mixture is adjusted to 8.0 with NH 4 HCO 3 , 2.5 ng of trypsin (Promega) and 10 are added. ng of α-chymotrypsin (Sigma) for each μg of substrate and continue to incubate for the next 24 hours, simulating intestinal digestion. As a control of cleavage, a proteolysis sensitive substrate, cow's milk casein α-casein (Sigma-Aldrich), which is completely cleaved in the first 5 minutes of treatment with pepsin, is used. Pis s 3 has a very high resistance to digestion by gastric pepsin (cleavage by ~ 19% in 2 hours) and a mixture of intestinal enzymes (cleavage by ~ 47% after incubation for another 24 hours) (Fig. 6).
Пример 4.Example 4
Определение уровня специфических к Pis s 3 антител класса IgE в сыворотках пациентов с пищевой аллергией методом ELISA.Determination of the level of IgE class specific antibodies to Pis s 3 in the sera of patients with food allergy by ELISA.
Для определения уровня специфических к Pis s 3 антител класса IgE белок-антиген (0,5 мкг) вносят в ячейки 96-луночного планшета (Costar) в 50 мкл трис-солевого буферного раствора (TBS) и инкубируют в течение 1 ч при 37°С. После промывки тем же буферным раствором, содержащим твин-20 (TBST), планшет инкубируют в течение 2 ч при 37°С с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA) в TBS. Далее планшет инкубируют в течение 2 ч при 37°С с серийными разведениями сывороток пациентов с аллергией (1:2-1:16) в TBS. После промывки TBST в лунки вносят раствор конъюгированных с пероксидазой хрена козьих антивидовых антител к IgE человека (Sigma) и инкубируют планшет при температуре 37°С в течение 1 ч. Детектирование связавшихся антител проводят после промывки лунок TBST, используя 3,3',5,5'-тетраметилбензидин для ИФА (Sigma). Ферментативную реакцию останавливают добавлением 4 н H2SO4 и измеряют оптическую плотность в лунках при 450 нм. В исследовании использовали сыворотки 20 пациентов с пищевой аллергией на фрукты, орехи и бобовые, из числа которых в 9 сыворотках (45%) пациентов присутствовали специфические антитела, способные связываться с Pis s 3, а следовательно, вызывать аллергические реакции при попадании Pis s 3 в организм сенсибилизированных пациентов (фиг. 7).To determine the level of IgE class specific antibodies to Pis s 3, protein-antigen (0.5 μg) is added to the cells of a 96-well plate (Costar) in 50 μl of Tris-buffered saline (TBS) and incubated for 1 h at 37 ° FROM. After washing with the same buffer solution containing tween-20 (TBST), the plate was incubated for 2 hours at 37 ° C with 1% solution of bovine serum albumin (BSA) in TBS. The plate is then incubated for 2 hours at 37 ° C with serial dilutions of the sera of patients with allergies (1: 2-1: 16) in TBS. After washing with TBST, a solution of horseradish peroxidase conjugated goat anti-human IgE antibodies (Sigma) was added to the wells and the plate was incubated at 37 ° C for 1 h. Detection of bound antibodies was carried out after washing the TBST wells using 3.3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine for ELISA (Sigma). The enzymatic reaction is stopped by adding 4 n H 2 SO 4 and the absorbance in the wells is measured at 450 nm. The study used the sera of 20 patients with food allergies to fruits, nuts, and legumes, among which specific antibodies were able to bind to Pis s 3 in 9 sera (45%) of patients and, therefore, cause allergic reactions when Pis s 3 enters the body of sensitized patients (Fig. 7).
Аминокислотная последовательностьAmino Acid Sequence
SEQ ID No. 1SEQ ID No. one
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016129502A RU2651488C2 (en) | 2016-07-19 | 2016-07-19 | Pis s 3 pea allergen for diagnostics and therapy of food allergy and method of its release from natural raw materials |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016129502A RU2651488C2 (en) | 2016-07-19 | 2016-07-19 | Pis s 3 pea allergen for diagnostics and therapy of food allergy and method of its release from natural raw materials |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016129502A RU2016129502A (en) | 2017-01-10 |
| RU2651488C2 true RU2651488C2 (en) | 2018-04-19 |
Family
ID=57955907
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016129502A RU2651488C2 (en) | 2016-07-19 | 2016-07-19 | Pis s 3 pea allergen for diagnostics and therapy of food allergy and method of its release from natural raw materials |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2651488C2 (en) |
-
2016
- 2016-07-19 RU RU2016129502A patent/RU2651488C2/en active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| БОГДАНОВ И.В. и др. Получение и исследование новых растительных аллергенов класса LTP. Международная научно-практическая конференция "Биотехнология и качество жизни", 2014, c.209. * |
| БОГДАНОВ И.В. и др. Получение и исследование новых растительных аллергенов класса LTP. Международная научно-практическая конференция "Биотехнология и качество жизни", 2014, c.209. ТЮТЯЕВА В.В. и др. Выделение рекомбинантного белка, содержащего антигенные эпитопы актуального аллерена BETV2 Березы повислой. Иммунология, N 4, 2013, с.215-217. БОРИСОВА И.В. и др. Пищевая аллергия у детей. Красноярск, 2011, с.19-20, 23. * |
| БОРИСОВА И.В. и др. Пищевая аллергия у детей. Красноярск, 2011, с.19-20, 23. * |
| ТЮТЯЕВА В.В. и др. Выделение рекомбинантного белка, содержащего антигенные эпитопы актуального аллерена BETV2 Березы повислой. Иммунология, N 4, 2013, с.215-217. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016129502A (en) | 2017-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lupinek et al. | Advances in allergen-microarray technology for diagnosis and monitoring of allergy: the MeDALL allergen-chip | |
| Taheri-Kafrani et al. | Effects of heating and glycation of β-lactoglobulin on its recognition by IgE of sera from cow milk allergy patients | |
| Burks et al. | Identification of a major peanut allergen, Ara h I, in patients with atopic dermatitis and positive peanut challenges | |
| Helm et al. | Cellular and molecular characterization of a major soybean allergen | |
| You et al. | Development of a monoclonal antibody-based competitive ELISA for detection of β-conglycinin, an allergen from soybean | |
| US10871493B2 (en) | Assay for the diagnosis of peanut allergy | |
| Caira et al. | Allergenicity of milk proteins | |
| Sélo et al. | Allergy to Bovine â–Lactoglobulin: Specificity of Human IgE Using Cyanogen Bromide–Derived Peptides | |
| TWI690537B (en) | Novel macadamia allergen | |
| CN109942689B (en) | Epitope | |
| US20140154257A1 (en) | Materials and methods for diagnosing and treating asthma and dietary Fru-AGEs related disorders including auto-immune and other diseases found to be associated with elevated RAGE. The specification describes methods to identify and make dietary derived advanced glycation end-products, known as Fru-AGEs, Fru-AGE-haptens, and Fru-AGE immune complexes, and to make monoclonal and polyclonal antibodies to this plurality of bio-molecules for use in immunoassays and for use as therapeutic agents | |
| CN112079909A (en) | Antigens and epitopes of allergy | |
| US20100129409A1 (en) | Novel Prostate Kallikrein Allergen | |
| Su et al. | Immunologic and physicochemical studies of Bermuda grass pollen antigen BG60 | |
| CN111051336A (en) | Antigens and epitopes of allergy | |
| RU2651488C2 (en) | Pis s 3 pea allergen for diagnostics and therapy of food allergy and method of its release from natural raw materials | |
| JP2022538691A (en) | new allergen | |
| US20140037661A1 (en) | Wheat Antigens and Peptides for Diagnosis of Wheat Induced Hypersensitivity | |
| Wang et al. | Cow milk αs1-casein induces allergic responses in a mouse model of atopy | |
| JP3983260B2 (en) | Atopic dermatitis attractant | |
| Castro et al. | Proteomic analysis of food allergens | |
| Keet et al. | Overview of mucosal immunity and development of oral tolerance | |
| CN111132734A (en) | Veterinary product | |
| Castroa et al. | Proteomic analysis of food allergens | |
| Liu | Extensive dry heating-induced changes in physicochemical and immunological properties of whey proteins |