RU2649767C1 - Test-system for chemical compounds screening for inhibiting activity against parp-1 - Google Patents

Test-system for chemical compounds screening for inhibiting activity against parp-1 Download PDF

Info

Publication number
RU2649767C1
RU2649767C1 RU2016148005A RU2016148005A RU2649767C1 RU 2649767 C1 RU2649767 C1 RU 2649767C1 RU 2016148005 A RU2016148005 A RU 2016148005A RU 2016148005 A RU2016148005 A RU 2016148005A RU 2649767 C1 RU2649767 C1 RU 2649767C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
parp
fret
test system
nucleosome
nucleosomes
Prior art date
Application number
RU2016148005A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Василий Михайлович Студитский
Алексей Валерьевич Феофанов
Даниэль Чингизович Султанов
Ксения Сергеевна Кудряшова
Надежда Сергеевна Герасимова
Наталия Валериевна Малюченко
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority to RU2016148005A priority Critical patent/RU2649767C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2649767C1 publication Critical patent/RU2649767C1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: group of inventions concerns a test system for chemical compounds screening for inhibitory activity against PARP-1 based on FRET microscopy of single particles (spFRET), which is a mixture comprising a mononucleosome complex on a nucleosome-positioning DNA template labeled with a pair of fluorophores, forming donor-acceptor pairs to implement the FRET effect; PARP-1 protein and its substrate - NAD+. The group of inventions also relates to a method for chemical compounds screening for inhibitory activity against PARP-1 based on FRET microscopy of single particles.
EFFECT: group of inventions provides detection of compounds directed to PARP-1 and capable of inhibiting its activity.
12 cl, 1 ex, 8 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Группа изобретений относится к области медицинской и молекулярной биологии, может быть использована для поиска противоопухолевых препаратов, направленных на PARP-1 с использованием способа, основанного на применении тест-системы из специальных флуоресценто-меченных мононуклеосомных матриц и молекулярной мишени - белка PARP-1 в комплексе с НАД+. При внесении тестируемых соединений и взаимодействии с активированным PARP-1 происходит изменение частотного распределения нуклеосом по величине FRET, что позволяет обнаружить соединения, направленные на PARP-1 и способные ингибировать его активность.The group of inventions relates to the field of medical and molecular biology, can be used to search for anticancer drugs aimed at PARP-1 using a method based on the use of a test system from special fluorescence-labeled mononucleosome matrices and a molecular target - protein PARP-1 in the complex with OVER +. When test compounds are introduced and interacting with activated PARP-1, the frequency distribution of nucleosomes in the FRET value changes, which allows one to detect compounds directed to PARP-1 and capable of inhibiting its activity.

Уровень техникиState of the art

Одной из перспективных молекулярных мишеней для поиска противоопухолевых средств является поли(ADP-рибозо)полимераза 1 (PARP-1) - второй по распространенности после гистонов ядерный белок (в среднем насчитывается 1-2 млн молекул PARP-1 на клетку). PARP-1 - регуляторный белок и вовлечен во множество клеточных процессов, начиная с репарации ДНК, при ее повреждениях, репликации, рекомбинации, транскрипции, вплоть до регуляции преждевременного старения и гибели клетки. PARP-1 - ключевой белок, выполняющий функцию «сенсора» разрывов ДНК. Получено множество данных об участии PARP-1 в развитии опухолевого процесса: было показано, что экспрессия PARP-1 повышена при меланомах, раке легкого, молочной железы и других опухолевых заболеваниях [М.

Figure 00000001
Peralta-Leal A, O'Valle F, Rodriguez-Vargas JM, Gonzalez-Flores A, Majuelos-Melguizo J,
Figure 00000002
L, Serrano S, de Herreros AG,
Figure 00000003
JC,
Figure 00000004
R, Del Moral RG, de
Figure 00000005
JM, Oliver FJ. PARP-1 regulates metastatic melanoma through modulation of vimentin-induced malignant transformation. // PLoS Genet. 2013. Vol.9. P. el003531; S. Nowsheen, Cooper T, Stanley JA, Yang ES.. Synthetic lethal interactions between EGFR and PARP inhibition in human triple negative breast cancer cells. // PLoS One. 2012. Vol. 7. P. e46614; A. Galia, Calogero AE, Condorelli R, Fraggetta F, La Corte A, Ridolfo F, Bosco P, Castiglione R, Salemi M. PARP-1 protein expression in glioblastoma multiforme. // Eur J Histochem. 2012. Vol. 56. P. е9; В. Csete, Lengyel Z,
Figure 00000006
Z,
Figure 00000007
Z. Mar. Poly(adenosine diphosphate-ribose)polymerase-l expression in cutaneous malignant melanomas as a new molecular marker of aggressive tumor. // Pathol Oncol Res. 2009. Vol. 15. P. 47-53; M. Telli, Ford JM. Novel treatment approaches for triple-negative breast cancer. // Clin Breast Cancer. 2010. Vol.10 Suppl 1. P. E16-22; S.N. Shimizu F.; Tomonaga Т.; Sunaga M.; Noda M.; Ebara M.; Saisho H. Expression of poly(ADP-ribose) polymerase in human hepatocellular carcinoma and analysis of biopsy specimens obtained under sonographic guidance. // Oncol. Rep. 2004. Vol. 12. P. 821-825]. При этом повышенный уровень экспрессии ассоциирован с худшим прогнозом выживаемости, поскольку высокий уровень экспрессии PARP-1 коррелирует с более агрессивным фенотипом злокачественных опухолей [P.Н. Domagala Т.; Lubinski J.; Gugala К.; Domagala W. PARP-1 expression in breast cancer including BRCA1-associated, triple negative and basal-like tumors: Possible implications for PARP-1 inhibitor therapy. // Breast Cancer Res. Treat. 2011. Vol. 127. P. 861-869], кроме того, может коррелировать с устойчивостью опухолей к терапии [Michels J.; Vitale I.; Galluzzi L.; Adam J.; Olaussen K.A.; Kepp O.; Senovilla L.; Talhaoui I.; Guegan J.; Enot D.P. Cisplatin Resistance Associated with PARP Hyperactivation. // Cancer Res. 2013. Vol. 73. P. 2271-2280]. Онкогенез может быть вызван PARP-1-зависимой дисрегуляцией факторов, вовлеченных в клеточный цикл, митоз, а также факторов, регулирующих экспрессию генов, связанных с инициацией и развитием опухолей [С.М. Simbulan-Rosenthal, Ly D.H., Rosenthal D.S., Konopka G., Luo R., Wang Z.Q., Schultz P.G., Smulson M.E. Misregulation of gene expression in primary fibroblasts lacking poly(ADP-ribose) polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 11274-11279].One of the promising molecular targets for the search for antitumor agents is poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) - the second most common nuclear protein after histones (on average, there are 1-2 million PARP-1 molecules per cell). PARP-1 is a regulatory protein and is involved in many cellular processes, starting with DNA repair, during its damage, replication, recombination, transcription, up to the regulation of premature aging and cell death. PARP-1 is a key protein that acts as a “sensor” of DNA breaks. A lot of data was obtained on the participation of PARP-1 in the development of the tumor process: it was shown that the expression of PARP-1 is increased in melanomas, lung cancer, breast cancer and other tumor diseases [M.
Figure 00000001
Peralta-Leal A, O'Valle F, Rodriguez-Vargas JM, Gonzalez-Flores A, Majuelos-Melguizo J,
Figure 00000002
L, Serrano S, de Herreros AG,
Figure 00000003
Jc
Figure 00000004
R, Del Moral RG, de
Figure 00000005
JM, Oliver FJ. PARP-1 regulates metastatic melanoma through modulation of vimentin-induced malignant transformation. // PLoS Genet. 2013. Vol. 9. P. el003531; S. Nowsheen, Cooper T, Stanley JA, Yang ES .. Synthetic lethal interactions between EGFR and PARP inhibition in human triple negative breast cancer cells. // PLoS One. 2012. Vol. 7. P. e46614; A. Galia, Calogero AE, Condorelli R, Fraggetta F, La Corte A, Ridolfo F, Bosco P, Castiglione R, Salemi M. PARP-1 protein expression in glioblastoma multiforme. // Eur J Histochem. 2012. Vol. 56. P. e9; B. Csete, Lengyel Z,
Figure 00000006
Z
Figure 00000007
Z. Mar. Poly (adenosine diphosphate-ribose) polymerase-l expression in cutaneous malignant melanomas as a new molecular marker of aggressive tumor. // Pathol Oncol Res. 2009. Vol. 15. P. 47-53; M. Telli, Ford JM. Novel treatment approaches for triple-negative breast cancer. // Clin Breast Cancer. 2010. Vol.10 Suppl 1. P. E16-22; SN Shimizu F .; Tomonaga T .; Sunaga M .; Noda M .; Ebara M .; Saisho H. Expression of poly (ADP-ribose) polymerase in human hepatocellular carcinoma and analysis of biopsy specimens obtained under sonographic guidance. // Oncol. Rep. 2004. Vol. 12. P. 821-825]. Moreover, an increased expression level is associated with a worse prognosis of survival, since a high level of PARP-1 expression correlates with a more aggressive phenotype of malignant tumors [P.N. Domagala T .; Lubinski J .; Gugala K .; Domagala W. PARP-1 expression in breast cancer including BRCA1-associated, triple negative and basal-like tumors: Possible implications for PARP-1 inhibitor therapy. // Breast Cancer Res. Treat. 2011. Vol. 127. P. 861-869], in addition, may correlate with the resistance of tumors to therapy [Michels J .; Vitale I .; Galluzzi L .; Adam J .; Olaussen KA; Kepp O .; Senovilla L .; Talhaoui I .; Guegan J .; Enot DP Cisplatin Resistance Associated with PARP Hyperactivation. // Cancer Res. 2013. Vol. 73. P. 2271-2280]. Oncogenesis can be caused by PARP-1-dependent dysregulation of factors involved in the cell cycle, mitosis, as well as factors that regulate the expression of genes associated with the initiation and development of tumors [S.M. Simbulan-Rosenthal, Ly DH, Rosenthal DS, Konopka G., Luo R., Wang ZQ, Schultz PG, Smulson ME Misregulation of gene expression in primary fibroblasts lacking poly (ADP-ribose) polymerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000. Vol. 97. P. 11274-11279].

Ингибиторы PARP-1 рассматриваются в качестве перспективных противоопухолевых агентов, действующих как химио- и радиосенсибилизаторы при традиционной терапии злокачественных образований. В отдельных случаях при опухолях, в которых нарушены определенные пути репарации ДНК, ингибиторы PARP-1 могут использоваться как самостоятельные лекарственные средства. Практически все существующие ингибиторы PARP-1 являются миметиками никотинамида, т.е. ориентированы на связывание с каталитическим доменом PARP-1 НАД+-связывающей области и конкуренцию с НАД+. При проведении расширенных клинических испытаний ингибиторов PARP-1 обнаружена достаточно высокая токсичность таких соединении, поскольку они блокируют множественные ферментативные пути с участием НАД+, происходящие в клетке (известно, НАД+ это кофактор, который взаимодействует со многими ферментами, вовлеченными в ряд клеточных процессов, поэтому конкуренция с НАД+ приводит к высокой токсичности). Кроме того, не решен вопрос о безопасности длительного применения ингибиторов PARP-1 из-за возникающей устойчивости опухолей к монотерапии [Mandery К., Fromm M.F. // Br. J. Pharmacol. 2012. V. 165. Р. 345-362]. Обнаруженный в клинических исследованиях ингибиторов PARP-1 ряд побочных эффектов заставляют менять стратегию разработки новых препаратов. Во-первых, каталитический центр молекулы PARP-1 устроен сложным образом: в нем есть несколько карманов: 1) карман, непосредственно связывающий никотинамидную часть НАД+; 2) карман для связывания аденозиновой части НАД+; 3) карман, связывающий пирофосфатную часть НАД+. Поэтому есть возможность разработки соединений, проникающих не только в никотимамид-связывающий карман, но и другие примыкающие области, что будет создавать основу для разработки селективных к PARP-1 соединений и уменьшать риск интерференции с другими НАД+ зависимыми ферментами. Кроме того, есть возможность искать мишени действия в других доменах PARP-1, поскольку данный белок мультидоменный и, соответственно, активность PARP-1 можно регулировать ингибированием других функциональных доменов, помимо каталитического домена. Например, получать препараты, направленные на ингибирование связывания PARP-1 с ДНК. Такие работы ведутся: [Kirsanov KI, Kotova Е, Makhov Р, Golovine К, Lesovaya ЕА, Kolenko VM, Yakubovskaya MG, Tulin AV.// Oncotarget. 2014 V. 5. P. 428-437]. Или пытаться «выключить PARP-1», воздействуя на его функцию в регуляции транскрипции [Maluchenko N.V., Kotova Е., Chupyrkina А.А., Nikitin D.V., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M. // Mol. biol. Mosc. 2015. V. 49. №1. P. 1-15; Kotova E., Tulin A.V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. №14. P. 6406-6411].PARP-1 inhibitors are considered promising antitumor agents that act as chemo- and radiosensitizers in the traditional treatment of malignant tumors. In some cases, in tumors in which certain DNA repair pathways are impaired, PARP-1 inhibitors can be used as independent drugs. Almost all existing PARP-1 inhibitors are nicotinamide mimetics, i.e. focused on binding to the catalytic domain of PARP-1 NAD + -binding region and competition with NAD +. When conducting extensive clinical trials of PARP-1 inhibitors, a sufficiently high toxicity of such compounds was found, since they block the multiple enzymatic pathways involving NAD + occurring in the cell (NAD + is known to be a cofactor that interacts with many enzymes involved in a number of cellular processes, therefore, competition with NAD + leads to high toxicity). In addition, the question of the safety of prolonged use of PARP-1 inhibitors due to the emerging resistance of tumors to monotherapy [Mandery K., Fromm M.F. // Br. J. Pharmacol. 2012. V. 165. R. 345-362]. A number of side effects found in clinical studies of PARP-1 inhibitors are forcing a change in the strategy for the development of new drugs. First, the catalytic center of the PARP-1 molecule has a complex structure: it has several pockets: 1) a pocket directly linking the nicotinamide part of NAD +; 2) a pocket for binding the adenosine part of NAD +; 3) a pocket that binds the pyrophosphate part of NAD +. Therefore, it is possible to develop compounds that penetrate not only the nicotimamide-binding pocket, but also other adjacent areas, which will create the basis for the development of PARP-1 selective compounds and reduce the risk of interference with other NAD + dependent enzymes. In addition, it is possible to search for action targets in other PARP-1 domains, since this protein is multi-domain and, accordingly, PARP-1 activity can be regulated by inhibition of other functional domains besides the catalytic domain. For example, to obtain drugs aimed at inhibiting the binding of PARP-1 to DNA. Such work is underway: [Kirsanov KI, Kotova E, Makhov P, Golovine K, Lesovaya EA, Kolenko VM, Yakubovskaya MG, Tulin AV.// Oncotarget. 2014 V. 5. P. 428-437]. Or try to "turn off PARP-1" by affecting its function in the regulation of transcription [Maluchenko N.V., Kotova E., Chupyrkina A.A., Nikitin D.V., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M. // Mol. biol. Mosc. 2015. V. 49. No. 1. P. 1-15; Kotova E., Tulin A.V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010. V. 107. No. 14. P. 6406-6411].

В качестве основы для поиска новых ингибиторов PARP-1 можно использовать тест-системы на основе мононуклеосом. Известно, что нуклеосомы являются структурообразующими единицами хроматина, которые позволяют компактизовать ДНК путем наматывания на нуклеосомный кор. Структура нуклеосом известна - они состоят из октамера гистонов, который опоясан 147 п. н. ДНК. С использованием мононуклеосом проводят многочисленные исследования особенностей процессов транскрипции, репарации, репликации, поскольку нуклеосомы позволяют воссоздать упаковку ДНК, приближенную к естественной. Применение нуклеосомной системы анализа имеет ряд преимуществ, поскольку: 1) в ней воспроизводятся многие эффекты процесса ДНК-зависимых процессов, наблюдаемые в клетке; 2) система собирается из высокоочищенных компонентов: белков и нуклеиновых кислот, что в значительной степени облегчает интерпретацию данных, 3) возможно проведение модификаций данной системы для проведения биохимического, молекулярно-генетического и флуоресцентного анализа; 4) также система может быть модифицирована (функционализирована) введением различных молекулярных мишеней действия лекарств, например, введением молекул, взаимодействующих в нуклеосомой ДНК или гистонами, в частности - PARP-1. Перспективными технологиями для подобных исследований являются флуоресцентные методы анализа взаимодействий белков с нуклеосомами.Mononucleosome-based test systems can be used as the basis for the search for new PARP-1 inhibitors. Nucleosomes are known to be structural units of chromatin that allow compacting of DNA by winding onto the nucleosome core. The structure of nucleosomes is known - they consist of a histone octamer, which is encircled by 147 bp. DNA Using mononucleosomes, numerous studies of the characteristics of transcription, repair, and replication processes are carried out, since nucleosomes make it possible to recreate a package of DNA that is close to natural. The use of the nucleosome analysis system has several advantages, because: 1) it reproduces many effects of the process of DNA-dependent processes observed in the cell; 2) the system is assembled from highly purified components: proteins and nucleic acids, which greatly facilitates the interpretation of data; 3) it is possible to carry out modifications of this system for biochemical, molecular genetic and fluorescence analysis; 4) the system can also be modified (functionalized) by the introduction of various molecular targets for the action of drugs, for example, the introduction of molecules interacting in the DNA nucleosome or histones, in particular PARP-1. Promising technologies for such studies are fluorescent methods for the analysis of interactions of proteins with nucleosomes.

Известен способ обнаружения и измерения присутствия моно-нуклеосом и олиго-нуклеосом и использование таких измерений для обнаружения и диагностики заболеваний [United States Patent Application 20140206015 Method for detecting nucleosomes // Application Number 14/239,782]. Данный способ обнаружения нуклеосом в образце включает взаимодействие тестируемого образца с двумя или более связывающих агентами, которые связываются с различными эпитопами нуклеосом (в качестве агентов используются меченные антитела). При использовании антител, маркированных флурофорами могут быть использованы флюоресцентые методы детекции. Недостаток данного способа заключается в том, что в системе отсутствует молекулярная мишень-PARP-1, а, кроме того, флуоресцентная детекция основана не на SP-FRET взаимодействии (как в предлагаемом способе), а на иммунофлуоресцентном методе анализа, что уменьшает чувствительность метода и не позволяет детектировать взаимодействия единичных молекул.A known method for detecting and measuring the presence of mono-nucleosomes and oligonucleosomes and the use of such measurements for the detection and diagnosis of diseases [United States Patent Application 20140206015 Method for detecting nucleosomes // Application Number 14 / 239,782]. This method for detecting nucleosomes in a sample involves the interaction of the test sample with two or more binding agents that bind to different epitopes of nucleosomes (labeled antibodies are used as agents). When using antibodies labeled with fluorophores, fluorescence detection methods can be used. The disadvantage of this method is that there is no molecular target-PARP-1 in the system, and, in addition, fluorescence detection is not based on SP-FRET interaction (as in the proposed method), but on the immunofluorescence analysis method, which reduces the sensitivity of the method and does not allow detecting interactions of single molecules.

Известен способ использования нуклеосом в качестве флоуресцентых биосенсоров [United States Patent Application 20090062130 Nucleosome-based biosensors//Application Number 11/687859]. Подобный биосенсор состоит по крайней мере из одной нуклеосомы, состоящей из ДНК-регулирующего транскрипционного элемента, в котором ДНК помечена двумя метками (а гистоновый октамер остается немеченым). В ДНК введена последовательность, взаимодействующая с лигандом ядерных рецепторов. Система предложена для высокопроизводительного скрининга определенных веществ агонистов и антагонистов ядерных рецепторов, что ограничивает использование данного способа в отношении ингибиторов PARP-1.A known method of using nucleosomes as fluorescent biosensors [United States Patent Application 20090062130 Nucleosome-based biosensors // Application Number 11/687859]. Such a biosensor consists of at least one nucleosome consisting of a DNA regulatory transcriptional element in which the DNA is labeled with two labels (and the histone octamer remains unlabeled). A sequence is introduced into the DNA that interacts with the ligand of nuclear receptors. The system is proposed for high-throughput screening of certain substances of agonists and antagonists of nuclear receptors, which limits the use of this method in relation to PARP-1 inhibitors.

Известен способ идентификации агентов, которые модулируют активность гистона модифицирующих ферментов, такие как ацетилазы, деацетилаз, метилтрансферазы, деметилазы, киназы и т.д. [United States Patent Application 20080070257 A1 High throughput screening assay for histone modifying enzyme modulators //Application Number 11/854611]. В данном способе используют собранные и иммобилизованные нуклеосомы, тестируют способность агентов модулировать активность гистон-модифицирующих ферментов. Способ идентификации агента, который модулирует пост-трансляционную модификацию гистонов заключается в следующем - осуществляют взаимодействие иммобилизованных собранных нуклеосом и гистон-модифицирующего фермента с тестируемым агентом, и на основе флуоресцентного анализа определяют модулирует ли тестируемое средство активность гистон-модифицирующего фермента. Недостаток данного способа заключается в том, что с помощью такого подхода невозможно обнаружить ингибиторы PARP-1, поскольку они не модифицируют гистоны.A known method for identifying agents that modulate the activity of histone modifying enzymes, such as acetylases, deacetylases, methyltransferases, demethylases, kinases, etc. [United States Patent Application 20080070257 A1 High throughput screening assay for histone modifying enzyme modulators // Application Number 11/854611]. In this method, assembled and immobilized nucleosomes are used, and the ability of agents to modulate the activity of histone-modifying enzymes is tested. A method for identifying an agent that modulates the post-translational modification of histones is as follows: the immobilized assembled nucleosomes and histone-modifying enzyme interact with the test agent, and based on fluorescence analysis, it is determined whether the test agent modulates the activity of the histone-modifying enzyme. The disadvantage of this method is that using this approach it is impossible to detect PARP-1 inhibitors, since they do not modify histones.

Известен также способ определения связывания и/или функционального взаимодействия, представляющего интерес белка с нуклеосомой [WO 2015104431 А1, Nucleosome substrate assays// Application Number PCT/EP2015/050515]. В одном из вариантов осуществления предложенного способа, представляющий интерес, белок метят FRET акцептором, а нуклеосомный субстрат метят соответствующим FRET донором. В еще одном варианте осуществления композиция веществ дополнительно содержит репортерный белок (это антитело или гистон-связывающий домен), способный распознавать гистон, имеющего посттрансляционную модификацию. Недостаток данного способа, как и в предыдущем случае, заключается в том, что не применим для поиска ингибиторов PARP-1, поскольку PARP-1 не модифицирует гистоны.There is also a method of determining the binding and / or functional interaction of interest of a protein with a nucleosome [WO 2015104431 A1, Nucleosome substrate assays // Application Number PCT / EP2015 / 050515]. In one embodiment of the proposed method of interest, the protein is labeled with an FRET acceptor, and the nucleosome substrate is labeled with an appropriate FRET donor. In yet another embodiment, the composition of the substances further comprises a reporter protein (an antibody or histone binding domain) capable of recognizing a histone having a post-translational modification. The disadvantage of this method, as in the previous case, is that it is not applicable for the search for PARP-1 inhibitors, since PARP-1 does not modify histones.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является метод, описанный в статье [К.С. Кудряшова, Д.В. Никитин, О.В. Чертков, Н.С. Герасимова, М.Е. Валиева, В.М. Студитский, А.В. Феофанов Разработка флуоресценто-меченых мононуклеосом для изучения механизмов транскрипции методом микросокпии одиночных комплексов //Вестник. Московского Университета. СЕР. 16. Биология. 2015. №4, с. 41-45], в котором мононуклеосомы собирали на (Су3, Су5)-меченой ДНК-матрице с позиционирующей последовательностью с линкерной ДНК, 20 п. о, в ходе диализа против уменьшающейся концентрации NaCl по протоколу, опубликованному ранее [D.A. Gaykalova, Kulaeva OI, Pestov NA, Hsieh FK, Studitsky VM. Experimental analysis of the mechanism of chromatin remodeling by RNA polymerase II. // Methods Enzymol. 2012. Vol.512. P. 293-314; D.A. Gaykalova, Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes. // Methods Mol. Biol. 2009. Vol.523. P. 109-23]. Нуклеосомную ДНК получали при помощи полимеразной цепной реакции (ПНР) с использованием опубликованных флуоресцентно-меченых ДНК-праймеров. Данные праймеры обеспечивали введение пары FRET меток Су3/Су5 в срединное по отношению к точке входа ДНК в нуклеосому. Недостаток этого способа заключается в том, что флуоресцентные сенсорные метки располагаются в срединном положении, что позволяет детектировать события, касающиеся обширного отворачивания ДНК, доходящего с точки входа до середины нуклеосомы. В таком расположении метки не чувствительны к детекции событий, происходящих на входе/выходе из нуклеосомы и в линкерных участках. Учитывая, что в линкерных областях и на входе/выходе нуклеосомы происходят важные структурные перестройки во время регуляции транскрипции, то размещение флуоресцентных сенсоров в область входа в нуклеосому (проксимальное) позволит детектировать взаимодействие целого ряда белковых регуляторов с нуклеосомой. Кроме того, в описанном в статье способе не предложено введение в нуклеосомную систему таргетных белков, поэтому он не применим для поиска ингибиторов PARP-1.The closest technical solution (prototype) is the method described in the article [K.S. Kudryashova, D.V. Nikitin, O.V. Chertkov, N.S. Gerasimova, M.E. Valieva, V.M. Studitsky, A.V. Feofanov Development of fluorescence-labeled mononucleosomes for studying the mechanisms of transcription by the method of microcopy of single complexes // Vestnik. Moscow University. SER. 16. Biology. 2015. No4, p. 41-45], in which mononucleosomes were collected on a (Cy3, Cy5) -labeled DNA matrix with a positioning sequence with linker DNA, 20 bp, during dialysis against a decreasing concentration of NaCl according to the protocol published previously [D.A. Gaykalova, Kulaeva OI, Pestov NA, Hsieh FK, Studitsky VM. Experimental analysis of the mechanism of chromatin remodeling by RNA polymerase II. // Methods Enzymol. 2012. Vol. 512. P. 293-314; D.A. Gaykalova, Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes. // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 523. P. 109-23]. Nucleosomal DNA was obtained by polymerase chain reaction (NDP) using published fluorescently-labeled DNA primers. These primers provided the introduction of a pair of FRET labels of Cy3 / Cy5 into the median with respect to the entry point of DNA into the nucleosome. The disadvantage of this method is that the fluorescent sensor labels are located in the middle position, which allows you to detect events related to extensive DNA folding, reaching from the entry point to the middle of the nucleosome. In this arrangement, the labels are not sensitive to the detection of events occurring at the entrance / exit of the nucleosome and in the linker sites. Considering that important structural rearrangements take place in the linker regions and at the nucleosome entry / exit during transcriptional regulation, the placement of fluorescent sensors in the nucleosome entry region (proximal) will allow the interaction of a number of protein regulators with the nucleosome to be detected. In addition, the method described in the article does not propose the introduction of targeted proteins into the nucleosome system, therefore, it is not applicable for the search for PARP-1 inhibitors.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей заявляемой группы изобретений является разработка тест-системы для скрининга химических соединений на наличие ингибирующей активности в отношении PARP-1 на основе SP-FRET-микроскопии (single-particle FRET микроскопии, FRET микроскопии единичных частиц, sp-FRET) на основе использования мононуклеосомной системы и способа ее применения.The task of the claimed group of inventions is to develop a test system for screening chemical compounds for inhibitory activity against PARP-1 based on SP-FRET microscopy (single-particle FRET microscopy, FRET single particle microscopy, sp-FRET) using the mononucleosome system and how to use it.

Поставленная задача решается тест-системой для скрининга химических соединений на наличие ингибирующей активности в отношении PARP-1 на основе FRET-микроскопии единичных частиц (spFRET), представляющей собой смесь, включающую комплекс мононуклеосомы на нуклеосом-позиционирующей ДНК-матрице, меченной парой флуорофоров, формирующих донор-акцепторные пары для реализации эффекта FRET; белок PARP-1, взятый по меньшей мере в 20-кратном молярном избытке по отношении к мононуклеосоме, и его субстрат - НАД+, взятый по меньшей мере в 2000-кратном молярном избытке по отношению к PARP-1.The problem is solved by a test system for screening chemical compounds for inhibitory activity against PARP-1 on the basis of single-particle FRET microscopy (spFRET), which is a mixture comprising a mononucleosome complex on a nucleosome-positioning DNA matrix labeled with a pair of fluorophores forming donor-acceptor pairs for the implementation of the FRET effect; protein PARP-1 taken in at least a 20-fold molar excess with respect to the mononucleosome, and its substrate NAD + taken in at least a 2000-fold molar excess with respect to PARP-1.

Предпочтительно использовать ДНК-матрицу, модифицированную линкером, позволяющим иммобилизовать комплекс на твердой поверхности.It is preferable to use a DNA template modified with a linker that allows the complex to be immobilized on a solid surface.

Предпочтительно, когда смесь иммобилизована на твердой поверхности.Preferably, the mixture is immobilized on a solid surface.

Предпочтительно, когда твердая поверхность представляет собой поверхности лунок планшета или зерен сорбента, в виде пробирок, планшетов для микротитрования, шариков, пленок. Наиболее предпочтительно, когда твердые поверхности изготовлены из природных или искусственных полимерных материалов, включая полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, целлюлоза, нитроцеллюлоза, нейлон, гели декстрана, полиакриламида, агарозы, стекло, кварц и др. Твердая фаза может быть в виде пробирок, планшетов для микротитрования с пластиковым или стеклянным дном, стеклянных пластинок, шариков, пленок и др.Preferably, when the solid surface is the surface of the wells of the tablet or grains of the sorbent, in the form of tubes, tablets for microtiter, balls, films. Most preferably, solid surfaces are made of natural or artificial polymeric materials, including polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene, cellulose, nitrocellulose, nylon, dextran gels, polyacrylamide, agarose, glass, quartz, etc. The solid phase can be in the form of tubes, tablets for microtiter with a plastic or glass bottom, glass plates, balls, films, etc.

Предпочтительно, когда пара флуорофоров, формирующих донор-акцепторные пары для реализации эффекта FRET, расположена в проксимальном или дистальном или серединном положении относительно входа ДНК в нуклеосому.Preferably, when a pair of fluorophores forming donor-acceptor pairs for the implementation of the FRET effect is located in the proximal or distal or mid-position relative to the entry of DNA into the nucleosome.

Предпочтительно в качестве пара флуорофоров, формирующих донор-акцепторные пары для реализации эффекта FRET использовать флуорофоры

Figure 00000008
радиус которых составляет до 10 нм.It is preferable to use fluorophores as a pair of fluorophores forming donor-acceptor pairs to realize the FRET effect.
Figure 00000008
whose radius is up to 10 nm.

Предпочтительно пары флуорофоров, выбирать из группы Су3/Су5, BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Су3, GFP-mOrange, YFP-RFP, TagBFP-TagGFP2, TagGFP2-TagRFP.Preferably, fluorophore pairs are selected from the groups Cy3 / Cy5, BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Cy3, GFP-mOrange, YFP-RFP, TagBFP-TagGFP2, TagGFP2-TagRFP.

Предпочтительно использовать нуклеосом-позиционирующую ДНК-матрицу дополнительно содержащую гистон H1 натурального или рекомбинантного происхождения, взятый в избытке по отношению к нуклеосомам. Существует также вариант, в котором для сборки нуклеосомных матриц дополнительно используют гистон HI как натурального, так и рекомбинантного происхождения.It is preferable to use a nucleosome-positioning DNA matrix additionally containing histone H1 of natural or recombinant origin, taken in excess relative to the nucleosomes. There is also an option in which histone HI of both natural and recombinant origin is additionally used to assemble nucleosome matrices.

Предпочтительно комплекс нуклеосомы на нуклеосом-позиционирующей ДНК-матрице получать с использованием нативных или мутантных коровых гистоновых белков. Можно использовать также вариант, в котором для сборки нуклеосомных матриц используют препараты гистонов различного происхождения или мутантные гистоновые белки (Sin-мутанты и др.).Preferably, the nucleosome complex on the nucleosome positioning DNA template is prepared using native or mutant core histone proteins. You can also use the option in which for the assembly of nucleosome matrices using histone preparations of various origins or mutant histone proteins (Sin mutants, etc.).

Существует способ, характеризующийся тем, что перед внесением агентов в систему проводят предварительное математическое моделирование.There is a method characterized in that prior to introducing the agents into the system, preliminary mathematical modeling is carried out.

Также поставленная задача решается способом скрининга химических соединений на наличие ингибирующей активности в отношении PARP-1 на основе FRET-микроскопии единичных частиц (spFRET), включающим разделение смеси, содержащей комплекс мононуклеосомы на нуклеосом-позиционирующей ДНК-матрице, меченной парой флуорофоров, формирующих донор-акцепторные пары для реализации эффекта FRET; белок PARP-1 и его субстрат -НАД+, на аликвоты, при этом одну из аликвот - без внесения химических соединений, используют в качестве контрольного образца, в другую аликвоту вносят исследуемое химическое соединение, после чего проводят измерение spFRET с получением кривой частотного распределения нуклеосом по величине FRET исследуемого и контрольного образцов, где профиль кривой, характеризующей контрольный образец, имеет два максимума, при этом вывод о наличии у исследуемого соединения ингибирующей активности в отношении PARP-1 делают при выявлении у кривой, характеризующей исследуемое соединение, одного максимума, лежащего в интервале значений между двумя максимумами кривой, характеризующей контрольный образец.The problem is also solved by a method for screening chemical compounds for inhibitory activity against PARP-1 based on single particle particle FRET microscopy (spFRET), including separation of a mixture containing a mononucleosome complex on a nucleosome-positioning DNA matrix labeled with a pair of fluorophores forming donor acceptor pairs for the implementation of the FRET effect; PARP-1 protein and its substrate, NAD +, in aliquots, while one of the aliquots without chemical compounds is used as a control sample, the studied chemical compound is introduced into another aliquot, after which spFRET is measured to obtain a curve of the frequency distribution of nucleosomes by the FRET value of the test and control samples, where the profile of the curve characterizing the control sample has two maxima, and the conclusion about the presence of the inhibitory activity of the test compound against PARP-1 is made when and the curve characterizing the test compound has one maximum lying in the interval between the two maxima of the curve characterizing the control sample.

Предпочтительно в третью аликвоту вносят референсное химическое соединение, с последующим измерением частотного распределения нуклеосом по величине FRET и при выявлении у кривой одного максимума, лежащего в интервале значений между двумя максимумами кривой, характеризующей контрольный образец делают вывод о работоспособности полученной тест-системы.Preferably, a reference chemical compound is added to the third aliquot, followed by measurement of the frequency distribution of nucleosomes by the FRET value and when a curve identifies one maximum lying in the range between the two maxima of the curve characterizing the control sample, we conclude that the obtained test system is working.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в расширении функциональных возможностей используемой системы путем внесения белка PARP-1 - молекулярной мишени действия лекарственных препаратов (химических соединений) и субстрата, активирующего белок PARP-1 - НАД+. В модифицированную по сравнению с прототипом систему затем будут вноситься различные тестируемые соединения - потенциальные ингибиторы действия PARP-1 и проводиться оценка изменения частотного распределения нуклеосом по величине FRET до и после внесения тестируемого соединения. Для сравнения используется положительный контроль в виде референс образца - олапариба. Изменения в профиле FRET определяют селективность системы по отношению к действию ингибиторов PARP-1. Несомненным преимуществом используемой системы является минимализация компонентов - для детекции используется только флуоресцентно меченная нуклеосома в нековалетном комплексе с активированным PARP-1 и тестируемое соединение. Такая минимальная флуоресцентно меченная система может стать основой для разработки современного метода высокопроизводительного скрининга (high throughput screening, HTS), когда в планшеты (от 96 до 1536 луночного формата) раскапывается система детекции, а роботизированная станция вносит в отдельные лунки соединение из большой серии однотипных молекул и затем проводится реакция и анализ изменений. На основании полученных результатов делается вывод о биологической активности множества разнообразных соединений и выявление среди них соединений-лидеров с наилучшими характеристиками. Высокочувствительные флуоресцирующие метки идеально подходят для подобных широкомасштабных биоаналитических исследований. В последние годы ведущие научные центры и фармацевтические компании всего мира прикладывают значительные усилия к внедрению технологий высокопроизводительного скрининга. Использование высокопроизводительного скрининга позволяет оценивать до 300000 соединений в день, таким образом, для проведения скрининга миллионов веществ потребуется несколько недель.The technical result of the invention consists in expanding the functionality of the system used by introducing the PARP-1 protein, the molecular target of the action of drugs (chemical compounds) and the PARP-1 protein activating substrate, NAD +. Modified as compared with the prototype system, various test compounds will then be introduced — potential inhibitors of the PARP-1 action, and the change in the frequency distribution of nucleosomes by the FRET value will be evaluated before and after the test compound is introduced. For comparison, a positive control is used in the form of a reference sample - olaparib. Changes in the FRET profile determine the selectivity of the system with respect to the action of PARP-1 inhibitors. The undoubted advantage of the system used is the minimization of components - only fluorescently labeled nucleosome in a non-calet complex with activated PARP-1 and the test compound are used for detection. Such a minimal fluorescently labeled system can become the basis for the development of a modern method of high throughput screening (HTS), when a detection system is dug up into tablets (from 96 to 1536 well format) and a robotic station introduces a compound from a large series of molecules of the same type into individual wells and then a reaction and change analysis is carried out. Based on the results obtained, the conclusion is drawn about the biological activity of many diverse compounds and the identification of leading compounds with the best characteristics among them. Highly sensitive fluorescent labels are ideal for such large-scale bioanalytical studies. In recent years, leading research centers and pharmaceutical companies around the world have made significant efforts to introduce high-performance screening technologies. Using high throughput screening allows you to evaluate up to 300,000 compounds per day, so it will take several weeks to screen millions of substances.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг. 1 показано схематичное изображение модельной нуклеосомы с небольшим 20 п.н. линкерным участком, в цепи нуклеосомной ДНК, в проксимальном положении введены два флуорофора (звездочка А - донор возбуждения Су3, звездочка Б - акцептор возбуждения Су5).In FIG. 1 shows a schematic representation of a model nucleosome with a small 20 bp two fluorophores were introduced at the proximal linker site in the nucleosomal DNA chain (asterisk A is a Cy3 excitation donor, asterisk B is a Cy5 excitation acceptor).

На фиг. 2 показаны результаты измерений 7 образцов методом spFRET, где под цифрой 1 - частотное распределение нуклеосомы (N=8222), 2 - нуклеосома в комплексе с PARP-1 (N=1862), 3 - нуклеосома в комплексе с PARP-1 в присутствии НАД+ (N=11345), 4 - нуклеосома в комплексе с PARP-1 в присутствии олапариба (N=2923), 5 - нуклеосома в комплексе с PARP-1 в присутствии олапариба и НАД+ (N=2088), 6 - нуклеосома в комплексе с PARP-1 в присутствии НАД+ (N=1849), 7 - нуклеосома в комплексе с PARP-1 в присутствии олапариба и НАД+ (N=1615).In FIG. 2 shows the results of measurements of 7 samples by the spFRET method, where under the number 1 is the frequency distribution of the nucleosome (N = 8222), 2 is the nucleosome in complex with PARP-1 (N = 1862), 3 is the nucleosome in complex with PARP-1 in the presence of NAD + (N = 11345), 4 - nucleosome in complex with PARP-1 in the presence of olaparib (N = 2923), 5 - nucleosome in complex with PARP-1 in the presence of olaparib and NAD + (N = 2088), 6 - nucleosome in complex with PARP-1 in the presence of NAD + (N = 1849), 7 - nucleosome in complex with PARP-1 in the presence of olaparib and NAD + (N = 1615).

На фиг. 3 показаны частотные распределения по величине FRET нуклеосом (1) и нуклеосом в комплексе с PARP-1 (2), измеренные методом spFRET.In FIG. Figure 3 shows the frequency distributions of FRETs of nucleosomes (1) and nucleosomes in complex with PARP-1 (2), measured by spFRET.

На фиг. 4 представлены частотные распределения по величине FRET нуклеосом в комплексе с PARP-1 в присутствии НАД+, измеренные методом spFRET.In FIG. Figure 4 shows the frequency distributions of the FRET of nucleosomes in complex with PARP-1 in the presence of NAD +, as measured by spFRET.

На фиг. 5 представлены частотные распределения по величине FRET нуклеосом в комплексе с PARP-1 в присутствии олапариба (слева), а также олапариба и НАД+ (справа). Измерения выполнены методом spFRET.In FIG. Figure 5 shows the frequency distributions of the FRET nucleosomes in complex with PARP-1 in the presence of olaparib (left), as well as olaparib and NAD + (right). The measurements were performed using the spFRET method.

На фиг. 6 показано действие тестируемого химического соединения (ингибитора) можно наблюдать в реакции активации PARP-1 при взаимодействии с нуклеосомами, сравнивая пики в частотных распределениях нуклеосом по величине FRET до внесения тестируемого соединения (ингибитора) и после.In FIG. Figure 6 shows the effect of the test chemical compound (inhibitor) can be observed in the PARP-1 activation reaction when interacting with nucleosomes, comparing the peaks in the frequency distributions of nucleosomes by the FRET value before and after the test compound (inhibitor) was introduced.

На фиг. 7 показана тест-система детекции связывания с ингибитором в модифицированном виде: сначала прединкубация PARP-1 с НАД+, затем внесение тестируемого химического соединения.In FIG. Figure 7 shows a modified detection inhibitor binding test system: first, pre-incubation of PARP-1 with NAD +, then application of the test chemical compound.

На фиг. 8 представлена схема сборки нуклеосом для иммобилизации на подложке.In FIG. Figure 8 shows the assembly of nucleosomes for immobilization on a substrate.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Реализация данного способа может служить основой для получения высокопроизводительной коммерческой системы поиска новых противоопухолевых лекарственных препаратов, направленных на PARP-1. Для оценки конкурентоспособности и патентоспособности результатов авторами заявки был проведен информационный поиск по патентным базам данных и по работам, опубликованным в открытой печати. Анализ результатов поиска показал, что предлагаемый подход не используется в исследовательской и медицинской практике, не описан в открытых источниках и не защищен патентами.The implementation of this method can serve as the basis for a high-performance commercial search system for new anticancer drugs aimed at PARP-1. To assess the competitiveness and patentability of the results, the authors of the application carried out an information search on patent databases and on works published in the open press. Analysis of the search results showed that the proposed approach is not used in research and medical practice, is not described in open sources and is not protected by patents.

Для реализации способа используют препараты гистонов различного происхождения или мутантные гистоновые белки, например [Hsieh FK, Fisher М,

Figure 00000009
A, Studitsky VM, Luse DS.//Histone Sin mutations promote nucleosome traversal and histone displacement by RNA polymerase II.//EMBO Rep. 2010 Sep; 11(9):705-10. doi: 10.1038/embor.2010.113].To implement the method, histone preparations of various origins or mutant histone proteins are used, for example [Hsieh FK, Fisher M,
Figure 00000009
A, Studitsky VM, Luse DS.// Histone sin mutations promote nucleosome traversal and histone displacement by RNA polymerase II.//EMBO Rep. 2010 Sep; 11 (9): 705-10. doi: 10.1038 / embor.2010.113].

В качестве линкера для модификации ДНК-матрицы, позволяющего иммобилизовать комплекс на твердой поверхности, используют биотинилированный спейсер (фиг. 8). Для иммобилизации смеси на стекле в состав флуоресцентно меченой ДНК матрицы перед промотером должен быть введен олигонуклеотидный фрагмент (спейсер) с биотином на 3'-конце. На первой стадии иммобилизованные нуклеосомы собираются так же, как и обычные (см. ниже). Затем по сайту TSPRI лигируется следующий линкерный участок, содержащий биотин на 5' конце:A biotinylated spacer is used as a linker for modifying the DNA template to immobilize the complex on a solid surface (Fig. 8). To immobilize the mixture on glass, an oligonucleotide fragment (spacer) with biotin at the 3'-end must be introduced into the fluorescently labeled template DNA before the promoter. In the first stage, immobilized nucleosomes are assembled in the same way as ordinary nucleosomes (see below). Then, the following linker site containing biotin at the 5 'end is ligated to the TSPRI site:

Figure 00000010
Figure 00000010

Таким образом, этот участок лигируется непосредственно к собранной нуклеосоме в следующих условиях: Т4 Lig Buff, PEG 4000, BSA, T4 Lig30 u 0.5 мкл, все концентрации в соответствии с рекомендациями производителя, объем 30 мкл, 16°С в течение ночи. При этом комплекс оказывается ковалентно или нековалетно прикреплен к твердой поверхности носителя.Thus, this region is ligated directly to the assembled nucleosome under the following conditions: T4 Lig Buff, PEG 4000, BSA, T4 Lig30 u 0.5 μl, all concentrations in accordance with the manufacturer's recommendations, volume 30 μl, 16 ° С overnight. In this case, the complex is covalently or non-covalently attached to the solid surface of the carrier.

Данную модификацию осуществляют известным специалисту в данной области техники способом, например, Кудряшова К.С., Чертков О.В., Иванов Я.О., Студитский B.М., Феофанов А.В. Экспериментальная установка для изучения одиночных иммобилизованных нуклеосом с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. 2016; (2):37-42.This modification is carried out by a method known to a person skilled in the art, for example, Kudryashova KS, Chertkov OV, Ivanov Ya.O., Studitsky B.M., Feofanov A.V. An experimental setup for studying single immobilized nucleosomes using fluorescence microscopy of total internal reflection. Bulletin of Moscow University. Series 16. Biology. 2016; (2): 37-42.

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С.All reagents used are commercially available, all procedures, unless otherwise specified, were carried out at room temperature or ambient temperature, that is, in the range from 18 to 25 ° C.

Способ использования специальных функциональных нуклеосомных матриц для проведения скрининга для тестирования ингибиторов PARP-1 реализуется следующим образом.The method of using special functional nucleosome matrices for screening for testing PARP-1 inhibitors is implemented as follows.

Методика реализации способаMethodology for implementing the method

1. Сборка мононуклеосом1. Assembly of mononucleosomes

Вначале проводят сборку нуклеосом на матричной ДНК согласно опубликованному ранее протоколу [D.A. Gaykalova, Kulaeva OI, Pestov NA, Hsieh FK, Studitsky VM. Experimental analysis of the mechanism of chromatin remodeling by RNA polymerase II. // Methods Enzymol. 2012. Vol. 512. P. 293-314; D.A. Gaykalova, Kulaeva O.I., Bondarenko V.A., Studitsky V.M. Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes. // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 523. P. 109-23] с модификациями [M. Valieva, Armeev G.A., Kudryashova Ks.S., Gerasimova N.S., Shaytan A.K., Kulaeva O.I., McCullough L.L, Formosa T, Georgiev P.G., Kirpichnikov M.P., Studitsky V.M., Feofanov A.V. Large-Scale ATP-Independent Nucleosome Unfolding by a Histone Chaperone. // Nature Structure and Molecular Biology. 2016. Vol. Р.]. Кратко: нуклеосомы собирают на целевой флуоресцентно-меченой ДНК и донорном хроматине методом диализа против растворов с понижающейся ионной силой. В ходе диализа получаются коровые (безлинкерные) нуклеосомы, которые хранят в силиконизированных пробирках (Eppendorf) при ±4°С (заморозка не допускается). Качество сборки определяют измерением электрофоретической подвижности (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) в 4% полиакриламидном геле (ПААГ). Собранные нуклеосомы очищали от примесей методом препаративного электрофореза в ПААГ. В ходе сборки формируются нуклеосомы, одна из цепей ДНК которой меченная двумя флуорофорами - Су3 (донор) и Су5 (акцептор) - которые после укладки ДНК на гистоновом октамере оказываются на соседних участках ДНК и взаимодействуют по механизму Ферстеровского резонансного переноса энергии (

Figure 00000011
Resonance Energy Transfer, FRET) (фиг. 1). Существует вариант, когда используют другие пары флуорофоров, формирующие донор-акцепторные пары для реализации эффекта FRET. Возможно введение меток в различные положения относительно входа ДНК в нуклеосому: проксимальное, срединное, дистальное [Stein IH, S.V.,
Figure 00000012
Р, Tinnefeld Р, Liedl Т.: Single-molecule FRET ruler based on rigid DNA origami blocks.. / Stein IH, S.V.,
Figure 00000013
P, Tinnefeld P, Liedl T. // Journal Single-molecule FRET ruler based on rigid DNA origami blocks. - 2011. - T. 25. - C. 689-695].First, nucleosomes are assembled on template DNA according to the previously published protocol [DA Gaykalova, Kulaeva OI, Pestov NA, Hsieh FK, Studitsky VM. Experimental analysis of the mechanism of chromatin remodeling by RNA polymerase II. // Methods Enzymol. 2012. Vol. 512. P. 293-314; DA Gaykalova, Kulaeva OI, Bondarenko VA, Studitsky VM Preparation and analysis of uniquely positioned mononucleosomes. // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 523. P. 109-23] with modifications [M. Valieva, Armeev GA, Kudryashova Ks.S., Gerasimova NS, Shaytan AK, Kulaeva OI, McCullough LL, Formosa T, Georgiev PG, Kirpichnikov MP, Studitsky VM, Feofanov AV Large-Scale ATP-Independent Nucleosome Unfolding by a Histone Chaperone. // Nature Structure and Molecular Biology. 2016. Vol. R.]. Briefly: nucleosomes are harvested on the target fluorescently-labeled DNA and donor chromatin by dialysis against solutions with decreasing ionic strength. During dialysis, core (linker-free) nucleosomes are obtained, which are stored in siliconized tubes (Eppendorf) at ± 4 ° C (freezing is not allowed). Build quality is determined by measuring electrophoretic mobility (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA) in 4% polyacrylamide gel (PAGE). The collected nucleosomes were purified from impurities by preparative electrophoresis in SDS page. During assembly, nucleosomes are formed, one of the DNA chains of which is labeled with two fluorophores - Cy3 (donor) and Cy5 (acceptor) - which, after folding of the DNA on the histone octamer, are in neighboring DNA regions and interact according to the Forster resonance energy transfer mechanism (
Figure 00000011
Resonance Energy Transfer, FRET) (Fig. 1). There is an option when other pairs of fluorophores are used that form donor-acceptor pairs to realize the FRET effect. It is possible to introduce labels at various positions relative to the entry of DNA into the nucleosome: proximal, median, distal [Stein IH, SV,
Figure 00000012
P, Tinnefeld P, Liedl T .: Single-molecule FRET ruler based on rigid DNA origami blocks .. / Stein IH, SV,
Figure 00000013
P, Tinnefeld P, Liedl T. // Journal Single-molecule FRET ruler based on rigid DNA origami blocks. - 2011. - T. 25. - C. 689-695].

2. Очистка рекомбинатного PARP-12. Purification of Recombinant PARP-1

Гены, кодирующие полноразмерные белки человека PARP-1, отдельные домены PARP-1, а также мутантные формы PARP-1 (полученные нами ранее в сотрудничестве с институтом Fox Chase Cancer Center, США) направленно клонировали в вектор экспрессии рЕТ28 (Novagen/EMD Millipore) по сайтам NdeI/XhoI. РЕТ28 плазмида кодирует N-концевые участки расщепления His-tag/thrombin site/T7-tag и имеющий С-концевой His-tag. Эти векторы используются с лямбда DE3 лизогенными штаммами Е. coli. В этих штаммах экспрессия геномной копии РНК-полимеразы Т7 находится под контролем lac репрессора. Экспрессия рекомбинантного белка индуцируется добавлением IPTG в культуральную среду. В рЕТ векторах Т7-промотор запускает экспрессию рекомбинантного гена. Клонированные клетки рассеивали на подогретые чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл канамицина и 35 мкг/мл хлорамфеникола и инкубировали в течение ночи при 37°С. Одиночные колонии использовали для получения ночной культуры 100 мл LB среды с добавкой 50 мкг/мл канамицина и 35 мкг/мл хлорамфеникола и 1% глюкозы (рЕТ28 вектора экспрессии содержат ген lacI, подавляющий экспрессию Т7 в присутствии глюкозы). Инкубировали при перемешивании в течение ночи при 37°С. Затем 10 мл ночной культуры инокулировали в литр свежей LB среды, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 35 мкг/мл хлорамфеникола и инкубировали при перемешивании при 37°С до достижения оптической плотности OD600 от 0,4 до 0,6, соответствующей середине логарифмической фазе роста. Было показано, что для хорошего выхода полноразмерного PARP-1, необходимо получить 6 л культуры. Для доменов PARP-1 меньшего размера достаточно от 2 до 4 л культуры. Добавляли к культуре 100 мМ ZnSO4 до конечной концентрации 0,1 мМ и продолжали инкубировать при перемешивании при 37°С до достижения OD 600 от 0,8 до 1,0. Затем культуру охлаждали на льду в течение 1 ч и инициировали индукцию белка добавлением IPTG до конечной концентрации 0,2 мМ. Культуру инкубировали при 16°С при встряхивании в течение ночи (>16 ч). Клеточный осадок собирали центрифугированием при 4°С (30 мин 2600×g). Удаляли супернатант и осадок ресуспендировали в 25 мл буфера ТСЕР 1 на 1 л культуры. Осадок переносили в охлажденный стальной стакан и перемешивали на льду, при этом медленно добавляли NP-40 до финальной 0,1% концентрации, PMSF до 1 мМ, ингибиторы протеаз: лейпептин (до конечной концентрации 0,5 мкг/мл), пепстатин А (до конечной концентрации 0,7 мкг/мл) antipain (до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и апротинин (до конечной концентрации 0,5 мкг/мл). Клетки лизировали на холоде, используя клеточный гомогенизатор «под давлением» EmulsiFlex (Avestin). Затем лизат центрифугировали при при 4°С (2 ч, 40000×g) для удаления клеточного дебриса, при этом PARP-1 белки остаются в супернатанте. Затем полученный супернатант подвергали трехступенчатой очистке на 5-мл никелевую HiTrap Chelating колонку (GE Healthcare) согласно рекомендациям производителя, затем отмывали 15 объемами дистиллированной воды и уравновешивали буфером ТСЕР-2. His-tag PARP-1 белки должны связываться с колонкой. Проскоки собирали. Затем колонку последовательно отмывали: (1) 50 мл промывочного буфера 3 с низкой концентрацией соли, (2) 50 мл промывочного буфера 4 с высокой концентрацией соли, (3) и снова 50 мл промывочного буфера 5 с низкой концентрацией соли. Все отмывки проводили при низком давлении насоса, при скорости потока 3 мл/мин. Образцы, полученные после никелевой колонки, наносили на гепариновую колонку с использованием перистальтического насоса низкого давления, установленного на скорости потока 3 мл/мин. PARP-1 белки должны связываться с колонкой. Проскоки собирали. Элюцию проводили на хроматографической системе низкого давления на скорости 3 мл /мин в три стадии. Элюат собирали по 4 мл и анализировали спектрофотометрически (А280) и электрофоретически. Элюаты концентрировали на Amicon. Очищенные белки PARP-1 хранили при -80°С.Genes encoding full-length human proteins PARP-1, individual PARP-1 domains, as well as mutant forms of PARP-1 (obtained by us earlier in collaboration with the Fox Chase Cancer Center, USA) were directedly cloned into the pET28 expression vector (Novagen / EMD Millipore) NdeI / XhoI sites. The PET28 plasmid encodes the N-terminal His-tag / thrombin site / T7-tag cleavage sites and the C-terminal His-tag. These vectors are used with lambda DE3 lysogenic strains of E. coli. In these strains, the expression of a genomic copy of T7 RNA polymerase is controlled by a lac repressor. The expression of the recombinant protein is induced by the addition of IPTG to the culture medium. In pET vectors, the T7 promoter triggers expression of the recombinant gene. Cloned cells were scattered on heated plates with LB agar containing 50 μg / ml kanamycin and 35 μg / ml chloramphenicol and incubated overnight at 37 ° C. Single colonies were used to obtain an overnight culture of 100 ml of LB medium supplemented with 50 μg / ml kanamycin and 35 μg / ml chloramphenicol and 1% glucose (pET28 expression vectors contain the lacI gene that inhibits T7 expression in the presence of glucose). Incubated with stirring overnight at 37 ° C. Then, 10 ml of the overnight culture was inoculated into a liter of fresh LB medium containing 50 μg / ml kanamycin and 35 μg / ml chloramphenicol and incubated with stirring at 37 ° C until an optical density of OD600 from 0.4 to 0.6, corresponding to the middle of the logarithmic phase, was reached. growth. It was shown that for a good yield of full-sized PARP-1, it is necessary to obtain 6 l of culture. For smaller PARP-1 domains, 2 to 4 L of culture is sufficient. 100 mM ZnSO4 was added to the culture to a final concentration of 0.1 mM and continued to incubate with stirring at 37 ° C until an OD 600 of 0.8 to 1.0 was reached. The culture was then cooled on ice for 1 h and protein induction was initiated by addition of IPTG to a final concentration of 0.2 mM. The culture was incubated at 16 ° C with shaking overnight (> 16 hours). Cell pellet was collected by centrifugation at 4 ° C (30 min 2600 × g). The supernatant was removed and the pellet was resuspended in 25 ml of TCEP 1 buffer per 1 liter of culture. The precipitate was transferred into a chilled steel glass and stirred on ice, while NP-40 was slowly added to a final 0.1% concentration, PMSF to 1 mM, protease inhibitors: leipeptin (to a final concentration of 0.5 μg / ml), pepstatin A ( to a final concentration of 0.7 μg / ml) antipain (to a final concentration of 0.5 μg / ml and aprotinin (to a final concentration of 0.5 μg / ml). Cells were lysed in the cold using an EmulsiFlex cell homogenizer “under pressure” (Avestin ). Then the lysate was centrifuged at 4 ° C (2 h, 40,000 × g) to remove cell debris, while PARP-1 proteins of the remainder Then the obtained supernatant was subjected to three-stage purification on a 5 ml nickel HiTrap Chelating column (GE Healthcare) according to the manufacturer's recommendations, then washed with 15 volumes of distilled water and equilibrated with TCEP-2 buffer. His-tag PARP-1 proteins should bind to the column Breakthroughs were collected, then the column was washed successively: (1) 50 ml of low salt concentration wash buffer 3, (2) 50 ml of high salt concentration wash buffer 4, and (3) again 50 ml of low salt wash buffer 5. All washing was carried out at low pressure of the pump, at a flow rate of 3 ml / min. Samples obtained after the nickel column were applied to a heparin column using a low pressure peristaltic pump set at a flow rate of 3 ml / min. PARP-1 proteins must bind to the column. Hops collected. Elution was performed on a low pressure chromatographic system at a rate of 3 ml / min in three stages. The eluate was collected in 4 ml and analyzed spectrophotometrically (A280) and electrophoretically. The eluates were concentrated on Amicon. Purified PARP-1 proteins were stored at -80 ° C.

3. Подготовка стоковых растворов для экспериментов spFRET3. Preparation of stock solutions for spFRET experiments

Для измерений методом spFRET нуклеосомы собранные на (Су3, Су5)-меченой S603 ДНК-матрице, описанным выше способом (см. пункт 1 методики) разбавляют до концентрации 0,3 нг/мкл в ТВ-буфере с добавкой 150 мМ KCl и 0,1% полиэтиленгликоля (380-420 Да). Для экспериментов spFRET 50 нМ раствор PARP в 15% глицерине хранится при -20°С. Раствор НАД берется в концентрации 2 мМ. При проведении эксперимента с автомодифицированным PARP-1 добавляли НАД до конечной концентрации 133 мкМ. Концентрации остальных компонентов были такими же, как и с использованием немодифицированного PARP-1. В приведенном примере использовали стоковый раствор олапариба 10 мМ в ДМСО.For spFRET measurements, nucleosomes collected on a (Cy3, Cy5) -labeled S603 DNA matrix as described above (see step 1 of the procedure) are diluted to a concentration of 0.3 ng / μl in a TV buffer supplemented with 150 mM KCl and 0, 1% polyethylene glycol (380-420 Yes). For spFRET experiments, a 50 nM solution of PARP in 15% glycerol was stored at -20 ° C. The NAD solution is taken at a concentration of 2 mM. During the experiment with self-modified PARP-1, NAD was added to a final concentration of 133 μM. The concentrations of the remaining components were the same as using unmodified PARP-1. In the above example, a stock solution of olaparib 10 mM in DMSO was used.

4. Условия проведения экспериментов spFRET4. Conditions for conducting spFRET experiments

Измерения spFRET выполняли с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM710- Confocor3 (Zeiss, Германия) с 40-кратным водоиммерсионным объективом C-Apochromat (числовая апертура 1,2) в 8-луночных камерах на покровном стекле Lab-Tek (Thermo Scientific, США). Флуоресценцию возбуждали Ar+-ионным лазером (514,5 нм, 2 мкВт под объективом) и регистрировали с помощью лавинных фотодиодов в диапазонах 530-635 нм (Су3) и 635-800 нм (Су5). Диаметр конфокальной диафрагмы был равен 1 диску Эйри. Для каждого образца зависимости интенсивности флуоресценции от времени измеряли в течение 10 мин с константой интегрирования 5 мс. В анализ включали нуклеосомы с интенсивностью сигнала I3=10÷80 кГц и I5=5÷80 кГц, где I3 и I5 - это интенсивности сигналов Су3 и Су5. I3 и I5 корректировали на величину фона, равную соответственно 1,0 и 0,5 кГц. Интенсивности флуоресценции Су3 и Су5, измеренные для каждой нуклеосомы, пересчитывали в эффективность FRET (Е).SpFRET measurements were performed using an LSM710 Confocor3 laser scanning confocal microscope (Zeiss, Germany) with a 40-fold C-Apochromat water-immersion lens (numerical aperture 1.2) in 8-well cameras on Lab-Tek coverslip (Thermo Scientific, USA) . Fluorescence was excited by an Ar + ion laser (514.5 nm, 2 μW under the lens) and recorded using avalanche photodiodes in the ranges 530-635 nm (Cy3) and 635-800 nm (Cy5). The diameter of the confocal aperture was equal to 1 Airy disk. For each sample, the dependences of the fluorescence intensity on time were measured for 10 min with an integration constant of 5 ms. The analysis included nucleosomes with a signal intensity of I3 = 10 ÷ 80 kHz and I5 = 5 ÷ 80 kHz, where I3 and I5 are the intensities of the signals Su3 and Su5. I3 and I5 were corrected by a background value of 1.0 and 0.5 kHz, respectively. The fluorescence intensities of Cy3 and Cy5, measured for each nucleosome, were recalculated into the efficiency of FRET (E).

Для анализа действия тестовых соединений на связывание PARP-1 с нуклеосомой методом spFRET брали несколько экспериментальных точек, нормализованных по одному конечному времени - 45 мин инкубации - съемка 15 мин:To analyze the effect of test compounds on the binding of PARP-1 to the nucleosome by spFRET, several experimental points were taken, normalized to one final time - 45 min incubation - 15 min survey:

1) нуклеосомы (45 мин);1) nucleosomes (45 min);

2) нуклеосомы + PARP-1 (45 мин);2) nucleosomes + PARP-1 (45 min);

3) нуклеосомы + PARP-1 (10 мин); + НАД+ (35 мин);3) nucleosomes + PARP-1 (10 min); + OVER + (35 min);

4) PARP-1 + ингибитор (10 мин); + нуклеосомы (45 мин);4) PARP-1 + inhibitor (10 min); + nucleosomes (45 min);

5) PARP-1 + ингибитор (10 мин); + нуклеосомы (10 мин); + НАД+ (35 мин);5) PARP-1 + inhibitor (10 min); + nucleosomes (10 min); + OVER + (35 min);

6) PARP-1 + НАД+ (35 мин); + нуклеосомы (10 мин);6) PARP-1 + OVER + (35 min); + nucleosomes (10 min);

7) PARP-1 + ингибитор (10 мин); + НАД+ (35 мин); + нуклеосомы (10 мин);7) PARP-1 + inhibitor (10 min); + OVER + (35 min); + nucleosomes (10 min);

5. Анализ данных. Тестирование spFRET на примере ингибитора PARP-1 олапариба.5. Data analysis. Testing spFRET with the PARP-1 inhibitor olaparib as an example.

Профиль распределения эффективностей spFRET от 7 образцов, перечисленных выше, существенно отличается (фиг. 2). Если все профили spFRET наложить на один график, то интерпретация данных будет сильно затруднена, поэтому следует разобрать графики отдельных кривых spFRET попарно (фиг. 3-7).The efficiency distribution profile of spFRET from the 7 samples listed above is significantly different (Fig. 2). If all spFRET profiles are superimposed on a single graph, then the interpretation of the data will be very difficult, so you should parse the graphs of individual spFRET curves in pairs (Fig. 3-7).

5.1. Если выделить кривую распределения spFRET от чистых (необработанных ничем) нуклеосом и нуклеосом в комплексе с PARP-1, то видно изменение характера кривых, что говорит о том, что система чувствительно детектирует образование комплексы PARP-1 с нуклеосомами (фиг. 3). Проксимально-меченные нуклеосомы в положениях +13/+91 имеют характерный профиль распределения частиц с разными эффективностями FRET с двумя пиками. Добавление PARP-1 вызывает уменьшение доли частиц с FRET, близким к нулю, но при этом наблюдается общий сдвиг профиля к более низкой эффективности FRET.5.1. If we isolate the spFRET distribution curve from pure (untreated) nucleosomes and nucleosomes in complex with PARP-1, we can see a change in the nature of the curves, which indicates that the system sensitively detects the formation of PARP-1 complexes with nucleosomes (Fig. 3). Proximal-labeled nucleosomes at + 13 / + 91 positions have a characteristic particle distribution profile with different FRET efficiencies with two peaks. The addition of PARP-1 causes a decrease in the fraction of particles with a near zero FRET, but there is a general shift in profile to a lower FRET efficiency.

5.2. PARP-1 активируется при связывании с нуклеосомами (фиг. 4). При добавлении субстрата PARP-1 - НАД+ - происходит активация фермента, сопровождаемая изменением профиля распределения частиц с разными эффективностями FRET. Снова наблюдается характерное для свободных нуклеосом распределение частиц с двумя максимумами. Но при активации не происходит полного возвращения профиля (фиг 4 справа).5.2. PARP-1 is activated upon binding to nucleosomes (Fig. 4). When PARP-1 substrate, NAD +, is added, the enzyme is activated, accompanied by a change in the distribution profile of particles with different FRET efficiencies. Again, a distribution of particles with two maxima characteristic of free nucleosomes is observed. But upon activation, the profile does not return completely (Fig. 4 on the right).

5.3. Олапариб не влияет на связывание PARP-1 и нуклеосом (фиг. 5).5.3. Olaparib does not affect the binding of PARP-1 and nucleosomes (Fig. 5).

При добавлении олапариба в концентрации 100 мкМ не наблюдается никаких изменений в связывании PARP-1 с нуклеосомой. При этом активация при добавлении НАД+ не наблюдается: напротив, есть стабилизация комплекса и рост количества частиц со средним значением FRET (фиг. 5 справа).When olaparib was added at a concentration of 100 μM, there was no change in the binding of PARP-1 to the nucleosome. Moreover, activation with the addition of NAD + is not observed: on the contrary, there is stabilization of the complex and an increase in the number of particles with an average FRET value (Fig. 5 on the right).

5.4. В проверенных системах изменение профиля в присутствии ингибитора PARP-1 было заметно в образцах с активированным PARP-1. Если наложить профили без олапариба и с олапарибом в такой системе, видна разница (фиг. 6).5.4. In the tested systems, the profile change in the presence of the PARP-1 inhibitor was noticeable in samples with activated PARP-1. If you apply profiles without olaparib and with olaparib in such a system, the difference is visible (Fig. 6).

Таким образом, в качестве способа скрининга противоопухолевых препаратов-ингибиторов PARP-1 можно использовать данный вариант. В целом способ оценки будет заключаться в следующем.Thus, this method can be used as a screening method for antitumor PARP-1 inhibitor preparations. In general, the evaluation method will be as follows.

1. После сборки мононуклеосом раствор, содержащий мононуклеосомы, разделяют на 3 пробирки: 1 - опытная, 2 - референсный образец, 3 - отрицательный контроль.1. After mononucleosome assembly, the solution containing mononucleosomes is divided into 3 tubes: 1 — experimental, 2 — reference sample, 3 — negative control.

2. В каждую из пробирок добавляют одинаковое количество PARP-1 (инкубация 10 мин).2. The same amount of PARP-1 is added to each tube (incubation 10 min).

3. В каждую из пробирок добавляют одинаковое количество НАД+ (инкубируют 35 мин).3. The same amount of NAD + is added to each tube (incubated for 35 minutes).

4. В опытную пробирку (№1) добавляют тестируемое вещество. Возможно, для определения диапазона действия следует использовать раститровку тетсируемого вещества (поэтому опытных пробирок может быть несколько).4. Add the test substance to the test tube (No. 1). Perhaps, to determine the range of action, a trituration of the substance to be tested should be used (therefore, there may be several experimental tubes).

5. В пробирку, предназначенную для референс-образца, добавляют олапариб (инкубация 10 мин).5. Add olaparib (10 min incubation) to the tube intended for the reference sample.

6. В пробирку, предназначенную для отрицательного контроля, добавляют ТВ-буфер (инкубация 10 мин).6. Add a TV buffer (10 min incubation) to the tube intended for negative control.

7. Производят измерение FRET каждого препарата.7. Measure the FRET of each drug.

8. Оценка результатов проводится в сравнении с отрицательным контролем. Также дополнительно можно использовать референс-образец (приведен пример с олапарибом). Как видно на фиг. 6 кривая FRET отрицательного контроля (не содержащего ингибитор PARP-1) представлена двумя пиками: первый находится в области нулевого FRET. Второй, более интенсивный в области 50% FRET. При введении активного ингибитора (например, олапариба) характер кривой распределения FRET меняется: имеется только один острый и высокий пик в области 35-38% FRET, при этом исчезает пик с нулевым FRET. Таким образом, если при введении тестируемого вещества будет наблюдаться «двухгорбый» пик с нулевым и 50% FRET, то скорее всего вещество не будет обладать ингибирующей PARP-1 активностью. Если при внесении тестируемого вещества будут наблюдаться изменения в FRET кривой, аналогичные тем, что происходят при внесении олапариба (то есть два максимума исчезают и FRET собирается в один пик (фиг. 7), то, возможно, данное вещество будет обладать ингибирующей PARP-1 активностью и годиться для дальнейшей проверки на клетках.8. Evaluation of the results is carried out in comparison with the negative control. You can also optionally use a reference sample (an example with olaparib is given). As seen in FIG. 6, the FRET curve of the negative control (not containing the PARP-1 inhibitor) is represented by two peaks: the first is in the region of zero FRET. The second, more intense in the area of 50% FRET. With the introduction of an active inhibitor (for example, olaparib), the nature of the FRET distribution curve changes: there is only one sharp and high peak in the region of 35-38% FRET, while the peak with zero FRET disappears. Thus, if a “two-humped” peak with zero and 50% FRET is observed upon administration of the test substance, then most likely the substance will not have PARP-1 inhibitory activity. If changes in the FRET curve are observed during the introduction of the test substance, similar to those that occur during the introduction of olaparib (i.e., the two maxima disappear and the FRET gathers at one peak (Fig. 7), then this substance may have an inhibitory PARP-1 activity and suitable for further testing on cells.

В качестве отрицательного контроля при проведении экспериментов использовался образец без вносимых соединений, а референсный препарат - олапариб - это ингибитор PARP1, обладающий противоопухолевой активностью, прошедший все стадии клинический испытаний на онкологических пациентах и разрешенный к применению FDA.As a negative control during the experiments, we used a sample without added compounds, and the reference drug, olaparib, is a PARP1 inhibitor with antitumor activity, which has passed all stages of clinical trials in cancer patients and is approved for use by the FDA.

Claims (12)

1. Тест-система для скрининга химических соединений на наличие ингибирующей активности в отношении PARP-1 на основе FRET-микроскопии единичных частиц (spFRET), характеризующаяся тем, что представляет собой смесь, включающую комплекс мононуклеосомы на нуклеосом-позиционирующей ДНК-матрице, меченной парой флуорофоров, формирующих донор-акцепторные пары для реализации эффекта FRET; белок PARP-1, взятый по меньшей мере в 20-кратном молярном избытке по отношению к мононуклеосомам, и его субстрат - НАД+, взятый по меньшей мере в 2000-кратном избытке по отношению к PARP-1.1. A test system for screening chemical compounds for inhibitory activity against PARP-1 based on single particle particle FRET microscopy (spFRET), characterized in that it is a mixture comprising a mononucleosome complex on a nucleosome positioning DNA matrix labeled with a pair fluorophores forming donor-acceptor pairs to realize the FRET effect; protein PARP-1 taken in at least a 20-fold molar excess with respect to mononucleosomes, and its substrate NAD + taken in at least a 2000-fold excess with respect to PARP-1. 2. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что ДНК-матрица модифицирована линкером, позволяющим иммобилизовать комплекс на твердой поверхности.2. The test system according to claim 1, characterized in that the DNA matrix is modified by a linker, allowing the complex to be immobilized on a solid surface. 3. Тест-система по п. 2, характеризующаяся тем, что смесь иммобилизована на твердой поверхности.3. The test system according to claim 2, characterized in that the mixture is immobilized on a solid surface. 4. Тест-система по п. 3, характеризующаяся тем, что твердая поверхность представляет собой поверхности лунок планшета или зерен сорбента в виде пробирок, планшетов для микротитрования, шариков, пленок.4. The test system according to claim 3, characterized in that the solid surface is the surface of the wells of the tablet or sorbent grains in the form of test tubes, microtiter plates, balls, films. 5. Тест-система по п. 3, характеризующаяся тем, что твердые поверхности изготовлены из природных или искусственных полимерных материалов, включая полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, целлюлоза, нитроцеллюлоза, нейлон, гели декстрана, полиакриламида, агарозы.5. The test system according to claim 3, characterized in that the solid surfaces are made of natural or artificial polymeric materials, including polystyrene, polyvinyl chloride, polypropylene, cellulose, nitrocellulose, nylon, dextran gels, polyacrylamide, agarose. 6. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что пара флуорофоров, формирующих донор-акцепторные пары для реализации эффекта FRET, расположена в проксимальном или дистальном, или серединном положении относительно входа ДНК в нуклеосому.6. The test system according to claim 1, characterized in that the pair of fluorophores forming donor-acceptor pairs for the implementation of the FRET effect is located in the proximal or distal or middle position relative to the entry of DNA into the nucleosome. 7. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что ферстеровский радиус флуорофоров, формирующих донор-акцепторные пары для реализации эффекта FRET составляет до 10 нм.7. The test system according to claim 1, characterized in that the Förster radius of the fluorophores forming donor-acceptor pairs for realizing the FRET effect is up to 10 nm. 8. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что пары флуорофоров выбраны из группы Cy3/Cy5, BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Су3, GFP-mOrange, YFP-RFP, TagBFP-TagGFP2, TagGFP2-TagRFP.8. The test system according to claim 1, characterized in that the pairs of fluorophores are selected from the group Cy3 / Cy5, BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Cy3, GFP-mOrange, YFP-RFP, TagBFP-TagGFP2 TagGFP2-TagRFP. 9. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что нуклеосом-позиционирующая ДНК-матрица дополнительно содержит гистон H1 натурального или рекомбинантного происхождения, взятый в избытке по отношению к нуклеосомам.9. The test system according to claim 1, characterized in that the nucleosome-positioning DNA matrix additionally contains histone H1 of natural or recombinant origin, taken in excess with respect to the nucleosomes. 10. Тест-система по п. 9, характеризующаяся тем, что комплекс нуклеосомы на нуклеосом-позиционирующей ДНК-матрице получен с использованием нативных или мутантных коровых гистоновых белков.10. The test system according to claim 9, characterized in that the nucleosome complex on the nucleosome-positioning DNA matrix is obtained using native or mutant core histone proteins. 11. Способ скрининга химических соединений на наличие ингибирующей активности в отношении PARP-1 на основе FRET-микроскопии единичных частиц (spFRET), характеризующийся тем, что включает разделение смеси, полученной по п. 1, на аликвоты, при этом одну из аликвот - без внесения химических соединений - используют в качестве контрольного образца, в другую аликвоту вносят исследуемое химическое соединение, после чего проводят измерение spFRET с получением кривой частотного распределения нуклеосом по величине FRET исследуемого и контрольного образцов, где профиль кривой, характеризующей контрольный образец, имеет два максимума, при этом вывод о наличии у исследуемого соединения ингибирующей активности в отношении PARP-1 делают при выявлении у кривой, характеризующей исследуемое соединение, одного максимума, лежащего в интервале значений между двумя максимумами кривой, характеризующей контрольный образец.11. A method for screening chemical compounds for inhibitory activity against PARP-1 based on single particle FRET microscopy (spFRET), characterized in that it involves the separation of the mixture obtained according to claim 1, in aliquots, while one of the aliquots is without chemical compounds — used as a control sample, the studied chemical compound is introduced into another aliquot, after which spFRET is measured to obtain a curve of the frequency distribution of nucleosomes by the FRET value of the test and control samples, where The profile of the curve characterizing the control sample has two maxima, and the conclusion about the presence of the inhibitory activity of the test compound against PARP-1 is made when the curve characterizing the test compound has one maximum lying in the interval between the two maxima of the curve characterizing the control sample. 12. Способ по п. 11, характеризующийся тем, что дополнительно в третью аликвоту вносят референсное химическое соединение с последующим измерением частотного распределения нуклеосом по величине FRET и при выявлении у кривой одного максимума, лежащего в интервале значений между двумя максимумами кривой, характеризующей контрольный образец, делают вывод о работоспособности полученной тест-системы.12. The method according to p. 11, characterized in that an additional chemical aliquot is added to the third aliquot, followed by measuring the frequency distribution of nucleosomes by the FRET value and when the curve reveals one maximum lying in the interval between the two maxima of the curve characterizing the control sample, conclude that the resulting test system is operational.
RU2016148005A 2016-12-07 2016-12-07 Test-system for chemical compounds screening for inhibiting activity against parp-1 RU2649767C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016148005A RU2649767C1 (en) 2016-12-07 2016-12-07 Test-system for chemical compounds screening for inhibiting activity against parp-1

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016148005A RU2649767C1 (en) 2016-12-07 2016-12-07 Test-system for chemical compounds screening for inhibiting activity against parp-1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2649767C1 true RU2649767C1 (en) 2018-04-04

Family

ID=61867159

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016148005A RU2649767C1 (en) 2016-12-07 2016-12-07 Test-system for chemical compounds screening for inhibiting activity against parp-1

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2649767C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080176261A1 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Colorimetric Substrate and Methods for Detecting Poly(ADP-ribose) Polymerase Activity including PARP Enzymes PARP-1, VPARP, and Tankyrase-1
US20160097083A1 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 Institute For Cancer Research D/B/A The Research Institute Of Fox Chase Cancer Center Screening assay for identification of poly(adp-ribose) polymerase 1 inhibitors

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080176261A1 (en) * 2007-01-18 2008-07-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Colorimetric Substrate and Methods for Detecting Poly(ADP-ribose) Polymerase Activity including PARP Enzymes PARP-1, VPARP, and Tankyrase-1
US20160097083A1 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 Institute For Cancer Research D/B/A The Research Institute Of Fox Chase Cancer Center Screening assay for identification of poly(adp-ribose) polymerase 1 inhibitors

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEKETE A. et al. The guanine-quadruplex structure in the human c-myc gene's promoter is converted into B-DNA form by the human poly(ADP-ribose)polymerase-1.PLoS One. 2012; 7(8):e42690. doi: 10.1371/journal.pone.0042690. Epub 2012 Aug 6. *
FEKETE A. et al. The guanine-quadruplex structure in the human c-myc gene's promoter is converted into B-DNA form by the human poly(ADP-ribose)polymerase-1.PLoS One. 2012; 7(8):e42690. doi: 10.1371/journal.pone.0042690. Epub 2012 Aug 6. STANKOVA K. et al. Conformational transitions of proteins engaged in DNA double-strand break repair, analysed by tryptophan fluorescence emission and FRET.Biochem J. 2012 May 1; 443(3):701-9. doi: 10.1042/BJ20112151. *
STANKOVA K. et al. Conformational transitions of proteins engaged in DNA double-strand break repair, analysed by tryptophan fluorescence emission and FRET.Biochem J. 2012 May 1; 443(3):701-9. doi: 10.1042/BJ20112151. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Böhm et al. Chromosome organization by a conserved condensin-ParB system in the actinobacterium Corynebacterium glutamicum
Anders et al. Genome-wide localization of small molecules
Yadavilli et al. Ribosomal protein S3: A multi-functional protein that interacts with both p53 and MDM2 through its KH domain
Prasad et al. Suicidal cross-linking of PARP-1 to AP site intermediates in cells undergoing base excision repair
Melo et al. A unified view of the DNA-damage checkpoint
Friedrich-Heineken et al. The two DNA clamps Rad9/Rad1/Hus1 complex and proliferating cell nuclear antigen differentially regulate flap endonuclease 1 activity
Carmody et al. The mitogen-activated protein kinase Slt2 regulates nuclear retention of non-heat shock mRNAs during heat shock-induced stress
Bantele et al. Quantitative sensing and signalling of single-stranded DNA during the DNA damage response
Takaku et al. Halenaquinone, a chemical compound that specifically inhibits the secondary DNA binding of RAD51
Wang et al. Mechanism of long-range chromosome motion triggered by gene activation
Marini et al. Unwinding of synthetic replication and recombination substrates by Srs2
Peritore et al. Strand-specific ChIP-seq at DNA breaks distinguishes ssDNA versus dsDNA binding and refutes single-stranded nucleosomes
Masai et al. Rif1 promotes association of G-quadruplex (G4) by its specific G4 binding and oligomerization activities
Borgstahl et al. Interplay of DNA damage and cell cycle signaling at the level of human replication protein A
Itzhak et al. Multiple autophosphorylations significantly enhance the endoribonuclease activity of human inositol requiring enzyme 1α
di Cicco et al. A cell cycle-independent mode of the Rad9-Dpb11 interaction is induced by DNA damage
Klein et al. Guidelines for DNA recombination and repair studies: Mechanistic assays of DNA repair processes
RU2649767C1 (en) Test-system for chemical compounds screening for inhibiting activity against parp-1
Carzaniga et al. A conserved loop in polynucleotide phosphorylase (PNPase) essential for both RNA and ADP/phosphate binding
Schmohl et al. Chemo‐enzymatic three‐fragment assembly of semisynthetic proteins
Peñalver‐Mellado et al. Recruitment of a novel zinc‐bound transcriptional factor by a bacterial HMGA‐type protein is required for regulating multiple processes in Myxococcus xanthus
Sasaki et al. Visualization of the dynamic interaction between nucleosomal histone H3K9 tri-methylation and HP1α chromodomain in living cells
Zafar et al. The expression of human DNA helicase B is affected by G-quadruplexes in the promoter
Boichenko et al. Chemical and biophysical methods to explore dynamic mechanisms of chromatin silencing
Deng et al. A T5 exonuclease-based assay for DNA topoisomerases and DNA intercalators