RU2646810C1 - Means for pneumofibrosis prevention and treatment and method for its production - Google Patents
Means for pneumofibrosis prevention and treatment and method for its production Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646810C1 RU2646810C1 RU2016139928A RU2016139928A RU2646810C1 RU 2646810 C1 RU2646810 C1 RU 2646810C1 RU 2016139928 A RU2016139928 A RU 2016139928A RU 2016139928 A RU2016139928 A RU 2016139928A RU 2646810 C1 RU2646810 C1 RU 2646810C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- pneumofibrosis
- endo
- acetylhexosaminidase
- hyaluronate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно пульмонологии, а также фармацевтической промышленности и биотехнологии, и предназначено для получения средства, обладающего антифибротической активностью, которое может быть использовано для профилактики и лечения пневмофиброза.The invention relates to medicine, namely pulmonology, as well as the pharmaceutical industry and biotechnology, and is intended to obtain funds with antifibrotic activity, which can be used for the prevention and treatment of pneumofibrosis.
Пневмофиброз включает в себя гетерогенную группу легочных расстройств, характеризующихся прогрессирующей и необратимой деструкцией архитектуры альвеолярного эпителия, вызванной образованием рубцов, что приводит к нарушению газообмена и в конечном итоге к смерти от дыхательной недостаточности. Идиопатический пневмофиброз - наиболее тяжелая форма пневмофиброза с неизвестной этиологией, хотя описаны различные потенциальные факторы риска, такие как курение, генетические факторы, вирусные инфекции, радио- и химиотерапия, воздействие окружающей среды и др. Медикаментозная терапия при пневмофиброзе разделяется на противовоспалительную терапию, антифиброзную терапию и терапию, направленную на устранение нежелательных симптомов. В действующем в настоящее время Руководстве по диагностике и ведению идиопатического пневмофиброза [Raghu G., Rochwerg B., Zhang Y. et al. An Official ATS/ERS/JRS/ALAT Clinical Practice Guideline: Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. An Update of the 2011 Clinical Practice Guideline. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2015, Vol. 192, №2, P. e3-19], разработанном под эгидой Европейского респираторного общества, Американского торакального общества, Японского респираторного общества и Латиноамериканской торакальной ассоциации, даются научно обоснованные рекомендации но лечению пациентов и подчеркивается, что в настоящее время невозможно сделать однозначный выбор в пользу какой-либо одной медикаментозной терапии для идиопатического пневмофиброза.Pneumofibrosis includes a heterogeneous group of pulmonary disorders characterized by progressive and irreversible destruction of the architecture of the alveolar epithelium caused by scarring, which leads to impaired gas exchange and ultimately to death from respiratory failure. Idiopathic pneumofibrosis is the most severe form of pneumofibrosis with an unknown etiology, although various potential risk factors such as smoking, genetic factors, viral infections, radio and chemotherapy, environmental exposure, etc. are described. Drug therapy for pneumofibrosis is divided into anti-inflammatory therapy, antifibrotic therapy and therapy to eliminate unwanted symptoms. In the current Guidelines for the diagnosis and management of idiopathic pneumofibrosis [Raghu G., Rochwerg B., Zhang Y. et al. An Official ATS / ERS / JRS / ALAT Clinical Practice Guideline: Treatment of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. An Update of the 2011 Clinical Practice Guideline. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2015, Vol. 192, No. 2, P. e3-19], developed under the auspices of the European Respiratory Society, the American Thoracic Society, the Japanese Respiratory Society and the Latin American Thoracic Association, scientifically sound recommendations are made for the treatment of patients and it is emphasized that it is currently impossible to make an unambiguous choice in the benefit of any one drug therapy for idiopathic pneumofibrosis.
Среди средств для антифиброзной терапии могут использоваться лекарственные средства на основе гиалуронидазы, поскольку этот фермент препятствует образованию коллагеновых волокон и является наиболее универсальным средством воздействия на соединительную ткань. Однако препараты на основе нативной гиалуронидазы малоэффективны. При парентеральном пути введения они быстро инактивируются ингибиторами сыворотки крови. Кроме этого эти препараты термолабильны, требуют длительного курса лечения, и при их применении возможно развитие аллергических реакций у пациента [Самцов А.В., Лучина Е.Н. Клинический опыт применения препаратов на основе гиалуронидазы: комплексная терапия Рубцовых деформаций кожи. Экспериментальная и клиническая дерматокосметология, 2012, №6, С. 33-37].Among the antifibrotic agents, hyaluronidase-based drugs can be used, since this enzyme prevents the formation of collagen fibers and is the most universal means of acting on connective tissue. However, drugs based on native hyaluronidase are ineffective. With the parenteral route of administration, they are rapidly inactivated by serum inhibitors. In addition, these drugs are thermolabile, require a long course of treatment, and when they are used, it is possible to develop allergic reactions in the patient [Samtsov A.V., Luchina E.N. Clinical experience with the use of drugs based on hyaluronidase: a complex therapy of cicatricial deformities of the skin. Experimental and clinical dermatocosmetology, 2012, No. 6, S. 33-37].
Гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза (далее - ГЭБНА) - фермент из семейства гиалуронидаз. Специфическая активность нативной ГЭБНА заключается в расщеплении гиалуроновой кислоты на низкомолекулярные фрагменты. Известно, что ГЭБНА препятствует гибели клеток альвеолярного эпителия и развитию пневмофиброза у мышей, однако ее концентрация в тканях легкого из-за воздействия протеолитических ферментов быстро уменьшается, что приводит к прогрессии фиброза легких. Задача защиты фермента от действия ингибиторов сыворотками крови решается путем его связывания с высокомолекулярными инертными носителями.Hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase (hereinafter - HEBNA) is an enzyme from the hyaluronidase family. The specific activity of the native GEBNA is the cleavage of hyaluronic acid into low molecular weight fragments. GEBNA is known to inhibit the death of alveolar epithelial cells and the development of pneumofibrosis in mice, but its concentration in lung tissues is rapidly reduced due to the action of proteolytic enzymes, which leads to progression of pulmonary fibrosis. The task of protecting the enzyme from the action of inhibitors by blood serum is solved by binding it to high molecular weight inert carriers.
В клинической практике в настоящее время используется препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани [патент RU 2112542, МПК A61 38/43, опубл. 10.06.1998], который содержит конъюгат фермента гиалуронидаза с высокомолекулярным синтетическим носителем полиоксидоний, молекулярная масса которого 40000-100000 Да. К недостаткам этого препарата можно отнести отсутствие тканевой кумуляции, в том числе и в тканях легких.In clinical practice, a drug is currently used to treat pathological conditions of connective tissue [patent RU 2112542, IPC A61 38/43, publ. 06/10/1998], which contains a conjugate of the enzyme hyaluronidase with a high molecular weight synthetic carrier polyoxidonium, the molecular weight of which is 40,000-100,000 Da. The disadvantages of this drug include the lack of tissue cumulation, including in the tissues of the lungs.
Наиболее близкой к заявляемому средству является иммобилизированная на полиоксиэтилене нативная тестикулярная ГЭБНА, полученная с помощью электронно-лучевого синтеза и обладающая антифибротической активностью [патент RU 2409669, МПК C12N 11/08, опубл. 20.01.2011]. Недостаток данного способа заключается в том, что в процессе иммобилизации на полиоксиэтилене ГЭБНА подвергается воздействию ионизирующего излучения, и это приводит к частичному ее разрушению. Тем не менее, данное средство является наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату: иммобилизированная на полиоксиэтилене нативная тестикулярная ГЭБНА обладает высокой эффективностью в условиях экспериментальной модели необратимого фиброза мышей при введении в терапевтическом режиме [Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Ермакова Н.Н. и др. Антифибротические эффекты иммобилизированной гиалуронидазы при повторяющихся травмах альвеолярного эпителия блеомицином. Бюл. эксперим. биол. и медицины, 2013, Т. 155, №4, С. 499-503]. Однако недостаток данного средства заключается в том, что при его введении в профилактическом режиме на мышиной модели частично обратимого фиброза, эффективность не так значительна.Closest to the claimed tool is immobilized on polyoxyethylene native testicular HEBNA obtained by electron beam synthesis and having antifibrotic activity [patent RU 2409669, IPC C12N 11/08, publ. 01/20/2011]. The disadvantage of this method is that in the process of immobilization on polyoxyethylene, HEBNA is exposed to ionizing radiation, and this leads to its partial destruction. However, this tool is the closest to the claimed technical essence and the achieved result: the native testicular immobilized on polyoxyethylene is highly effective in the experimental model of irreversible mouse fibrosis when administered in a therapeutic regimen [Digay AM, Skurikhin EG, Ermakova N.N. et al. Antifibrotic effects of immobilized hyaluronidase in repeated injuries of the alveolar epithelium with bleomycin. Bull. an experiment. biol. and medicine, 2013, T. 155, No. 4, S. 499-503]. However, the disadvantage of this tool is that when it is introduced prophylactically on a mouse model of partially reversible fibrosis, the effectiveness is not so significant.
Технический результат, достигаемый данным изобретением, заключается в создании средства для профилактики и лечения пневмофиброза и разработке способа получения этого средства, при котором исключено ионизирующее воздействие на сам фермент.The technical result achieved by this invention is to create a tool for the prevention and treatment of pneumofibrosis and to develop a method for producing this tool, which eliminates the ionizing effect on the enzyme itself.
Заявленный технический результат достигается в средстве для профилактики и лечения пневмофиброза, полученном путем облучения раствора триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена ионизирующим излучением и последующим добавлением к облученному раствору гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы и стабилизатора и представляющем прозрачный раствор, обладающий специфической активностью гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы от 50 до 150 УЕ/мл, с величиной pH от 4,5 до 7,5, мутнеющий при термостатироваиии выше 30°C и вновь становящийся прозрачным при охлаждении до температуры от 15 до 25°C. Заявленный технический результат достигается также в способе получения заявляемого средства, включающем облучение раствора триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена с концентрацией от 0,25 до 8,00% ионизирующим излучением (потоком ускоренных электронов или гамма-излучением) в дозе от 0,25 до 2,00 Мрад и последующее добавление к облученному раствору гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы до концентрации от 50 до 200 УЕ/мл, и растворимого в воде неорганического стабилизатора. В качестве растворителя используют очищенную воду или водные буферные растворы, обеспечивающие поддержание pH от 4,5 до 7,5. В качестве триблок-сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена используют полимер с нижней критической температурой растворения от 30 до 40°C (например, Pluronic L31 производства фирмы BASF, Германия), в качестве гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы используют нативную бычью тестикулярную гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазу (например, производства ООО «Самсон-Мед», Санкт-Петербург, Россия), а в качестве стабилизатора - хлористый натрий в концентрации 0,9%. В качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов, полученный любым доступным способом, например в промышленном импульсном линейном ускорителе ИЛУ-10. В целях хранения к полученному раствору заявляемого средства может быть добавлен консервант (предпочтительно вещество, не проявляющее поверхностно-активные свойства и не содержащее атомы тяжелых металлов, например бензоат натрия) до концентрации в растворе не более 0,1%, после чего раствор подвергают стерилизующей фильтрации и производят розлив и фасовку в стерильную упаковку в стерильных условиях, например во флаконы. Заявляемое средство используют в виде раствора.The claimed technical result is achieved in an agent for the prevention and treatment of pneumofibrosis obtained by irradiating a solution of a triblock copolymer of polyoxyethylene and polyoxypropylene with ionizing radiation and then adding a hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase and a stabilizer to the irradiated solution and presenting a clear solution with specific activity of g and -endo-β-N-acetylhexosaminidase from 50 to 150 U / ml, with a pH from 4.5 to 7.5, turbid when thermostated above 30 ° C and again becomes ysya transparent when cooled to a temperature of from 15 to 25 ° C. The claimed technical result is also achieved in a method for producing the claimed agent, which includes irradiating a solution of triblock copolymer of polyoxyethylene and polyoxypropylene with a concentration of 0.25 to 8.00% ionizing radiation (accelerated electron beam or gamma radiation) in a dose of 0.25 to 2 , 00 Mrad and the subsequent addition to the irradiated solution of hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase to a concentration of from 50 to 200 UE / ml and a water-soluble inorganic stabilizer. As a solvent, purified water or aqueous buffer solutions are used to maintain the pH from 4.5 to 7.5. As a triblock copolymer of polyoxyethylene and polyoxypropylene, a polymer with a lower critical dissolution temperature of 30 to 40 ° C (for example, Pluronic L31 manufactured by BASF, Germany) is used; native bovine testicular hyaluronate is used as hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase endo-β-N-acetylhexosaminidase (for example, manufactured by Samson-Med LLC, St. Petersburg, Russia), and sodium chloride at a concentration of 0.9% as a stabilizer. As the ionizing radiation using a stream of accelerated electrons obtained in any available way, for example in an industrial pulse linear accelerator ILU-10. For storage purposes, a preservative (preferably a substance that does not exhibit surface-active properties and does not contain heavy metal atoms, for example sodium benzoate) can be added to the resulting solution of the claimed agent to a concentration in the solution of not more than 0.1%, after which the solution is subjected to sterilizing filtration and produce filling and packaging in sterile packaging under sterile conditions, such as bottles. The inventive tool is used in the form of a solution.
Отличие заявляемого средства от прототипа заключается в том, что по сравнению с прототипом заявляемое средство:The difference of the claimed funds from the prototype is that, compared with the prototype of the claimed tool:
- эффективно при применении не только в терапевтическом, но и в профилактическом режиме: на модели частично обратимого пневмофиброза мышей при профилактическом режиме введения статистически достоверно снижает уровень коллагена 1 типа, гидроксипролина, гиалуроновой кислоты и общего коллагена до уровня интактного контроля;- effective when used not only in the therapeutic, but also in the prophylactic mode: on the model of partially reversible pneumofibrosis of mice, in the prophylactic mode of administration, it statistically significantly reduces the level of type 1 collagen, hydroxyproline, hyaluronic acid and total collagen to the level of intact control;
- более эффективно препятствует токсическому разрушению альвеолярного эпителия и фиброзу в легочной ткани: содержание соединительной ткани в легких мышей на модели частично обратимого пневмофиброза на 21 сутки исследования при профилактическом режиме введения заявляемого средства составляет 1,17±0,05% против 2,16±0,18% для иммобилизированной на полиоксиэтилене тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы, при терапевтическом режиме введения эти показатели составляют 1,83±0,09% и 2,29±0,17% соответственно;- more effectively prevents the toxic destruction of the alveolar epithelium and fibrosis in the lung tissue: the content of connective tissue in the lungs of mice on the model of partially reversible pneumofibrosis on day 21 of the study with a prophylactic regimen of the proposed drug is 1.17 ± 0.05% versus 2.16 ± 0 , 18% for testicular hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase immobilized on polyoxyethylene, with a therapeutic regimen of administration, these indicators are 1.83 ± 0.09% and 2.29 ± 0.17%, respectively;
- более эффективно разрушает профибротический матрикс гиалуронана, снижает активность синтеза коллагена и отложения фибротических масс в легочной ткани, при этом отмечается значительное уменьшение содержания соединительной ткани в паренхиме легких: при курсовом введении заявляемого средства на модели необратимого пневмофиброза содержание соединительной ткани в легких мышей на 21 сутки эксперимента составляет 2,41±0,09% против 2,91±0,32% при курсовом введении иммобилизированной на полиоксиэтилене тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазы.- more efficiently destroys the profibrotic matrix of hyaluronan, reduces the activity of collagen synthesis and deposition of fibrotic masses in the lung tissue, while there is a significant decrease in the content of connective tissue in the lung parenchyma: with the course administration of the claimed drug on the model of irreversible pneumofibrosis, the content of connective tissue in the lungs of mice is 21 days the experiment is 2.41 ± 0.09% versus 2.91 ± 0.32% with the course administration of testicular hyaluronate-endo-β-N-acetylge immobilized on polyoxyethylene soaminidases.
Кроме того, заявляемое средство получено способом, при котором:In addition, the claimed tool is obtained by a method in which:
- исключено облучение ГЭБНА ионизирующим излучением, что способствует сохранению активности фермента, уменьшению технологических потерь и снижению себестоимости продукта;- excluded irradiation of HEBNA with ionizing radiation, which helps to preserve the activity of the enzyme, reduce technological losses and reduce the cost of the product;
- в качестве высокомолекулярного полимера-носителя используют блок-сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена, который в силу своих физико-химических свойств позволяет заявляемому средству кумулироваться в легких и проходить через эпителий дыхательных путей и альвеол;- as a high molecular weight carrier polymer, a block copolymer of polyoxyethylene and polyoxypropylene is used, which due to its physicochemical properties allows the claimed agent to accumulate in the lungs and pass through the epithelium of the respiratory tract and alveoli;
- в качестве стабилизатора конечной формы продукта используют хлористый натрий, разрешенный к применению в фармацевтических средствах, в концентрации 0,9%, что соответствует концентрации в физиологическом растворе и обеспечивает минимальное раздражающее воздействие на эпителий дыхательных путей.- as a stabilizer of the final form of the product using sodium chloride, approved for use in pharmaceuticals, at a concentration of 0.9%, which corresponds to the concentration in physiological saline and provides minimal irritating effect on the epithelium of the respiratory tract.
Заявляемое средство позволяет увеличивать время действия ГЭБНА без потери эффективности за счет связывания с инертным носителем, защищающим ее от денатурирующего воздействия протеаз и ингибиторов и обеспечивающим сохранение фармакологической активности без повышения дозы и частоты введения. Антифибротическое действие заявляемого средства показано на модели блеомицин-индуцированного частично обратимого и необратимого пневмофиброза мышей при введении в профилактическом и терапевтическом режимах.The inventive tool allows you to increase the duration of the BBE without loss of effectiveness due to binding to an inert carrier that protects it from the denaturing effects of proteases and inhibitors and ensures the preservation of pharmacological activity without increasing the dose and frequency of administration. The antifibrotic effect of the claimed drug is shown in a model of bleomycin-induced partially reversible and irreversible pneumofibrosis of mice when introduced in prophylactic and therapeutic modes.
Блеомицин относится к группе цитостатиков. Основное токсическое действие блеомицин оказывает на легкие: вызывает пневмонию, фибротические изменения в паренхиме легких и субплевральное рубцевание аналогичное человеческому заболеванию, поэтому модель токсического пневмофиброза, вызванная интратрахеальным введением блеомицина, наиболее широко применяется в экспериментах по изучению патогенеза и поиску возможных способов лечения фиброзных заболеваний легких. Однако в условиях однократной интратрахеальной инсталляции блеомицина вызываемый пневмофиброз частично обратим, в связи с чем на экспериментальных животных, получавших блеомицин однократно, невозможно изучение аспекта медленного и необратимого прогрессирования заболевания. Необратимый пневмофиброз (в том числе идиопатический пневмофиброз) развивается в силу многократно повторяющихся (циклических) травм альвеолярного эпителия. В основе животной модели циклического повреждения легкого выступает многократное интратрахеальное введение блеомицина с помощью интубации трахеи. Гистологические показатели легких при многократном введении блеомицина более коррелирует с человеческим идиопатическим пневмофиброзом, чем однократная инсталляция цитостатика. В связи с вышеизложенным при изучении антифибротического действия заявляемого средства было использовано 2 модели экспериментального пневмофиброза.Bleomycin belongs to the group of cytostatics. The main toxic effect of bleomycin has on the lungs: it causes pneumonia, fibrotic changes in the lung parenchyma and subpleural scarring similar to a human disease, therefore the model of toxic pneumofibrosis caused by intratracheal administration of bleomycin is most widely used in experiments on the study of pathogenesis and the search for possible methods of treating fibrotic diseases. However, under conditions of a single intratracheal installation of bleomycin, the caused pneumofibrosis is partially reversible, and therefore, it is impossible to study the aspect of the slow and irreversible progression of the disease in experimental animals that received bleomycin once. Irreversible pneumofibrosis (including idiopathic pneumofibrosis) develops due to repeatedly repeated (cyclic) injuries of the alveolar epithelium. The animal model of cyclic lung damage is based on repeated intratracheal administration of bleomycin via tracheal intubation. Histological parameters of the lungs with repeated administration of bleomycin are more correlated with human idiopathic pneumofibrosis than a single installation of cytostatic. In connection with the foregoing, in studying the antifibrotic effect of the claimed drug, 2 experimental pneumofibrosis models were used.
1. Модель частично обратимого пневмофиброза1. Partially reversible pneumofibrosis model
Частично обратимый пневмофиброз моделируют однократным интратрахеальным введением раствора блеомицина мышам из расчета 80 мкг блеомицина сульфата (Blenoxane®; «
Специфические эффекты заявляемого средства исследовали в сравнении с иммобилизированной на полиоксиэтилене ГЭБНА (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент", г. Новосибирск) и нативной тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой (ООО Самсон-Мед, г. Санкт-Петербург, Россия). Препараты вводили интраназально, ежедневная доза препаратов составляла 8 УЕ.The specific effects of the claimed drug were investigated in comparison with the immobilized on polyoxyethylene GEBNA (LLC "Pacific Future Management", Novosibirsk) and the native testicular hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase (LLC Samson-Med, St. Petersburg, Russia) . The drugs were administered intranasally, the daily dose of drugs was 8 UE.
Препараты испытывали в двух режимах - профилактическом и терапевтическом. Профилактический режим: введение препаратов проводят в фазу становления воспалительной реакции (ежедневно с 1-х по 5-е сутки после введения блеомицина). Терапевтический режим: введение препаратов проводят в фазу отложения фибротических масс в паренхиме легких (ежедневно с 10-х по 20-е сутки после введения блеомицина).The drugs were tested in two modes - prophylactic and therapeutic. Preventive regimen: administration of drugs is carried out in the phase of formation of the inflammatory reaction (daily from 1 to 5 days after administration of bleomycin). Therapeutic regimen: the administration of drugs is carried out in the phase of deposition of fibrotic masses in the lung parenchyma (daily from 10 to 20 days after the injection of bleomycin).
2. Модель необратимого пневмофиброза2. The model of irreversible pneumofibrosis
Для моделирования необратимого пневмофиброза в первые сутки эксперимента раствор блеомицина вводят мышам интратрахеально из расчета 80 мкг блеомицина в 30 мкл физиологического раствора на мышь, далее - в 7, 14, 21, 28-е сутки эксперимента раствор блеомицина вводят интраназально из расчета 80 мкг блеомицина в 15 мкл физиологического раствора на мышь. Контрольным животным в аналогичных условиях вводят эквивалентный объем физиологического раствора (группа контроля). Для сравнения используют интактных животных (группа интактного контроля).To simulate irreversible pneumofibrosis on the first day of the experiment, the bleomycin solution was administered to mice intratracheally at the rate of 80 μg of bleomycin in 30 μl of physiological saline per mouse, then on the 7th, 14th, 21st, 28th day of the experiment, the bleomycin solution was administered intranasally at the rate of 80 μg of bleomycin in 15 μl of saline per mouse. Control animals under similar conditions are injected with an equivalent volume of physiological saline (control group). For comparison, intact animals are used (intact control group).
Специфические эффекты заявляемого средства исследовали в сравнении с иммобилизированной на полиоксиэтилене ГЭБНА (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент", г. Новосибирск) и нативной тестикулярной гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидазой (ООО Самсон-Мед, г. Санкт-Петербург, Россия). Препараты вводили интраназально в терапевтическом режиме (на 10-20-е сутки эксперимента), ежедневная доза препаратов составляла 8 УЕ.The specific effects of the claimed drug were investigated in comparison with the immobilized on polyoxyethylene GEBNA (LLC "Pacific Future Management", Novosibirsk) and the native testicular hyaluronate-endo-β-N-acetylhexosaminidase (LLC Samson-Med, St. Petersburg, Russia) . The drugs were administered intranasally in a therapeutic regimen (on the 10-20th day of the experiment), the daily dose of drugs was 8 UE.
Исследования легких проводили на 3, 7, 14, 21-е сутки опыта на модели частично обратимого пневмофиброза и на 21, 40, 60-е сутки опыта на модели необратимого пневмофиброза. Эвтаназию мышей осуществляли передозировкой CO2, после чего изучали морфологическую картину легких.Studies of the lungs were performed on the 3rd, 7th, 14th, 21st day of the experiment on the model of partially reversible pneumofibrosis and on the 21st, 40th, 60th day of the experiment on the model of irreversible pneumofibrosis. Euthanasia of mice was performed with an overdose of CO 2 , after which the morphological picture of the lungs was studied.
Для проведения гистологических исследований стандартно обработанные легкие мышей окрашивали по Ван-Гизону на соединительную ткань. С помощью компьютерного графического анализа на стандартной площади гистологического среза измеряли площадь коллагеновых волокон в ткани легкого. Затем вычисляли долю этих показателей от стандартной площади среза.For histological studies, standardly treated lungs of mice were stained according to Van Gieson on connective tissue. Using computer graphical analysis on the standard area of the histological section was measured the area of collagen fibers in lung tissue. Then calculated the proportion of these indicators from the standard cut area.
Уровни коллагена I типа, гидроксипролина и гиалуроновой кислоты определялись методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями производителя (Cusabio Biotech CO., Ltd, China). Чувствительность ИФА для гидроксипролина>1,95 нг/мл, для гиалуроновой кислоты>15,6 пг/мл и для коллагена I типа>0,039 нг/мл. Общий коллаген определяли с помощью стандартной кривой Sircol™ анализа (Biocolor Ltd, UK) в соответствии с инструкциями изготовителя, предел обнаружения: 1,0 мкг/100 мкл.Levels of type I collagen, hydroxyproline and hyaluronic acid were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in accordance with the manufacturer's instructions (Cusabio Biotech CO., Ltd, China). The ELISA sensitivity for hydroxyproline is> 1.95 ng / ml, for hyaluronic acid> 15.6 pg / ml and for type I collagen> 0.039 ng / ml. Total collagen was determined using a standard Sircol ™ curve analysis (Biocolor Ltd, UK) according to the manufacturer's instructions, detection limit: 1.0 μg / 100 μl.
Математическую обработку результатов производили с применением стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали с использованием параметрического t критерия Стьюдента или непараметрического U критерия Уилкоксона.Mathematical processing of the results was carried out using standard methods of variation statistics. Significance of differences was evaluated using parametric Student's t test or nonparametric Wilcoxon's U test.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. 2% водный раствор Pluronic L31 облучают потоком ускоренных электронов в дозе 0,5 Мрад на импульсном линейному ускорителе ИЛУ 10. В облученный раствор вносят хлористый натрий до концентрации 0,9% и нативную бычью тестикулярную ГЭБНА до концентрации 100 УЕ/мл, перемешивают при комнатной температуре, добиваясь полного растворения, и получают готовое средство, представляющее собой прозрачный раствор слабокоричневого цвета без осадка и посторонних включений, с pH от 4,5 до 7,5, обладающий специфической активностью ГЭБНА 100 УЕ/мл, становящийся мутным при термостатировании выше 30°C и вновь становящийся прозрачным при охлаждении до температуры от 15 до 25°C. Готовое средство подвергают стерилизующей фильтрации и производят розлив и фасовку в стерильные флаконы в стерильных условиях.Example 1. A 2% aqueous solution of Pluronic L31 is irradiated with a stream of accelerated electrons in a dose of 0.5 Mrad on an ILU 10 linear pulse accelerator. Sodium chloride is added to the irradiated solution to a concentration of 0.9% and a native bovine testicular HEBNA to a concentration of 100 U / ml, stirred at room temperature, achieving complete dissolution, and get the finished product, which is a clear solution of light brown color without sediment and impurities, with a pH of 4.5 to 7.5, with a specific activity of GEBNA 100 U / ml, becoming turbid when thermostatted above 30 ° C and again becomes transparent when cooled to a temperature of 15 to 25 ° C. The finished product is subjected to sterilizing filtration and is filled and packaged in sterile vials under sterile conditions.
Прозрачность и цветность раствора определялась визуально, pH - иотенциометрически, специфическая активность - прямой гидролитической реакцией полученного средства с гиалуроновой кислотой.The transparency and color of the solution was determined visually, the pH was determined iotentiometrically, and the specific activity was determined by the direct hydrolytic reaction of the obtained product with hyaluronic acid.
In vivo специфическое действие заявляемого средства было изучено на мышиных моделях частично обратимого и необратимого пневмофиброза.In vivo, the specific effect of the claimed drug has been studied in mouse models of partially reversible and irreversible pneumofibrosis.
1. Модель частично обратимого пневмофиброза мышей1. Model of partially reversible pneumofibrosis of mice
На модели частично обратимого пневмофиброза у мышей при окрашивании легкого по Ван-Гизону на соединительную ткань в интерстиции альвеол отмечается прогрессирующее разрастание соединительной ткани: на 7 сутки эксперимента соединительная ткань располагается в основном периваскулярно и перибронхиально, на 14, 21 сутки наблюдается диффузное распространение фибротических масс, на 21 сутки эксперимента содержание коллагеновых волокон наибольшее и составляет 4,12±0,14% от площади ткани легкого (табл. 1).In the model of partially reversible pneumofibrosis in mice, when Van Gieson stained the lung with connective tissue in the interstitium of the alveoli, a progressive proliferation of connective tissue was noted: on the 7th day of the experiment, the connective tissue is located mainly perivascular and peribronchial, on the 14th, 21st days there is a diffuse distribution of fibrotic masses, on the 21st day of the experiment, the content of collagen fibers was the highest and amounted to 4.12 ± 0.14% of the lung tissue area (Table 1).
Интраназальное введение заявляемого средства в профилактическом режиме препятствует отложению коллагена в ткани легких у мышей. При окрашивании легкого по Ван-Гизону в легких больных животных, получавших препарат в профилактическом режиме, наблюдается уменьшение площади отложения фиброзных масс по сравнению с контролем. Эффективность заявляемого средства при профилактическом режиме введения выше эффективности иммобилизированной на полиоксиэтилене ГЭБНА. Таблица 1 показывает, что при введении животным заявляемого средства в профилактическом режиме площадь коллагеновых волокон уменьшается до уровня интактного контроля, а при введении в терапевтическом режиме - уменьшается в 2,25 раза (p=0,0037). Антифибротическая активность заявляемого средства также значительно превосходит активность иммобилизированной на полиоксиэтилене и нативной ГЭБНА.Intranasal administration of the inventive prophylactically inhibits the deposition of collagen in lung tissue in mice. When staining the lung according to Van Gieson in the lungs of sick animals treated with the drug in a prophylactic mode, there is a decrease in the area of deposition of fibrous masses compared to the control. The effectiveness of the proposed drug in the prophylactic regimen of administration is higher than the efficiency of the immobilized on polyoxyethylene GEBNA. Table 1 shows that when the inventive agent is introduced into the prophylactic regimen, the area of collagen fibers decreases to the level of intact control, and when administered in the therapeutic regimen, it decreases 2.25 times (p = 0.0037). The antifibrotic activity of the claimed drug also significantly exceeds the activity of the immobilized on polyoxyethylene and native GEBNA.
Уровни коллагена I типа, гидроксипролина, гиалуроновой кислоты и общего коллагена определялись в гомогенатах легких методом ИФА на 21 сутки эксперимента, когда наблюдается наибольшее уменьшение количества фибротических масс в легких под влиянием заявляемого средства. Результаты представлены в таблице 2: выявлено снижение под влиянием заявляемого средства уровней коллагена I типа на 36,6%, гидроксипролина на 36,3%, гиалуроновой кислоты на 34,2% и общего коллагена (на 41,1%) по сравнению с контролем (таблица 2), при этом иммобилизированная на полиоксиэтилене ГЭБНА снижает только уровень гидроксипролина и не влияет на уровень коллагена 1 типа, гиалуроновой кислоты и общего коллагена, а нативная ГЭБНА не изменяет эти показатели.Levels of type I collagen, hydroxyproline, hyaluronic acid and total collagen were determined in lung homogenates by ELISA on the 21st day of the experiment, when the greatest decrease in the number of fibrotic masses in the lungs was observed under the influence of the claimed agent. The results are presented in table 2: revealed a decrease under the influence of the proposed drug levels of type I collagen by 36.6%, hydroxyproline by 36.3%, hyaluronic acid by 34.2% and total collagen (by 41.1%) compared with the control (Table 2), while the GEBNA immobilized on polyoxyethylene only reduces the level of hydroxyproline and does not affect the level of type 1 collagen, hyaluronic acid and total collagen, and the native GEBNA does not change these indicators.
Результаты морфологических исследований и ИФА показывают, что при частично обратимом фиброзе заявляемое средство препятствует токсическому разрушению альвеолярного эпителия и развитию пневмофиброза. Эффективность заявляемого средства значительно превосходит активность иммобилизированной на полиоксиэтилене и нативной ГЭБНА.The results of morphological studies and ELISA show that with partially reversible fibrosis, the claimed drug prevents the toxic destruction of the alveolar epithelium and the development of pneumofibrosis. The effectiveness of the proposed drug significantly exceeds the activity of immobilized on polyoxyethylene and native GEBNA.
2. Модель необратимого пневмофиброза мышей2. Model irreversible pneumofibrosis of mice
При изучении специфической активности заявляемого средства на модели необратимого пневмофиброза у мышей показано, что интраназальное введение заявляемого средства в терапевтическом режиме препятствует повреждению легких, при этом отмечается значительное уменьшение содержания соединительной ткани в паренхиме легких (табл. 3). В этих условиях иммобилизированная на полиоксиэтилене и нативная ГЭБНА оказывают более слабое влияние на количество фибротических масс в паренхиме легких. К 60-м суткам эксперимента погибают 30% животных из контрольной группы, а также получавших иммобилизированную на полиоксиэтилене и нативную ГЭБНА. При лечении заявляемым средством все животные выживают.When studying the specific activity of the claimed drug in a model of irreversible pneumofibrosis in mice, it was shown that intranasal administration of the claimed drug in therapeutic mode prevents lung damage, while there is a significant decrease in the content of connective tissue in the lung parenchyma (Table 3). Under these conditions, polyoxyethylene immobilized and native GEBNA have a weaker effect on the amount of fibrotic masses in the lung parenchyma. By the 60th day of the experiment, 30% of the animals from the control group, as well as those receiving immobilized on polyoxyethylene and native HEBNA, die. When treating the claimed means, all animals survive.
Таким образом, заявляемое средство эффективно в условиях необратимого пневмофиброза при терапевтическом режиме. Антифибротическая активность препарата превосходит иммобилизированную на полиоксиэтилене и нативную ГЭБНА. Это позволяет оценивать заявляемое средство как новый и перспективный инструмент для лечения пневмофиброза.Thus, the claimed tool is effective in conditions of irreversible pneumofibrosis in a therapeutic regimen. Antifibrotic activity of the drug exceeds immobilized on polyoxyethylene and native GEBNA. This allows us to evaluate the claimed tool as a new and promising tool for the treatment of pneumofibrosis.
Пример 2. Заявляемое средство получали так же, как в примере 1, при этом концентрация водного раствора Pluronic L31 составляла 4%.Example 2. The inventive tool was obtained in the same manner as in example 1, while the concentration of an aqueous solution of Pluronic L31 was 4%.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016139928A RU2646810C1 (en) | 2016-10-10 | 2016-10-10 | Means for pneumofibrosis prevention and treatment and method for its production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016139928A RU2646810C1 (en) | 2016-10-10 | 2016-10-10 | Means for pneumofibrosis prevention and treatment and method for its production |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2646810C1 true RU2646810C1 (en) | 2018-03-07 |
Family
ID=61568381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016139928A RU2646810C1 (en) | 2016-10-10 | 2016-10-10 | Means for pneumofibrosis prevention and treatment and method for its production |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2646810C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2112542C1 (en) * | 1997-02-28 | 1998-06-10 | Аркадий Васильевич Некрасов | Preparation for treatment of connective tissue pathological state |
| US20090075875A1 (en) * | 2006-10-03 | 2009-03-19 | Stanley Hoffman | Protection against lung fibrosis by up-regulating the function or expression of caveolin-1 |
| RU2480236C1 (en) * | 2011-10-05 | 2013-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент") | Drug possessing regenerative activity |
-
2016
- 2016-10-10 RU RU2016139928A patent/RU2646810C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2112542C1 (en) * | 1997-02-28 | 1998-06-10 | Аркадий Васильевич Некрасов | Preparation for treatment of connective tissue pathological state |
| US20090075875A1 (en) * | 2006-10-03 | 2009-03-19 | Stanley Hoffman | Protection against lung fibrosis by up-regulating the function or expression of caveolin-1 |
| RU2480236C1 (en) * | 2011-10-05 | 2013-04-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент") | Drug possessing regenerative activity |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DYGAI AM. et al. Antifibrotic activity of hyaluronidase immobilized on polyethylenoxide under conditions of bleomycin-induced pneumofibrosis. Bull Exp Biol Med. 2013 Jan; 154(3): 388-92. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Papayannopoulos | Neutrophil extracellular traps in immunity and disease | |
| De Breij et al. | Prevention of Staphylococcus aureus biomaterial-associated infections using a polymer-lipid coating containing the antimicrobial peptide OP-145 | |
| Qadri et al. | Recombinant human proteoglycan-4 reduces phagocytosis of urate crystals and downstream nuclear factor kappa B and inflammasome activation and production of cytokines and chemokines in human and murine macrophages | |
| Xiang et al. | Pattern recognition receptor-dependent mechanisms of acute lung injury | |
| JP6400628B2 (en) | Antibacterial application of poly-N-acetylglucosamine nanofibers | |
| Han et al. | The antimicrobial effect of CEN1HC-Br against Propionibacterium acnes and its therapeutic and anti-inflammatory effects on acne vulgaris | |
| US9750766B2 (en) | Compositions and methods of using lamellar bodies for modifying linear biological macromolecules | |
| JP6625677B2 (en) | Calcium flux agonist and method thereof | |
| ES2315417T3 (en) | USES OF OLIGOSACARIDOS DE QUITOSANA. | |
| Wang et al. | Intravenous release of NO from lipidic microbubbles accelerates deep vein thrombosis resolution in a rat model | |
| EA029461B1 (en) | Use of glutaryl histamine to treat respiratory tract infections | |
| US20230241095A1 (en) | Partially desulfated heparin for treating coronaviral infections | |
| Farfán et al. | The immunomodulatory potential of phage therapy to treat acne: A review on bacterial lysis and immunomodulation | |
| CN104411303B (en) | Method for treating inflammatory disease of the skin | |
| RU2668827C2 (en) | Topical antimicrobial dermatological composition | |
| CN103405751B (en) | Composition with cell repairing function and preparation method and application thereof | |
| EP4219534A2 (en) | Methods for treatment of and prophylaxis against inflammatory disorders | |
| RU2646810C1 (en) | Means for pneumofibrosis prevention and treatment and method for its production | |
| US20220071908A1 (en) | Polymer particles for neutrophil injury | |
| Xiang et al. | The molecular mechanism of neutrophil extracellular traps and its role in bone and joint disease | |
| At et al. | Research of Mitomycin-C saturation in dacryocystorhinostomy osteotomy site tissue | |
| Gilbertie | Bacterial Behavior in Synovial Fluid and Development of a Novel Therapeutic to Combat Infectious Arthritis | |
| JP2008127346A (en) | Pharmaceutical for treatment and prevention of autoimmune diseases, inflammations and nervous diseases | |
| Chen et al. | Alpha-lipoic acid prevents atrial electrical and structural remodeling via inhibition of NADPH oxidase in a rabbit rapid atrial pacing model | |
| US20170189479A1 (en) | Syndecan-4 proteoliposomes for enhanced cutaneous wound healing and minimized inflammatory immune response |