RU2646135C1 - Method of storage of the piglet kidney for the production of monolayer of primary-tripsinated cells and using it in virusological studies - Google Patents
Method of storage of the piglet kidney for the production of monolayer of primary-tripsinated cells and using it in virusological studies Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646135C1 RU2646135C1 RU2016140461A RU2016140461A RU2646135C1 RU 2646135 C1 RU2646135 C1 RU 2646135C1 RU 2016140461 A RU2016140461 A RU 2016140461A RU 2016140461 A RU2016140461 A RU 2016140461A RU 2646135 C1 RU2646135 C1 RU 2646135C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- monolayer
- kidney
- primary
- storage
- Prior art date
Links
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000002356 single layer Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000003860 storage Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 57
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 27
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 13
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 9
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 9
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 4
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 claims description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 230000016072 chemical homeostasis Effects 0.000 claims 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу хранения почки поросенка, предназначенной для дальнейшего получения монослоя первичнотрипсинизированных клеток, используемого в научно-практических работах по определению авирулентности вакцин, для постановки реакции нейтрализации и титрования вирусов.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a method for storing a piglet’s kidney, intended for the further preparation of a monolayer of primary trypsinized cells used in scientific and practical work to determine the avirulence of vaccines, for setting up the neutralization and titration of viruses.
Основные исследования и изобретения в медицинской трансплантологии касаются создания консервирующих растворов и сред, которые способствуют поддержанию необходимого уровня сохранения органов. Важная роль принадлежит гепарину (антикоагулянт), буферным компонентам (соли) и глюкозе, для обеспечения минимального энергетического обмена [12-14]. Предлагаемые методы консервации печени крыс с использованием перфузатов и контейнеров, выдерживающих высокое давление во избежание экстра и интракристаллизации растворов и тканей, довольно громоздки и пока применимы только в лабораторных условиях [15]. Во всех предлагаемых изобретениях исключается процесс кристаллизации органов [16].The main research and inventions in medical transplantology concern the creation of preservative solutions and media that help maintain the required level of organ conservation. An important role belongs to heparin (anticoagulant), buffer components (salt) and glucose, to ensure minimal energy metabolism [12-14]. The proposed methods for preserving rat liver using perfusates and containers that can withstand high pressure in order to avoid extra and intracrystallization of solutions and tissues are rather cumbersome and are still applicable only in laboratory conditions [15]. In all proposed inventions, the process of crystallization of organs is excluded [16].
Консервация органов животных для применения их в клеточных технологиях обходит некоторые проблемы, связанные с агрегацией (процесс тромбообразования) эритроцитов и лейкоцитов, а также полноценности физиологического состояния. В данном случае важно, после хранения при субнормальных температурах, получить жизнеспособные клетки после трипсинизации, которые могут адгезироваться, делиться и расти.Preservation of animal organs for their use in cell technology bypasses some of the problems associated with the aggregation (process of thrombosis) of red blood cells and white blood cells, as well as the full physiological state. In this case, it is important, after storage at subnormal temperatures, to obtain viable cells after trypsinization, which can adhere, divide and grow.
Нами был выяснен такой вариант, как хранение замороженных почек поросят при температуре от минус 4°C до минус 2°C (с кристаллизацией органа). Была проведена трипсинизация почки поросенка после оттаивания кристаллической фазы системы среда + почка (т.е. почка была во льду и, вероятно, сама была частично кристаллизована). Трипсинизация органа прошла стандартным вариантом, полученная суспензия клеток была «посеяна» в пенициллиновые флаконы и пластиковые «матрасы» площадью 25 см2. Неокрашенные трипановой синью клетки (концентрация 200000 кл/мл) при посеве не адгезировались и не формировали монослой, трипсинизированные клетки оказались на стадии апоптоза. Окончательно было сделано заключение, что любое замораживание с фазой кристаллизации без криопротекторов, отрицательно сказывается на выживаемости клеток и тканей органов, в которых около 90% воды [1, 8].We have found out such an option as storing frozen piglet kidneys at a temperature from minus 4 ° C to
В медицинской практике и ветеринарной вирусологии не найдено сведений по применению хранившихся при пониженных температурах (около 0°C) изолированных почек для получения клеточных культур. В 1982 году был предложен метод криоконсервирования первичных клеточных культур и тканей для вирусологических целей. После применения этого метода жизнеспособность клеток снижалась до 60% [11]. Метод требует длительной подготовки и восстановления после криоконсервирования. Но есть преимущество, хранение может быть длительным, до нескольких месяцев.In medical practice and veterinary virology, no information was found on the use of isolated kidneys stored at low temperatures (about 0 ° C) to obtain cell cultures. In 1982, a method of cryopreservation of primary cell cultures and tissues for virological purposes was proposed. After using this method, cell viability decreased to 60% [11]. The method requires long preparation and recovery after cryopreservation. But there is an advantage, storage can be long, up to several months.
Основная цель разработки способа более длительного хранения почек (больше 2-4 часов) - это рационализация технологического процесса получения первичных клеток, когда период трипсинизации необходимо пролонгировать во времени для получения полноценных, не переросших культур клеток, пригодных для вирусологических исследований.The main goal of developing a method for longer storage of kidneys (more than 2-4 hours) is to rationalize the process of obtaining primary cells, when the trypsinization period must be prolonged in time to obtain complete, not overgrown cell cultures suitable for virological studies.
Вторая цель - это изучение сохранности органов при субнормальных температурах в лабораторных условиях для дальнейшего применения полученных данных в полевых условиях с возможностью последующего получения полноценных первичных клеток и субкультур. При получении из трипсинизированных органов полноценного монослоя первичных клеток необходимо также изучить их пригодность для вирусологических исследований.The second goal is to study the safety of organs at subnormal temperatures in the laboratory for the further application of the obtained data in the field with the possibility of subsequent obtaining complete primary cells and subcultures. When a full monolayer of primary cells is obtained from trypsinized organs, it is also necessary to study their suitability for virological studies.
Первичная культура клеток, полученная из почки поросенка (СП), применяется не только при работе с вирусом ящура, но и при выделении вирусов, поражающих свиней, в том числе африканской чумы свиней (АЧС).The primary cell culture obtained from the kidney of a piglet (SP) is used not only when working with foot-and-mouth disease virus, but also in the isolation of viruses that infect pigs, including African swine fever (ASF).
Авторами был разработан способ хранения почки поросенка, способный сохранять должным образом исходное состояние органа, пригодного для вирусологических исследований в течение более длительного времени, чем другими известными способами.The authors have developed a method for storing a kidney of a piglet, capable of properly maintaining the initial state of an organ suitable for virological studies for a longer time than other known methods.
Наши исследования позволяют заполнить пробел в области более длительного использования донорских органов для вирусологических целей.Our studies fill a gap in the longer use of donor organs for virological purposes.
Для осуществления поставленных целей проводили опыты с использованием среды 199, которая пригодна для сохранения жизнеспособности и специфических функций клеток. Эта среда так же используется как основной компонент для хранения трансплантационных почек человека. В эту среду входят 62 компонента веществ, включая соли, аминокислоты, витамины, нуклеозиды и глюкозу. Относительно невысокая концентрация веществ обеспечивает незначительный обмен веществ и минимальное накопление метаболитов при хранении [9]. Температурный режим хранения варьировал от 0°C до 4°C в течение 2-7 суток.To achieve these goals, experiments were carried out using medium 199, which is suitable for maintaining viability and specific cell functions. This medium is also used as the main component for storing human transplant kidneys. This medium contains 62 components of substances, including salts, amino acids, vitamins, nucleosides and glucose. A relatively low concentration of substances provides an insignificant metabolism and minimal accumulation of metabolites during storage [9]. Storage temperature ranged from 0 ° C to 4 ° C for 2-7 days.
Изолированные почки от 3-5-недельных поросят помещали во флакон с широким горлом с питательной средой 199, в которую, кроме 100 ед. пенициллина и 100 ед. стрептомицина, добавляли 50 мкг/мл гентамицина. Соотношение среды и газовой фазы составляло 2:1. Флакон накрывали стерильной чашкой Петри и помещали в бытовой холодильник. При хранении выбирали температурный режим, исключающий кристаллизацию среды и органа.Isolated kidneys from 3-5-week-old piglets were placed in a wide-necked vial with nutrient medium 199, in which, in addition to 100 units. penicillin and 100 units. streptomycin, 50 μg / ml gentamicin was added. The ratio of medium to gas phase was 2: 1. The vial was covered with a sterile Petri dish and placed in a household refrigerator. During storage, a temperature regime was chosen that excluded crystallization of the medium and organ.
Нами выявлено, что хранение почек в стерильных условиях при температуре, от 0°C до 4°C, не приводит к их кристаллизации, в то же время сохраняется жизнеспособность гистотипических клеток, которые после трипсинизации и получения полноценного монослоя чувствительны к различным вирусам, в том числе к вирусу ящура.We found that storing the kidneys under sterile conditions at temperatures from 0 ° C to 4 ° C does not lead to their crystallization, while at the same time, the vitality of histotypic cells is preserved, which, after trypsinization and obtaining a complete monolayer, are sensitive to various viruses, including including foot and mouth disease virus.
Применение метода визуализации контроля предлагаемого изобретения (фотографирование и описание выращенных в культуральных флаконах полученных трипсинизированных клеток) позволяет объективно оценивать и использовать полученные культуры.The use of the visualization control method of the invention (photographing and description of the obtained trypsinized cells grown in culture bottles) makes it possible to objectively evaluate and use the resulting cultures.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графических материалах:The essence of the invention is illustrated in the graphic materials:
Фиг. 1 - монослой первичной культуры СП полученный на 5-е сутки после трипсинизации «свежей» почки (0 часов хранения);FIG. 1 - monolayer of the primary culture of the joint venture obtained on the 5th day after trypsinization of the "fresh" kidney (0 hours of storage);
Фиг. 2 - монослой первичной культуры СП полученный на 5-е сутки после трипсинизации 3-суточной почки (72 часа хранения);FIG. 2 - monolayer of the primary culture of the joint venture obtained on the 5th day after trypsinization of a 3-day kidney (72 hours of storage);
Фиг. 3 - монослой первичной культуры СП полученный на 5-е сутки после трипсинизации 4-суточной почки (96 часов хранения);FIG. 3 - monolayer of the primary culture of the joint venture obtained on the 5th day after trypsinization of the 4-day kidney (96 hours of storage);
Фиг. 4 - монослой первичной культуры СП полученный на 5-е сутки после трипсинизации 6-суточной почки (144 часов хранения);FIG. 4 - monolayer of the primary culture of the joint venture obtained on the 5th day after trypsinization of the 6-day kidney (144 hours of storage);
Фиг. 5 - дегенерация монослоя первичных клеток СП (полученной из почки хранившейся 6 суток) при взаимодействии с вирусом ящура.FIG. 5 - degeneration of a monolayer of primary SP cells (obtained from a kidney that was stored for 6 days) when interacting with foot and mouth disease virus.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Способы консервации органов человека при субнормальных температурах (0÷4°C) уже несколько десятилетий применяются в трансплантационной хирургии [7]. Благодаря фундаментальным исследованиям, проведенным с органами животных, было выявлено, что паренхиматозные органы (печень, почки) и сердце можно пересаживать в течение суток после изъятия от донора, роговицу глаз в течение 3-х суток хранения [4, 7, 8]. После этого срока наступают необратимые биохимические и морфологические изменения в тканях, которые приводят к отторжению органа реципиентом [1, 6]. В большинстве случаев необратимые изменения наступают в сосудистых системах (образуются тромбы) и в стромальных тканях, которые обеспечивают приживаемость органов.The methods of preserving human organs at subnormal temperatures (0–4 ° C) have been used in transplant surgery for several decades [7]. Thanks to fundamental studies conducted with animal organs, it was found that parenchymal organs (liver, kidneys) and heart can be transplanted within a day after removal from the donor, the cornea of the eyes for 3 days of storage [4, 7, 8]. After this period, irreversible biochemical and morphological changes in tissues occur that lead to organ rejection by the recipient [1, 6]. In most cases, irreversible changes occur in the vascular systems (blood clots form) and in stromal tissues, which ensure the survival of organs.
В ветеринарной вирусологии, несмотря на рекомендуемые 2-4 часа хранения при 0÷4°C внутренних органов и тканей [3], длительное сохранение более 2 суток так же имеет научно-прикладное значение. В литературных источниках, включая патенты, нами не было обнаружено сведений, касающихся этой проблемы в ветеринарной вирусологии.In veterinary virology, despite the recommended 2-4 hours of storage at 0 ÷ 4 ° C of internal organs and tissues [3], long-term storage of more than 2 days also has scientific and applied value. In literary sources, including patents, we did not find information regarding this problem in veterinary virology.
Первичнотрипсинизированную культуру СП получали из почек поросят 3-5-недельного возраста с использованием общепринятых методик получения первичных клеточных культур [2, 4]. Хранение изолированных почек осуществляли при температуре от 0° до 4°C в среде 199 с добавлением 100 ед. пенициллина, 100 ед. стрепномицина и 50 мкг/мл гентамицина без сыворотки. Трипсинизацию почек проводили через 1-7 суток хранения. В результате нами была проведена работа по изучению адгезивной способности отдельных клеток и их агрегаций, морфологии седиментированных клеток, сроков формирования монослоя и чувствительности к вирусу ящура [2, 3]. Для выращивания первичных клеток почек поросенка (СП) нами были использованы питательная среда DMEM/F-12 с 0,1% ГЛА (гидролизат лактальбумина) фирмы Sigma и фетальная сыворотка КРС фирмы Bioclot. Культивирование клеток осуществляли в пенициллиновых флаконах площадью 3 см2 и пластиковых флаконах площадью 25 см2.The primary trypsinized culture of the joint venture was obtained from the kidneys of piglets of 3-5 weeks of age using generally accepted methods for obtaining primary cell cultures [2, 4]. Storage of isolated kidneys was carried out at a temperature from 0 ° to 4 ° C in medium 199 with the addition of 100 units. penicillin, 100 units. streptomycin and 50 μg / ml gentamicin without serum. Kidney trypsinization was performed after 1-7 days of storage. As a result, we carried out work to study the adhesive ability of individual cells and their aggregations, the morphology of sedimentary cells, the timing of the formation of a monolayer, and sensitivity to foot and mouth disease virus [2, 3]. To grow the primary cells of piglet kidneys (SP), we used DMEM / F-12 nutrient medium with 0.1% GLA (lactalbumin hydrolyzate) from Sigma and fetal bovine serum from Bioclot. Cell cultivation was carried out in penicillin vials with an area of 3 cm 2 and plastic bottles with an area of 25 cm 2 .
Анализ морфологии клеток и монослоя проводили с помощью фазовоконтрастного микроскопа Olimpus CKX-41. Также осуществлялся подсчет продуктивности первичных клеток после образования монослоя на 5-7 сутки.The analysis of the morphology of the cells and the monolayer was carried out using an Olimpus CKX-41 phase contrast microscope. The productivity of primary cells was also calculated after the formation of a monolayer on days 5–7.
Чувствительность первичной культуры клеток СП оценивали по результатам титрования рабочей дозы вируса при постановке реакции нейтрализации. Одно и то же разведение культурального вируса ящура (КВЯ) титровали на монослое первичной культуры клеток СП, выращенной сразу после трипсинизации. Через 2-3 суток повторяли контроль инфекционности вируса на культуре клеток СП, выращенной после хранения суспензии клеток или цельных почек поросенка в течение 2-7 суток при температуре от 0°C до 4°C.The sensitivity of the primary culture of SP cells was evaluated by titrating the working dose of the virus with the neutralization reaction. The same dilution of the culture of foot and mouth disease virus (CFJ) was titrated on the monolayer of the primary culture of SP cells grown immediately after trypsinization. After 2-3 days, the control of the virus infectivity was repeated on a SP cell culture grown after storage of a suspension of cells or whole piglet kidneys for 2-7 days at a temperature of 0 ° C to 4 ° C.
После забора почек от 3-5-недельных поросят органы помещали во флакон с широким горлом с питательной средой 199, в которую, кроме 100 ед. пенициллина и 100 ед. стрепномицина, добавляли 50 мкг/мл гентамицина. Соотношение среды и газовой фазы 2:1. Флакон накрывали стерильной чашкой Петри и помещали в бытовой холодильник. В холодильнике поддерживали температуру, близкую к нулю, не допуская кристаллизации органа и среды. Флакон со средой, в который была помещена почка поросенка, не был герметизирован пробкой для того, чтобы происходил пассивный газообмен с окружающим воздухом. Такое условие хранения было выполнено для того, чтобы избежать закисления среды, так как даже в охлажденных органах идет гликолиз [4]. При хранении почки поросенка (в 100 мл среды 199) при температуре, близкой к нулю, в течение 96 ч, значение pH среды повысилось с 7,0 до 7,1-7,2. Во флаконе со средой 199, где не было органа, значение pH повысилось до 7,6. Стабилизация pH среды, где находится почка, свидетельствует о том, что ткани органа «дышат», утилизируя глюкозу и выделяя углекислый газ и метаболиты.After kidney collection from 3-5-week-old piglets, the organs were placed in a wide-necked vial with nutrient medium 199, in which, in addition to 100 units. penicillin and 100 units. streptomycin, 50 μg / ml gentamicin was added. The ratio of the medium and the gas phase is 2: 1. The vial was covered with a sterile Petri dish and placed in a household refrigerator. A temperature close to zero was maintained in the refrigerator, preventing crystallization of the organ and the environment. The bottle with the medium in which the pig’s kidney was placed was not sealed with a plug so that passive gas exchange with the surrounding air took place. This storage condition was fulfilled in order to avoid acidification of the medium, since glycolysis occurs even in chilled organs [4]. When storing the kidney of a piglet (in 100 ml of medium 199) at a temperature close to zero for 96 hours, the pH of the medium increased from 7.0 to 7.1-7.2. In a 199 medium bottle where there was no organ, the pH increased to 7.6. The stabilization of the pH of the environment where the kidney is located indicates that the tissues of the body "breathe" by utilizing glucose and releasing carbon dioxide and metabolites.
Хранившиеся 2-7 суток при температуре от 0°C до 4°C почки поросенка не изменяли свою консистенцию и цвет. Корковый слой стандартно измельчали стальными ножницами, так же стандартно диспергировали теплым раствором трипсина. Из 1 грамма почечной ткани получали до 30 млн клеток, не окрашенных трипановой синью. Как было выявлено в предыдущих работах, трипсинизированные клетки были полиморфны и принадлежали к разным гистотипическим тканям. Не все клетки дают колонии [2, 3].Stored 2-7 days at a temperature of 0 ° C to 4 ° C, the kidneys of the pig did not change their texture and color. The cortical layer was standardly ground with steel scissors, and it was also standardly dispersed with a warm trypsin solution. From 1 gram of renal tissue received up to 30 million cells not stained with trypan blue. As was revealed in previous works, trypsinized cells were polymorphic and belonged to different histotypic tissues. Not all cells produce colonies [2, 3].
В нашем случае клетки, полученные из хранившихся при температуре от 0°C до 4°C в течение 2-7 суток почек, также были полиморфны и в дальнейшем имели стандартную динамику седиментации, адгезии и пролиферации. Первый показатель сохранности клеток после трипсинизации - это количество жизнеспособных клеток, полученных из 1 г почечной ткани, и тестирование окрашиванием трипановой синью. Количество клеток, полученных из 1 г почек, во всех случаях равнялось в среднем 15-20 млн.In our case, cells obtained from kidneys stored at temperatures from 0 ° C to 4 ° C for 2-7 days were also polymorphic and subsequently had standard dynamics of sedimentation, adhesion, and proliferation. The first indicator of cell safety after trypsinization is the number of viable cells obtained from 1 g of renal tissue, and testing with trypan blue staining. The number of cells obtained from 1 g of kidneys, in all cases was equal to an average of 15-20 million.
В процессе проведения опытов по хранению почек предложенным способом при температурах, близких к нулю, были уточнены морфологические характеристики первичных клеток в зависимости от «возраста» монослоя.In the process of conducting experiments on storing the kidneys by the proposed method at temperatures close to zero, the morphological characteristics of the primary cells depending on the "age" of the monolayer were refined.
Как видно из графических материалов, сформированный монослой во всех случаях представлен полиморфными клетками с минимальным количеством внеклеточного матрикса. После хранения почек данным способом до трех суток при температуре, близкой к нулю, и после последующей трипсинизации тканей коркового слоя (при оптимальной посевной концентрации клеток), монослой формируется за 5 суток (Фиг. 1, таблица 2); при хранении почек до 5 суток полноценный монослой образуется за 6 суток (Фиг. 3). При 6-дневном хранении почек монослой сформировался за 7 суток с преобладанием нормальных полиморфных клеток без внеклеточного матрикса (Фиг. 4).As can be seen from the graphic materials, the formed monolayer in all cases is represented by polymorphic cells with a minimal amount of extracellular matrix. After storing the kidneys by this method for up to three days at a temperature close to zero, and after subsequent trypsinization of the tissues of the cortical layer (at the optimal seed concentration of cells), a monolayer is formed in 5 days (Fig. 1, table 2); when storing kidneys up to 5 days, a full-fledged monolayer is formed in 6 days (Fig. 3). During 6-day storage of the kidneys, the monolayer formed in 7 days with the predominance of normal polymorphic cells without extracellular matrix (Fig. 4).
По нашим наблюдениям, почки поросят при температуре хранения, близкой к нулю, не меняют цвет, также не наблюдается явных признаков некроза, диспергирование трипсином происходит в стандартном режиме. Но после 5-дневного хранения почек пролиферативная активность выживших после трипсинизации клеток ниже на 15-20%. Динамика формирования монослоя запаздывает в среднем на 1 сутки. Во всех опытах мы не наблюдали контаминации банальной микрофлорой и получали первичную культуру стерильной.According to our observations, the kidneys of piglets at a storage temperature close to zero do not change color, there are also no obvious signs of necrosis, and trypsin dispersion occurs in the standard mode. But after 5-day storage of the kidneys, the proliferative activity of surviving trypsinization cells is 15-20% lower. The dynamics of the formation of a monolayer is delayed by an average of 1 day. In all experiments, we did not observe contamination with banal microflora and received a primary sterile culture.
При проведении вирусологических работ, все варианты полученного клеточного материала были пригодны для определения авирулентности полуфабрикатов биопрепаратов, для проведения реакции нейтрализации и для выделения вируса ящура.When conducting virological work, all variants of the obtained cellular material were suitable for determining the avirulence of semi-finished biological products, for carrying out the neutralization reaction, and for isolating foot and mouth disease virus.
Чувствительность клеток к вирусу ящура была сравнима с контролем. В наших исследованиях чувствительность к вирусу ящура первичных клеток, полученных из хранившихся почек предложенным способом, была на 7% выше, чем в контроле (таблица 3).The sensitivity of cells to foot and mouth disease virus was comparable to control. In our studies, the sensitivity to the FMD virus of primary cells obtained from stored kidneys by the proposed method was 7% higher than in the control (table 3).
Цитопатическое действие вируса ящура на клетках, полученных после хранения органа до 6 суток, было типичным и интенсивным (Фиг. 5).The cytopathic effect of the foot and mouth disease virus on cells obtained after storage of the organ for up to 6 days was typical and intense (Fig. 5).
В процессе постановки вирусологических реакций, нам удалось проанализировать динамику и специфику цитопатического действия ВЯ на первичные клетки. В первую очередь поражаются эпителиоподобные клетки монослоя. Они становятся сферическими, процесс деадгезирования сопровождается появлением множества цитоплазматических выростов, через некоторое время поверхность клеток становится гладкой, затем зернистой, и далее происходит фрагментация, т.е. разрушение монслоя до детрита. По нашему мнению, эпителиоподобные клетки выросшего монослоя являются предшественниками эпителиальных тканей, выстилающих поверхность бауменовых капсул, которые первыми принимают на себя контакт с вирусами, циркулирующими в организме поросенка. «Потомки» стромальных тканей сосудов и органов - фибробластоподобные клетки, в последнюю очередь поражаются вирусной инфекцией.In the process of staging virologic reactions, we were able to analyze the dynamics and specifics of the cytopathic effect of VJ on primary cells. First of all, epithelial-like cells of a monolayer are affected. They become spherical, the process of deadhesion is accompanied by the appearance of many cytoplasmic outgrowths, after some time the surface of the cells becomes smooth, then granular, and then fragmentation occurs, i.e. destruction of the monolayer to detritus. In our opinion, the epithelial-like cells of the grown monolayer are the precursors of the epithelial tissues lining the surface of the baumen capsules, which are the first to take on contact with the viruses circulating in the piglet's body. The “descendants” of stromal tissues of blood vessels and organs - fibroblast-like cells, are last affected by a viral infection.
В литературных источниках мы не нашли данных об условиях хранения почек животных для получения первичных клеточных культур. Наши исследования позволяют заполнить пробел в области более длительного использования донорских органов. Нами выявлено, что хранение почек в стерильных условиях при температуре 0°C до 4°C не приводит к кристаллизации органов, в то же время сохраняется жизнеспособность гистотипических клеток, которые после трипсинизации и получения полноценного монослоя чувствительны к вирусу ящура.In literature, we did not find data on the storage conditions of animal kidneys to obtain primary cell cultures. Our research helps fill the gap in the area of longer-term use of donor organs. We found that storing the kidneys in sterile conditions at a temperature of 0 ° C to 4 ° C does not lead to crystallization of organs, at the same time, the vitality of histotypic cells is preserved, which, after trypsinization and obtaining a complete monolayer, are sensitive to foot and mouth disease virus.
Было определено, что кристаллизация среды и почек во время хранения при температуре от минус 4°C до минус 2°C ведет к необратимым изменениям в трипсинизированных клетках, которые после инокуляции в культуральные сосуды не адгезируются и не дают колоний.It was determined that crystallization of the medium and kidneys during storage at temperatures from minus 4 ° C to minus 2 ° C leads to irreversible changes in trypsinized cells, which after inoculation into culture vessels do not adhere and do not give colonies.
В результате проведенных опытов было показано, что при хранении первично трипсинизированных клеточных суспензий в холодильнике двое суток при температуре 4÷6°C (таблица 2), происходит частичная гибель эпителиальных клеток, наиболее чувствительных к вирусу ящура. В то же время, хранение почек при субнормальных температурах (0÷4°C) от 2 до 7 суток позволяет получать после трипсинизации нормальные популяции первичных клеток с высокой чувствительностью к вирусу.As a result of the experiments, it was shown that when the primary trypsinized cell suspensions were stored in the refrigerator for two days at a temperature of 4 ÷ 6 ° C (table 2), partial death of the epithelial cells most sensitive to foot and mouth disease occurs. At the same time, storing the kidneys at subnormal temperatures (0 ÷ 4 ° C) from 2 to 7 days allows to obtain normal populations of primary cells with high sensitivity to the virus after trypsinization.
Предложенный нами способ хранения почек поросят позволяет более рационально использовать донорские органы для получения первичных культур, используемых в вирусологии. В то же время можно предложить этот способ хранения органов для консервирования и транспортировки органов, полученных в полевых условиях от домашних и диких животных.Our proposed method for storing the kidneys of piglets makes it possible to more efficiently use donor organs to obtain primary cultures used in virology. At the same time, this method of storing organs for preserving and transporting organs obtained in the field from domestic and wild animals can be proposed.
Сущность изобретения пояснена примерами его реализации и использования.The invention is illustrated by examples of its implementation and use.
Пример 1. При выбранных физических параметрах хранения почек и при свободном газообмене, pH среды сохраняется на уровне физиологических значений - 7,1-7,2, что свидетельствует о функциональной активности органа и пригодности для трипсинизации. В контрольной среде (без почки) значение pH повышалось до 7,6.Example 1. With the selected physical parameters of kidney storage and with free gas exchange, the pH of the medium remains at the level of physiological values - 7.1-7.2, which indicates the functional activity of the organ and suitability for trypsinization. In the control medium (without kidney), the pH increased to 7.6.
Пример 2. Получение первичнотрипсинизированной культуры СП из почек, хранившихся разное количество дней, проиллюстрирован таблицей 1. Монослой выросших клеточных культур, полученных из хранившихся почек, сохраняет пролиферативную активность, но сроки формирования конфлюэнтного слоя увеличиваются на 1-2 дня. Полиморфизм первичных клеток сохраняется (Фиг. 1-4).Example 2. Obtaining a primary trypsinized culture of SP from kidneys stored for different days is illustrated in Table 1. The monolayer of grown cell cultures obtained from stored kidneys retains proliferative activity, but the formation period of the confluent layer is increased by 1-2 days. Primary cell polymorphism is maintained (Fig. 1-4).
Пример 3. В процессе постановки вирусологических реакций, нам удалось проанализировать динамику и специфику цитопатического действия ВЯ на первичные клетки. В первую очередь вирусом поражаются эпителиоподобные клетки монослоя (Фиг. 5). Чувствительность к вирусу первичных клеток, полученных из хранившихся почек, была на 7% выше, чем в контроле (таблица 3).Example 3. In the process of staging virologic reactions, we were able to analyze the dynamics and specifics of the cytopathic effect of VJ on primary cells. First of all, the epithelial-like cells of the monolayer are affected by the virus (Fig. 5). The sensitivity to the virus of primary cells obtained from stored kidneys was 7% higher than in the control (table 3).
Пример 4. Клетки, полученные из хранившихся при 0÷4°C в течение 2-7 суток почек, были полиморфны и в дальнейшем имели стандартную динамику седиментации, адгезии и пролиферации. Первый показатель сохранности клеток после трипсинизации - это количество жизнеспособных клеток, полученных из 1 г почечной ткани и тестировании окрашиванием трипановой синью. Количество клеток, полученных из 1 г почек, во всех случаях равнялось в среднем 15-20 млн.Example 4. Cells obtained from kidneys stored at 0-4 ° C for 2-7 days were polymorphic and subsequently had standard dynamics of sedimentation, adhesion and proliferation. The first indicator of cell safety after trypsinization is the number of viable cells obtained from 1 g of renal tissue and tested with trypan blue staining. The number of cells obtained from 1 g of kidneys, in all cases was equal to an average of 15-20 million.
Пример 5. В процессе длительного хранения почек, после трипсинизации, в суспензии преобладают эпителиоподобные клетки, которые в первую очередь поражаются вирусом ящура. Цитопатическое действие проявляется в деадгезировании клеток, трансформации их в сферические структуры с проницаемой оболочкой и дальнейшем лизисе монослоя.Example 5. In the process of long-term storage of the kidneys, after trypsinization, epithelial-like cells prevail in the suspension, which are primarily affected by the foot and mouth disease virus. The cytopathic effect is manifested in the degradation of cells, their transformation into spherical structures with a permeable membrane and further lysis of the monolayer.
Предложенный способ хранения почек поросят при 0÷4°C в течение 2-7 суток обеспечивает получение полноценного клеточного препарата для проведение научно-исследовательских работ: определения авирулентности биопрепаратов, постановки реакции нейтрализации и выделения вируса ящура.The proposed method for storing the kidneys of piglets at 0 ÷ 4 ° C for 2-7 days provides a full-fledged cell preparation for scientific research: determining the avirulence of biological products, staging the neutralization reaction and isolation of foot and mouth disease virus.
Источники информации Information sources
1. Кирпатовский В.И. Кудрявцев Ю.В. Криоконсервация почки крысы и кролика. // II международная конференция «Успехи современной криобиологии». - Харьков, 1992. - с. 82-83.1. Kirpatovsky V.I. Kudryavtsev Yu.V. Cryopreservation of rat and rabbit kidneys. // II international conference "Successes of modern cryobiology". - Kharkov, 1992. - p. 82-83.
2. Манин Б.Л., Коропова Н.В. Влияние артефактов биологического статуса поросят на культивирование первичной культуры, полученной из почки // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 238-245.2. Manin B.L., Koropova N.V. The influence of artifacts of the biological status of piglets on the cultivation of the primary culture obtained from the kidney // Tr. Federal Center for Animal Health. - Vladimir, 2012 .-- T. 10 .-- S. 238-245.
3. Ночевный В.Т. Комплексная стандартизация получения первичных культур клеток. «Цитология», М.; 1999 Т. 41, с. 298-299.3. Overnight V.T. Comprehensive standardization of the production of primary cell cultures. "Cytology", M .; 1999 T. 41, p. 298-299.
4. Трошина В.П. Функциональное состояние изолированных тканей при температуре близкой к нулю. Вест. ЛГУ, 1957, 3, сер. Биол., 1, с. 111-121.4. Troshina V.P. The functional state of isolated tissues at a temperature close to zero. West. LSU, 1957, 3, ser. Biol., 1, p. 111-121.
5. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Изд-во «Бином. Лаборатория знаний», М., 2011, 691 с.5. Freshney R. Ya. Culture of animal cells. Publishing house “Binom. Laboratory of knowledge ”, M., 2011, 691 p.
6. Юрченко Т.Н., Жуликова Е.П., Говоруха Т.П. Структурно-функциональные показатели клеток печени на этапах подготовки к криоконсервации. // Проблемы криобиологии. - 1991. - №1. - С. 8-16.6. Yurchenko T.N., Zhulikova E.P., Govorukha T.P. Structural and functional parameters of liver cells at the stages of preparation for cryopreservation. // Problems of cryobiology. - 1991. - No. 1. - S. 8-16.
7. Янгсон Р.-М.. Хирургия. Что и зачем делает хирург? Минск «Попури» 1997 - 592 с.7. Yangson R.-M .. Surgery. What and why does the surgeon do? Minsk "Popuri" 1997 - 592 s.
8. Jeske А.Н., Fontebs A.M., Karow A.M. Functional preservation of the mammalian kidney. III. Ultrastructural effects of perfusion with DMSO / - Cryobiology, 1974, 11, №2, p. 170-181.8. Jeske A.N., Fontebs A.M., Karow A.M. Functional preservation of the mammalian kidney. III. Ultrastructural effects of perfusion with DMSO / - Cryobiology, 1974, 11, No. 2, p. 170-181.
9. Методы культивирования клеток: Сборник научных трудов, под ред. Г.П. Пинаева - Л.: Наука, 1988. - 313 с.9. Cell Culture Methods: Collection of scientific papers, ed. G.P. Pinaeva - L .: Nauka, 1988 .-- 313 p.
10. Методы культивирования клеток / под ред.: Г.П. Пинаева, М.С Богдановой. - СПб.: Изд-во Политехн. Ун-та, 2008. - 278 с.10. Methods of cell cultivation / ed.: GP Pinaeva, M.S. Bogdanova. - SPb .: Publishing house of the Polytechnic. Univ., 2008 .-- 278 p.
11. Стегний Б.Т. Криоконсервирование первичных клеточных культур и тканей для вирусологических исследований. Автореферат канд. вет. Наук, Владимир, 1982.11. Stegny B.T. Cryopreservation of primary cell cultures and tissues for virological research. Abstract of Cand. vet. Science, Vladimir, 1982.
12. Авторское свидетельство №938873, A01N 1/00, 30.06.82.12. Copyright certificate No. 938873,
13. Патент РФ №2140152, A01N 1/02, 27.10.99.13. RF patent No. 2140152,
14. Патент РФ №2140153, A01N 1/02, 27.10.99.14. RF patent No. 2140153,
15. Патент РФ №2362299, A01N 1/02, 27.07.2009.15. RF patent No. 2362299,
16. Патент РФ №2479999, A01N 1/02, 27.04.2013.16. RF patent No. 2479999,
Claims (3)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016140461A RU2646135C1 (en) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Method of storage of the piglet kidney for the production of monolayer of primary-tripsinated cells and using it in virusological studies |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016140461A RU2646135C1 (en) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Method of storage of the piglet kidney for the production of monolayer of primary-tripsinated cells and using it in virusological studies |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2646135C1 true RU2646135C1 (en) | 2018-03-01 |
Family
ID=61568880
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016140461A RU2646135C1 (en) | 2016-10-14 | 2016-10-14 | Method of storage of the piglet kidney for the production of monolayer of primary-tripsinated cells and using it in virusological studies |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2646135C1 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2779551C2 (en) * | 2020-09-15 | 2022-09-08 | Федеральное Казенное Предприятие "Щелковский Биокомбинат" | Strain “bartha щбк-61” of aujeszky's disease virus for manufacture of diagnostic and vaccine preparations, and method for production of vaccine against animal aujeszky's disease (options) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1756930A1 (en) * | 1990-04-16 | 1992-08-23 | Донецкий государственный медицинский институт им.М.Горького | Method for storage of insulated kidney |
RU2140152C1 (en) * | 1997-03-13 | 1999-10-27 | Иван Антонович Мазур | Preservative solution for transplants |
RU2362299C1 (en) * | 2007-12-18 | 2009-07-27 | Яков Нахманович Львович | Bioorgans curing method |
-
2016
- 2016-10-14 RU RU2016140461A patent/RU2646135C1/en active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1756930A1 (en) * | 1990-04-16 | 1992-08-23 | Донецкий государственный медицинский институт им.М.Горького | Method for storage of insulated kidney |
RU2140152C1 (en) * | 1997-03-13 | 1999-10-27 | Иван Антонович Мазур | Preservative solution for transplants |
RU2362299C1 (en) * | 2007-12-18 | 2009-07-27 | Яков Нахманович Львович | Bioorgans curing method |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2779551C2 (en) * | 2020-09-15 | 2022-09-08 | Федеральное Казенное Предприятие "Щелковский Биокомбинат" | Strain “bartha щбк-61” of aujeszky's disease virus for manufacture of diagnostic and vaccine preparations, and method for production of vaccine against animal aujeszky's disease (options) |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0399647B1 (en) | Method of revitalizing cells prior to cryopreservation | |
US20190037832A1 (en) | Cell Cryopreservation Protective Composition, Use Thereof, and Cell Cryopreservation Method | |
CN102511471B (en) | Mesenchymal stem cell frozen stock solution and preparation method thereof | |
CN109845728B (en) | Clinical application-grade adipose tissue cryopreservation liquid and cryopreservation method | |
CN110050782A (en) | A kind of stem cell cryopreserving liquid and preparation method thereof and cryopreservation methods | |
US3303662A (en) | Process for cell preservation | |
CN109843052A (en) | The composition and method saved for cell freezing | |
CN104145943A (en) | Cryopreservation protection liquid for Wharton jelly tissues of human umbilical cord and preparation and application of cryopreservation protection liquid | |
CN109090100A (en) | A kind of mesenchymal stem cell cryopreserving liquid and preparation method thereof and application method | |
CN105961374A (en) | Cell cryopreservation fluid | |
CN108207930A (en) | A kind of cocktail type cryoprotector and its application | |
AU2017377309B9 (en) | Mammalian cell cryopreservation liquid | |
Rajan et al. | Development and application of cryoprotectants | |
Choi et al. | Cooling rate dependent biophysical and viability response shift with attachment state in human dermal fibroblast cells | |
Wu et al. | Vitreous cryopreservation of cell–biomaterial constructs involving encapsulated hepatocytes | |
CN107810948A (en) | A kind of serum-free frozen stock solution of human umbilical cord mesenchymal stem cells | |
CN109619088A (en) | A kind of preservation liquid of fat mesenchymal stem cell | |
Parihar et al. | Cryopreservation: a comprehensive overview, challenges, and future perspectives | |
KR20210127774A (en) | Composition for cryopreservation of bovine reproductive cells and cryopreservation method therefor | |
CN105211052B (en) | Frozen stock solution of cultured NKT cells and preparation method thereof | |
Larman et al. | Vitrification of mouse pronuclear oocytes with no direct liquid nitrogen contact | |
CN109329272A (en) | A kind of spermatozoa cryopreservation liquid and its preparation method and application | |
RU2646135C1 (en) | Method of storage of the piglet kidney for the production of monolayer of primary-tripsinated cells and using it in virusological studies | |
CN107711823A (en) | The cells frozen storing liquid and its application that a kind of normal temperature preserves | |
CN106520680A (en) | Bovine sperm capacitation solution and in vitro sperm capacitation method |