RU2645089C1 - Method of dna extraction, suitable for conducting quantitative real-time pcr, from dry blood spots of newborns - Google Patents
Method of dna extraction, suitable for conducting quantitative real-time pcr, from dry blood spots of newborns Download PDFInfo
- Publication number
- RU2645089C1 RU2645089C1 RU2017100186A RU2017100186A RU2645089C1 RU 2645089 C1 RU2645089 C1 RU 2645089C1 RU 2017100186 A RU2017100186 A RU 2017100186A RU 2017100186 A RU2017100186 A RU 2017100186A RU 2645089 C1 RU2645089 C1 RU 2645089C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- blood
- newborns
- trec
- krec
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/113—Real time assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D21H27/00—Special paper not otherwise provided for, e.g. made by multi-step processes
- D21H27/08—Filter paper
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Abstract
Description
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для получения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из сухих пятен цельной крови новорожденных, нанесенных на фильтровальную карточку для неонатального скрининга, и ее дальнейшего исследования методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).The invention relates to biology and medicine and can be used to obtain deoxyribonucleic acid (DNA) from dry spots of whole blood of newborns deposited on a filter card for neonatal screening, and its further study by the method of quantitative polymerase chain reaction in real time (PCR-RV).
Существующие на сегодня наборы для экстракции ДНК из сухого пятна крови (например, «Экстра-ДНК-Био» №400-20 (Алькор Био, Россия), «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия)) [1, 2] позволяют добиться выделения качественной ДНК, пригодной для ее дальнейшего исследования молекулярно-генетическими методами: аллель-специфичной ПЦР, методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и прямого секвенирования по Сэнгеру. Однако в инструкции к перечисленным наборам не указано рекомендуемое количество биологического материала (сухих пятен крови), которое необходимо взять в работу для получения ДНК требуемого качества. Между тем, проблема использования сухих пятен крови новорожденных для выделения ДНК состоит именно в наличии ограниченного количества исходного биологического материала, особенно при ретроспективном исследовании для верификации диагноза у детей с летальными исходами, когда биологический материал не может быть взят повторно.Currently available kits for extracting DNA from a dry blood stain (for example, Extra-DNA-Bio No. 400-20 (Alkor Bio, Russia), AmpliPrim DNA-sorb-V (LLC NextBio, Russia) [ 1, 2] make it possible to achieve the isolation of high-quality DNA suitable for its further study by molecular genetic methods: allele-specific PCR, restriction fragment length polymorphism (RFLP), and direct Sanger sequencing. However, the instructions for the listed sets do not indicate the recommended amount of biological material (dry blood stains), which must be taken into work to obtain DNA of the required quality. Meanwhile, the problem of using dry blood stains of newborns for DNA isolation consists precisely in the presence of a limited amount of initial biological material, especially in a retrospective study to verify the diagnosis in children with fatal outcomes, when biological material cannot be taken again.
Кроме того, метод количественной ПЦР в реальном времени предусматривает особые требования к исследуемым образцам. В частности, требуется брать одинаковый объем цельной крови для выделения ДНК у всех образцов, поскольку происходит сравнение количества продукта ПЦР, образующегося при амплификации исследуемого локуса, с количеством продукта ПЦР контрольного локуса и определяются их количественные соотношения в геноме. Такое условие не представляет сложности при работе с образцами жидкой цельной крови. Однако при выделении ДНК из пятен сухой крови на фильтровальной карточке практически невозможно определить точный объем взятого количества крови, если не указан размер пятна, взятого в исследование.In addition, the real-time quantitative PCR method provides for specific requirements for the test samples. In particular, it is required to take the same volume of whole blood to isolate DNA from all samples, since the amount of PCR product formed during amplification of the studied locus is compared with the amount of PCR product of the control locus and their quantitative ratios in the genome are determined. This condition is not difficult when working with samples of liquid whole blood. However, when DNA is extracted from stains of dry blood on a filter card, it is practically impossible to determine the exact volume of the taken amount of blood unless the size of the spot taken in the study is indicated.
Технология неонатального скрининга предусматривает процедуру выбивания дисков стандартного размера 3,2 мм из пятен крови с помощью автоматического оборудования типа DBS Puncher Instrument (PerkinElmer, Finland) или ручным дыроколом типа Single Hole Punch, 1/8" Hole Size (USA). Известны способы экстракции ДНК из 1 стандартного диска, выбитого из сухого пятна крови новорожденных, для проведения количественной ПЦР с целью оценки количества наивных Т-лимфоцитов, основанной на определении количества копий эксцизионных колец Т-клеточного рецептора (TREC): "MyTREC RealTime qPCR Assay Reagent Kit" (GenenPlus, USA), [3] "The EnLite™ Neonatal TREC Kit" (PerkinElmer, Finland) [4]. Однако в указанных наборах выделение ДНК не является самостоятельной методикой, а служит одним из этапов непрерывного автоматизированного процесса анализа образца. Кроме того, возможность применения данных тест-систем на российском рынке ограничена следующими документами: Приказом Минпромторга России №655 от 31 марта 2015 года «Об утверждении плана мероприятий по импортозамещению в отрасли медицинской промышленности Российской Федерации» [5] и Постановлением Правительства РФ №102 от 5 февраля 2015 г. «Об установлении ограничения допуска отдельных видов медицинских изделий, происходящих из иностранных государств, для целей осуществления закупок для обеспечения государственных и муниципальных нужд» [6].Neonatal screening technology involves the procedure of knocking out standard-sized 3.2 mm discs from blood stains using automatic equipment such as DBS Puncher Instrument (PerkinElmer, Finland) or a manual hole punch such as Single Hole Punch, 1/8 "Hole Size (USA). Extraction methods are known. DNA from 1 standard disc, knocked out of a dry spot in the blood of newborns, for quantitative PCR to assess the number of naive T-lymphocytes based on the number of copies of excision rings of the T-cell receptor (TREC): "MyTREC RealTime qPCR Assay Reagent Kit" ( Genenp lus, USA), [3] “The EnLite ™ Neonatal TREC Kit” (PerkinElmer, Finland) [4]. However, in these kits, DNA extraction is not an independent technique, but serves as one of the stages of a continuous automated sample analysis process. the possibility of using these test systems on the Russian market is limited by the following documents: Order of the Ministry of Industry and Trade of Russia No. 655 of March 31, 2015 “On approval of the import substitution action plan in the medical industry of the Russian Federation” [5] and Decree of the Government of the Russian Federation No. 102 of February 5, 2015 g. “On the establishment of access restrictions for certain types of medical devices originating from foreign countries, for the purpose of procurement to meet state and municipal needs” [6].
Таким образом, для получения корректных результатов исследований методом количественной ПЦР в реальном времени требуется стандартизация образцов сухих пятен, взятых для выделения ДНК, по объему цельной крови, нанесенной на фильтровальную бумагу. При этом должны соблюдаться следующие условия:Thus, in order to obtain correct results of studies by quantitative real-time PCR, standardization of samples of dry spots taken for DNA extraction is required by the volume of whole blood deposited on filter paper. In this case, the following conditions must be met:
- биологический материал из фильтровальной карточки должен быть взят в минимальном количестве (количество материала на карточке ограничено пятью стандартными пятнами крови для неонатального скрининга - по одному пятну на одно скринируемое заболевание);- biological material from the filter card should be taken in the minimum amount (the amount of material on the card is limited to five standard blood stains for neonatal screening - one spot per one disease to be screened);
- взятого количества должно быть достаточно для выделения качественной ДНК (качественный ДНК-продукт - условие успешного прохождения реакции амплификации);- the amount taken should be sufficient to isolate high-quality DNA (a high-quality DNA product is a condition for a successful amplification reaction);
- цифровое значение этого количества должно быть удобным для последующих расчетов (например, при исследовании ДНК на первичные иммунодефицитные состояния, требуется рассчитать количество копий маркеров Т-клеточного (TREC) и В-клеточного неогенеза (KREC) в образце крови на количество лейкоцитов в данном объеме крови с учетом внутреннего контроля).- the digital value of this amount should be convenient for subsequent calculations (for example, when examining DNA for primary immunodeficiency states, it is necessary to calculate the number of copies of T-cell markers (TREC) and B-cell neogenesis (KREC) in a blood sample per white blood cell count in a given volume blood taking into account internal control).
Прототипом для нашего способа экстракции ДНК послужил отечественный комплект реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия).The prototype for our method of DNA extraction was the domestic set of reagents for the extraction of DNA from the clinical material AmpliPrime DNA-sorb-B (LLC NextBio, Russia).
Технической задачей изобретения является уменьшение количества исходного биологического материала, взятого для исследования, удобство и простота использования данного значения для дальнейших расчетов, а также доступность метода для ПЦР-лабораторий российских ЛПУ (лечебно-профилактических учреждений)An object of the invention is to reduce the amount of initial biological material taken for research, the convenience and simplicity of using this value for further calculations, as well as the availability of the method for PCR laboratories of Russian hospitals (medical institutions)
Технический результат достигается за счет минимизации количества материала, требуемого для получения качественной ДНК (3 выбитых стандартных диска), удобства в расчетах при проведении исследования методом количественной ПЦР в реальном времени (достигается единый объем цельной крови, взятой в реакцию).The technical result is achieved by minimizing the amount of material required to obtain high-quality DNA (3 knocked out standard disks), convenience in calculations when conducting a quantitative PCR study in real time (a single volume of whole blood is taken into the reaction).
Для достижения указанного результата предлагается способ экстракции ДНК, пригодной для проведения количественной ПЦР в реальном времени, из сухих пятен крови, нанесенных на фильтровальные карточки для неонатального скрининга, характеризующийся тем, что из сухого пятна крови выбивают 3 стандартных диска диаметром 3,2 мм каждый, вносят их в центрифужную пробирку «Эппендорф» объемом 1,5 мл, заливают 150,0 мкл лизирующего буфера, тщательно встряхивают на шейкере и, после краткосрочного центрифугирования в течение 15 с, инкубируют в термостате при 65°С на протяжении 45 мин, встряхивая каждые 15 мин, затем пробирки помещают в центрифугу «Mini Spin» и центрифугируют в течение 5 мин при 12500 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в чистую пробирку, добавляют 15 мкл Сорбента из набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия) и проводят экстракцию ДНК, используя указанный набор.To achieve this result, a method for extracting DNA suitable for real-time quantitative PCR from dry blood spots applied to filter cards for neonatal screening is proposed, characterized in that 3 standard discs 3.2 mm in diameter are knocked out of a dry blood spot, place them in an Eppendorf centrifuge tube with a volume of 1.5 ml, fill in 150.0 μl of lysis buffer, shake thoroughly on a shaker and, after short-term centrifugation for 15 s, incubate in an incubator 65 ° C for 45 min, shaking every 15 minutes then placed in a centrifuge tube «Mini Spin» and centrifuged for 5 min at 12,500 rev / min. The supernatant is transferred to a clean tube, 15 μl of Sorbent from the AmpliPrim DNA-sorb-B kit (NextBio LLC, Russia) are added and DNA extraction is performed using the kit.
Предлагаемый способ выделения ДНК из сухих пятен крови для проведения количественной ПЦР может быть также реализован на базе существующих вариантов методики выделения геномной ДНК из любого биологического материала следующей последовательностью действий.The proposed method for the isolation of DNA from dry blood stains for quantitative PCR can also be implemented on the basis of existing methods for the isolation of genomic DNA from any biological material by the following sequence of actions.
В реакцию выделения ДНК берут 3 диска, выбитых из сухого пятна крови на фильтровальной карточке ручным дыроколом. Указанные диски (3 шт. от каждого образца) помещают в пробирки типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл, заливают 150 мкл лизирующего буфера, тщательно встряхивают на шейкере и после краткосрочного центрифугирования в течение 15 с инкубируют в термостате при 65°С на протяжении 45 мин, встряхивая на шейкере каждые 15 мин. Для исключения контаминации соседних образцов область ножа пробойника после каждого образца обрабатывают 70% раствором этанола и обжигают в пламени горелки. По окончании инкубации пробирки помещают в центрифугу «Mini Spin» (Eppendorf, USA) и центрифугируют в течение 5 мин при 12500 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в чистую пробирку и добавляют 15 мкл сорбента, входящего в состав набора. Дальнейшая процедура экстракции не отличается от инструкции фирмы-производителя. С целью концентрирования образца ввиду малого количества материала ДНК элюируют в 50 мкл ТЕ-буфера. Хранение образцов ДНК производится при -30°С без удаления сорбента.In the reaction of DNA extraction take 3 disc, knocked out of a dry spot of blood on the filter card with a manual hole punch. The indicated disks (3 pcs from each sample) were placed in 1.5 ml Eppendorf tubes, filled with 150 μl of lysis buffer, shaken thoroughly on a shaker and, after short-term centrifugation for 15 s, incubated in a thermostat at 65 ° C for 45 min, shaking on a shaker every 15 min. To exclude contamination of neighboring samples, the area of the punch knife after each sample is treated with a 70% ethanol solution and burned in a burner flame. At the end of the incubation, the tubes are placed in a Mini Spin centrifuge (Eppendorf, USA) and centrifuged for 5 minutes at 12,500 rpm. The supernatant is transferred to a clean tube and 15 μl of the sorbent included in the kit is added. The further extraction procedure does not differ from the manufacturer's instructions. In order to concentrate the sample, due to the small amount of material, DNA is eluted in 50 μl of TE buffer. DNA samples are stored at -30 ° C without removing the sorbent.
Экспериментальным путем подтверждено, что данный объем крови (3 диска) отвечает вышеуказанным требованиям: концентрация полученных растворов ДНК составляет 10-30 нг/мкл; отношение поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм (коэффициент А260/А280) находится в пределах 1,7-1,9, что свидетельствует о высокой чистоте препаратов. Измерение концентрации ДНК и степени ее чистоты определялись спектрофотометрическим методом с использованием NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA).It has been experimentally confirmed that this volume of blood (3 discs) meets the above requirements: the concentration of the obtained DNA solutions is 10-30 ng / μl; the absorption ratio at wavelengths of 260 nm and 280 nm (coefficient A 260 / A 280 ) is in the range of 1.7-1.9, indicating a high purity of the preparations. Measurement of DNA concentration and its purity was determined spectrophotometrically using NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA).
Пример 1. Определение нормативных значений TREC и KREC в группе условно здоровых новорожденныхExample 1. Determination of normative values of TREC and KREC in the group of conditionally healthy newborns
Образцы ДНК, полученной описанным выше методом, мы использовали для диагностики состояния иммунной системы новорожденных на основе оценки количества наивных Т- и В-клеток, суррогатными маркерами которых являются кольцевые молекулы ДНК TREC и KREC. Работа выполнена с помощью мультиплексной тест-системы "TREC&KREC", разработанной в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии Наук (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск) и Новосибирского государственного исследовательского университета (Новосибирск) совместно с ГБУЗ «Детская городская клиническая больница №9 (ДГКБ №9) им. Г.Н. Сперанского (Москва) [8].We used DNA samples obtained by the method described above to diagnose the state of the immune system of newborns based on an estimate of the number of naive T and B cells whose surrogate markers are the circular DNA molecules TREC and KREC. This work was carried out using the TREC & KREC multiplex test system developed at the Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences (Institute of Chemical Biophysics and Mathematics SB RAS, Novosibirsk) and the Novosibirsk State Research University (Novosibirsk) together with the Children's City Clinical Hospital No. 9 (DGKB No. 9) them. G.N. Speransky (Moscow) [8].
Согласно заявленной тест-системе, абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК определяется с помощью калибровочных кривых. Поскольку концентрации TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в калибровочных кривых выражены в копиях молекул на миллилитр, то и количество данных маркеров для каждого исследуемого образца, определяемое в течение реакции, выражается в тех же единицах - копиях на миллилитр. Учитывая количество взятого в реакцию объема раствора ДНК, можно получить размерность маркеров в копиях на реакцию. Однако для клинициста-иммунолога гораздо важнее знать не абсолютное количество TREC и KREC на один миллилитр цельной крови пациента или на одну абстрактную реакцию, а долю наивных Т- и В-клеток (суррогатными маркерами которых и являются TREC и KREC соответственно) среди всех клеток лейкоцитарного ряда. Таким образом, зная количество ядросодержащих клеток в единице объема цельной крови, взятой в реакцию выделения ДНК, можно легко пересчитать количество TREC (KREC) на количество лейкоцитов.According to the claimed test system, the absolute number of TREC, KREC molecules and the normalization locus of IL17RA in the analyzed DNA sample is determined using calibration curves. Since the concentrations of TREC, KREC, and the normalization locus IL17RA in the calibration curves are expressed in copies of molecules per milliliter, the amount of these markers for each test sample, determined during the reaction, is expressed in the same units — copies per milliliter. Given the amount of the volume of the DNA solution taken into the reaction, it is possible to obtain the dimension of the markers in copies per reaction. However, it is much more important for a clinician-immunologist to know not the absolute amount of TREC and KREC per milliliter of the patient’s whole blood or one abstract reaction, but the proportion of naive T and B cells (which surrogate markers are TREC and KREC, respectively) among all leukocyte cells row. Thus, knowing the number of nucleated cells per unit volume of whole blood taken in the DNA extraction reaction, one can easily recalculate the number of TREC (KREC) per the number of leukocytes.
При исследовании ДНК, выделенной из цельной крови, количество копий TREC(KREC) в образце рассчитывают на 105 лейкоцитов с учетом внутреннего контроля, осуществляемого нормировочным локусом IL17RA, по формуле [9]:In the study of DNA isolated from whole blood, the number of copies of TREC (KREC) in the sample is calculated on 10 5 leukocytes, taking into account the internal control carried out by the normalizing IL17RA locus, according to the formula [9]:
Количество TREC(KREC)=(количество копий TREC(KREC) в 1 мл / количество копий IL17RA в 1 мл)⋅200000.Number of TREC (KREC) = (number of copies of TREC (KREC) in 1 ml / number of copies of IL17RA in 1 ml) ⋅ 200000.
Данная формула учитывает количество ядросодержащих клеток в образце крови, взятой для выделения ДНК (100 мкл): 1 мл крови содержит примерно 106 лейкоцитов, следовательно, в 0,1 мл их 105, к тому же, количество клеток в 2 раза меньше копий IL17RA (в связи с диплоидным набором хромосом у человека).This formula takes into account the number of nucleated cells in a blood sample taken to isolate DNA (100 μl): 1 ml of blood contains about 10 6 leukocytes, therefore, 0.1 ml of them have 10 5 , in addition, the number of cells is 2 times less than copies IL17RA (due to the diploid set of chromosomes in humans).
При исследовании ДНК, выделенной из сухих пятен крови, разработанным нами способом количество копий TREC(KREC) в образце рассчитывают на 104 лейкоцитов с учетом внутреннего контроля IL17RA:When examining DNA isolated from dry blood stains using our developed method, the number of copies of TREC (KREC) in the sample is calculated on 10 4 leukocytes taking into account the internal control of IL17RA:
Количество TREC(KREC) = (количество копий TREC(KREC) в 1 мл / количество копий IL17RA в 1 мл)⋅20000.Number of TREC (KREC) = (number of copies of TREC (KREC) in 1 ml / number of copies of IL17RA in 1 ml) ⋅ 20000.
Данная формула также учитывает количество ядросодержащих клеток в образце крови: количество клеток в 2 раза меньше копий IL17RA, а объем материала для выделения ДНК (3×3,2 мкл=9,6~10 мкл (0,01 мл) цельной крови [10]). С учетом объема реакции и в пересчете на лейкоциты числитель равен 2⋅104 (20 000).This formula also takes into account the number of nucleated cells in a blood sample: the number of cells is 2 times less than copies of IL17RA, and the volume of material for DNA isolation (3 × 3.2 μl = 9.6 ~ 10 μl (0.01 ml) of whole blood [10 ]). Considering the volume of the reaction and in terms of leukocytes, the numerator is 2 × 10 4 (20 000).
В ходе исследования было выполнено количественное определение копий TREC, KREC и гена рецептора интерлейкина 17 - IL17RA - (в качестве внутреннего контроля взятия материала) в лимфоцитах 52 условно-здоровых новорожденных (26 девочек и 26 мальчиков). По результатам исследования количество фрагмента контрольного гена IL17RA составило 9,0⋅105-7,0⋅107 копий на мл цельной крови, что соответствует валидному уровню данного нормировочного локуса, заявленного в инструкции производителя (более 5,0⋅104 копий на мл цельной крови) [9]. Количественные значения уровней TREC и KREC, рассчитанные по вышеуказанной формуле, представлены в таблице 1.In the course of the study, quantitative determination of copies of TREC, KREC, and the interleukin 17 receptor gene, IL17RA, was performed (as an internal control of material collection) in lymphocytes of 52 conditionally healthy newborns (26 girls and 26 boys). According to the results of the study, the number of fragments of the control IL17RA gene was 9.0 × 10 5 -7.0 × 10 7 copies per ml of whole blood, which corresponds to the valid level of this normalization locus stated in the manufacturer's instructions (more than 5.0 × 10 4 copies per ml of whole blood) [9]. Quantitative values of the levels of TREC and KREC, calculated by the above formula, are presented in table 1.
Данные количественные значения TREC и KREC, впервые полученные в Российской Федерации в образцах ДНК, выделенной из сухих пятен крови новорожденных, использовались нами в дальнейшем как нормативные значения.These quantitative values of TREC and KREC, first obtained in the Russian Federation in samples of DNA isolated from dry blood stains of newborns, were used by us in the future as standard values.
Пример 2. Клинический случай. Ретроспективное количественное определение уровней TREC и KREC у ребенка с Х-сцепленной агаммаглобулинемиейExample 2. Clinical case. Retrospective quantification of TREC and KREC levels in a child with X-linked agammaglobulinemia
Мальчик П., ребенок от II беременности (I - девочка, здорова), роды в срок. Масса при рождении - 3390 г, рост 53 см. Привит БЦЖ, гепатит В. Грудное вскармливание до 3-х месяцев.Boy P., child from II pregnancy (I - girl, healthy), delivery on time. Weight at birth - 3390 g, height 53 cm. BCG, hepatitis B vaccinated. Breastfeeding up to 3 months.
Анамнез заболевания: в 3,5 мес - респираторная вирусная инфекция, экссудативный отит, в 4 мес - серозный менингит, в 5 мес - острая вирусная инфекция - ларинготрахеит, серозный менингит.Disease history: at 3.5 months - respiratory viral infection, exudative otitis media, at 4 months - serous meningitis, at 5 months - acute viral infection - laryngotracheitis, serous meningitis.
Уровень иммуноглобулинов в периферической крови в возрасте 4-х месяцев: IgА - 0.05 г/л, IgМ - 0,2 г/л, IgG - 0,75 г/л.The level of immunoglobulins in peripheral blood at the age of 4 months: IgA - 0.05 g / l, IgM - 0.2 g / l, IgG - 0.75 g / l.
На основании клинических и лабораторных данных мальчику П. в возрасте 6-ти месяцев был поставлен диагноз - «Первичный иммунодефицит, агаммаглобулинемия с дефицитом В-клеток».On the basis of clinical and laboratory data, a boy P., aged 6 months, was diagnosed with “Primary immunodeficiency, agammaglobulinemia with B-cell deficiency”.
Из архива лаборатории неонатального скрининга была извлечена фильтровальная карточка с сухими пятнами крови П., взятой на 4-е сутки жизни ребенка. Ретроспективное исследование количества копий кольцевых участков ДНК Т-клеточного и В-клеточного рецепторов лимфоцитов (TREC и KREC) в образце ДНК, полученном разработанным нами способом, показало полное отсутствие KREC в генетическом материале (0,0 копий/104L) при нормальном количестве копий TREC (280,2 копий/104L). Это явилось косвенным подтверждением наличия генетической причины дефекта В-клеточного компонента иммунной системы ребенка.A filter card with dry blood stains of P. taken on the 4th day of a child’s life was extracted from the archive of the neonatal screening laboratory. A retrospective study of the number of copies of the circular sections of DNA of T-cell and B-cell lymphocyte receptors (TREC and KREC) in the DNA sample obtained by our developed method showed the complete absence of KREC in the genetic material (0.0 copies / 10 4 L) with a normal amount copies of TREC (280.2 copies / 10 4 L). This was an indirect confirmation of the presence of a genetic cause of a defect in the B-cell component of the child’s immune system.
В дальнейшем, при секвенировании кодирующей части гена ВТК во втором экзоне гена была обнаружена делеция 13 нуклеотидов c.64-76del13 (delCCTCTAAACTTCA, p.P22fsX28), приводящая к сдвигу рамки считывания и преждевременной остановке синтеза тирозинкиназы.Subsequently, upon sequencing of the coding part of the BTK gene, a deletion of 13 nucleotides c.64-76del13 (delCCTCTAAACTTCA, p.P22fsX28) was detected in the second exon of the gene, leading to a shift in the reading frame and premature termination of tyrosine kinase synthesis.
В представленном клиническом случае своевременное тестирование ДНК, выделенной описываемым способом из сухого пятна крови новорожденного П., на KREC могло предупредить развитие тяжелых инфекций у мальчика в первые месяцы жизни и значительно сократить время до постановки правильного диагноза.In the presented clinical case, timely testing of the DNA isolated by the described method from the dry blood spot of a newborn P. for KREC could prevent the development of serious infections in the boy in the first months of life and significantly reduce the time to make the correct diagnosis.
Источники информацииInformation sources
1. Инструкция по применению комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «Экстра-ДНК-Био» №400-20 (РУ № ФСР 2012/13631 от 29.06.2012).1. Instructions for use of the kit of reagents for the extraction of DNA from the clinical material Extra-DNA-Bio No. 400-20 (RU No. ФСР 2012/13631 dated 06/29/2012).
2. Инструкция по применению комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (РУ № ФСР 2012/14019 от 30.10.2012).2. Instructions for use of the kit of reagents for the extraction of DNA from the clinical material “AmpliPrime DNA-sorb-B” (RU No. ФСР 2012/14019 from 10.30.2012).
3. Sreelatha Reddy. My TREC RealTime qPCR Assay Reagent Kit for Quantification of Human T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) // J Clin Epigenet. - 2015. - Vol. 1. - No. 1-4.3. Sreelatha Reddy. My TREC RealTime qPCR Assay Reagent Kit for Quantification of Human T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) // J Clin Epigenet. - 2015. - Vol. 1. - No. 1-4.
4. The EnLite™ Neonatal TREC Kit. URL: http://newbornscreening.perkinelmer.com/products/enlite_neonatal_tree_instrument/enlite_neonatal_trec_kit (дата доступа 02.12.2016).4. The EnLite ™ Neonatal TREC Kit. URL: http://newbornscreening.perkinelmer.com/products/enlite_neonatal_tree_instrument/enlite_neonatal_trec_kit (access date 12/02/2016).
5. Приказ Минпромторга России №655 от 31 марта 2015 года «Об утверждении плана мероприятий по импортозамещению в отрасли медицинской промышленности Российской Федерации» URL: http://minpromtorg.gov.ru/docs/#!prikaz_655_ot_31_marta_2015_goda (дата доступа 02.12.2016).5. Order of the Ministry of Industry and Trade of Russia No. 655 of March 31, 2015 “On approval of the import substitution action plan in the medical industry of the Russian Federation” URL: http://minpromtorg.gov.ru/docs/#!prikaz_655_ot_31_marta_2015_goda (access date 12/02/2016) .
6. Постановление Правительства РФ №102 от 5 февраля 2015 г. «Об установлении ограничения допуска отдельных видов медицинских изделий, происходящих из иностранных государств, для целей осуществления закупок для обеспечения государственных и муниципальных нужд». URL: http://pravo.gov.ru/proxy/ips/?docbody=&nd=102367173 (дата доступа 02.12.2016).6. Decree of the Government of the Russian Federation No. 102 of February 5, 2015 “On the establishment of access restrictions for certain types of medical devices originating from foreign countries, for the purpose of procurement to meet state and municipal needs”. URL: http://pravo.gov.ru/proxy/ips/?docbody=&nd=102367173 (access date 12/02/2016).
7. Jacalyn L. Gerstel-Thompson, Jonathan F. Wilkey, Jennifer C. Baptiste, Jennifer S. Navas, Sung-Yun Pai, Kenneth A. Pass, Roger B. Eaton, Anne Marie Comeau. High-Throughput Multiplexed T-Cell-Receptor Excision Circle Quantitative PCR Assay with Internal Controls for Detection of Severe Combined Immunodeficiency in Population-Based Newborn Screening // Clinical Chemistry. - 2010. - 56:9. - P. 1466-1474.7. Jacalyn L. Gerstel-Thompson, Jonathan F. Wilkey, Jennifer C. Baptiste, Jennifer S. Navas, Sung-Yun Pai, Kenneth A. Pass, Roger B. Eaton, Anne Marie Comeau. High-Throughput Multiplexed T-Cell-Receptor Excision Circle Quantitative PCR Assay with Internal Controls for Detection of Severe Combined Immunodeficiency in Population-Based Newborn Screening // Clinical Chemistry. - 2010 .-- 56: 9. - P. 1466-1474.
8. Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки ДНК молекул TREC, KREC и количества геном-эквивалентов ДНК (патент Российской Федерации №2587540 от 20.06.2016).8. A method for diagnosing the state of the patient’s immune system and a set of primers, probes and standard samples for the quantitative assessment of the DNA of TREC, KREC molecules and the number of DNA equivalent genomes (patent of the Russian Federation No. 2587540 dated 06/20/2016).
9. Инструкция по применению набора реагентов для количественного определения молекул ДНК TREC и KREC в цельной крови и сухих пятнах крови методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.9. Instructions for the use of a reagent kit for the quantitative determination of TREC and KREC DNA molecules in whole blood and dry blood stains by polymerase chain reaction with hybridization-fluorescence detection in real time.
10. Wood S., Neudert L., Meunier L., Struwe P. Assesment of factors influencing method precision in a human dried blood spot assay for the determination of a novel analyte // Poster Presentation at the dried blood spot sampling in the pharmaceutical industry meeting. Philadelphia, May 3-4, 2011.10. Wood S., Neudert L., Meunier L., Struwe P. Assesment of factors influencing method precision in a human dried blood spot assay for the determination of a novel analyte // Poster Presentation at the dried blood spot sampling in the pharmaceutical industry meeting. Philadelphia, May 3-4, 2011.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017100186A RU2645089C1 (en) | 2017-01-09 | 2017-01-09 | Method of dna extraction, suitable for conducting quantitative real-time pcr, from dry blood spots of newborns |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017100186A RU2645089C1 (en) | 2017-01-09 | 2017-01-09 | Method of dna extraction, suitable for conducting quantitative real-time pcr, from dry blood spots of newborns |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2645089C1 true RU2645089C1 (en) | 2018-02-15 |
Family
ID=61227123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017100186A RU2645089C1 (en) | 2017-01-09 | 2017-01-09 | Method of dna extraction, suitable for conducting quantitative real-time pcr, from dry blood spots of newborns |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2645089C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111197072A (en) * | 2018-11-19 | 2020-05-26 | 深圳华大生命科学研究院 | Rapid extraction method of DNA and application of rapid extraction method in detection of low-frequency chimeric gene |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587540C1 (en) * | 2015-08-06 | 2016-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АБВ-ТЕСТ" | Method of diagnosing condition of immune system of patient and set of primers, probes and standard samples for quantitative estimation of dna molecules trec, krec and number of genome equivalents of dna |
-
2017
- 2017-01-09 RU RU2017100186A patent/RU2645089C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2587540C1 (en) * | 2015-08-06 | 2016-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "АБВ-ТЕСТ" | Method of diagnosing condition of immune system of patient and set of primers, probes and standard samples for quantitative estimation of dna molecules trec, krec and number of genome equivalents of dna |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BAKER M.W. et al. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009 Sep; 124(3): 522-527. Epub 2009 May 31. * |
| BAKER M.W. et al. Development of a routine newborn screening protocol for severe combined immunodeficiency. J Allergy Clin Immunol. 2009 Sep; 124(3): 522-527. Epub 2009 May 31. BORTE S. et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 2012 Mar 15; 119(11): 2552-2555. Epub 2011 Nov 30. Инструкция по применению комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "АмплиПрайм ДНК-сорб-В". ООО "НекстБио". 2012; 9 с. * |
| BORTE S. et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 2012 Mar 15; 119(11): 2552-2555. Epub 2011 Nov 30. Инструкция по применению комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала "АмплиПрайм ДНК-сорб-В". ООО "НекстБио". 2012; 9 с. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111197072A (en) * | 2018-11-19 | 2020-05-26 | 深圳华大生命科学研究院 | Rapid extraction method of DNA and application of rapid extraction method in detection of low-frequency chimeric gene |
| CN111197072B (en) * | 2018-11-19 | 2023-09-19 | 深圳华大生命科学研究院 | Rapid extraction method of DNA and application of rapid extraction method in detection of low-frequency chimeric gene |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cavalli et al. | Comparative analysis between RQ‐PCR and digital droplet PCR of BCL 2/IGH gene rearrangement in the peripheral blood and bone marrow of early stage follicular lymphoma | |
| RU2766004C1 (en) | Method for assessing normal state of immune repertoire and its application | |
| Kwok et al. | Establishing simultaneous T cell receptor excision circles (TREC) and K-deleting recombination excision circles (KREC) quantification assays and laboratory reference intervals in healthy individuals of different age groups in Hong Kong | |
| WO2009151628A2 (en) | Monitoring tcr-b to determine hiv therapy and disease progression | |
| Fox-Fisher et al. | Remote immune processes revealed by immune-derived circulating cell-free DNA | |
| Hansen et al. | A decade with whole exome sequencing in haematology | |
| CN104313698A (en) | DNA (Deoxyribonucleic Acid) library for detecting cholestatic jaundice pathogenic genes and application thereof | |
| Guan et al. | Assessment of cell cycle regulators in human peripheral blood cells as markers of cellular senescence | |
| Adamek et al. | A fast and simple method for detecting and quantifying donor-derived cell-free DNA in sera of solid organ transplant recipients as a biomarker for graft function | |
| CN106987642A (en) | Detect the kit and method of the full extron of MPL genes | |
| CN105543361A (en) | DNA library for detection and diagnosis of polycystic kidney causing genes and application thereof | |
| CN107312861A (en) | A kind of B ALL patients prognosis risk assessment label | |
| Koutsi et al. | Diagnostic molecular techniques in haematology: recent advances | |
| RU2645089C1 (en) | Method of dna extraction, suitable for conducting quantitative real-time pcr, from dry blood spots of newborns | |
| KR102150490B1 (en) | Method and Composition for Detecting Parkinson's Disease by using epigenetic marker | |
| RU2009144277A (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSTIC OF OSTEOARTHRITIS IN AN ANIMAL FAMILY | |
| Lang et al. | Comparison of manual and automated DNA purification for measuring TREC in dried blood spot (DBS) samples with qPCR | |
| JP2017531424A (en) | Hybrid multi-step nucleic acid amplification | |
| Morley et al. | Is aplastic anaemia due to abnormality of DNA? | |
| US20220148690A1 (en) | Immunorepertoire wellness assessment systems and methods | |
| JP6628178B2 (en) | Method for testing IgE-independent allergic disease | |
| Bahakeem et al. | Current diagnostic methods for hematological malignancies: a mini-review | |
| John et al. | Multiplex ligation-dependant probe amplification study of children with idiopathic mental retardation in South India | |
| Van Paemel et al. | Minimally invasive classification of pediatric solid tumors using reduced representation bisulfite sequencing of cell-free DNA: a proof-of-principle study | |
| Lim et al. | Diagnostic validation of a clinical laboratory-oriented targeted RNA sequencing system for detecting gene fusions in hematologic malignancies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200110 |