RU2645458C2

RU2645458C2 - Method for production of chemically polysialylated recombinant human butyrylcholin esterase

Info

Publication number: RU2645458C2
Application number: RU2012153925A
Authority: RU
Inventors: Денис Григорьевич Илюшин; Алексей Анатольевич Белогуров; Оксана Михайловна Эртле; Александр Габибович Габибов; Кирилл Геннадиевич Сурков; Наталья Александровна Пономаренко; Массон Патрик; Иван Витальевич Смирнов
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2018-02-21
Also published as: RU2012153925A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: conjugate is intended to treat, prevent, inhibit or reduce the toxic effects of organophosphorus compounds. This invention also relates to a method for preparation of the said conjugate. The method includes culturing of CHO cells transformed by an expression vector containing a human butyrylcholin esterase gene, purification and chemical sialylation of the resulting recombinant butyrylcholin esterase. The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the said conjugate and to a method for treatment, prevention, inhibition or reduction of the toxic effects of organophosphorus compounds in an animal. This method provides administration of the said conjugate or composition to an animal.

EFFECT: invention allows to obtain a conjugate and a pharmaceutical composition for treatment, prevention, suppression or reduction of the toxic effects of organophosphorus compounds.

14 cl, 13 dwg, 4 tbl, 1 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности, более конкретно к способам получения рекомбинантных ферментов, и в частности, к новому способу получения бутирилхолинэстеразы, системе для производства бутирилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразе, полученной предложенным способом, фармацевтическим композициям, содержащим бутирилхолинэстеразу, способам лечения или предотвращения заболеваний, нарушений и состояний, требующих введения бутирилхолинэстеразы, а также к применению бутирилхолинэстеразы, полученной указанным способом.The invention relates to the field of pharmaceutical industry, more specifically to methods for producing recombinant enzymes, and in particular, to a new method for producing butyrylcholinesterase, a system for the production of butyrylcholinesterase obtained by the proposed method, pharmaceutical compositions containing butyrylcholinesterase, methods for treating or preventing diseases conditions requiring the introduction of butyrylcholinesterase, as well as the use of butyrylcholinesterase obtained specified th way.

Уровень техникиState of the art

Бутирилхолинэстераза (БуХЭ, номер по Классификации ферментов 3.1.1.8, также известна под названиями псевдохолинэстераза, холинэстераза сыворотки, ВСНЕ, BuChE), представляет собой фермент класса гидролаз, катализирующий расщепление сложных эфиров холина. Нативная чБуХЭ (бутирилхолинэстераза человека) представляет собой сложную сериновую эстеразу, состоящую из четырех идентичных субъединиц, включающих 574 аминокислоты, которые удерживаются вместе за счет нековалентных взаимодействий, и около 40 углеводных цепей (Rosenberg, 2010).Butyrylcholinesterase (BChE, enzyme classification number 3.1.1.8, also known as pseudocholinesterase, serum cholinesterase, BCHE, BuChE), is an enzyme of the hydrolase class that catalyzes the breakdown of choline esters. Native hBEChE (human butyrylcholinesterase) is a complex serine esterase composed of four identical subunits, including 574 amino acids that are held together by non-covalent interactions, and about 40 carbohydrate chains (Rosenberg, 2010).

Бутирилхолинэстераза выполняет в организме защитные функции. Этот фермент способен метаболизировать кокаин и его производные с образованием нетоксичных продуктов распада, поэтому ее используют при передозировке кокаина. Также бутирилхолинэстераза способна нейтрализовать токсичное воздействие фосфорорганических соединений. В небольших количествах она продуцируется в организме человека. Однако ее количества настолько малы, что не способны защитить человека при отравлении. Риск отравления фосфорорганическими агентами, воздействующими на нервную систему, связан, например, с их применением в военных целях и при террористической угрозе, при авариях во время хранения, транспортировки и использования инсектицидов, а также при передозировке органофосфатов, использующихся для наркоза, в лечении нейродегенеративных заболеваний и в офтальмологии.Butyrylcholinesterase performs protective functions in the body. This enzyme is able to metabolize cocaine and its derivatives with the formation of non-toxic decomposition products, therefore, it is used for overdose of cocaine. Butyrylcholinesterase is also able to neutralize the toxic effects of organophosphorus compounds. In small quantities, it is produced in the human body. However, its quantities are so small that they are not able to protect a person in case of poisoning. The risk of poisoning by organophosphorus agents affecting the nervous system is associated, for example, with their use for military purposes and with the terrorist threat, in accidents during storage, transportation and use of insecticides, as well as with an overdose of organophosphates used for anesthesia in the treatment of neurodegenerative diseases and in ophthalmology.

Известно, что введение в кровь животным сывороточной холинэстеразы лошади или рекомбинантной холинэстеразы человека (рБУХЭ) защищает их от смертельных доз зарина, зомана, нервнопаралитических агентов (Vx-агентов) и других соединений, относящихся к фосфорорганическим соединениям, а также карбаматов. Хотя плазма крови человека может служить источником нативной чБуХЭ, это сырье является достаточно дорогим, объемы его ограничены, а получение и очистка требуют больших затрат времени и материалов при том, что очистка не устраняет опасность заражения инфекционными агентами, содержащимися в плазме, полностью. В связи с этим, получение бутририлхолинэстеразы биотехнологическими способами является актуальной и важной задачей.The introduction of horse serum cholinesterase or recombinant human cholinesterase (rBUCH) into the blood of animals is known to protect them from lethal doses of sarin, soman, nerve agents (Vx agents), and other compounds related to organophosphorus compounds, as well as carbamates. Although human blood plasma can serve as a source of native BChE, this raw material is quite expensive, its volumes are limited, and the preparation and purification require a lot of time and materials, while purification does not completely eliminate the risk of infection with infectious agents contained in the plasma. In this regard, the preparation of butyrylcholinesterase by biotechnological methods is an urgent and important task.

Традиционно, бутирилхолинэстераза считается очень сложной для производства молекулой. За последнее десятилетие были предприняты многочисленные попытки осуществить трансгенную экспрессию чБуХЭ с использованием трансгенных животных (мышей и коз), а также растений и микроорганизмов, но ни одно из этих исследований не обеспечило экономически эффективного способа получения БуХЭ, одобренной для введения человеку.Traditionally, butyrylcholinesterase is considered to be a very complex molecule to produce. Over the past decade, numerous attempts have been made to transgenically express hBChE using transgenic animals (mice and goats), as well as plants and microorganisms, but none of these studies have provided a cost-effective way to obtain BChE, approved for administration to humans.

В частности, экспрессия рБуХЭ (рекомбинантной бутирилхолинэстеразы) в прокариотических клетках привлекательна с точки зрения относительной дешевизны исходных материалов, однако продукция в микроорганизмах не обеспечивает правильного скручивания и гликозилирования и дает неактивный или слабоактивный фермент.In particular, the expression of rBChE (recombinant butyrylcholinesterase) in prokaryotic cells is attractive from the point of view of the relative cheapness of the starting materials, however, production in microorganisms does not provide the correct twisting and glycosylation and gives an inactive or weakly active enzyme.

Экспрессия рБуХЭ в дрожжевых клетках также является относительно экономически эффективной, обеспечивает скручивание и гликозилирование продукта, однако активность получаемой бутирилхолинэстеразы все же недостаточна.The expression of rBChE in yeast cells is also relatively cost-effective, provides twisting and glycosylation of the product, however, the activity of the obtained butyrylcholinesterase is still insufficient.

Производство рБуХЭ с использованием трансгенных животных дает активный фермент, часто характеризуется высоким уровнем продукции, однако является сравнительно затратным и связано с определенными этическими проблемами.The production of rBChE using transgenic animals gives an active enzyme, often characterized by a high level of production, however, it is relatively expensive and associated with certain ethical problems.

Продукция бутирилхолинэстеразы в культурах эукариотических клеток позволила бы решить большую часть указанных проблем. Однако существующие системы эукариотической продукции не позволяют достичь высокого выхода продукта, а также получить фермент, который обладал бы достаточной стабильностью в кровотоке и, соответственно, был бы достаточно эффективен при применении in vivo.The production of butyrylcholinesterase in eukaryotic cell cultures would solve most of these problems. However, existing systems of eukaryotic production do not allow to achieve a high yield of the product, as well as to obtain an enzyme that would have sufficient stability in the bloodstream and, accordingly, would be quite effective when applied in vivo.

Соответственно, существует потребность в эффективном способе производства активной бутирилхолинэстеразы, которую можно было бы вводить человеку с целью защиты от нарушений, вызванных фосфорорганическими и карбаматными соединениями.Accordingly, there is a need for an effective method for the production of active butyrylcholinesterase that can be administered to humans in order to protect against disorders caused by organophosphorus and carbamate compounds.

Задачи изобретенияObjectives of the invention

Задачей настоящего изобретения является создание эффективной системы экспрессии бутирилхолинэстеразы человека, которая обеспечивала бы высокий выход формы бутирилхолинэстеразы, подходящей для введения человеку и обладающей достаточной фармакологической активностью и стабильностью in vivo.An object of the present invention is to provide an effective system for the expression of human butyrylcholinesterase, which would provide a high yield of the form of butyrylcholinesterase suitable for administration to humans and possessing sufficient pharmacological activity and stability in vivo.

Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Один аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения сиалированной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека, включающий стадии:One aspect of the present invention is a method for producing sialylated recombinant human butyrylcholinesterase, comprising the steps of:

- культивирования клеток СНО, трансформированных вектором экспрессии, содержащим ген бутирилхолинэстеразы человека с сайтом полиаденилирования под контролем промотора фактора элонгации (EF) человека и ген маркера селекции, и вектором экспрессии, содержащим ген PRAD с сайтом полиаденилирования под контролем промотора фактора элонгации (EF) человека и ген маркера селекции, в безбелковой питательной среде;culturing CHO cells transformed with an expression vector containing a human butyrylcholinesterase gene with a polyadenylation site under the control of a human elongation factor (EF) promoter and a selection marker gene, and an expression vector containing a PRAD gene with a polyadenylation site under the control of a human elongation factor (EF) promoter and selection marker gene, in a protein-free culture medium;

- очистки полученной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека последовательно путем ультра-фильтрации, аффинной хроматографии, анионообменной хроматографии и диафильтрации;- purification of the obtained recombinant human butyrylcholinesterase sequentially by ultra-filtration, affinity chromatography, anion exchange chromatography and diafiltration;

- химического сиалирования выделенной рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека при pH 6,0-7,0 в присутствии цианоборгидрида.- chemical sialylation of the isolated recombinant human butyrylcholinesterase at pH 6.0-7.0 in the presence of cyanoborohydride.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой сиалированную рекомбинантную бутирилхолинэстеразу, полученную предложенным способом.Another aspect of the present invention is a sialylated recombinant butyrylcholinesterase obtained by the proposed method.

Далее предложена фармацевтическая композиция для лечения, предотвращения, подавления или снижения токсических эффектов фосфорорганических соединений, содержащая бутрилхолинэстеразу согласно настоящему изобретению в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.The following provides a pharmaceutical composition for treating, preventing, suppressing or reducing the toxic effects of organophosphorus compounds comprising the butylcholinesterase of the present invention in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.

Другой аспект относится к способу лечения, предотвращения, подавления или снижения токсических эффектов фосфорорганических соединений у животного, включающему введение указанному животному бутирилхолинэстеразы или композиции согласно настоящему изобретению.Another aspect relates to a method for treating, preventing, suppressing or reducing the toxic effects of organophosphorus compounds in an animal, comprising administering to said animal a butyrylcholinesterase or composition according to the present invention.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На Фиг. 1 показаны схемы создания плазмид pcDNA/CMV/BCHE (A), pBudCE/EF/BCHE (Б), pcDNA/CMV/PRAD (В), pcDNA/EF/PRAD (Г), а также электрофореграммы продуктов рестрикции плазмид pcDNA3.1/Hygro (Д, 1) и pGS/CMV/BCHE (Д, 2) по сайтам HindIII-ApaI, плазмид pBudCE/EF (Е, 1) и pBudCE/EF/BCHE (Е, 2) по сайту Bg/II, и электрофореграмма плазмид pRc/RSV-rQ45 (Ж, 1), pcDNA/CMV/PRAD (Ж, 3), pcDNA/EF/PRAD (Ж, 5), а также указанных плазмид, обработанных эндонуклеазами рестрикции SpeI-XnoI (Ж, 2; Ж, 4; Ж, 6, соответственно). М - маркер.In FIG. Figure 1 shows the schemes for creating plasmids pcDNA / CMV / BCHE (A), pBudCE / EF / BCHE (B), pcDNA / CMV / PRAD (C), pcDNA / EF / PRAD (D), as well as electrophoregrams of restriction products of plasmids pcDNA3.1 / Hygro (D, 1) and pGS / CMV / BCHE (D, 2) at the HindIII-ApaI sites, plasmids pBudCE / EF (E, 1) and pBudCE / EF / BCHE (E, 2) at the Bg / II site, and electrophoregram of plasmids pRc / RSV-rQ45 (G, 1), pcDNA / CMV / PRAD (G, 3), pcDNA / EF / PRAD (G, 5), as well as these plasmids treated with SpeI-XnoI restriction endonucleases (G, 2; F, 4; F, 6, respectively). M is a marker.

На Фиг. 2 показаны: (А) анализ эффективности временной трансфекции клеток линии СНО экспрессионными конструкциями pBudCE/EF/BCHE, pGS/CMV/BCHE и pcDNA/CMV/BCHE; (Б) сравнительный анализ продукции БуХЭ отобранными моноклонами после стабильной трансфекции клеток линии СНО линеаризованной конструкцией pBudCE/EF/BChE; (В) анализ подбора условий экспрессии рекомбинантной БуХЭ человека клоном A3 в различных ростовых средах; (Г) анализ олигомерного состава рБуХЭ методом Карновского. Разделение БуХЭ осуществляли в 8% ПААГ в неденатурирующих условиях. 1 - культуральная среда клона A3, 2 - культуральная среда клона A3 после временной трансфекции конструкцией pcDNA/CMV/PRAD, 3 - культуральная среда клона A3 после временной трансфекции конструкцией pcDNA/EF/PRAD, 4 - культуральная среда клона А3Н9, 5 - образец плазмы крови человека, 6 - образец коммерчески доступной бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека (Sigma, США), 7 - образец очищенной бутирилхолинэстеразы плазмы крови человека; (Д) оценка уровня экспрессии БуХЭ при длительной экспрессии клона A3 при различных концентрациях бычьей фетальной сыворотки.In FIG. Figure 2 shows: (A) analysis of the effectiveness of transient transfection of CHO cells with expression constructs pBudCE / EF / BCHE, pGS / CMV / BCHE and pcDNA / CMV / BCHE; (B) a comparative analysis of BChE production by selected monoclones after stable transfection of CHO cells by the linearized construct pBudCE / EF / BChE; (C) analysis of the selection of the conditions for expression of recombinant human BChE by clone A3 in various growth media; (D) analysis of the oligomeric composition of rBhE by the Karnowski method. The separation of BChE was carried out in 8% PAG under non-denaturing conditions. 1 - culture medium of clone A3, 2 - culture medium of clone A3 after temporary transfection with the pcDNA / CMV / PRAD construct, 3 - culture medium of clone A3 after temporary transfection with the pcDNA / EF / PRAD construct, 4 - culture medium of clone A3H9, 5 - plasma sample human blood; 6 - sample of commercially available human plasma butyrylcholinesterase (Sigma, USA), 7 - sample of purified human plasma butyrylcholinesterase; (D) assessment of the expression level of BChE during prolonged expression of clone A3 at various concentrations of bovine fetal serum.

На Фиг. 3 показан градиентный ПААГ (4-30%) в неденатурирующих условиях, окрашенный по методике M.J. Karnovski и L. Roots. Образцы плазмы крови человека (1), бутирилхолинэстеразы (Sigma) (3-5) 1,6 нг, 0,8 нг, 0,4 нг, соответственно, и образцы культуральной среды клона A3 (7,8).In FIG. Figure 3 shows gradient PAAG (4-30%) under non-denaturing conditions, stained according to the method of M.J. Karnovski and L. Roots. Samples of human blood plasma (1), butyrylcholinesterase (Sigma) (3-5) 1.6 ng, 0.8 ng, 0.4 ng, respectively, and samples of the culture medium of clone A3 (7.8).

На Фиг. 4 приведены результаты иммунодетекции рекомбинантного пептида PRAD. Образцы (1 - маркер, 2 - клетки до индукции, 3 - клетки после индукции, 4 - растворимая фракция, 5 - нерастворимая фракция) разделяли на ДДС-ПААГ 12% и далее переносили на мембрану Hybond C-extra (Amersham, США). Детекцию пептида проводили инкубацией мембраны с моноклональными антителами к FLAG эпитопу, конъюгированными с пероксидазой хрена.In FIG. 4 shows the results of immunodetection of the recombinant peptide PRAD. Samples (1 — marker, 2 — cells before induction, 3 — cells after induction, 4 — soluble fraction, 5 — insoluble fraction) were separated into 12% SDS-PAGE and then transferred to a Hybond C-extra membrane (Amersham, United States). Peptide detection was performed by incubation of the membrane with monoclonal antibodies to the FLAG epitope conjugated to horseradish peroxidase.

На Фиг. 5 показан ПААГ (8%) в неденатурирующих условиях, окрашенный по методике M.J. Karnovski и L. Roots. 1 - Гидролизат: среда = 1:1,2-1:2,3-1:4,4-1:10,5-1:20,6 гидролизат с 8М мочевиной - 1:10,7-1:20,9 - высокоочищенный тетрамер БуХЭ, 10 - кондиционная среда A3 клона.In FIG. 5 shows PAG (8%) under non-denaturing conditions, stained according to the method of M.J. Karnovski and L. Roots. 1 - Hydrolyzate: medium = 1: 1.2-1: 2.3-1: 4.4-1: 10.5-1: 20.6 hydrolyzate with 8M urea - 1: 10.7-1: 20, 9 - highly purified tetramer BChE, 10 - conditioning medium A3 clone.

На Фиг. 6 показан ПААГ (8%) в неденатурирующих условиях, окрашенный по методике M.J. Karnovski и L. Roots. 1 - маркер, 2 - A3A3F4, 3 - A3A3F5, 4 - А3А3Н5, 5 - А3А3Е6, 6 - A3A3D7, 7 - A3A3D10, 8 - A3A3G11, 9 - А3А3С12, 10 - А3А3Е12, 11 - A3, 12 - очищенный тетрамер БуХЭ, 1 мкг, 13 - пустая дорожка, 14 - очищенный тетрамер БуХЭ, 4 мкг.In FIG. Figure 6 shows PAG (8%) under non-denaturing conditions, stained according to the method of M.J. Karnovski and L. Roots. 1 - marker, 2 - A3A3F4, 3 - A3A3F5, 4 - A3A3H5, 5 - A3A3E6, 6 - A3A3D7, 7 - A3A3D10, 8 - A3A3G11, 9 - A3A3C12, 10 - A3A3E12, 11 - A3, 12 - purified tetramer BChE, 1 μg, 13 - empty path, 14 - purified tetramer BChE, 4 μg.

На Фиг. 7 показан ПААГ (8%) в неденатурирующих условиях, окрашенный по методике M.J. Karnovski и L. Roots. 1 - маркер, 2 - А3А3В2, 3 - А3А3С2, 4 - А3А3А3, 5 - А3А3С3, 6 - A3A3D3, 7 - A3A3F3, 8 - A3A3G3, 9 - А3А3Н3, 10 - А3А3С4, 11 - A3, 12 - пустая дорожка, 13 - очищенный тетрамер БуХЭ, 1 мкг, 14 - пустая дорожка, 15 - очищенный тетрамер БуХЭ, 4 мкг.In FIG. 7 shows PAAG (8%) under non-denaturing conditions, stained according to the method of M.J. Karnovski and L. Roots. 1 - marker, 2 - A3A3B2, 3 - A3A3C2, 4 - A3A3A3, 5 - A3A3C3, 6 - A3A3D3, 7 - A3A3F3, 8 - A3A3G3, 9 - A3A3H3, 10 - A3A3C4, 11 - A3, 12 - empty track, 13 - purified tetramer BChE, 1 μg, 14 - empty path, 15 - purified tetramer BChE, 4 μg.

На Фиг. 8 показана схема культивирования клона А3Н9.In FIG. 8 shows a culture scheme for clone A3H9.

На Фиг. 9 показаны (А) схема реакции химического полисиалирования рсБуХЭ и (Б-Е) результаты поэтапного подбора оптимальных условий реакции химического полисиалирования. Остаточная активность и выход реакции изображены сетчатой и сплошной плоскостями соответственно.In FIG. Figure 9 shows (A) the scheme of the chemical polysialylation reaction of rsBuHE and (BE) the results of a phased selection of the optimal reaction conditions for the chemical polysialylation. The residual activity and the reaction yield are depicted by the net and solid planes, respectively.

На Фиг. 10 показаны результаты масс-спектрометрического анализа химической модификации полисиаловыми кислотами. РчБуХЭ и рчБуХЭ-CAO27 были обработаны α(2->3,6,8,9) нейрамидазой и ацилированы йодацетамидом. Полученные смеси были очищены методом белкового ПААГ. Полосы белка, соответствующие десиалированной БуХЭ, элюировали из геля и подвергали трипсинолизу. Полученные пептидные смеси изучали на масс-спектрографе с ионизацией электроспреем. Исследование выполнено на базе Института биохимической медицины РАМН.In FIG. 10 shows the results of a mass spectrometric analysis of chemical modification with polysialic acids. RhBChE and rhBChE-CAO27 were treated with α (2-> 3,6,8,9) neuramidase and acylated with iodoacetamide. The resulting mixtures were purified by the method of protein page. The protein bands corresponding to desialized BChE were eluted from the gel and subjected to trypsinolysis. The resulting peptide mixtures were studied on an electrospray ionization mass spectrograph. The study was performed at the Institute of Biochemical Medicine, Russian Academy of Medical Sciences.

На Фиг. 11 показаны: (А) Схематическое изображение процесса очистки рчБуХЭ; (Б) Анализ олигомерного состава очищенной рчБуХЭ и конъюгата рчБуХЭ-САО27 методом Карновского; (В) Электрофореграмма основных фракций, собранных в процессе очистки и химической модификации рчБуХЭ. 10% ПААГ в восстанавливающих условиях, 1 - кондиционная среда клона А3Н9, 2 - концентрат кондиционной среды, 3 - элюат после аффинной хроматографии, 4 - элюат после ионообменной хроматографии, 5 - конъюгат рчБуХЭ-CAO27, 6 - бутирилхолинэстераза плазмы крови человека. Стрелками отмечено смещение полосы белка в результате химической модификации. (Г) Анализ целостности С-концевого фрагмента рчБуХЭ.In FIG. Figure 11 shows: (A) Schematic representation of the process for purification of rhBChE; (B) Analysis of the oligomeric composition of purified rhBChE and rhBChE-SAO27 conjugate by the Karnowski method; (B) Electrophoregram of the main fractions collected during the purification and chemical modification of rhBChE. 10% PAG in reducing conditions, 1 - conditioned medium of clone А3Н9, 2 - concentrate of conditioned medium, 3 - eluate after affinity chromatography, 4 - eluate after ion exchange chromatography, 5 - rhBChE-CAO27 conjugate, 6 - butyrylcholinesterase of human blood plasma. The arrows indicate the shift of the protein band as a result of chemical modification. (D) Analysis of the integrity of the C-terminal fragment of rhBChE.

На Фиг. 12 показаны фармакодинамические кривые выведения из крови препаратов рчБуХЭ и рчБуХЭ-CAO27.In FIG. 12 shows the pharmacodynamic curves of the excretion of rhBChE and rhBChE-CAO27 from the blood.

На Фиг. 13 приведены результаты наблюдений за животными, защищенными от действия агента VR препаратами рчБуХЭ-CAO27 и чБуХЭ, в тестах ⋅ʺОткрытое полеʺ (А-В) и испытании на физическую выносливость на третбане (Г). Животных наблюдали до начала эксперимента за сутки до введения препаратов (1) белков, в момент введения (2) и после отравления агентом VR (3). Медианное значение контрольной группы во всех экспериментах - 100%, штрихованные полосы представляют интерквантильный разброс значений для контрольной группы.In FIG. Figure 13 shows the results of observations of animals protected from the action of the VR agent by rhBChE-CAO27 and hBhCHe drugs in the Open Field tests (A-B) and the physical endurance test on a treadmill (G). Animals were observed before the start of the experiment one day before the administration of preparations (1) of proteins, at the time of administration (2) and after poisoning with VR agent (3). The median value of the control group in all experiments is 100%, the dashed bands represent the interquantile scatter of values for the control group.

Подробное описаниеDetailed description

Авторы настоящего изобретения разработали новый подход к получению соответствующим образом сиалированной бутирилхолинэстеразы, обладающей высокой активностью в организме животного.The authors of the present invention have developed a new approach to the production of appropriately sialylated butyrylcholinesterase with high activity in the animal.

Проведенные авторами в ходе создания изобретения исследования показали, что культивирование клеток СНО, трансформированных вектором экспрессии, содержащим ген бутирилхолинэстеразы человека с сайтом полиаденилирования под контролем промотора фактора элонгации (EF) человека и ген маркера селекции, и вектором экспрессии, содержащим ген PRAD с сайтом полиаденилирования под контролем промотора фактора элонгации (EF) человека и ген маркера селекции, в безбелковой питательной среде в сочетании с определенной последовательностью стадий очистки (ультрафильтрация, аффинная хроматография, анионобменная хроматография, диафильрация) привело к увеличению удельной специфической активности рекомбинатного фермента. При этом использование безбелковой среды позволило ввести стадию анионообменной хроматографии, что обеспечило существенное увеличение чистоты препарата без существенных потерь белка на стадиях очистки.The studies carried out by the authors during the development of the invention showed that the cultivation of CHO cells transformed with an expression vector containing a human butyrylcholinesterase gene with a polyadenylation site under the control of the human elongation factor (EF) promoter and a selection marker gene, and an expression vector containing a PRAD gene with a polyadenylation site under control of the promoter of the elongation factor (EF) of a person and a marker marker of selection, in a protein-free culture medium in combination with a certain sequence of stages of purification (Ultrafiltration, affinity chromatography, anion exchange chromatography, diafilratsiya) led to an increase in specific activity of the specific recombinant enzyme. At the same time, the use of a protein-free medium allowed us to introduce the stage of anion exchange chromatography, which ensured a significant increase in the purity of the drug without significant protein losses at the purification stages.

Культивирование и трансформацию клеток осуществляют в соответствии с любыми подходящими процедурами и с использованием любых материалов, известных специалисту.The cultivation and transformation of cells is carried out in accordance with any suitable procedures and using any materials known to the specialist.

Клетки СНО (линия клеток яичника китайского хомячка) могут быть получены из любой линии или популяции клеток СНО, в частности, доступные в Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС), Американской коллекции типовых клеточных культур (АТТС), Российской коллекции клеточных культур (РККК) и др., и может представлять собой клетку, выбранную из клеток линий СНО-К1, CHO-K1v, K2, L2, СНО Еро-2, СНО-S, CHO-DP и любых других подходящих линий.CHO cells (Chinese hamster ovary cell line) can be obtained from any CHO cell line or population, in particular those available from the European Cell Culture Collection (ECACC), the American Type Cell Culture Collection (ATTS), the Russian Cell Culture Collection (RCCC), and etc., and may be a cell selected from cells of the lines CHO-K1, CHO-K1v, K2, L2, CHO EPO-2, CHO-S, CHO-DP and any other suitable lines.

В качестве векторов экспрессии, содержащих ген бутирилхолинэстеразы, может быть использован вектор экспрессии, содержащий ген бутирилхолинэстеразы человека под контролем эукариотических промоторов, например, синтетических промоторов.As expression vectors containing the butyrylcholinesterase gene, an expression vector containing the human butyrylcholinesterase gene can be used under the control of eukaryotic promoters, for example, synthetic promoters.

В одном из вариантов реализации промотор, содержащийся в векторе, несущем ген бутирилхолинэстеразы человека, выбран из группы, состоящей из: SV40/FerH/mEF1, hEF1-HTLV, hFerL и hFerH.In one embodiment, the promoter contained in a vector containing the human butyrylcholinesterase gene is selected from the group consisting of: SV40 / FerH / mEF1, hEF1-HTLV, hFerL and hFerH.

В конкретном варианте реализации эукариотический промотор представляет собой промотор фактора элонгации (EF) человека.In a specific embodiment, the eukaryotic promoter is a human elongation factor (EF) promoter.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая чБуХЭ, может представлять собой любую известную последовательность гена чБуХЭ или вариант известного гена чБуХЭ, кодирующий функциональную бутирилхолинэстеразу.The nucleotide sequence encoding hBChE may be any known hBBChE gene sequence or variant of the known hBChE gene encoding functional butyrylcholinesterase.

Ген маркера селекции может представлять собой любой ген, совместимый с клетками СНО, например, ген устойчивости к зеоцину, гигромицину, неомицину.The selection marker gene can be any gene compatible with CHO cells, for example, the gene for resistance to zeocin, hygromycin, neomycin.

В одном из способов реализации вектор, содержащий ген бутирилхолинэстеразы человека, содержит дополнительно непромоторные регуляторы экспрессии, такие как например, энхансеры например, энахансер CMV мыши, и/или MAR/SAR-последовательности, такие как MAR-последовательность гена β-интерферона человека.In one embodiment, the vector containing the human butyrylcholinesterase gene further comprises non-promoter expression regulators, such as, for example, enhancers, such as mouse CMV enhancers, and / or MAR / SAR sequences, such as the MAR sequence of the human β-interferon gene.

Стадии очистки осуществляют в соответствии с процедурами, известными специалисту, в частности, как описано в разделе «Примеры» настоящей заявки.The purification steps are carried out in accordance with procedures known to the skilled person, in particular as described in the Examples section of this application.

Безбелковая среда представляет собой любую среду, позволяющую исключить загрязнение целевого белка другими белками, в частности представляет собой безбелковую среду, и в предпочтительном варианте представляет собой такую среду, как ProCHO4 или ProCHO6 (Lonza, Basel, Швейцария).A protein-free medium is any medium that eliminates contamination of the target protein with other proteins, in particular it is a protein-free medium, and is preferably a medium such as ProCHO4 or ProCHO6 (Lonza, Basel, Switzerland).

Далее, для сиалирования очищенной согласно настоящему изобретению бутирилхолинэстеразы используют окисленную каламиновую кислоту (САО), предпочтительно САО со средней молекулярной массой 27кДа (CAO27). САО может быть приобретена в коммерческом источнике или получена, например, как описано в WO-A-9222331.Further, oxidized calamic acid (CAO), preferably CAO with an average molecular weight of 27 kDa (CAO27), is used to sialylate the butyrylcholinesterase purified according to the present invention. CAO can be purchased in a commercial source or obtained, for example, as described in WO-A-9222331.

Получение паттерна сиалирования, обеспечивающего оптимальные фармакокинетические свойства и одновременно высокую активность, зависит от многих параметров процесса сиалирования, взаимное влияние которых плохо поддается предсказанию. Соответственно, невозможно предсказать, какой набор параметров может обеспечить оптимальное сиалирование конкретного фермента.Obtaining a sialylation pattern that provides optimal pharmacokinetic properties and at the same time high activity depends on many parameters of the sialylation process, the mutual influence of which is difficult to predict. Accordingly, it is impossible to predict which set of parameters can provide optimal sialylation of a particular enzyme.

Проведя серию экспериментов, авторы настоящего исследования обнаружили набор условий полисиалирования, который позволил сохранить выход активного коньюгата при увеличении его специфической активности до более 85% от теоритически возможной, а также увеличить время полувыведения в 6 раз относительно немодифицированного аналога и полностью сохранить активный центр фермента и его активность в отношении фосфорорганических токсинов.After a series of experiments, the authors of this study found a set of polysialylation conditions, which allowed to preserve the yield of the active conjugate with an increase in its specific activity to more than 85% of the theoretically possible, as well as to increase the half-life by 6 times relative to the unmodified analog and to completely preserve the active center of the enzyme and activity against organophosphorus toxins.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полисиалирование осуществляют при соотношении [САО]/[БуХЭ] от 20 до 100, предпочтительно от 20 до 80, более предпочтительно: от 30 до 70, более предпочтительно: от 40 до 60, и наиболее предпочтительно приблизительно 50.In one embodiment, the polysialylation is carried out at a ratio of [CAO] / [BChE] from 20 to 100, preferably from 20 to 80, more preferably from 30 to 70, more preferably from 40 to 60, and most preferably about 50 .

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения полисиалирование осуществляют при температуре инкубации от 4 до 37°С, более предпочтительно: от 10 до 30°С, более предпочтительно: от 15 до 30°С; более предпочтительно: от 20 до 30°С; более предпочтительно: от 22 до 27°С и наиболее предпочтительно при температуре приблизительно 25°С.In a further embodiment of the present invention, polysialylation is carried out at an incubation temperature of from 4 to 37 ° C, more preferably: from 10 to 30 ° C, more preferably: from 15 to 30 ° C; more preferably: from 20 to 30 ° C; more preferably: from 22 to 27 ° C. and most preferably at a temperature of about 25 ° C.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения полисиалирование осуществляют при pH от 6,0 до 7,5, предпочтительно, при pH от 6,5 до 7,0, наиболее предпочтительно, при pH, приблизительно равном 6,9.In a further embodiment of the present invention, polysialylation is carried out at a pH of from 6.0 to 7.5, preferably at a pH of from 6.5 to 7.0, most preferably at a pH of approximately 6.9.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения полисиалирование осуществляют в присутствии цианоборгидрида. В одном из вариантов реализации концентрация цианоборгидрида составляет от 2,5 до 4 мг/мл, наиболее предпочтительно: 3,16 мг/мл.In a further embodiment of the present invention, polysialylation is carried out in the presence of cyanoborohydride. In one embodiment, the concentration of cyanoborohydride is from 2.5 to 4 mg / ml, most preferably: 3.16 mg / ml.

В одном из аспектов осуществления процесс сиалирования включает любую комбинацию перечисленных выше вариантов условий.In one aspect of the implementation, the sialing process includes any combination of the above conditions.

Что касается бутирилхолинэстеразы, полученной способом согласно настоящему изобретению, такой фермент может характеризоваться масс-спектром, представленным на Фиг. 10.As for the butyrylcholinesterase obtained by the method of the present invention, such an enzyme may be characterized by the mass spectrum shown in FIG. 10.

Также настоящее изобретение относится к композиции для лечения, предотвращения, подавления или снижения токсических эффектов фосфорорганических соединений, содержащей бутирилхолинэстеразу согласно настоящему изобретению в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.The present invention also relates to a composition for treating, preventing, suppressing or reducing the toxic effects of organophosphorus compounds containing the butyrylcholinesterase of the present invention in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.

Композиция согласно настоящему изобретению может содержать любые фармацевтически пригодные вспомогательные ингредиенты и может быть приготовлена любым способом, известным специалисту, например, из Remington: The Science And Practice Of Pharmacy (Lippincott Williams & Wilkins, 2006, 2393 стр. , или любого аналогичного издания. Качественный и количественный состав вспомогательных ингредиентов (носители, наполнители, увлажняющие и солюбилизирующие агенты и пр.) будет зависеть от желаемой формы и пути введения. В предпочтительном случае композицию согласно настоящему изобретению вводят путем инъекции.The composition according to the present invention may contain any pharmaceutically acceptable auxiliary ingredients and can be prepared by any method known to the person skilled in the art, for example, from Remington: The Science And Practice Of Pharmacy (Lippincott Williams & Wilkins, 2006, 2393 pages, or any similar publication. and the quantitative composition of the auxiliary ingredients (carriers, fillers, moisturizing and solubilizing agents, etc.) will depend on the desired form and route of administration. In a preferred case, the composition according to the present invention ju is administered by injection.

Эффективное количество бутирилхолинэстеразы может быть определено специалистом и может быть рассчитано таким образом, чтобы обеспечивать доставку ориентировочно, например, 1-1000 мг/кг массы субъекта, приблизительно 0,01, приблизительно 1, приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 150, приблизительно 200, приблизительно 250, приблизительно 300, приблизительно 350, приблизительно 400, приблизительно 450, приблизительно 500, приблизительно 550, приблизительно 600, приблизительно 650, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 850, приблизительно 900, приблизительно 950, приблизительно 1000 мг/кг массы субъекта или может представлять собой любое значение, лежащее между приведенными выше значениями, а также может быть выше или ниже в зависимости от конкретных задач и условий введения.An effective amount of butyrylcholinesterase can be determined by a person skilled in the art and can be designed to deliver approximately 1-1000 mg / kg of subject weight, approximately 0.01, approximately 1, approximately 5, approximately 10, approximately 20, approximately 30, approximately 40, approximately 50, approximately 60, approximately 70, approximately 80, approximately 90, approximately 100, approximately 150, approximately 200, approximately 250, approximately 300, approximately 350, approximately 40 0, approximately 450, approximately 500, approximately 550, approximately 600, approximately 650, approximately 700, approximately 750, approximately 800, approximately 850, approximately 900, approximately 950, approximately 1000 mg / kg of the subject’s weight, or may be any value lying between the above values, and may also be higher or lower depending on the specific tasks and conditions of administration.

Далее настоящее изобретение относится к способу лечения, предотвращения, подавления или снижения токсических эффектов фосфорорганических соединений у животного, включающему введение указанному животному бутирилхолинэстеразы или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.The present invention further relates to a method for treating, preventing, suppressing or reducing the toxic effects of organophosphorus compounds in an animal, comprising administering to said animal a butyrylcholinesterase or a pharmaceutical composition according to the present invention.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения введение осуществляют до контакта животного с фосфорорганическим соединением. В некоторых вариантах реализации введение бутирилхолинэстеразы или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению осуществляют приблизительно за 5 ч, 4 ч, 3 ч, 2 ч, 1 ч или 0,5 ч до контакта животного с фосфорорганическим соединением.In a preferred embodiment, the administration is carried out before the animal contacts the organophosphorus compound. In some embodiments, the administration of the butyrylcholinesterase or pharmaceutical composition of the present invention is carried out approximately 5 hours, 4 hours, 3 hours, 2 hours, 1 hour or 0.5 hours before the animal contacts the organophosphorus compound.

В предпочтительном случае животное представляет собой млекопитающее, например человека.In a preferred case, the animal is a mammal, for example a human.

Ниже осуществление настоящего изобретения описано на конкретных примерах. Для специалиста будут очевидны возможные модификации указанных в приведенных примерах условий. Такие модификации включены в объем настоящего изобретения, определяемый формулой изобретения.The implementation of the present invention is described below with specific examples. For the specialist, possible modifications of the conditions indicated in the above examples will be apparent. Such modifications are included in the scope of the present invention defined by the claims.

ПримерыExamples

Реагенты. VR, S-(2-(диэтиламино)этил) О-изобутирил метанофосфонотионат синтезировали в Государственном Исследовательском Институте Органической Химии и Технологии, Москва. Reagents VR, S- (2- (diethylamino) ethyl) O-isobutyryl methanophosphonothionate was synthesized at the State Research Institute of Organic Chemistry and Technology, Moscow.

ЯМР агента VR (¹Н, ³¹Р) выполняли на спектрографе AVANCE 300 (Brucker, Германия) в растворе CDCl₃ С использованием стандартных процедур. NMR of agent VR ( ¹ H, ³¹ P) was performed on an AVANCE 300 spectrograph (Brucker, Germany) in a CDCl ₃ solution using standard procedures.

1. Конструирование вектора для экспрессии BChE. Исходный вектор pBudCE 4.1 (Invitrogen, США) модифицировали путем удаления промотора CMV с использованием сайтов рестрикции SpeI и XbaI, гибридизации и лигирования по тупым концам (pBudCE4.1/EF). Кодирующую последовательность человеческой BChE из pGS/CMV/BCHE (Nachon, F. et al. Engineering of a monomeric and low-glycosylated form of human butyrylcholinesterase: expression, purification, characterization and crystallization. Eur J Biochem 269, 630-637 (2002)) (i) клонировали в pBudCE4.1/EF, используя сайты рестрикции Bg/II, с получением pBudCE/EF/BCHE или (ii) клонировали в вектор pcDNA3.1 (Invitrogen, США), используя сайты рестрикции HindIII и ApaI, с получением pcDNA/CMV/BCHE. (См. Фиг. 1) 1 . Construction of a vector for the expression of BChE. The original pBudCE 4.1 vector (Invitrogen, USA) was modified by removing the CMV promoter using SpeI and XbaI restriction sites, hybridization and blunt end ligation (pBudCE4.1 / EF). The coding sequence of human BChE from pGS / CMV / BCHE (Nachon, F. et al. Engineering of a monomeric and low-glycosylated form of human butyrylcholinesterase: expression, purification, characterization and crystallization. Eur J Biochem 269, 630-637 (2002) ) (i) cloned into pBudCE4.1 / EF using Bg / II restriction sites to obtain pBudCE / EF / BCHE or (ii) cloned into pcDNA3.1 vector (Invitrogen, USA) using the HindIII and ApaI restriction sites, c obtaining pcDNA / CMV / BCHE. (See Fig. 1)

2. Конструирование вектора экспрессии PRAD. Кодирующую последовательность PRAD из pRc/RSV-rQ45 (Xie, W. et al. An improved cocaine hydrolase: the A328Y mutant of human butyrylcholinesterase is 4-fold more efficient. Mol Pharmacol 55, 83-91 (1999).) клонировали в вектор экспрессии pcDNA3.1 (Invitrogen, США), используя сайты рестрикции HindIII и XnoI, с получением pcDNA/CMV/PRAD. Участок промотора EF - получали из вектора pBudCE4.1/EF с использованием сайтов рестрикции Bg/II и WneI. Вектор pcDNA/CMV/PRAD модифицировали путем замены последовательности промотора CMV на последовательность промотора EF, используя сайты рестрикции SpeI и HindIII и лигирование по липким концам (pcDNA/EF/PRAD) (См. Фиг. 1). 2. Construction of the expression vector of PRAD. The PRAD coding sequence from pRc / RSV-rQ45 (Xie, W. et al. An improved cocaine hydrolase: the A328Y mutant of human butyrylcholinesterase is 4-fold more efficient. Mol Pharmacol 55, 83-91 (1999).) Cloned into a vector expression of pcDNA3.1 (Invitrogen, USA) using HindIII and XnoI restriction sites to obtain pcDNA / CMV / PRAD. Plot of the EF promoter - was obtained from the vector pBudCE4.1 / EF using restriction sites Bg / II and WneI. The pcDNA / CMV / PRAD vector was modified by replacing the CMV promoter sequence with the EF promoter sequence using SpeI and HindIII restriction sites and sticky end ligation (pcDNA / EF / PRAD) (See FIG. 1).

3. Культивирование клеток СНО. Клетки CHO-K1 культивировали в пластиковых 25 см² флаконах с крышками с клапаном, содержащими среду DMEM (GIBCO, Life Technologies, США) с 2% (об./об.) фетальной сыворотки крупного рогатого скота (GIBCO, Life Technologies, США) и 2 мМ L-глютамина (GIBCO, Life Technologies, США) при 37°С, 5% CO₂ и влажности 95%. После того как клетки достигали 100% монослоя, их пересевали в новые флаконы. Для получения субкультуры клеток удаляли среду, после чего клетки промывали свежим стерильным ФБР. После этого добавляли 0,25% трипсина. После инкубирования в течение 5-10 минут при 37°C клетки суспендировали в среде DMEM и высевали в новые флаконы в концентрации 1,5-2,0×10⁵ клеток/мл. 3. Cultivation of CHO cells. CHO-K1 cells were cultured in 25 cm ² plastic flask vials with valve caps containing DMEM medium (GIBCO, Life Technologies, USA) with 2% (v / v) cattle fetal serum (GIBCO, Life Technologies, USA) and 2 mM L-glutamine (GIBCO, Life Technologies, USA) at 37 ° C, 5% CO ₂ and 95% humidity. After the cells reached 100% monolayer, they were reseeded in new bottles. To obtain a cell subculture, the medium was removed, after which the cells were washed with fresh sterile PBS. After that, 0.25% trypsin was added. After incubation for 5-10 minutes at 37 ° C, the cells were suspended in DMEM and plated in new vials at a concentration of 1.5-2.0 × 10 ⁵ cells / ml.

4. Трансфекция клеток СНО. Пробы по 0,2 мг линеаризованного ДНК-вектора экспрессии трансфецировали в клетки СНО с использованием реагентов Lipofectamine™ и PlusDNA™ (Invitrogen, Сан-Диего, США), следуя инструкции производителя, и получали клоны со стабильной продукцией. Трансфецированные клетки культивировали в неселективной среде в течение 48-72 ч и определяли уровень продукции BChE в тесте Эллмана (ELLMAN, G.L, COURTNEY, K.D., ANDRES, V. & FEATHER-STONE, R.М.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 7, 88-95 (1961). Затем клетки подкармливали средой DMEM, которая содержала селективные антибиотики для отбора стабильных клонов. 4. Transfection of CHO cells. Samples of 0.2 mg of the linearized DNA expression vector were transfected into CHO cells using Lipofectamine ™ and PlusDNA ™ reagents (Invitrogen, San Diego, USA), following the manufacturer's instructions, and obtained clones with stable products. Transfected cells were cultured in a non-selective medium for 48-72 h and the BChE production level was determined in the Ellman test (ELLMAN, GL, COURTNEY, KD, ANDRES, V. & FEATHER-STONE, R.M. new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity Biochem Pharmacol 7, 88-95 (1961), The cells were then fed with DMEM, which contained selective antibiotics to select stable clones.

5. Экспрессия рекомбинантной BChE. С целью исключения загрязнения ацетилхолинэстеразой и белками сыворотки rBChE экспрессировали в безбелковой среде (ProCHO, Lonza, Basel, Швейцария). Клетки культивировали и субкультивировали в соответствии со стандартными процедурами в 225 см² флаконах (См. Фиг. 8). После того как клетки достигали 50-60% монослоя, ростовую среду заменяли на безбелковую среду. Среду для экспрессии меняли каждые 3 дня. BChE во флаконах получали непрерывно на протяжении 9 дней. Концентрацию фермента определяли с использованием теста Эллмана, предполагая, что активность, равная 720 единицам, соответствует 1 мг чистой BChE. Уровень экспрессии rBChE составлял до 30 мг/мл. Культуральную среду центрифугировали при 1500 g в течение 10 и хранили при -20°C до использования. 5. Expression of recombinant BChE. To eliminate contamination with acetylcholinesterase and serum proteins, rBChE was expressed in a protein-free medium (ProCHO, Lonza, Basel, Switzerland). Cells were cultured and subcultured according to standard procedures in 225 cm ² vials (See Fig. 8). After the cells reached 50-60% of the monolayer, the growth medium was replaced with a protein-free medium. The expression medium was changed every 3 days. BChE in vials was obtained continuously for 9 days. The enzyme concentration was determined using the Ellman test, assuming that an activity of 720 units corresponds to 1 mg of pure BChE. The rBChE expression level was up to 30 mg / ml. The culture medium was centrifuged at 1500 g for 10 and stored at -20 ° C until use.

6. Ферментные анализы. Уровень экспрессии rhBChE определяли непосредственно в культуральной среде. Образцы обрабатывали 1 мМ бутирилтиохолин иодидом (ВТС, Sigma) и 0,5 мМ 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) (DTNB, Sigma) в 0,1 М калий-фосфатного буфера с pH 7.0 при 25°C. За образованием продукта следили по увеличению поглощения 5-тио-2-нитробензойной кислоты при 412 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 13,600 М^-1 см^-1. Активность регистрировали в единицах на мл, где 1 единица соответствует гидролизу 1 мМ бутирилтиохолина в минуту. 6. Enzyme assays. The expression level of rhBChE was determined directly in the culture medium. Samples were treated with 1 mM butyrylthiocholine iodide (BTC, Sigma) and 0.5 mM 5.5-dithio-bis- (2-nitrobenzoic acid) (DTNB, Sigma) in 0.1 M potassium phosphate buffer at pH 7.0 at 25 ° C. The formation of the product was monitored by increasing the absorption of 5-thio-2-nitrobenzoic acid at 412 nm using a molar extinction coefficient of 13.600 M ^-1 cm ^-1 . Activity was recorded in units per ml, where 1 unit corresponds to the hydrolysis of 1 mM butyrylthiocholine per minute.

Конъюгированный фермент rBChE+CA027 гидролизовал ВТС с K_m 28±2 мкМ и k_cat 830±10 s^-1, что соответствовало каталитическим свойствам немодифицированного фермента.The conjugated enzyme rBChE + CA027 hydrolyzed BTC with K _m 28 ± 2 μM and k _cat 830 ± 10 s ^-1 , which corresponded to the catalytic properties of the unmodified enzyme.

Для оценки параметров кинетики осуществляли реакции rhBChE или rhBChE-CA027 или высокоочищенной BChE плазмы (3-10 мкМ) в ВТС в концентрациях от 10 до 1000 мкМ и 0,5 мМ DTNB в 0,1 М фосфатном буфере с pH 7.0 при 25°C. Для определения k_cat, K_M, K_SS и b стройли график по результатам и применяли нелинейную регрессию (SigmaPlot ver. 11.0, SYSTAT). Титрование активного центра выполняли в соответствии с тестом Эллмана с использованием диизопропил флюорофосфатазы в качестве ингибитора. (См. Фиг. 2)To evaluate the kinetics parameters, reactions of rhBChE or rhBChE-CA027 or highly purified BChE plasma (3-10 μM) were carried out in PTS at concentrations from 10 to 1000 μM and 0.5 mM DTNB in 0.1 M phosphate buffer at pH 7.0 at 25 ° C . To determine k _cat , K _M , K _SS and b, we plotted the results and used non-linear regression (SigmaPlot ver. 11.0, SYSTAT). The titration of the active center was carried out in accordance with the Ellman test using diisopropyl fluorophosphatase as an inhibitor. (See Fig. 2)

Необратимое ингибирование BChE органофосфатами. Константы ингибирования получали путем инкубирования интактной rhBChE и конъюгата rhBCHE-CAO27 в течение 1 минуты с VR в 0,1 М калий-фосфатном буфере (pH = 7.4) при 25°C, после чего проводили тест Эллмана с 1 мМ ВТС и 0,5 mM DTNB для определения остаточной активности BChE. Констатны бимолекулярного ингибирования рассчитывали с использованием уравнения (Worek, F., Thiermann, Н., Szinicz, L. & Eyer, P. Kinetic analysis of interactions between human acetylcholinesterase, structurally different organophosphorus compounds and oximes. Biochem Pharmacol 68, 2237-2248 (2004)):Irreversible inhibition of BChE by organophosphates. Inhibition constants were obtained by incubating the intact rhBChE and rhBCHE-CAO27 conjugate for 1 minute with VR in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.4) at 25 ° C, after which an Ellman test was performed with 1 mM BTC and 0.5 mM DTNB to determine the residual activity of BChE. The bimolecular inhibition constants were calculated using the equation (Worek, F., Thiermann, N., Szinicz, L. & Eyer, P. Kinetic analysis of interactions between human acetylcholinesterase, structurally different organophosphorus compounds and oximes. Biochem Pharmacol 68, 2237-2248 ( 2004)):

k_i=1/(tC)in(ΔA₀/ΔA_i),k _i = 1 / (tC) in (ΔA ₀ / ΔA _i ),

где t - время ингибирования, мин.; С - концентрация ингибитора, М; ΔA₀ - гидролиз ВСТ без ингибитора, ΔA_i - гидролиз ВТС с ингибитором.where t is the time of inhibition, min .; C is the concentration of inhibitor, M; ΔA ₀ - hydrolysis of TSB without inhibitor, ΔA _i - hydrolysis of BTC with inhibitor.

Очистка BChE от ростовой среду ProCHO. 10 л безбелковой ростовой среды, содержащей до 30 мг/л rhBChE, сначала фильтровали через систему картриджей Pellicon (Millipore, США) и мембрану с отсекаемым размером 300 кДа. В буферы добавляли EDTA и азид натрия в конечных концентрациях 5 мМ и 0,05%, соответственно. Фильтрованную ростовую среду концентрировали до объема 0,5 L с использованием мембраны с отсекаемым размером 10 кДа. Концентрированную среду загружали на колонку с прокаинамид-сефарозным сорбентом XK10/50, уравновешенную 20 мМ калий-фосфатным буфером pH = 7.2 (GE Healthcare, США) в течение ночи при скорости потока 5 мл/мин. Затем колонку промывали последовательно 20 объемами колонки 20 мМ калий-фосфатного буфера и 300 мМ NaCl. Рекомбинантный белок элюировали 1 М NaCl, концентрировали на ультрафильтрационных мембранах Centricon (Millipore, Bedford, США) с отсекаемым объемом 10 КДа и диализировали против 20 мМ калий-фосфатного буфера, pH = 7.2. Анионообменную хроматографию осуществляли с использованием колонки MonoQ 5/50 (GE Healthcare, США) с градиентной элюцией 0-1000 мМ NaCl. Очищенный белок концентрировали на ультрафильтрационных мембранах Amicon™ (Millipore, Bedford, MA) с отсекаемым размером 10 кДа и диализировали против 20 мМ калий-фосфатного буфера, pH = 7.2 (См. Фиг. 11). Purification of BChE from ProCHO growth medium. 10 l of protein-free growth medium containing up to 30 mg / l rhBChE was first filtered through a Pellicon cartridge system (Millipore, USA) and a 300 kDa cut-off membrane. EDTA and sodium azide were added to the buffers at final concentrations of 5 mM and 0.05%, respectively. The filtered growth medium was concentrated to a volume of 0.5 L using a 10 kDa cut-off membrane. The concentrated medium was loaded onto a column with procainamide-sepharose sorbent XK10 / 50, balanced with 20 mM potassium phosphate buffer pH = 7.2 (GE Healthcare, USA) overnight at a flow rate of 5 ml / min. The column was then washed sequentially with 20 column volumes of 20 mM potassium phosphate buffer and 300 mM NaCl. The recombinant protein was eluted with 1 M NaCl, concentrated on Centricon ultrafiltration membranes (Millipore, Bedford, USA) with a cut-off volume of 10 KDa and dialyzed against 20 mM potassium phosphate buffer, pH = 7.2. Anion exchange chromatography was performed using a MonoQ 5/50 column (GE Healthcare, USA) with a gradient elution of 0-1000 mM NaCl. The purified protein was concentrated on Amicon ™ ultrafiltration membranes (Millipore, Bedford, MA) with a cut-off size of 10 kDa and dialyzed against 20 mM potassium phosphate buffer, pH = 7.2 (See FIG. 11).

Химическая модификация полисиаловой кислотой. Окисленную каламиновую кислоту со средней массой 27кДа (CAO27) получали на установке Lipoxen. Конъюгирование осуществляли в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН=6,9 с молярным отношением белок:САО - 1:50 при 25°C с конечной концентраций NaCNBH3 равной 3 мг/мл в течение 48 ч; Конъюгат rhBChE-CAO27 очищали путем аффинной хроматографии с использованием прокаинамид-сефарозного сорбента. После концентрации на ультрафильтрационных мембранах Amicon™ Ultra (Millipore, Bedford, США) с отсекаемым объемом 10 кДа, rhBChE-CAO27 диализировали против ФБР. Chemical modification with polysialic acid. Oxidized calamic acid with an average weight of 27 kDa (CAO27) was obtained using a Lipoxen apparatus. Conjugation was carried out in 0.1 M potassium phosphate buffer, pH = 6.9, with a protein: CAO molar ratio of 1:50 at 25 ° C with a final concentration of NaCNBH3 of 3 mg / ml for 48 hours; The rhBChE-CAO27 conjugate was purified by affinity chromatography using procainamide-sepharose sorbent. After concentration on Amicon ™ Ultra ultrafiltration membranes (Millipore, Bedford, USA) with a cut-off volume of 10 kDa, rhBChE-CAO27 was dialyzed against the FBI.

Полисиалирование в других наборах условий осуществляли аналогичным образом, варьируя соответствующие параметры. Результаты показаны на Фиг. 9Polysialylation in other sets of conditions was carried out in a similar way, varying the corresponding parameters. The results are shown in FIG. 9

Количественное определение САО. Относительное количество САО в конъюгате ВСНЕ-CAO27 определяли в ресорциноловом тесте. Реагент Ресорцинол (100 мл) готовили с использованием сульфата меди (0.1 М; 250 мкл), ресорцинола (1%; 20 мл) и соляной кислоты (концентрированной, количество, достаточное для 80 мл) в бутылке янтарного цвета и выдерживали в холодильнике в течение месяца. Образец конъюгата СНЕ-CAO27 и калибровочные образцы CAO27 смешивали с 4 объемами реагента ресорцинола и инкубировали при в течение 15 минут. Комплексы ресорцинол-нейраминовая кислота экстрагировали путем добавления 4 объемов 2-метилбутанола. ОП измеряли на устройстве Varioskan Flash (Thermo Scientific, Германия) при 560 нм. Количество остатков CAO27 на одну молекулу BChE рассчитывали как отношение молярной концентрации CAO27 в образце к молярной концентрации BChE при предположении, что молекулярная масса мономера BChE равна 82 кДа. Quantitative determination of CAO. The relative amount of CAO in the BCHE-CAO27 conjugate was determined in the resorcinol test. The reagent Resorcinol (100 ml) was prepared using copper sulfate (0.1 M; 250 μl), resorcinol (1%; 20 ml) and hydrochloric acid (concentrated, sufficient for 80 ml) in an amber bottle and kept in the refrigerator for months. A sample of conjugate CHE-CAO27 and calibration samples CAO27 were mixed with 4 volumes of rezorcinol reagent and incubated for 15 minutes. Resorcinol-neuraminic acid complexes were extracted by adding 4 volumes of 2-methylbutanol. OD was measured on a Varioskan Flash device (Thermo Scientific, Germany) at 560 nm. The amount of CAO27 residues per one BChE molecule was calculated as the ratio of the molar concentration of CAO27 in the sample to the molar concentration of BChE under the assumption that the molecular weight of the BChE monomer is 82 kDa.

Соотношение белок:каламиновая кислота в среднем составляло 1:6.The ratio of protein: calamic acid averaged 1: 6.

Анализ модификаций методом масс-спектрометрии в модификации ESI-TOF (ионизация электроспреем, времяпролетное измерение). Образцы rhBChE и rhBChE-CAO24 обрабатывали α(2->3,6,8,9) нейрамидазой (N3786, Sigma, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем десиалированную rhBChE и rhBChE-CAO24 инкубировали с 5 мМ DTT в течение 1 ч при 37°C с последующей инкубацией с 12 мМ иодацетамида в течение мин в темноте. Полученные смеси разделяли на 10% ПААГ в невосстанавливающих условиях. Гели окрашивали красителемКумасси. Полосы, соответствующие десиалированной rhBChE, элюировали с геля, расщепляли трипсином и использовали для анализа методами SELDI and MS. Analysis of modifications by mass spectrometry in the ESI-TOF modification (electrospray ionization, time-of-flight measurement). Samples of rhBChE and rhBChE-CAO24 were treated with α (2-> 3,6,8,9) neuramidase (N3786, Sigma, USA) according to the manufacturer's protocol. Then, the desialized rhBChE and rhBChE-CAO24 were incubated with 5 mM DTT for 1 h at 37 ° C, followed by incubation with 12 mM iodoacetamide for min in the dark. The resulting mixture was divided into 10% PAG under non-reducing conditions. The gels were stained with Kumasi. Bands corresponding to desialized rhBChE were eluted from the gel, digested with trypsin and used for analysis by SELDI and MS.

Образцы исследовали на масс-спектрометре в режиме ESI-TOF (Bruker Daltonics Inc). Пептиды идентифицировали в следующих условиях: фиксированная модификация - Карбамидометил (С); вариабельные модификации - Окисление (М), Ацетил (N-конец), пиро-Glu (N-конец Q), Деамидирование (N,Q); значения массы - моноизотоп; допуск масс пептидов - 10 ppm; максимальные пропущенные расщепления - 2. Расчеты производили с использованием программного обеспечения GPMaw (Lighthouse data, Дания).Samples were examined on an ESI-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics Inc). Peptides were identified under the following conditions: fixed modification - Urea (C); variable modifications - Oxidation (M), Acetyl (N-terminus), pyro-Glu (N-terminus Q), Deamidation (N, Q); mass values - monoisotope; the tolerance of the mass of peptides is 10 ppm; maximum missed cleavages - 2. Calculations were performed using the GPMaw software (Lighthouse data, Denmark).

Неденатирирующий гель-электрофорез. Относительное количество тетрамеров, димеров и мономеров оценивали на активно-окрашенных неденатурирующих полиакриламидных гелях. От 4% до 30% полиакриламидные гели готовили вручную. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 120 В в течение 15 ч при 4°C. Гели окрашивали 2 мМ бутирилтиохолином (субстрат) по методу Karnovsky и Roots (KARNOVSKY, М.J. & ROOTS, L.A "DIRECT-COLORING" THIOCHOLINE METHOD FOR CHOLINESTERASES. J Histochem Cytochem 12, 219-221 (1964)) в течение 1 ч. Интенсивность полос определяли с использованием системы Bio-Rad, США. (см. Фиг. 5-7) Non-denaturing gel electrophoresis. The relative amounts of tetramers, dimers, and monomers were evaluated on active-stained non-denaturing polyacrylamide gels. From 4% to 30% polyacrylamide gels were prepared manually. Electrophoresis was carried out at a constant voltage of 120 V for 15 hours at 4 ° C. The gels were stained with 2 mM butyrylthiocholine (substrate) according to the method of Karnovsky and Roots (KARNOVSKY, M.J. & ROOTS, LA "DIRECT-COLORING" THIOCHOLINE METHOD FOR CHOLINESTERASES. J Histochem Cytochem 12, 219-221 (1964)) The intensity of the bands was determined using the Bio-Rad system, USA. (see Fig. 5-7)

Эксперименты In vivo. Эти исследования были проведены в Институте Биоорганической Химии Российской Академии Наук, в лаборатории биологического тестирования (Пущино, Россия). Самцы мышей Balb/C массой 25-30 были получены из вивария Института Биоорганической Химии. Мышам (n=10) вводили rhBChE и конъюгат rhBChE-CA027 в дозе 100 ед/мышь путем быстрой внутривенной инъекции. После введения фермента брали по 10 мкл крови из глазного синуса через различные промежутки времени в течение 5 дней. Образцы крови разбавляли 50х в ФБР для определения общей активности BChE в крови. Среднее время удержания, выведения и распределение времен полужизни, стаж и AUC рассчитывали по зависимости от времени концентрации BChE в крови с использованием двухкомпартментной фармакодинамической модели. Все расчеты осуществляли с использованием программного обеспечения KaleidaGraph (Synergy Software, США). In vivo experiments . These studies were carried out at the Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences, in the biological testing laboratory (Pushchino, Russia). Male Balb / C mice weighing 25-30 were obtained from the vivarium of the Institute of Bioorganic Chemistry. Mice (n = 10) were injected with rhBChE and rhBChE-CA027 conjugate at a dose of 100 u / mouse by rapid intravenous injection. After administration of the enzyme, 10 μl of blood was taken from the ophthalmic sinus at various intervals for 5 days. Blood samples were diluted 50x in the FBI to determine the total activity of BChE in the blood. The mean retention, elimination, and distribution of half-lives, length of service, and AUC were calculated as a function of time of BChE concentration in the blood using a two-compartment pharmacodynamic model. All calculations were carried out using KaleidaGraph software (Synergy Software, USA).

Определение эффективности rhBChE-CA027 против воздействия VR. Защитную эффективность полисиалированной rhBChE оценивали с использованием самцов мышей SPF, которым вводили 21,05 мг/кг (400 ед) фермента внутривенно, после чего через 30 минут их обрабатывали VR. Дозы VR варьировали от нелетальных до абсолютно летальных (LD100), чтобы точно определить защитную эффективность. Каждому животному вводили VR путем внутримышечной инъекции (в мышцу gluteus maximus) в виде водного раствора в объеме 50-100 мл. За животными наблюдали в течение 5 дней после обработки VR и регистрировали выживаемость через 30 мин после обработки. Результаты рассчитывали методом Личфилда и Уилкоксона с использованием программного обеспечения Biostat (AnalystSoft, США). Determination of the effectiveness of rhBChE-CA027 against exposure to VR. The protective efficacy of polysialized rhBChE was evaluated using male SPF mice that were injected with 21.05 mg / kg (400 units) of the enzyme intravenously, after which they were treated with VR after 30 minutes. Doses of VR ranged from non-lethal to completely lethal (LD100) to accurately determine protective efficacy. VR was administered to each animal by intramuscular injection (into gluteus maximus muscle) in the form of an aqueous solution in a volume of 50-100 ml. Animals were observed for 5 days after VR treatment and survival was recorded 30 minutes after treatment. The results were calculated by the Lichfield and Wilcoxon method using Biostat software (AnalystSoft, USA).

Исследование поведения и физической выносливости животных. Исследование поведения и физической выносливости животных проводили в Государственном исследовательском Институте Органической Химии и Технологии (Москва, Россия). Открытое поле включало камеру размером 50×30 см с черным акрилатным полом, размеченным на 40 квадратов. Также на полу было 28 отверстий для выглядывания диаметром 2 см. Животных помещали в центр открытого поля и в течение 3 минут подсчитывали следующие события: (i) число пересечений линий, характеризующее горизонтальную активность, (ii) число вставаний, характеризующее вертикальную активность, и (iii) число осмотра отверстий, характеризующее исследовательскую активность. Все эти параметры исследовали перед введением фермента, после введения фермента и после обработки VR. Тест на физическую активность состоял из 30 минут на беговой дорожке. Результаты рассчитывали с использованием программного обеспечения Statistics (StatSoft Inc., США). Результаты показаны на Фиг. 13. The study of the behavior and physical endurance of animals . The study of the behavior and physical endurance of animals was carried out at the State Research Institute of Organic Chemistry and Technology (Moscow, Russia). The open field included a camera measuring 50 × 30 cm with a black acrylate floor, spaced 40 squares. Also on the floor there were 28 peep holes with a diameter of 2 cm. The animals were placed in the center of an open field and the following events were counted for 3 minutes: (i) the number of intersections of lines characterizing horizontal activity, (ii) the number of risings characterizing vertical activity, and ( iii) the number of inspection holes characterizing research activity. All these parameters were investigated before the introduction of the enzyme, after the introduction of the enzyme and after treatment with VR. A physical activity test consisted of 30 minutes on a treadmill. Results were calculated using Statistics software (StatSoft Inc., USA). The results are shown in FIG. 13.

Claims

1. A method of obtaining a conjugate of recombinant human butyrylcholinesterase and oxidized calamic acid with an average molecular weight of 27 kDa, comprising the steps of:

- culturing CHO cells transformed with an expression vector containing a human butyrylcholinesterase gene with a polyadenylation site under the control of the eukaryotic promoter and a selection marker gene and an expression vector containing a PRAD gene with a polyadenylation site under the control of a human elongation factor (EF) promoter and a selection marker gene, protein-free culture medium;

- purification of the obtained recombinant human butyrylcholinesterase sequentially by ultrafiltration, affinity chromatography, anion exchange chromatography and diafiltration; and

- chemical sialylation of purified recombinant human butyrylcholinesterase at pH 6.0-7.0, ratio [oxidized calamic acid with an average molecular weight of 27 kDa] / [recombinant human butyrylcholinesterase] from 20 to 100 in the presence of cyanoborohydride.

2. The method according to p. 1, characterized in that the eukaryotic promoters are selected from SV40 / FerH / mEF1, hEF1-HTLV, hFerL and hFerH.

3. The method according to p. 1, characterized in that the vector containing the human butyrylcholinesterase gene further comprises non-promoter expression and / or MAR / SAR sequence regulators.

4. The method according to p. 3, characterized in that the non-promoter expression regulator is an enhancer.

5. The method of claim 4, wherein the enhancer is a mouse CMV enhancer.

6. The method according to p. 3, characterized in that the MAR sequence is the MAR sequence of the human β-interferon gene.

7. The method according to any one of paragraphs. 1-6, characterized in that the chemical sialylation is carried out at a temperature of approximately + 25 ° C.

8. The method according to any one of paragraphs. 1-6, characterized in that the concentration of cyanoborohydride is from 2.5 to 4 mg / ml

9. The method according to any one of paragraphs. 1-6, characterized in that the concentration of cyanoborohydride is 3.16 mg / ml

10. The conjugate of recombinant human butyrylcholinesterase and oxidized calamic acid with an average molecular weight of 27 kDa for the treatment, prevention, suppression or reduction of toxic effects of organophosphorus compounds obtained by the method according to any one of claims. 1-9.

11. A pharmaceutical composition for treating, preventing, suppressing or reducing the toxic effects of organophosphorus compounds, comprising the conjugate of claim 10 in an effective amount and a pharmaceutically acceptable carrier.

12. A method of treating, preventing, suppressing or reducing the toxic effects of organophosphorus compounds in an animal, comprising administering to said animal a conjugate according to claim 10 or a composition according to claim 11.

13. The method according to p. 12, characterized in that the animal is a human being.

14. The method according to p. 12 or 13, characterized in that the introduction of the conjugate according to p. 10 or the composition according to p. 11 is carried out before the animal contacts the organophosphorus compound.