RU2648820C2

RU2648820C2 - Means of anti-clonogenic activity in respect of tumor human cells

Info

Publication number: RU2648820C2
Application number: RU2016114469A
Authority: RU
Inventors: Рахимджан Ахметджанович Розиев; Анна Яковлевна Гончарова; Кенес Тагаевич Еримбетов; Екатерина Валерьевна Бондаренко
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Научно-исследовательский центр "Парк активных молекул"
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2018-03-28
Also published as: RU2016114469A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, in particular to the use of a compound 2-Hydroxy-3-[5-(morpholin-4-ylmethyl)pyridin-2-yl]-1H-indole-5-carbonitrile as a drug having anti-clonogenic activity against human tumor cells.

EFFECT: implementation of the invention provides suppression of the clonogenicity of human tumor cells.

1 cl, 1 ex, 6 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства, обладающего противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека.The invention relates to medicine, specifically to pharmacology, and relates to agents having anti-clonogenic activity against human tumor cells.

Молекулярно-клеточные механизмы и факторы, влияющие на резистентность опухолей к химио- и радиотерапии, представляют большой интерес для современной медицины. Их изучение может открыть эффективные пути для искусственного модулирования реакций опухолей и нормальных тканей на облучение и химиофармпрепараты, что должно иметь практическую значимость для терапии рака. При этом исследование регуляторных ферментов, способствующих выживанию и адаптации раковых клеток, представляется особенно перспективным. Molecular cell mechanisms and factors affecting the resistance of tumors to chemo and radiotherapy are of great interest to modern medicine. Their study can open up effective ways for artificially modulating the responses of tumors and normal tissues to radiation and chemopharmaceuticals, which should be of practical importance for cancer therapy. Moreover, the study of regulatory enzymes that contribute to the survival and adaptation of cancer cells seems especially promising.

К таким ферментам, несомненно, относится так называемая киназа гликогенсинтазы 3 (GSK-3), которая является одним из ключевых компонентов сигнальных путей регуляции энергетики, пролиферации и подвижности (миграции) нормальных, стволовых и злокачественных клеток [1, 2]. Известно, что этот фермент вовлечен в процессы онкогенеза, инвазии и метастазирования опухолей, а также в механизмы устойчивости раковых клеток к апоптозу и химиотерапии [2, 3]. В настоящее время активно обсуждается, что некоторые ингибиторы GSK-3 могли бы использоваться в борьбе с онкологическими заболеваниями [3]. Однако опубликованные результаты модельных исследований по данной теме достаточно противоречивы: в одних случаях ингибиторы GSK-3 оказывали противоопухолевые эффекты (подавление инвазии и пролиферации раковых клеток и пр.) [4-8], в других, напротив, способствовали росту опухоли [9-11]. Such enzymes undoubtedly include the so-called glycogen synthase kinase 3 (GSK-3), which is one of the key components of signaling pathways for regulating the energy, proliferation, and motility (migration) of normal, stem, and malignant cells [1, 2]. It is known that this enzyme is involved in the processes of oncogenesis, invasion and metastasis of tumors, as well as in the mechanisms of resistance of cancer cells to apoptosis and chemotherapy [2, 3]. It is currently under active discussion that some GSK-3 inhibitors could be used in the fight against cancer [3]. However, the published results of model studies on this topic are quite contradictory: in some cases, GSK-3 inhibitors exerted antitumor effects (suppression of invasion and proliferation of cancer cells, etc.) [4-8], in others, on the contrary, they contributed to tumor growth [9-11 ].

В этом аспекте интересным является возможность выявления противоклоногенных свойств в отношении опухолевых клеток человека у нового, недавно разработанного ингибитора GSK-3 – 2-Гидрокси-3-[5-(морфолин-4-илметил) пиридин-2-ил]-1Н-индол-5-карбонитрила в виде свободного основания, цитратной и солянокислой соли, описанного в заявках WO 03/082853 /A61P19/10, опубл. 22.10.2008/, US12/125,619 /A61P3/10, опубл. 26.11.2009/, US 12/596020 /C07D413/06, опубл. 11.11.2010/, RU2009138136 /C07D401/04 , опубл. 27.05.2011/. Данное соединение обладает фармакологической активностью, демонстрируя ингибирующий эффект в отношении GSK3. Предлагаемое соединение можно применять для лечения болезни Альцгеймера, деменций, хронических и острых нейродегенеративных заболеваний, биполярных расстройств, шизофрении, сахарного диабета, потери волос, расстройств, связанных с костной тканью и онкологических заболеваний. In this aspect, it is interesting to identify anti-clonogenic properties against human tumor cells in a new, recently developed GSK-3 inhibitor - 2-Hydroxy-3- [5- (morpholin-4-ylmethyl) pyridin-2-yl] -1H-indole -5-carbonitrile in the form of a free base, citrate and hydrochloric acid salt described in applications WO 03/082853 / A61P19 / 10, publ. 10.22.2008 /, US12 / 125.619 / A61P3 / 10, publ. November 26, 2009 /, US 12/596020 / C07D413 / 06, publ. 11.11.2010 /, RU2009138136 / C07D401 / 04, publ. 05/27/2011 /. This compound has pharmacological activity, demonstrating an inhibitory effect against GSK3. The proposed compound can be used for the treatment of Alzheimer's disease, dementia, chronic and acute neurodegenerative diseases, bipolar disorders, schizophrenia, diabetes mellitus, hair loss, disorders related to bone tissue and cancer.

Задачей изобретения является расширение арсенала средств, обладающих противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека. Технический результат заключается в том, что применение предлагаемого соединения в онкологии обеспечивает подавление клоногенности опухолевых клеток человека.The objective of the invention is to expand the arsenal of funds with anticlonogenic activity against human tumor cells. The technical result consists in the fact that the use of the proposed compounds in oncology ensures the suppression of the clonogenicity of human tumor cells.

Для решения поставленной задачи и для достижения заявляемого технического результата предлагается средство, обладающее противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека, и представляющее собой соединение 2-Гидрокси-3-[5-(морфолин-4-илметил) пиридин-2-ил]-1Н-индол-5-карбонитрил формулы (I):To solve the problem and to achieve the claimed technical result, there is proposed a tool having anticlonogenic activity against human tumor cells, and which is a compound of 2-Hydroxy-3- [5- (morpholin-4-ylmethyl) pyridin-2-yl] -1H -indole-5-carbonitrile of the formula (I):

Новым в предлагаемом изобретении является то, в качестве средства, подавляющего колониеобразующую способность (клоногенность) опухолевых клеток человека, может применяться соединение 2-Гидрокси-3-[5-(морфолин-4-илметил) пиридин-2-ил]-1Н-индол-5-карбонитрил. Для специалиста эти свойства явным образом не вытекают из уровня техники.New in the invention is that, as an agent suppressing the colony forming ability (clonogenicity) of human tumor cells, the compound 2-Hydroxy-3- [5- (morpholin-4-ylmethyl) pyridin-2-yl] -1H-indole can be used -5-carbonitrile. For a specialist, these properties are not explicitly derived from the prior art.

Предметом предлагаемого изобретения является средство, обладающее помимо ряда полезных фармакологических свойств противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека. The subject of the invention is a tool having, in addition to a number of useful pharmacological properties, anticlonogenic activity against human tumor cells.

Сущность изобретения поясняется примером конкретного выполнения. The invention is illustrated by an example of a specific implementation.

Пример. Исследован эффект изучаемого соединения на колониеобразующую способность опухолевых клеток человека. Целью исследований было изучение влияния предлагаемого соединения на клоногенный потенциал опухолевых культур MCF-7 и HBL-100 и нормальных клеток человека.Example. The effect of the studied compound on the colony forming ability of human tumor cells was studied. The aim of the study was to study the effect of the proposed compound on the clonogenic potential of tumor cultures of MCF-7 and HBL-100 and normal human cells.

В качестве основного метода исследования был выбран тест на клоногенность, поскольку способность отдельных раковых клеток формировать стабильные колонии (клоны) in vitro, как правило, коррелирует с их туморогенностью и устойчивостью к цитотоксическим (терапевтическим) воздействиям in vivo [12], а также с процентом стволовых раковых клеток в клеточном пуле, что имеет прямое отношение к степени агрессивности растущей опухоли и (не) эффективности клинической терапии.The clonogenicity test was chosen as the main research method, since the ability of individual cancer cells to form stable colonies (clones) in vitro, as a rule, correlates with their tumorigenicity and resistance to in vivo cytotoxic (therapeutic) effects [12], as well as with the percentage stem cancer cells in the cell pool, which is directly related to the degree of aggressiveness of the growing tumor and the (non) effectiveness of clinical therapy.

Объектом данного исследования явилось соединение, а также культуры распластанных клеток, происходящие из охарактеризованных опухолевых линий MCF-7 и HBL-100 (карциномы молочной железы человека) [13, 14]. Для сравнения эффектов препарата часть работы была сделана на культуре «нормальной» (нетуморогенной) клеточной линии, такой как эпителий эмбриональной почки человека (линия 293) [15].The object of this study was the compound, as well as the cultures of spread cells, originating from the characterized tumor lines MCF-7 and HBL-100 (human breast carcinoma) [13, 14]. To compare the effects of the drug, part of the work was done on a culture of a “normal” (non-tumorigenic) cell line, such as the human embryonic kidney epithelium (line 293) [15].

В данной работе использовались три линейные культуры эпителиальных клеток: In this work, three linear cultures of epithelial cells were used:

(I) MCF-7 – раковые клетки, происходящие из карциномы молочной железы человека; (I) MCF-7 - cancer cells derived from human breast carcinoma;

(II) HBL-100 – клетки, изначально происходящие из нормального эпителия молочной железы человека, которые теперь проявляют свойства злокачественных клеток; (II) HBL-100 - cells originally originating from the normal epithelium of the human mammary gland, which now exhibit the properties of malignant cells;

(III) 293 – клеточная линия почечного эпителия эмбриона человека. (III) 293 - cell line of the renal epithelium of a human embryo.

Эти клеточные культуры были получены из Онкологического Центра РАМН (Москва) и все время хранились в крио-ампулах, помещенных в жидкий азот. These cell cultures were obtained from the Oncology Center of the Russian Academy of Medical Sciences (Moscow) and were kept all the time in cryo-ampoules placed in liquid nitrogen.

Размораживание клеточных культур проводили стандартно: быстрый фазовый переход лед-жидкость при 37°С, затем резкое охлаждение до +4°С, разведение суспензии клеток в охлажденной среде DMEM с последующим центрифугированием (1500 об/мин) для отмывки от «крио-среды» (90% фетальной телячьей сыворотки + 10% ДМСО). Осадок размороженных и промытых клеток ресуспендировали в среде роста (DMEM с добавлением 10%-ной телячьей фетальной сыворотки, 2 моль/л L-глютамина, 10000 IU/мл пенициллин/стрептомицина), и затем полученную суспензию сажали в культуральные пластиковые флаконы или чашки Петри из расчета 10 тыс. клеток/см². Культуры прикрепленных и распластанных клеток выращивались во влажной камере инкубатора с 5%-ным углекислым газом (СО₂) при 37°С; среда роста менялась каждые 3 дня. Динамику роста, плотность и морфологию клеток периодически оценивали путем просмотра на инвертированном микроскопе. После разморозки клетки проводили, как минимум, через 1 пассаж: при образовании монослоя клетки снимали с пластика с помощью раствора Трипсин/Версен, промывали и снова рассаживали в разведении 1:3 или 1:4. Для обработки предлагаемым препаратом брали клеточные культуры, достигшие 65-70% конфлуэнтности и демонстрирующие нормальную морфологию эпителиальных клеток. Thawing of cell cultures was carried out as standard: a quick ice-liquid phase transition at 37 ° C, then rapid cooling to + 4 ° C, dilution of the cell suspension in a cooled DMEM medium, followed by centrifugation (1500 rpm) for washing from the “cryo-medium” (90% fetal calf serum + 10% DMSO). The pellet of thawed and washed cells was resuspended in growth medium (DMEM supplemented with 10% calf fetal serum, 2 mol / L L-glutamine, 10,000 IU / ml penicillin / streptomycin), and then the resulting suspension was placed in culture plastic bottles or Petri dishes at the rate of 10 thousand cells / cm ² . Attached and spread cell cultures were grown in a humid chamber of an incubator with 5% carbon dioxide (CO ₂ ) at 37 ° C; growth medium changed every 3 days. The growth dynamics, density and morphology of cells were periodically evaluated by viewing on an inverted microscope. After defrosting, the cells were carried out in at least 1 passage: during the formation of a monolayer, the cells were removed from the plastic using a Trypsin / Versen solution, washed and again seated at a dilution of 1: 3 or 1: 4. For treatment with the proposed preparation, cell cultures were taken that reached 65-70% confluency and showed normal morphology of epithelial cells.

Концентрированный раствор исследуемого соединения (200 мкМ) был приготовлен в физиологическом растворе и в ДМСО соответственно. Водный раствор для стерилизации пропускали через шприцевой фильтр (Ø пор = 0,22 мкМ). Микрообъемы (5 - 200 мкл) таких свежеприготовленных стерильных растворов добавлялись в среду роста к клеткам, чтобы с учетом разведения получить нужные концентрации веществ (0,5 - 20 мкМ) в инкубационной среде. A concentrated solution of the test compound (200 μM) was prepared in physiological saline and in DMSO, respectively. An aqueous solution for sterilization was passed through a syringe filter (Ø pore = 0.22 μM). Microvolumes (5 - 200 μl) of such freshly prepared sterile solutions were added to the growth medium to the cells in order to take into account the dilution to obtain the desired concentration of substances (0.5 - 20 μM) in the incubation medium.

Клетки каждой культуры инкубировались с изучаемым соединением в течение 24 или 72 часов в СО₂-инкубаторе при 37°С. Затем клетки из каждой временной точки снимались Трипсин/Версеном, подсчитывались их концентрации в суспензиях, и готовились серийные разведения клеточных суспензий. Строго лимитированные количества клеток рассаживались в чашки Петри из расчета (1 тыс. или 2 тыс. клеток на чашку) с параллельными пробами (3 чашки на каждую точку), и рост колоний продолжался 10 дней в СО₂-инкубаторе при 37°С со сменой среды на 5-й день. Размеры, плотность и морфология вырастающих из одной клетки колоний контролировались путем периодических просмотров на инвертированном микроскопе. На 10-й день выросшие в чашках Петри колонии клеток фиксировались 96% этанолом (5 мин) и сразу обрабатывались специальным синим красителем «кристалл-фиолетовый» (5 мин) для визуализации многоклеточных колоний. После отмывки (водой) от красителя и высушивания чашек все окрашенные препараты анализировались под микроскопом, и на дне каждой чашки фломастером отмечались колонии, содержащие не менее 50 клеток. Затем отмеченные колонии тщательно подсчитывались во всех параллельных пробах, и определялся процент выросших колоний относительно количества колоний в контроле (необработанные клетки), принимаемом за 100%.The cells of each culture were incubated with the studied compound for 24 or 72 hours in a CO ₂ incubator at 37 ° C. Then, cells from each time point were removed with Trypsin / Versen, their concentrations in suspensions were calculated, and serial dilutions of cell suspensions were prepared. Strictly limited cell numbers were seated in Petri dishes at the rate of (1 thousand or 2 thousand cells per cup) with parallel samples (3 cups per point), and the growth of the colonies lasted 10 days in a CO ₂ incubator at 37 ° C with a change Wednesday on the 5th day. The size, density, and morphology of colonies growing from a single cell were monitored by periodic scans with an inverted microscope. On the 10th day, cell colonies grown in Petri dishes were fixed with 96% ethanol (5 min) and immediately treated with a special crystal-violet blue dye (5 min) to visualize multicellular colonies. After washing (with water) from the dye and drying the plates, all stained preparations were analyzed under a microscope, and colonies containing at least 50 cells were noted on the bottom of each plate with a felt-tip pen. Then, the marked colonies were carefully counted in all parallel samples, and the percentage of grown colonies was determined relative to the number of colonies in the control (untreated cells), taken as 100%.

Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами с применением t-критерия Стьюдента. Гистограммы, демонстрирующие эффекты изучаемого соединения на процент выросших клеточных колоний, строили в графическом редакторе «Origin», включающем программу усреднения данных всех параллельных измерений с приведением разброса (± среднее квадратичное отклонение). При анализе эффектов исследуемого соединения достоверность отличий от контроля оценивали с помощью программы ANOVA.Statistical processing of the results was carried out by standard methods using Student t-test. Histograms demonstrating the effects of the studied compound on the percentage of grown cell colonies were plotted in the Origin graphic editor, which included a program for averaging the data of all parallel measurements with a spread (± standard deviation). When analyzing the effects of the test compound, the significance of differences from the control was evaluated using the ANOVA program.

Эффекты исследуемого соединения на опухолевые клетки MCF-7The effects of the test compound on tumor cells MCF-7

Периодическое просматривание образцов клеток под инвертированным микроскопом не выявило каких-либо драматических эффектов исследуемого соединения на морфологию распластанных клеток-мишеней MCF-7. Некоторое видимое ухудшение морфологии (ретракция цитоплазмы с нарушением межклеточных контактов) имело место только при высокой концентрации изучаемого соединения (20 мкМ) и после самого долгого срока инкубации (72 часа). Это свидетельствует об относительно слабой цитотоксичности препаратов.Periodic scanning of cell samples under an inverted microscope did not reveal any dramatic effects of the test compound on the morphology of the spread MCF-7 target cells. Some visible morphological deterioration (cytoplasm retraction with impaired intercellular contacts) occurred only at a high concentration of the studied compound (20 μM) and after the longest incubation period (72 hours). This indicates a relatively weak cytotoxicity of the drugs.

Регулярные наблюдения за динамикой митозов (скорость деления клеток) не обнаружили явных цитостатических эффектов у исследуемого соединения (т.е. данный препарат не тормозил пролиферацию клеток MCF-7 в первые 24-60 ч инкубации по сравнению с необработанным контролем).Regular monitoring of the dynamics of mitoses (cell division rate) did not reveal obvious cytostatic effects in the test compound (i.e., this drug did not inhibit the proliferation of MCF-7 cells in the first 24-60 hours of incubation compared with the untreated control).

Типичная картина выросших в чашках Петри (зафиксированных и окрашенных синим) колоний опухолевых клеток MCF-7 показана на Фиг. 1-3. A typical picture of MCF-7 tumor cell colonies grown in blue (fixed and blue stained) Petri dishes is shown in FIG. 1-3.

Статистически обработанные результаты подсчета колоний представлены в виде столбчатых гистограмм на Фиг. 4. Результаты исследований согласно усредненным данным 2-х серий экспериментов, что 5 мкМ исследуемого соединения в случае 72-часовой инкубации достоверно (в ~20 раз, т.е. до 5%) снижал клоногенность клеток MCF-7. При этом 24-часовая инкубация клеток с такой же концентрацией (5 мкМ) исследуемого соединения приводила всего лишь к 2-кратному (до ~40-50%) снижению процента выросших колоний. Более высокая концентрация (20 мкМ) значительно больше (в ~40-50 раз, т.е. примерно до 2-2,5%) подавляла клоногенность MCF-7 после 24 - или 72-часовой инкубации (Фиг.4). Исследование действия низких концентраций (1 мкМ) исследуемого соединения показало только незначительное недостоверное (на ~30-35%) подавление роста колоний.The statistically processed colony counts are presented as bar graphs in FIG. 4. The results of studies according to the averaged data of 2 series of experiments, that 5 μM of the test compound in the case of 72-hour incubation significantly (~ 20 times, i.e., up to 5%) reduced the clonogenicity of MCF-7 cells. Moreover, a 24-hour incubation of cells with the same concentration (5 μM) of the test compound led only to a 2-fold (up to ~ 40-50%) decrease in the percentage of grown colonies. A higher concentration (20 μM) significantly more (~ 40-50 times, i.e., approximately 2-2.5%) inhibited the clonogenicity of MCF-7 after 24- or 72-hour incubation (Figure 4). The study of the effect of low concentrations (1 μM) of the test compound showed only a slight unreliable (~ 30-35%) inhibition of colony growth.

Эффекты исследуемого соединения на опухолевые клетки HBL-100The effects of the test compound on tumor cells HBL-100

Визуальный анализ на инвертированном микроскопе не выявил никакого влияния изучаемого соединения на морфологию клеток HBL-100. Даже относительно высокие (10 мкМ) концентрации исследуемого соединения и долгие (72 часа) сроки инкубации не вызывали заметных изменений в морфологии обработанных клеток. Это может говорить как о слабой цитотоксичности исследуемого соединения, так и о высокой устойчивости клеточной культуры HBL-100. Также не наблюдалось какого-либо цитостатического эффекта изучаемого соединения на эти клетки (т.е. препарат не тормозил пролиферации данной культуры).Visual analysis using an inverted microscope did not reveal any effect of the studied compound on the morphology of HBL-100 cells. Even relatively high (10 μM) concentrations of the test compound and long (72 hours) incubation periods did not cause noticeable changes in the morphology of the treated cells. This can indicate both weak cytotoxicity of the test compound and high stability of the HBL-100 cell culture. Also, no cytostatic effect of the studied compound on these cells was observed (i.e., the drug did not inhibit the proliferation of this culture).

Две серии экспериментов с изучаемым соединением, которое добавлялось к клеткам HBL-100 в концентрациях 0,5 или 10 мкМ, не выявили каких либо эффектов на клоногенность этой клеточной культуры даже в случае самых длительных (72 часа) сроков инкубации (Фиг. 5). Таким образом, в отличие от ситуации с другой опухолевой линией – MCF-7, клетки HBL-100 никак не реагируют на изучаемое соединение. Two series of experiments with the studied compound, which was added to HBL-100 cells at concentrations of 0.5 or 10 μM, did not reveal any effects on the clonogenicity of this cell culture even in the case of the longest (72 hours) incubation periods (Fig. 5). Thus, unlike the situation with another tumor line, MCF-7, HBL-100 cells do not react in any way to the studied compound.

Эффекты исследуемого соединения на неопухолевые клетки 293Effects of the test compound on non-tumor cells 293

Изучаемое соединение не изменяло морфологию клеток линии 293 даже в случае высоких (20 мкМ) концентраций препарата и длительного (72 часа) периода инкубации. Это свидетельствует о низком уровне (или об отсутствии) цитотоксичности препарата. Не наблюдалось торможения деления в образцах клеток линии 293, обработанных изучаемым соединением. The studied compound did not change the morphology of line 293 cells even in the case of high (20 μM) drug concentrations and a long (72 hours) incubation period. This indicates a low level (or absence) of the cytotoxicity of the drug. No inhibition of fission was observed in samples of 293 line cells treated with the test compound.

Согласно усредненным данным 2-х серий независимых экспериментов, только высокая (20 мкМ) концентрация исследуемого соединения достоверно (в ~ 5-8 раз: до 20% при 24-часовой инкубации и до 12% при 72-часовой инкубации) снижала клоногенность клеток линии 293 относительно контроля (Фиг. 6). Однако более низкие концентрации (1 или 5 мкМ) исследуемого соединения уже не оказывали никакого влияния на количество выросших колоний клеток линии 293 (Фиг. 6). According to the averaged data of 2 series of independent experiments, only a high (20 μM) concentration of the test compound significantly (~ 5-8 times: up to 20% at 24-hour incubation and up to 12% at 72-hour incubation) reduced clonogenicity of line cells 293 relative to control (Fig. 6). However, lower concentrations (1 or 5 μM) of the test compound no longer had any effect on the number of grown colonies of 293 cell lines (Fig. 6).

Таким образом, изучаемое соединение в концентрациях 5 и 20 мкМ значительно подавляло клоногенность опухолевых клеток MCF-7. При этом степень подавления клоногенности коррелировала с продолжительностью инкубации этих клеток с данным препаратом.Thus, the studied compound at concentrations of 5 and 20 μM significantly inhibited the clonogenicity of MCF-7 tumor cells. Moreover, the degree of inhibition of clonogenicity correlated with the duration of incubation of these cells with this drug.

Исследуемое соединение, даже в максимальных концентрациях (20 мкМ) и при продолжительных периодах инкубации (72 часа), не снижал клоногенного потенциала опухолевой линии клеток HBL-100.The test compound, even at maximum concentrations (20 μM) and with long incubation periods (72 hours), did not reduce the clonogenic potential of the tumor cell line HBL-100.

В случае длительных сроков инкубации (72 часа) высокие концентрации (20 мкМ) исследуемого соединения оказывали подавляющий эффект на клоногенность неопухолевых клеток линии 293. Однако этот эффект был заметно слабее, чем на опухолевых клетках линии MCF-7.In the case of long incubation periods (72 hours), high concentrations (20 μM) of the test compound had an inhibitory effect on the clonogenicity of non-tumor cells of the 293 line. However, this effect was noticeably weaker than on MCF-7 tumor cells.

Тот факт, что исследуемое соединение подавляло клоногенность опухолевой клеточной линии MCF-7 клеток сильнее, чем неопухолевой линии 293, может означать некоторую полезную избирательность цитотоксического действия этого препарата.The fact that the test compound inhibited the clonogenicity of the tumor cell line MCF-7 cells more strongly than the non-tumor line 293 may indicate some useful selectivity of the cytotoxic effect of this drug.

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, обладающих противоклоногенной активностью в отношении опухолевых клеток человека.The present invention expands the arsenal of funds with anti-clonogenic activity against human tumor cells.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВLIST OF USED SOURCES

[1] Phukan S, Babu VS, Kannoji A, Hariharan R, Balaji VN. GSK3β: role in therapeutic landscape and development of modulators. Br J Pharm 2010; 160: 1-19. [1] Phukan S, Babu VS, Kannoji A, Hariharan R, Balaji VN. GSK3β: role in therapeutic landscape and development of modulators. Br J Pharm 2010; 160: 1-19.

[2] Luo J. Glycogen synthase kinase 3 β (GSK3β) in tumorigenesis and cancer chemotherapy. Cancer Lett 2009; 273: 194-200.[2] Luo J. Glycogen synthase kinase 3 β (GSK3β) in tumorigenesis and cancer chemotherapy. Cancer Lett 2009; 273: 194-200.

[3] Osolodkin DI, Palyulin VA, Zefirov NS. Glycogen synthase kinase 3 as an anticancer drug target: novel experimental findings and trends in the design of inhibitors. Curr Pharm Design 2013; 19: 665-679.[3] Osolodkin DI, Palyulin VA, Zefirov NS. Glycogen synthase kinase 3 as an anticancer drug target: novel experimental findings and trends in the design of inhibitors. Curr Pharm Design 2013; 19: 665-679.

[4] Rinnab L, Schutz SV, Diesch J, Schmid E, Kufer R, Hautmann RE, Spindler KD, Cronauer MV. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 in androgen-responsive prostate cancer cell lines: are GSK inhibitors therapeutically useful? Neoplasia 2008; 10, 624-633.[4] Rinnab L, Schutz SV, Diesch J, Schmid E, Kufer R, Hautmann RE, Spindler KD, Cronauer MV. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 in androgen-responsive prostate cancer cell lines: are GSK inhibitors therapeutically useful? Neoplasia 2008; 10, 624-633.

[5] Gos A, Al-Husein B, Katsanevas K, Steinbach A, Lou U, Sabbineni H, DeRemer DL, Somanath PR. Targeting Src-mediated Tyr216 phosphorylation and activation of GSK-3 in prostate cancer cells inhibit prostate cancer progression in vitro and in vivo. Oncotarget 2014; 5, 775-787. [5] Gos A, Al-Husein B, Katsanevas K, Steinbach A, Lou U, Sabbineni H, DeRemer DL, Somanath PR. Targeting Src-mediated Tyr216 phosphorylation and activation of GSK-3 in prostate cancer cells inhibit prostate cancer progression in vitro and in vivo. Oncotarget 2014; 5, 775-787.

[6] Azoulay-Alfaguter I, Elya R, Avrahami L, Katz A, Eldar-Finkelman H. Combined regulation of mTORC1 and lysosomal acidification by GSK-3 suppresses autophagy and contributes to cancer cell growth. Oncogene 2014; doi: 10.1038/onc.2014.390. [Epub ahead of print]. [6] Azoulay-Alfaguter I, Elya R, Avrahami L, Katz A, Eldar-Finkelman H. Combined regulation of mTORC1 and lysosomal acidification by GSK-3 suppresses autophagy and contributes to cancer cell growth. Oncogene 2014; doi: 10.1038 / onc.2014.390. [Epub ahead of print].

[7] Vincent EE, Elder DJ, O’Flaherty L, Pardo OE, Dzien P, Phillips L, Morgan C, Pawade J, May MT, Sohail M, Hetzel MR, Seckl MJ, Tavare JM. Glycogen synthase kinase 3 protein kinase activity is frequently elevated in human non-small cell lung carcinoma and supports tumour cell proliferation. PloS One 2014; 9(12):e114725. doi: 10.1371/journal.pone.0114725. eCollection 2014.[7] Vincent EE, Elder DJ, O’Flaherty L, Pardo OE, Dzien P, Phillips L, Morgan C, Pawade J, May MT, Sohail M, Hetzel MR, Seckl MJ, Tavare JM. Glycogen synthase kinase 3 protein kinase activity is frequently elevated in human non-small cell lung carcinoma and supports tumor cell proliferation. PloS One 2014; 9 (12): e114725. doi: 10.1371 / journal.pone.0114725. eCollection 2014.

[8] Yoshino Y, Suzuki M, Takahashi H, Ishioka C. Inhibition of invasion by glycogen synthase kinase-3 beta inhibitors through dysregulation of actin re-organization via down-regulation of WAVE2. Biochem Biophys Res Commun 2015; doi: 10.1016/j.bbrc.2015.06.142. [Epub ahead of print]. [8] Yoshino Y, Suzuki M, Takahashi H, Ishioka C. Inhibition of invasion by glycogen synthase kinase-3 beta inhibitors through dysregulation of actin re-organization via down-regulation of WAVE2. Biochem Biophys Res Commun 2015; doi: 10.1016 / j.bbrc.2015.06.06.142. [Epub ahead of print].

[9] Jiang Y, Dai J, Zhang H, Sottnik JL, Keller JM, Escott KJ, Sanganee HJ, Yao Z, McCauley LK, Keller ET. Activation of the Wnt pathway through AR79, a GSK3b inhibitor, promotes prostate cancer growth in soft tissue and bone. Mol Cancer Res 2013; 11, 1597-1610. [9] Jiang Y, Dai J, Zhang H, Sottnik JL, Keller JM, Escott KJ, Sanganee HJ, Yao Z, McCauley LK, Keller ET. Activation of the Wnt pathway through AR79, a GSK3b inhibitor, promotes prostate cancer growth in soft tissue and bone. Mol Cancer Res 2013; 11, 1597-1610.

[10] Koo J, Yue P, Gal AA, Khuri FR, Sun SY. Maintaining glycogen synthase kinase-3 activity is critical for mTOR kinase inhibitors to inhibit cancer cell growth. Cancer Res 2014; 74, 2555-2568. [10] Koo J, Yue P, Gal AA, Khuri FR, Sun SY. Maintaining glycogen synthase kinase-3 activity is critical for mTOR kinase inhibitors to inhibit cancer cell growth. Cancer Res 2014; 74, 2555-2568.

[11] Marchand B, Arsenault D, Raymond-Fleury A., Boisert FM, Boucher MJ. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3) inhibition induces prosurvival autophagic signals in human pancreatic cancer cells. J Biol Chem 2015; 290, 5592-5605.[11] Marchand B, Arsenault D, Raymond-Fleury A., Boisert FM, Boucher MJ. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3) inhibition induces prosurvival autophagic signals in human pancreatic cancer cells. J Biol Chem 2015; 290, 5592-5605.

[12] Kabakov AE, Kudryavtsev VA, Gabai VL. Methods of cell survival or death determination. Methods Mol Biol 2011; 787, 231-244.[12] Kabakov AE, Kudryavtsev VA, Gabai VL. Methods of cell survival or death determination. Methods Mol Biol 2011; 787, 231-244.

[13] Levenson AS, Jordan VC. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res 1997; 57, 3071-3078. [13] Levenson AS, Jordan VC. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res 1997; 57, 3071-3078.

[14] Gaffney EV. A cell line (HBL-100) established from human breast milk. Cell Tissue Res 1982; 227, 563-568.[14] Gaffney EV. A cell line (HBL-100) established from human breast milk. Cell Tissue Res 1982; 227, 563-568.

[15] Graham FL, Smiley J, Russel WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from adenovirus type 5. J Gen Virol 1977, 36, 59-74.[15] Graham FL, Smiley J, Russel WC, Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from adenovirus type 5. J Gen Virol 1977, 36, 59-74.

Claims

The use of the compound 2-Hydroxy-3- [5- (morpholin-4-ylmethyl) pyridin-2-yl] -1H-indole-5-carbonitrile as an agent having anti-clonogenic activity against human tumor cells and which is a structural compound formula (I):