RU2648517C1 - Method for obtaining a liophilized preparation of an activated protrombin complex having viii-shunting activity factor - Google Patents
Method for obtaining a liophilized preparation of an activated protrombin complex having viii-shunting activity factor Download PDFInfo
- Publication number
- RU2648517C1 RU2648517C1 RU2017122173A RU2017122173A RU2648517C1 RU 2648517 C1 RU2648517 C1 RU 2648517C1 RU 2017122173 A RU2017122173 A RU 2017122173A RU 2017122173 A RU2017122173 A RU 2017122173A RU 2648517 C1 RU2648517 C1 RU 2648517C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- prothrombin complex
- thrombin
- activation
- activated
- activity
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 34
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 238000001994 activation Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 7
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 abstract description 6
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 abstract description 6
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 abstract description 4
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 abstract 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 108010018823 anti-inhibitor coagulant complex Proteins 0.000 description 16
- 229940105776 factor viii inhibitor bypassing activity Drugs 0.000 description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 6
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 5
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 5
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 4
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical class CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108010079356 FIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H calcium citrate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FNAQSUUGMSOBHW-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001354 calcium citrate Substances 0.000 description 1
- OFNJDDJDXNMTHZ-UHFFFAOYSA-L calcium;2-aminoacetate Chemical compound [Ca+2].NCC([O-])=O.NCC([O-])=O OFNJDDJDXNMTHZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 229940112216 novoseven Drugs 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical group 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000348 solid-phase epitaxy Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013337 tricalcium citrate Nutrition 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и биотехнологии и касается способа получения лиофилизированного препарата активированного протромбинового комплекса из плазмы крови, обладающего фактор VIII-шунтирующей активностью.The invention relates to the field of pharmaceutical industry and biotechnology and relates to a method for producing a lyophilized preparation of an activated prothrombin complex from blood plasma having a factor VIII-shunting activity.
Гемофилия A - наиболее тяжелый врожденный геморрагический диатез, обусловленный дефицитом или дефектом плазменного белка - фактора VIII. Единственным доступным средством лечения данного заболевания на сегодняшний день остается введение недостающего фактора свертывания крови, очищенного из плазмы или полученного биоинженерным способом.Hemophilia A is the most severe congenital hemorrhagic diathesis due to a deficiency or defect in the plasma protein factor VIII. The only available treatment for this disease to date remains the introduction of the missing coagulation factor, purified from plasma or obtained by the bioengineering method.
Одной из наиболее серьезных проблем для больного является развитие ингибиторов. Ингибиторы представляют собой антитела, которые прикрепляются к фактору VIII и нейтрализует его. Антитела, направленные против фактора VIII, могут вырабатываться иммунной системой больного также вследствие заместительной терапии, в результате различных заболеваний или возрастных изменений в организме, во время беременности. Длительность циркуляции ингибиторов составляет от нескольких месяцев до нескольких лет.One of the most serious problems for a patient is the development of inhibitors. Inhibitors are antibodies that attach to and neutralize factor VIII. Antibodies directed against factor VIII can also be produced by the patient’s immune system as a result of replacement therapy, as a result of various diseases or age-related changes in the body, during pregnancy. The duration of circulation of inhibitors ranges from several months to several years.
Появление ингибиторов отягощает прогноз заболевания, снижается эффективность лечения, кровотечения становятся профузными, сочетанными, рано развиваются тяжелая артропатия и инвалидность. При этом увеличение частоты и количества вводимых препаратов крови больному может приводить не только к резистентности таких больных к этим препаратам, но и к усилению кровоточивости после их введения.The appearance of inhibitors aggravates the prognosis of the disease, the effectiveness of treatment decreases, bleeding becomes profuse, combined, severe arthropathy and disability develop early. At the same time, an increase in the frequency and quantity of blood preparations administered to a patient can lead not only to the resistance of such patients to these drugs, but also to an increase in bleeding after their administration.
В настоящее время существуют несколько подходов для лечения ингибиторной формы гемофилии A. Одним из способов эффективного восстановления гемостаза является применение лиофилизированных препаратов, обладающих FVIII-шунтирующей активностью. К препаратам данного ряда относятся активированный протромбиновый комплекс (aPCC), получаемый из донорской плазмы человека, и рекомбинантный активированный фактор VII (rFVIIa).Currently, there are several approaches for the treatment of the inhibitory form of hemophilia A. One of the ways to effectively restore hemostasis is the use of lyophilized drugs with FVIII-shunting activity. Preparations of this series include activated prothrombin complex (aPCC), obtained from human donor plasma, and recombinant activated factor VII (rFVIIa).
Активированный протромбиновый комплекс - это группа гликопротеинов плазмы крови, включающая факторы ее свертывания - II, IX и X (FII, FIX и FX) в неактивированной форме, а также фактор VII (FVII) преимущественно в активированной форме.An activated prothrombin complex is a group of blood plasma glycoproteins, including coagulation factors - II, IX and X (FII, FIX and FX) in an inactive form, as well as factor VII (FVII) mainly in an activated form.
Для характеристики концентратов активированного протромбинового комплекса используют термины «FEIBA-активность» и «специфическая активность» плазматических факторов свертывания II, IIa, VII, IX, X. Количественно данные параметры определяют методом коагулометрии в Международных Единицах (ME).To characterize the concentrates of the activated prothrombin complex, the terms “FEIBA activity” and “specific activity” of plasmatic coagulation factors II, IIa, VII, IX, X are used. Quantitatively, these parameters are determined by the method of coagulation in International Units (ME).
Одна ME FEIBA-активность соответствует такому количеству препарата, которое в тесте частичного активированного тромбопластинового времени (АЧТВ-тест) уменьшает время свертывания плазмы с высоким уровнем содержания ингибиторов FVIII в два раза.One ME FEIBA activity corresponds to the amount of the drug that in the partial activated thromboplastin time test (APTT test) reduces the clotting time of plasma with a high level of FVIII inhibitors by half.
Одна Международная Единица активности FII, FVII, FIX, FX эквивалентна активности соответствующего фактора, содержащегося в 1 мл нормальной человеческой плазмы. Одна ME активности FIIa эквивалентна такому количеству препарата, которое способно свернуть при температуре +37°C 1 мл нормальной человеческой плазмы за 30 с или 1 мл 0.1% раствора очищенного фибриногена за 15 с.One International Unit of Activity FII, FVII, FIX, FX is equivalent to the activity of the corresponding factor contained in 1 ml of normal human plasma. One ME of FIIa activity is equivalent to the amount of the drug that can coagulate at a temperature of + 37 ° C 1 ml of normal human plasma in 30 s or 1 ml of a 0.1% purified fibrinogen solution in 15 s.
Активированный протромбиновый комплекс является белковым препаратом, поэтому, как и другие белки, применяемые для лечебных целей, он может быть неустойчивым при хранении. Стабильность - одна из проблем, которая решается при разработке технологии производства препарата. Согласно существующим требованиям восстановленный концентрат должен быть стабилен, по крайней мере, в течение 12 часов.The activated prothrombin complex is a protein preparation, therefore, like other proteins used for medicinal purposes, it can be unstable during storage. Stability is one of the problems that is solved when developing the technology for the production of the drug. According to existing requirements, the reconstituted concentrate must be stable for at least 12 hours.
Другая проблема связана с использованием плазмы - это необходимость защиты реципиентов от вирусов, которые потенциально могут содержаться в крови доноров. Поэтому важными и ответственными в производственном цикле являются стадии химической и/или тепловой вирусной инактивации.Another problem associated with the use of plasma is the need to protect recipients from viruses that could potentially be in the blood of donors. Therefore, the stages of chemical and / or thermal viral inactivation are important and responsible in the production cycle.
Во второй половине 80-х годов был разработан и внедрен новый метод вирусной инактивации - сольвент/детергентный (S/D метод), который впоследствии взяли на вооружение многие компании. Этот метод является неспецифическим и позволяет инактивировать все вирусы с липидной оболочкой: в частности ВИЧ, вирусы гепатита C и B, а также возможные неизвестные вирусы с липидной оболочкой. Вирусы ВИЧ-инфекции, гепатитов B и C являются наиболее патогенными, поскольку имеют относительно сложное строение и легче преодолевают иммунный барьер. Однако S/D обработка столь действенна, что вирусная нагрузка в 1000000000 частиц на миллилитр устраняется менее чем за 2 минуты. Тем не менее, S/D обработку для многих препаратов выполняют в течение 4-24 часов, что обеспечивает высокий уровень вирусной безопасности. Применяемые детергенты TWEEN-80 или Triton-X-100 в сочетании с гидрофобным растворителем три-n-бутилфосфатом (TnBP) разрушают липопротеиновые оболочки вирусов. Оставшиеся фрагменты нуклеиновых кислот не обладают патогенным действием и удаляются на последующих этапах очистки препарата. Эффективность S/D метода зависит от температуры и времени воздействия. S/D метод также применяется в качестве метода вирусной инактивации при изготовлении рекомбинантных препаратов.In the second half of the 80s, a new method of viral inactivation was developed and introduced - the solvent / detergent (S / D method), which many companies subsequently adopted. This method is non-specific and allows inactivation of all viruses with a lipid membrane: in particular HIV, hepatitis C and B viruses, as well as possible unknown viruses with a lipid membrane. The viruses of HIV infection, hepatitis B and C are the most pathogenic because they have a relatively complex structure and are easier to overcome the immune barrier. However, S / D processing is so effective that a viral load of 1,000,000,000 particles per milliliter is eliminated in less than 2 minutes. Nevertheless, S / D treatment for many drugs is performed within 4-24 hours, which ensures a high level of viral safety. Detergents TWEEN-80 or Triton-X-100 used in combination with a hydrophobic solvent, tri-n-butylphosphate (TnBP) destroy lipoprotein coatings of viruses. The remaining fragments of nucleic acids do not have a pathogenic effect and are removed at subsequent stages of drug purification. The effectiveness of the S / D method depends on temperature and exposure time. The S / D method is also used as a method of viral inactivation in the manufacture of recombinant preparations.
Тепловой способ вирусной инактивации применяется на лиофилизированных препаратах для воздействия на оболочечные вирусы (ВИЧ, гепатиты B и C) и на вирусы, не имеющие оболочек (гепатит A, парвовирус В19). Эффективность данной вирусной инактивации зависит от комбинации нескольких факторов воздействия на вирус: температурного режима, экспозиции установленной температуры, физическое состояние препарата, содержание соли, природы и концентрации стабилизатора. Последний необходим для сохранения качества и гемостатической активности препарата. Тепловой режим варьируется от 60°C до 100°C, экспозиция от 30 минут до 72 часов. В настоящее время многими фирмами применяется так называемый «тепловой шок»: температурный режим 100°C в течение 30 минут.The thermal method of viral inactivation is used on lyophilized preparations to act on enveloped viruses (HIV, hepatitis B and C) and on viruses without membranes (hepatitis A, parvovirus B19). The effectiveness of this viral inactivation depends on a combination of several factors influencing the virus: temperature, exposure to the set temperature, physical condition of the drug, salt content, nature and concentration of the stabilizer. The latter is necessary to maintain the quality and hemostatic activity of the drug. Thermal conditions vary from 60 ° C to 100 ° C, exposure from 30 minutes to 72 hours. Currently, many firms use the so-called “heat shock”: temperature conditions of 100 ° C for 30 minutes.
Помимо S/D метода и тепловой обработки третьим методом инактивации вирусов является нанофильтрация, нацеленная на безоболочечные вирусы. Это весьма действенный метод, хотя он и уступает в эффективности S/D и тепловой обработкам. С другой стороны, патогенность безоболочечных вирусов не так высока, и они преимущественно передаются пероральным и воздушно-капельным путями.In addition to the S / D method and heat treatment, the third method of virus inactivation is nanofiltration, aimed at non-enveloped viruses. This is a very effective method, although it is inferior in S / D efficiency and heat treatments. On the other hand, the pathogenicity of non-enveloped viruses is not so high, and they are predominantly transmitted by the oral and airborne routes.
Не редко производители препаратов плазмы комбинируют выше упомянутые способы обеспечения вирусной безопасности.It is not uncommon for manufacturers of plasma preparations to combine the above-mentioned methods for ensuring viral safety.
На сегодняшний день на рынке присутствуют только два препарата aPCC: «FEIBA» («Baxter», Австрия) и «Autoplex Т» («NABI», США). Первый и наиболее широко используемый препарат этого ряда, «FEIBA» получил название по ожидаемому механизму действия - Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity (активность в «обход» фактора VIII).Only two aPCC products are currently on the market: FEIBA (Baxter, Austria) and Autoplex T (NABI, USA). The first and most widely used drug of this series, FEIBA, was named after the expected mechanism of action - Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity (activity in the "bypass" of factor VIII).
Кроме концентратов активированного протромбинового комплекса также существуют два препарата активированного рекомбинантного фактора VII. Долгое время единственным в мире выпускаемым rFVIIa был препарат «NovoSeven» («Novo Nordisk», Дания). С 2010 года в России появился и стал успешно применяться для лечения больных с ингибиторной формой гемофилии первый отечественный препарат rFVIIa - «Коагил-VII» («ГЕНЕРИУМ», Россия).In addition to concentrates of the activated prothrombin complex, there are also two preparations of activated recombinant factor VII. For a long time, the only rFVIIa produced in the world was NovoSeven (Novo Nordisk, Denmark). Since 2010, the first domestic rFVIIa drug, Coagil-VII (GENERIUM, Russia), appeared and began to be successfully used to treat patients with an inhibitory form of hemophilia.
Препараты активированного протромбинового комплекса и рекомбинантного активированного фактора VII имеют разные механизм запуска системы гемостаза, при этом каким именно образом это происходит, остается предметом дискуссий.The preparations of the activated prothrombin complex and recombinant activated factor VII have different mechanisms for triggering the hemostasis system, and exactly how this happens remains the subject of discussion.
Концентраты aPCC и rFVIIa высокоэффективны и вирусбезопасны, но, к сожалению, весьма дорогостоящи, также следует учитывать, что российских аналогов aPCC просто не существует.Concentrates aPCC and rFVIIa are highly effective and virus-safe, but, unfortunately, are very expensive, it should also be borne in mind that Russian analogues of aPCC simply do not exist.
Известны способы получения активированного протромбинового комплекса, обладающего FVIII-шунтирующей активностью, включающие получение криосупернатанта из цитратной плазмы, активацию протромбинового комплекса в отсутствие свободных ионов кальция и последующее выделение aPCC методом анионообменной хроматографии на DEAE-Sephadex А50 в объеме. Авторы этих патентов осуществляли активацию путем добавления каолина или целита 512 (патент US 4160025, 03.07.1979) и декстрансульфата или непосредственно за счет перемешивания с сорбентом в течение не менее 12 часов (патент US 4395396, 26.07.1983).Known methods for producing an activated prothrombin complex having FVIII-shunting activity, including the preparation of a cryosupernatant from citrate plasma, activation of the prothrombin complex in the absence of free calcium ions, and subsequent isolation of aPCC by anion exchange chromatography on DEAE-Sephadex A50 in volume. The authors of these patents carried out activation by adding kaolin or Celite 512 (patent US 4160025, 03/03/1979) and dextransulfate, or directly by mixing with a sorbent for at least 12 hours (patent US 4395396, 07.26.1983).
Серьезным недостатком этих методов является невозможность контролировать процесс активации и, следовательно, невозможность стандартизации процесса производства. При этом продолжительность и ход активации чрезвычайно важны, так как в процессе активации может образовываться побочный продукт - тромбин. Тромбин повышает риск тромботических осложнений, его присутствие в значительных концентрациях в конечном продукте недопустимо. Также авторами этих патентов не оценивается состояние исходного материала для активации, таким образом, не принимается во внимание уже существующая степень активации каждой партии плазмы или криосупернатанта. Авторы данных патентов предлагают для компенсации вариаций объединять партии готовой продукции с разными количествами единиц FEIBA и тромбина. Это является неудовлетворительным, поскольку повышается риск контаминации, присущий такой процедуре, и не соответствует современным требованиям биофармацевтического производства.A serious drawback of these methods is the inability to control the activation process and, therefore, the inability to standardize the production process. At the same time, the duration and course of activation is extremely important, since in the process of activation, a by-product, thrombin, can form. Thrombin increases the risk of thrombotic complications, its presence in significant concentrations in the final product is unacceptable. Also, the authors of these patents do not evaluate the state of the starting material for activation, thus, the already existing degree of activation of each batch of plasma or cryosupernatant is not taken into account. The authors of these patents propose combining batches of finished products with different quantities of FEIBA and thrombin units to compensate for variations. This is unsatisfactory, since the risk of contamination inherent in such a procedure increases and does not correspond to modern requirements of biopharmaceutical production.
В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) является способ получения FVIII-шунтирующей активности, включающий последовательные стадии выделения протромбинового комплекса и его активации действием сверхнизких концентраций ионов кальция (патент US 4364861, 21.12.1982). Такой способ лишен вышеупомянутых недостатков, однако сопряжен с образованием неконтролируемых количеств тромбина, содержание которого в конечном препарате допускается только на крайне низком уровне.As the closest analogue (prototype) is a method of obtaining FVIII-shunting activity, which includes successive stages of the isolation of the prothrombin complex and its activation by the action of ultra-low concentrations of calcium ions (
Задачей настоящего изобретения являлась разработка технологии получения препарата, обладающего фактор VIII-шунтирующей активностью, лишенной вышеприведенных недостатков.The objective of the present invention was to develop a technology for producing a drug having factor VIII-shunting activity, devoid of the above disadvantages.
Технический результат заявленного изобретения заключается в расширении арсенала технических средств для получения активированного протромбинового комплекса, обладающего FVIII-шунтирующей активностью, с высокой степенью очистки от балластных белков и тромбина.The technical result of the claimed invention consists in expanding the arsenal of technical means for producing an activated prothrombin complex having FVIII-shunting activity, with a high degree of purification from ballast proteins and thrombin.
Технический результат достигается тем, что создан способ получения лиофилизированного препарата активированного протромбинового комплекса, обладающего фактор VIII-шунтирующей активностью, включающий криофракционирование свежезамороженной плазмы крови человека, выделение из криосупернатанта протромбинового комплекса методом анионообменной хроматографии, его активацию ионами кальция, вирусную инактивацию и последующие очистку от балластных белков и тромбина, стерильную фильтрацию и лиофильную сушку, при этом выделение из криосупернатанта протромбинового комплекса проводят с помощью сильного анионообменного сорбента, его активацию - ионами кальция с концентрацией 0,8÷1 мМ, а очистку от балластных белков и тромбина - хроматографией на слабом катионообменнике.The technical result is achieved by the fact that a method for producing a lyophilized preparation of an activated prothrombin complex having a factor VIII-shunting activity was created, including cryofractionation of freshly frozen human blood plasma, isolation of the prothrombin complex from the cryosupernatant by anion exchange chromatography, its activation by calcium ions, viral inactivation and subsequent purification from ballast proteins and thrombin, sterile filtration and freeze drying, while isolation from cryosupe natanta prothrombin complex is carried out by strong anion exchange sorbent, its activation - calcium ions with the concentration of 0,8 ÷ 1 mM, and the purification of the ballast proteins and thrombin - chromatography on a weak cation exchanger.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Получение препарата активированного протромбинового комплекса, обладающего фактор VIII-шунтирующей активностью, заключается в выделение криосупернатанта (КСН) из свежезамороженной плазмы (СЗП) в процессе первичного криофракционирования по методу J. Newman. Затем из КСН методом анионообменной хроматографии выделяют протромбиновый комплекс (PPSB) с помощью сильного анионообменного сорбента, затем активируют PPSB действием ионов кальция с концентрацией 0,8÷1 мМ. Полученный таким образом aPCC подвергают вирусной инактивации сольвент/детергентным методом. После чего осуществляют очистку aPCC от балластных белков и тромбина, образующегося в процессе активации путем проведения хроматографии на слабом катионообменнике с использованием буферных растворов разной ионной силы. На последнем этапе производства активированный протромбиновый комплекс стерилизуют и переводят в лиофилизированную форму. На схеме 1 представлена последовательность стадий производства активированного протромбинового комплекса согласно данному методу.Obtaining a preparation of an activated prothrombin complex with factor VIII-shunting activity consists in the isolation of cryosupernatant (SPF) from freshly frozen plasma (FFP) in the process of primary cryofraction according to the method of J. Newman. Then, the prothrombin complex (PPSB) is isolated from KSN by anion-exchange chromatography using a strong anion-exchange sorbent, then PPSB is activated by the action of calcium ions with a concentration of 0.8 ÷ 1 mM. The aPCC thus obtained was subjected to the viral inactivation of the solvent / detergent method. Then, aPCC is purified from ballast proteins and thrombin generated during activation by chromatography on a weak cation exchanger using buffer solutions of different ionic strengths. At the last stage of production, the activated prothrombin complex is sterilized and converted into a lyophilized form. Figure 1 shows the sequence of stages of production of the activated prothrombin complex according to this method.
Предложенное сочетание и последовательность стадий обработки КСН, условия выделения, активации и очистки в предлагаемом способе позволяют решить трудности, связанные с контролем процесса активации протромбинового комплекса, позволяют обеспечить отсутствие тромбина в конечном препарате, а также вирусную безопасность, стабильность при хранении и удобство применения готовой формы.The proposed combination and sequence of stages of the treatment of SPEs, the conditions of isolation, activation and purification in the proposed method can solve the difficulties associated with controlling the activation of the prothrombin complex, ensure the absence of thrombin in the final preparation, as well as viral safety, storage stability and ease of use of the finished form .
Для выделения протромбинового комплекса из КСН могут использоваться различные сильные анионообменные сорбенты, несущие различные положительно заряженные группы (DEAE, ТМАЕ, QAE, ТАМ, АЕ, Q и т.п.), способные сорбировать значительное количество фактора VII, например TOYOPEARL GigaCap Q-650M («TOSOH BIOSCIENCE», Япония), Capto Q, или QAE-Sephadex A50 («GE HealthCare», США).For the isolation of the prothrombin complex from SPH, various strong anion-exchange sorbents can be used, bearing various positively charged groups (DEAE, TMAE, QAE, TAM, AE, Q, etc.) capable of sorbing a significant amount of factor VII, for example, TOYOPEARL GigaCap Q-650M ("TOSOH BIOSCIENCE", Japan), Capto Q, or QAE-Sephadex A50 ("GE HealthCare", USA).
Для регулирования pH в способе предпочтительно использовать 0.5 М растворы уксусной кислоты или Tris.To adjust the pH in the method, it is preferable to use 0.5 M solutions of acetic acid or Tris.
В процессе активации в качестве источников ионов кальция можно использовать любые водорастворимые вещества, не нарушающие структуру и функцию белков, не препятствующие активации и нетоксичные для человека (хлорид кальция, ацетат кальция, глицинат кальция, и т.д.) в концентрации 0,8÷1 мМ. рН активируемого образца может варьировать в диапазоне от 7.0 до 8.0. Температура проведения процесса может находиться в диапазоне от 5 до 25°C, время активации может составлять от 4 до 48 ч.During the activation process, any water-soluble substances that do not violate the structure and function of proteins, do not interfere with activation and are non-toxic to humans (calcium chloride, calcium acetate, calcium glycinate, etc.) at a concentration of 0.8 ÷ can be used as sources of calcium ions 1 mM. The pH of the activated sample can vary from 7.0 to 8.0. The temperature of the process can be in the range from 5 to 25 ° C, the activation time can be from 4 to 48 hours.
Используемая для активации оптимальная концентрация ионов кальция, pH, температура и время активации связаны с исходной степенью активации протромбинового комплекса, концентрации и соотношения плазменных факторов свертывания крови, количества и относительного состава фосфолипидов, концентрации общего белка, состава буферного раствора.The optimal concentration of calcium ions used for activation, pH, temperature and activation time are related to the initial degree of activation of the prothrombin complex, the concentration and ratio of plasma coagulation factors, the amount and relative composition of phospholipids, the concentration of total protein, and the composition of the buffer solution.
То есть для активации следует использовать образец PPSB, в котором соотношение FII, FVII, FIX и FX, близкое 1:1:1:1 соответственно, при этом концентрация общего белка составляет порядка 3-5% при pH раствора около 7.60 и проводимости 10-15 мСи/см. В этом случае максимальная генерация FEIBA-активности достигается при концентрации ионов кальция 0,8÷1 мМ, температуре 15°C и инкубации в течение 24 часов.That is, for activation, a PPSB sample should be used, in which the ratio of FII, FVII, FIX and FX is close to 1: 1: 1: 1, respectively, while the concentration of the total protein is about 3-5% at a pH of about 7.60 and a conductivity of 10- 15 mSi / cm. In this case, the maximum generation of FEIBA activity is achieved at a concentration of calcium ions of 0.8 ÷ 1 mm, a temperature of 15 ° C and incubation for 24 hours.
Для прекращения процесса активации используют хелатирующие агенты, не нарушающие структуру и функцию белков и нетоксичные для человека (Chelex 100 («BioRad Laboratories», США), Amberlite («Dow Chemical Company», США) и т.п.) или вещества, необратимо связывающие ионы кальция в водном растворе (цитрат натрия, фосфат натрия, и т.п). Образовавшиеся в процессе сгустки удаляют центрифугированием или фильтрацией.To stop the activation process, chelating agents are used that do not violate the structure and function of proteins and are non-toxic to humans (Chelex 100 (BioRad Laboratories, USA), Amberlite (Dow Chemical Company, USA), etc.) or substances irreversibly binding calcium ions in an aqueous solution (sodium citrate, sodium phosphate, etc.). Clots formed during the process are removed by centrifugation or filtration.
Вирусную инактивацию производят путем перемешивания aPCC с 1% Tween 80 и 0.3% TnBP в течение от 4 до 24 часов. В качестве стабилизаторов используют, например, различные сочетания концентраций лизина и глицина.Viral inactivation is performed by mixing aPCC with 1% Tween 80 and 0.3% TnBP for 4 to 24 hours. As stabilizers, for example, various combinations of lysine and glycine concentrations are used.
Удаление S/D, очистку aPCC от тромбина, а также от балластных белков и продуктов деградации проводят колоночной хроматографией на слабом катионообменнике с использованием различных сорбентов, например TOYOPEARL GigaCap Q-650M или Capto Q. При этом буферный раствор, используемый для фракционирования, содержит оптимально Tris, цитрат натрия, хлорид натрия, воду для инъекций, pH 7.55-7.65. Одним из условий фракционирования является изменение концентрации натрия хлорида в сторону увеличения. В приведенной ниже таблице 1 представлены параметры используемых буферов в процессе очистки aPCC.S / D removal, purification of aPCC from thrombin, as well as from ballast proteins and degradation products, is carried out by column chromatography on a weak cation exchanger using various sorbents, for example, TOYOPEARL GigaCap Q-650M or Capto Q. In this case, the buffer solution used for fractionation contains optimally Tris, sodium citrate, sodium chloride, water for injection, pH 7.55-7.65. One of the conditions for fractionation is a change in the concentration of sodium chloride in the direction of increase. Table 1 below shows the parameters of the buffers used during the aPCC flushing process.
В полученном растворе aPCC корректируют содержание хлорида натрия, цитрата натрия и pH до уровня, близкого к физиологическому (137 мМ NaCl, 13.5 мМ CitNa3 и pH 7.34), затем раствор концентрируют и стерильно фильтруют оптимально в 3 этапа через мембранные микрофильтры с размерами пор 2-8 мкм, 1.2 мкм и, наконец, 0.65 мкм. После чего концентрат активированного протромбинового комплекса стерильно разливают по флаконам объемом 50 мл и подвергают лиофильной сушке.In the resulting aPCC solution, the content of sodium chloride, sodium citrate and pH is adjusted to a level close to physiological (137 mM NaCl, 13.5 mM CitNa 3 and pH 7.34), then the solution is concentrated and sterile filtered optimally in 3 stages through membrane microfilters with pore size 2 -8 microns, 1.2 microns and finally 0.65 microns. After that, the concentrate of the activated prothrombin complex is sterilely poured into 50 ml vials and subjected to freeze drying.
Ниже представлены конкретные примеры осуществления изобретения.The following are specific examples of carrying out the invention.
Пример 1Example 1
Свежезамороженную плазму размораживают при 35°C при непрерывном перемешивании, после того как температура смеси достигает 0-+4°C, криоприципитат отделяют проточным центрифугированием при 4000 об/мин при температуре 0°C. pH полученного криосупернатанта до 7.60 доводят 1.0 М гидроксидом натрия, затем к КСН медленно при перемешивании добавляют сухой сильный анионообменный сорбент QAE-Sephadex А50 («GE HealthCare», США) из расчета 1.5 г/л КСН, суспензию перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Сорбент отделяют на колонне и промывают буфером A (80 мМ NaCl, 20 мМ CitNa3, pH 7.60), протромбиновый комплекс элюируют буфером B (500 мМ NaCl, 20 мМ CitNa3, pH 7.60), элюат концентрируют и диализуют против буфера C (100 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 7.60) до конечной концентрации общего белка 4.0%. Выход PPSB по факторам II, VII, IX и X составлял 91.9%, 78.0%, 92.4% и 94.6% соответственно.Freshly frozen plasma is thawed at 35 ° C with continuous stirring, after the temperature of the mixture reaches 0- + 4 ° C, cryoprecipitate is separated by flow centrifugation at 4000 rpm at a temperature of 0 ° C. The pH of the obtained cryosupernatant was adjusted to 7.60 with 1.0 M sodium hydroxide, then QAE-Sephadex A50 dry strong anion-exchange sorbent (GE HealthCare, USA) was added slowly to the SPE with stirring at a rate of 1.5 g / L SPF, the suspension was stirred for 2 hours at room temperature. The sorbent is separated on a column and washed with buffer A (80 mM NaCl, 20 mM CitNa 3 , pH 7.60), the prothrombin complex is eluted with buffer B (500 mM NaCl, 20 mM CitNa 3 , pH 7.60), the eluate is concentrated and dialyzed against buffer C (100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7.60) to a final concentration of total protein of 4.0%. The yield of PPSB for factors II, VII, IX, and X was 91.9%, 78.0%, 92.4%, and 94.6%, respectively.
К концентрату протромбинового комплекса при перемешивании добавляют 25 мМ CaCl2 таким образом, чтобы конечная концентрация свободных ионов кальция составляла 0.85 мМ. Раствор инкубируют при непрерывном перемешивании при pH 7.60 и температуре 15°C в течение 24 часов. После этого свободные ионы кальция связывают добавлением при перемешивании трехкратного избытка 1.1 М CitNa3, осадок цитрата кальция, а также образовавшиеся в процессе активации сгустки отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. Количество сгенерированной FEIBA-активности составило 58.1 МЕ/мл, тромбина 101.3 МЕ/мл.To the prothrombin complex concentrate, 25 mM CaCl 2 is added with stirring so that the final concentration of free calcium ions is 0.85 mM. The solution was incubated with continuous stirring at pH 7.60 and a temperature of 15 ° C for 24 hours. After this, free calcium ions are bound by adding a triple excess of 1.1 M CitNa 3 with stirring, the precipitate of calcium citrate, and also clots formed during activation, are separated by centrifugation at 2000 rpm for 10 min. The amount of FEIBA activity generated was 58.1 IU / ml, thrombin 101.3 IU / ml.
К полученному таким образом концентрату активированного протромбинового комплекса добавляют сухой лизин до конечной концентрации 10 мМ в сочетание с сухим глицином до конечной концентрации 100 мМ, после растворения аминокислот к aPCC добавляют 11% TWEEN 80 до конечной концентрации 1.0% и TnBP до конечной концентрации 0.3%, вирусную инактивацию проводят при непрерывном перемешивании при комнатной температуре в течение 6 часов. Выход по целевой активности 85-90%.Dry lysine is added to the resulting concentrate of the activated prothrombin complex to a final concentration of 10 mM in combination with dry glycine to a final concentration of 100 mM, after dissolving the amino acids, 11% TWEEN 80 is added to aPCC to a final concentration of 1.0% and TnBP to a final concentration of 0.3%, viral inactivation is carried out with continuous stirring at room temperature for 6 hours. The yield of the target activity is 85-90%.
Очистку aPCC проводят методом колоночной хроматографии на слабом катионообменнике с использованием сорбента TOYOPEARL GigaCap Q-650M, для этого гель уравновешивают буфером A, после чего на него со скоростью 60 см/ч наносят aPCC из расчета 30-35 ME FEIBA-активности/мл геля. Для удаления несвязанных белков сорбент промывают буфером A, затем для очистки от балластных белков и тромбина буфером D (140 мМ NaCl, 20 мМ CitNa3, pH 7.60), десорбцию активированного протромбинового комплекса проводят буфером C, сорбент подвергают регенерации. Выход по FEIBA-активности 83-90%.Purification of aPCC is carried out by column chromatography on a weak cation exchanger using the TOYOPEARL GigaCap Q-650M sorbent, for which the gel is equilibrated with buffer A, after which aPCC is applied at a speed of 60 cm / h based on 30-35 ME FEIBA activity / ml gel. To remove unbound proteins, the sorbent is washed with buffer A, then to remove ballast proteins and thrombin with buffer D (140 mM NaCl, 20 mM CitNa 3 , pH 7.60), the activated prothrombin complex is desorbed with buffer C, the sorbent is regenerated. The yield on FEIBA activity is 83-90%.
К элюату добавляют 11.0 мМ CitNa3, таким образом, чтобы в растворе aPCC конечная концентрация хлорида натрия составила 137 мМ, а цитрата натрия 13.5 мМ, pH до 7.34 корректируют 0.5 М уксусной кислотой. Затем раствор активированного протромбинового комплекса концентрируют так, что бы количество единиц FEIBA-активности составило 25 МЕ/мл, стерилизуют в 3 этапа через мембранные микрофильтры с размерами пор 2-8 мкм, 1.2 мкм и 0.65 мкм, разливают по 20 мл во флаконы объемом 50 мл и замораживают при -50°C и давление 1 бар в течение 7.5 часов, лиофилизацию проводят повышением температуры от -20 до +30°C при давлении 60 мкбар в течение 40.5 ч. Выход по FEIBA-активности на данном этапе составлял 85-90%.11.0 mM CitNa 3 was added to the eluate, so that in the aPCC solution the final concentration of sodium chloride was 137 mM, and sodium citrate 13.5 mM, pH adjusted to 7.34 with 0.5 M acetic acid. Then, the solution of the activated prothrombin complex is concentrated so that the number of units of FEIBA activity is 25 IU / ml, sterilized in 3 stages through membrane microfilters with pore sizes of 2-8 μm, 1.2 μm and 0.65 μm, and poured into 20 ml 50 ml vials ml and frozen at -50 ° C and a pressure of 1 bar for 7.5 hours, lyophilization is carried out by increasing the temperature from -20 to + 30 ° C at a pressure of 60 μbar for 40.5 hours. The FEIBA activity at this stage was 85-90 %
Пример 2Example 2
Все этапы способа были проведены также как в примере 1. Отличие заключалось лишь в том, что выделение КСН проводили медленно при перемешивании, добавляя сухой сильный анионообменный сорбент Capto Q, его активацию осуществляли ионами кальция с концентрацией 1 мМ, а очистку aPCC проводили хроматографией на слабом катионообменнике с помощью сорбента Capto Q. Выход по FEIBA-активности на стадии хроматографии составил 83-90%. А после стерильной фильтрации и лиофильной сушки выход FEIBA-активности составил 84-90%.All steps of the method were carried out as in Example 1. The only difference was that the SPH was isolated slowly with stirring, adding Capto Q dry strong anion-exchange sorbent, its activation was carried out with calcium ions with a concentration of 1 mM, and aPCC was purified by weak chromatography cation exchanger using Capto Q sorbent. Yield by FEIBA activity at the chromatography stage was 83-90%. And after sterile filtration and freeze drying, the yield of FEIBA activity was 84-90%.
Для определения FEIBA-активности в кювете коагулометра смешивали по 50 мкл плазмы, содержащей ингибиторы FVIII, соответствующего разведения препарата, обладающего FVIII-шунтирующей активностью, АЧТВ-реагента и после прогрева при 37°C добавляли 35 мМ раствор хлорида кальция. Измеряли время от момента добавления раствора хлорида кальция до момента образования сгустка. FEIBA-активность определяли по калибровочному графику, построенному с использованием ряда последовательных разведений стандарта с известной активностью.To determine the FEIBA activity in a coagulometer cuvette, 50 μl of plasma containing FVIII inhibitors was mixed, the appropriate dilution of a drug with FVIII shunting activity, APTT reagent was mixed, and after heating at 37 ° C, a 35 mM calcium chloride solution was added. The time from the moment of adding a solution of calcium chloride to the moment of clot formation was measured. FEIBA activity was determined by a calibration graph constructed using a series of serial dilutions of a standard with known activity.
Измерение активности факторов свертывания крови и концентрации общего белка проводили по методикам, многократно описанным в литературе.Measurement of the activity of coagulation factors and the concentration of total protein was carried out according to the methods repeatedly described in the literature.
Предложенный способ позволяет получить препарат, по своей эффективности не уступающий лучшим зарубежным аналогам, и может быть рекомендован для промышленного использования.The proposed method allows to obtain a drug that is not inferior in its effectiveness to the best foreign analogues, and can be recommended for industrial use.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122173A RU2648517C1 (en) | 2017-06-23 | 2017-06-23 | Method for obtaining a liophilized preparation of an activated protrombin complex having viii-shunting activity factor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017122173A RU2648517C1 (en) | 2017-06-23 | 2017-06-23 | Method for obtaining a liophilized preparation of an activated protrombin complex having viii-shunting activity factor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2648517C1 true RU2648517C1 (en) | 2018-03-26 |
Family
ID=61707881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017122173A RU2648517C1 (en) | 2017-06-23 | 2017-06-23 | Method for obtaining a liophilized preparation of an activated protrombin complex having viii-shunting activity factor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2648517C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4160025A (en) * | 1976-08-30 | 1979-07-03 | Immuno Aktiengesellschaft Fur Chemisch-Medizinische Produkte | Method of producing a blood-coagulation-promoting preparation from human blood plasma |
| US4364861A (en) * | 1980-05-27 | 1982-12-21 | Cutter Laboratories, Inc. | Blood-coagulation-promoting products and methods of preparing them |
| US4395396A (en) * | 1980-07-22 | 1983-07-26 | Immuno Aktiengesellschaft Fur Chemisch-Medizinische Produkte | Blood-coagulation-promoting preparation based on human proteins and a method of producing the same |
-
2017
- 2017-06-23 RU RU2017122173A patent/RU2648517C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4160025A (en) * | 1976-08-30 | 1979-07-03 | Immuno Aktiengesellschaft Fur Chemisch-Medizinische Produkte | Method of producing a blood-coagulation-promoting preparation from human blood plasma |
| US4364861A (en) * | 1980-05-27 | 1982-12-21 | Cutter Laboratories, Inc. | Blood-coagulation-promoting products and methods of preparing them |
| US4395396A (en) * | 1980-07-22 | 1983-07-26 | Immuno Aktiengesellschaft Fur Chemisch-Medizinische Produkte | Blood-coagulation-promoting preparation based on human proteins and a method of producing the same |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| EHRLICH HJ. et al. Development of novel treatment options for patients with haemophilia.Hamostaseologie. 2013; 33 Suppl 1: S36-8. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6836562B2 (en) | Method for purification of therapeutic protein | |
| JP3701028B2 (en) | How to obtain high purity von Willebrand factor | |
| JPS6254286B2 (en) | ||
| AU2019208251B2 (en) | Plasma-supplemented formulation | |
| MXPA05000395A (en) | Processes for the preparation of fibrinogen. | |
| ES2400014T3 (en) | Methods for preparing factor X, factor X activated, factor X inactivated and factor Xa inactivated | |
| Michalski et al. | Large‐scale production and properties of a solvent‐detergent‐treated factor IX concentrate from human plasma | |
| EP0573605A1 (en) | Preparation of factor ix | |
| RU2648517C1 (en) | Method for obtaining a liophilized preparation of an activated protrombin complex having viii-shunting activity factor | |
| JP2001000179A (en) | Inactivation of virus | |
| RU2457248C2 (en) | Method for commercial production of thrombin | |
| RU2559576C1 (en) | Method of obtaining virus-safe complete prothrombin complex | |
| RU2583931C2 (en) | Method of producing thrombin concentrate | |
| JP2021073280A (en) | Method of purifying therapeutic proteins | |
| AU2008257222B9 (en) | Methods for preparing Factor X, activated Factor X, inactivated Factor X and inactivated Factor Xa, and pharmaceutical compositions comprising same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20200901 |