RU2641053C1 - Solid phase method for production of bioactive composite for tissue growing based on hyaluronic acid or polylactide microparticles and its copolymers, and method for manufacture of implant based on this composite - Google Patents
Solid phase method for production of bioactive composite for tissue growing based on hyaluronic acid or polylactide microparticles and its copolymers, and method for manufacture of implant based on this composite Download PDFInfo
- Publication number
- RU2641053C1 RU2641053C1 RU2016137673A RU2016137673A RU2641053C1 RU 2641053 C1 RU2641053 C1 RU 2641053C1 RU 2016137673 A RU2016137673 A RU 2016137673A RU 2016137673 A RU2016137673 A RU 2016137673A RU 2641053 C1 RU2641053 C1 RU 2641053C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polylactide
- hyaluronic acid
- salt
- copolymers
- composite
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретения относятся к области эстетической, пластической и реконструкционной косметологии/медицины, а именно к биоактивным композитам для наращивания ткани на основе гиалуроновой кислоты и микрочастиц полилактида или его сополимеров, имплантатам (наполнителям) на их основе, используемым для коррекции эстетических и возрастных изменений кожи и способам их получения.The invention relates to the field of aesthetic, plastic and reconstructive cosmetology / medicine, namely to bioactive composites for tissue growth based on hyaluronic acid and polylactide microparticles or its copolymers, implants (fillers) based on them, used to correct aesthetic and age-related skin changes and methods their receipt.
Главная цель пластических хирургов, дерматологов и фармацевтических компаний является разработка биосовместимых материалов с длительным эффектом клинического долголетия для использования их в качестве эстетических лицевых наполнителей объема мягких тканей агентами. Идеальные свойства имплантатов мягких тканей - это биосовместимость, неиммуногенность, неконцерогенность, способность придать разумный клинический внешний вид и создать длительный эффект, простота использования и минимальные тенденции мигрировать в отдаленные места организма.The main goal of plastic surgeons, dermatologists and pharmaceutical companies is to develop biocompatible materials with a long-term effect of clinical longevity for use as aesthetic facial fillers in soft tissue volume by agents. The ideal properties of soft tissue implants are biocompatibility, non-immunogenicity, non-carcinogenicity, the ability to give a reasonable clinical appearance and create a lasting effect, ease of use and minimal tendencies to migrate to distant places of the body.
В настоящее время известны имплантаты, которые можно разделить на не биоразлагаемые (постоянные) или биологические (временные). Примерами постоянных имплантатов могут служить жидкий силикон (например, Silikon®), твердые частицы кремния в виде суспензии (например, Bioplastique®), микросферы полиметилметакрилата в растворе бычьего коллагена (например, Artecoll®), частицы акрилового гидрогеля распределенного в гиалуроновой кислоте (например, Dermalive®), частицы гидроксиапатита кальция (например, Radiesse®, который ранее назывался Radiance), и различные композиции в полиакриламидном геле (например, Aquamid®). Многие из них являются наполнителями длительного срока действия, что связанно с определенным риском и иммунной реакцией на присутствие инородного тела в организме [Vargas-Machuca I, Gonzalez-Guerra Е, Angulo J, et al. 2006. Facial granulomas secondary to Dermalive microimplants: report of a case with histopathologic differential diagnosis among the granlomas secondary to different injectable permanent filler materials. Am J Dermatopathol, 28:173-7]. Временные имплантаты представляют собой микрочастицы гиалуроновой кислоты сшитой 1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром (БДДЕ) или диглицидиловым эфиром диэтиленгликоля (ДЕГ), например (Restylane®), полимолочной кислоты (например, New-Fill®), аллогенного человеческого коллагена из тканевой культуры собственного жира (например, CosmoDerm®), ксеногенного коллагена, такого как бычий коллаген (например, Zyderm®) и бычьего коллагена сшитого глутаревым альдегидом (например, Zyplast®).Currently, implants are known that can be divided into non-biodegradable (permanent) or biological (temporary) ones. Examples of permanent implants include liquid silicone (e.g., Silikon®), suspension solid silicon particles (e.g. Bioplastique®), polymethyl methacrylate microspheres in bovine collagen solution (e.g. Artecoll®), acrylic hydrogel particles dispersed in hyaluronic acid (e.g. Dermalive®), calcium hydroxyapatite particles (e.g. Radiesse®, formerly called Radiance), and various polyacrylamide gel formulations (e.g. Aquamid®). Many of them are long-acting excipients, which is associated with a certain risk and an immune response to the presence of a foreign body in the body [Vargas-Machuca I, Gonzalez-Guerra E, Angulo J, et al. 2006. Facial granulomas secondary to Dermalive microimplants: report of a case with histopathologic differential diagnosis among the granlomas secondary to different injectable permanent filler materials. Am J Dermatopathol, 28: 173-7]. Temporary implants are microparticles of hyaluronic acid crosslinked with 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDE) or diglycidyl ether of diethylene glycol (DEG), for example (Restylane®), polylactic acid (for example, New-Fill®), allogeneic human collagen from tissue-own fat (e.g. CosmoDerm®), xenogenic collagen such as bovine collagen (e.g. Zyderm®) and bovine collagen crosslinked with glutaraldehyde (e.g. Zyplast®).
До недавнего времени бычий коллаген рассматривался как ʺзолотой стандартʺ для увеличения мягких тканей лица. Тем не менее, использование бычьего коллагена связано с 3-5% риском нежелательной реакцией - гиперчувствительностью [Lowe NJ, Maxwell СA, Lowe PL, et al. 2001. Hyaluronic acid skin fillers: adverse reactions and skin testing. J Am Acad Dermatol, 45:930-3], что требует предварительного тестирования на коже до начала лечения [Narins RS, Brandt F, Leyden J, et al. 2003. A randomized, double-blind, multicenter comparison of the effi cacy and tolerability of Restylane versus Zyplast for the correction of nasolabial folds. Dermatol Surg, 29:588-95].Until recently, bovine collagen was considered as the “gold standard” for enlarging the soft tissues of the face. However, the use of bovine collagen is associated with a 3-5% risk of an adverse reaction - hypersensitivity [Lowe NJ, Maxwell CA, Lowe PL, et al. 2001. Hyaluronic acid skin fillers: adverse reactions and skin testing. J Am Acad Dermatol, 45: 930-3], which requires preliminary skin testing before treatment [Narins RS, Brandt F, Leyden J, et al. 2003. A randomized, double-blind, multicenter comparison of the effi cacy and tolerability of Restylane versus Zyplast for the correction of nasolabial folds. Dermatol Surg, 29: 588-95].
На сегодняшний день не существует универсально кожного наполнителя, хотя производители продуктов на основе гиалуроновой кислоты утверждают, что их продукция близка к идеальному заполнению ткани. Известные внутридермальные и внутритканевые имплантаты на основе гиалуроновой кислоты неживотного происхождения, сшитые химическими добавками в трехмерную структуру, и стабилизированные в растворе, на первый взгляд являются наиболее безопасными [например, патент RU 2456299 С2, 20.07.2012]. Сама молекула гиалуроновой кислоты не несет функциональной нагрузки и является инертным, биологически совместимым с тканями наполнителем. Однако, в этом случае, производители не учитывают потенциальные долгосрочные побочные эффекты, связанные с применением именно сшитой гиалуроновой кислоты. Количество сшивающего агента в имплантате должно быть минимальным, именно от него зависит частота осложнений: чем ниже его количество, тем выше качество сшитой гиалуроновой кислоты, тем ниже токсичность имплантата на ее основе.To date, there is no universally available dermal filler, although manufacturers of hyaluronic acid-based products claim that their products are close to perfect tissue filling. Known intradermal and interstitial implants based on non-animal hyaluronic acid, crosslinked with chemical additives in a three-dimensional structure, and stabilized in solution, are at first glance the safest [for example, patent RU 2456299 C2, 20.07.2012]. The hyaluronic acid molecule itself does not carry a functional load and is an inert, biologically compatible tissue filler. However, in this case, manufacturers do not take into account the potential long-term side effects associated with the use of crosslinked hyaluronic acid. The amount of crosslinking agent in the implant should be minimal, the frequency of complications depends on it: the lower its amount, the higher the quality of crosslinked hyaluronic acid, the lower the toxicity of the implant based on it.
Таким образом, важнейшим элементом практически во всех методах заместительной терапии является полимерная основа. Полимер имитирует множество внеклеточных матриц, находящихся в тканях. Внеклеточный матрикс состоит из различных аминокислот и сахаров, может контролировать структуру ткани, регулирует функцию клеток и обеспечивает диффузию питательных веществ, метаболитов - рост клеток. На сегодняшний день изучено достаточно много различных типов полимеров, которые используются в заместительной терапии. Из тех препаратов, что были перечислены выше, наиболее широко используются гиалуроновая кислота (ГК) и алифатические полиэфиры, в частности полимолочная кислота или полилактид (PLA) и сополимеры (ПМГК) из этих материалов. В организме человека полимолочная кислота гидролизуется до молочной кислоты или лактата, после чего принимает участие в регуляторно-обменных функциях организма. Молекула молочной кислоты в два раза меньше молекулы глюкозы и в четыре раза меньше звена гиалуроновой кислоты - с легкостью сама проходит через клеточные мембраны, стимулируя клеточные процессы. Поскольку она присутствует в любом живом организме, она обладает минимальной побочной реакцией и обеспечивает широкий диапазон возможных медицинских применений.Thus, the most important element in almost all methods of substitution therapy is the polymer base. The polymer mimics the many extracellular matrices found in tissues. The extracellular matrix consists of various amino acids and sugars, can control the structure of the tissue, regulates the function of cells and ensures the diffusion of nutrients, metabolites - cell growth. To date, quite a lot of different types of polymers that are used in replacement therapy have been studied. Of the preparations listed above, the most widely used are hyaluronic acid (HA) and aliphatic polyesters, in particular polylactic acid or polylactide (PLA) and copolymers (PMHA) from these materials. In the human body, polylactic acid is hydrolyzed to lactic acid or lactate, after which it takes part in the regulatory and metabolic functions of the body. The lactic acid molecule is two times smaller than the glucose molecule and four times smaller than the link of hyaluronic acid - it easily passes through cell membranes, stimulating cellular processes. Since it is present in any living organism, it has a minimal adverse reaction and provides a wide range of possible medical applications.
Известен инъекционный имплантат для подкожного или внутрикожного введения человеку в виде инъекции и способы его получения [патент RU 2214283 С2, 20.10.2003]. Имплантат состоит из биологически разрушающихся микросфер/микрочастиц полимолочной кислоты и/или ее сополимеров с гликолевой кислотой в виде суспензии в геле. Основным гелеобразующим компонентом является карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) или гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПЦ) в концентрации 0,1-7,5 мас.%. Концентрация микросфер или микрочастиц в геле 50-300 г/л. Согласно изобретению получение хорошей дисперсии микросфер или микрочастиц и гомогенность геля обеспечивается использованием поверхностно-активного вещества (ПАВ) полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата (Твин 80) или гиалуроновой кислоты. Протокол получения имплантата в случае готовой к употреблению суспензии (в шприцах или флаконах) включает стадии: предварительное получение микросфер полимера молочной кислоты, приготовление геля необходимой вязкости для удержания микросфер полимолочной кислоты и последующее распределение микросфер полимолочной кислоты в геле. В качестве способа получения микросфер полимера молочной кислоты, приводится протокол получения лиофилизированных частиц полимолочной кислоты. В данном источнике способ получения микросфер представлен в виде 4-х примеров. Так, в примерах №1-3 - приводится растворный способ получения микросфер полимолочной кислоты в органических растворителях, таких как этилацетат, дихлорметилен, хлороформ, а в примере №4 - в твердом теле - криоизмельчение. В заявленном изобретении размер частиц регулируется в результате сплавления отдельных частиц (исходных частиц) полимолочной кислоты при одновременном перемешивании частиц полимолочной кислоты.Known injection implant for subcutaneous or intradermal administration to humans in the form of an injection and methods for its preparation [patent RU 2214283 C2, 10.20.2003]. The implant consists of biodegradable microspheres / microparticles of polylactic acid and / or its copolymers with glycolic acid in the form of a suspension in a gel. The main gelling component is carboxymethyl cellulose (CMC) or hydroxypropyl methyl cellulose (HPC) in a concentration of 0.1-7.5 wt.%. The concentration of microspheres or microparticles in the gel is 50-300 g / l. According to the invention, obtaining a good dispersion of microspheres or microparticles and the homogeneity of the gel is ensured by the use of a polyoxyethylene sorbitan monooleate (Tween 80) surfactant or hyaluronic acid. The protocol for the preparation of an implant in the case of a ready-to-use suspension (in syringes or vials) includes the stages of: preliminary preparation of lactic acid polymer microspheres, preparation of a gel of the required viscosity to hold polylactic acid microspheres, and subsequent distribution of polylactic acid microspheres in the gel. As a method for producing microspheres of a polymer of lactic acid, a protocol for producing lyophilized particles of polylactic acid is provided. In this source, a method for producing microspheres is presented in the form of 4 examples. So, in examples No. 1-3, a solution method for producing polylactic acid microspheres in organic solvents, such as ethyl acetate, dichloromethylene, chloroform, is given, and in example No. 4, cryo-grinding in a solid body. In the claimed invention, the particle size is regulated by fusing individual particles (source particles) of polylactic acid while mixing the particles of polylactic acid.
К недостаткам известных способов получения имплантата можно отнести следующее. Растворный способ получения микросфер полимолочной кислоты в органических растворителях требует последующего удаления органических растворителей, вредных для живого организма, а также требует процедуры очистки полученных частиц от остатков растворителя. Полученные частицы при хранении слеживаются (слипаются). После того как частицы будут получены и очищены, их необходимо равномерно распределить в геле. Распределение в геле осуществляют с помощью ультразвука. Действие ультразвука «губительно» для гиалуроновой кислоты, и частично губительно для таких полисахаридов, как КМЦ. В целом известные способы более трудоемкие, затратные и несут определенные риски загрязнения конечного продукта (имплантата) продуктами окисления полисахаридов, что опасно для человека. Криоизмельчение - процесс энергоемкий с невысокой производительностью. Процесс сопровождается повышенной деструкцией (разрушением макроцепей) полимеров. Также как и для предыдущих способов, частицы, полученные в результате криозмельчения, необходимо распределить в геле с помощью ультразвука. Также недостатками является то, что основным гелеобразующим компонентом для получения имплантата является карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) или гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПЦ), которые являются чужеродными для организма человека и могут вызвать побочные реакции при введении имплантата.The disadvantages of the known methods for producing an implant include the following. The solution method for producing polylactic acid microspheres in organic solvents requires the subsequent removal of organic solvents harmful to the living organism, and also requires a procedure for cleaning the resulting particles from solvent residues. The particles obtained during storage are caked (stick together). After the particles are obtained and purified, they must be evenly distributed in the gel. The distribution in the gel is carried out using ultrasound. The action of ultrasound is “fatal” to hyaluronic acid, and partially fatal to polysaccharides such as CMC. In General, the known methods are more time-consuming, costly and carry certain risks of contamination of the final product (implant) with products of oxidation of polysaccharides, which is dangerous for humans. Cryo grinding is an energy-intensive process with low productivity. The process is accompanied by increased destruction (destruction of macrochains) of polymers. As for the previous methods, the particles obtained by cryo-grinding must be distributed in the gel using ultrasound. Another disadvantage is that the main gelling component for the implant is carboxymethyl cellulose (CMC) or hydroxypropyl methyl cellulose (GPC), which are foreign to the human body and can cause adverse reactions when the implant is inserted.
В указанном выше источнике упоминается, что диспергирование частиц в среде для лиофилизации осуществляется с помощью ультразвука. В случае, если в качестве гелеобразователя была бы гиалуроновая кислота, то ультразвуковая обработка неизбежно привела к деструкции макромолекулы полисахарида, т.е. к полному распаду гиалуроновой кислоты на низкомолекулярные фрагменты [Т. Miyazaki, С. Yomota, S. Okada. Ultrasonic depolymerization of hyaluronic acid // Polymer Degradation and Stability 74 (2001) 77-85].In the above source, it is mentioned that the dispersion of particles in a lyophilization medium is carried out using ultrasound. If hyaluronic acid would be the gelling agent, then ultrasonic treatment inevitably led to the destruction of the polysaccharide macromolecule, i.e. to the complete disintegration of hyaluronic acid into low molecular weight fragments [T. Miyazaki, S. Yomota, S. Okada. Ultrasonic depolymerization of hyaluronic acid // Polymer Degradation and Stability 74 (2001) 77-85].
В предложенном нами изобретении распределение частиц осуществляется в твердой фазе путем механохимического диспергирования - в порошке гиалуроновой кислоты, где отсутствует кислород (или находится в существенно меньшем количестве, чем в растворе) [М. Neil J.D., Wiebkin O.W., Betts W.H. Depolymerisation of HA after exposure to oxygen derived free radicals // Ann. Rheum. Dis. - 1985. - Vol. 44. - No. 11. - P. 780-789]. В результате окисление полимера незначительно, а снижение вязкости при достижение гомогенизации происходит максимум на 15%. В то время, как при озвучивание в растворе процесс окисления происходит неравномерно и вязкость падает более чем на 200% в зависимости от мощности УЗ диспергатора. Таким образом, нет необходимости вводить в рецептуру имплантата такие загустители, как КМЦ или ГПЦ и дополнительные стабилизаторы, как ПАВ, чужеродные для организма человека.In our invention, the distribution of particles is carried out in the solid phase by mechanochemical dispersion - in a powder of hyaluronic acid, where there is no oxygen (or is in a significantly smaller amount than in solution) [M. Neil J.D., Wiebkin O.W., Betts W.H. Depolymerisation of HA after exposure to oxygen derived free radicals // Ann. Rheum. Dis. - 1985. - Vol. 44. - No. 11. - P. 780-789]. As a result, the polymer oxidation is negligible, and a decrease in viscosity upon achieving homogenization occurs by a maximum of 15%. While the sounding process in the solution is not uniform during sonication, the viscosity drops by more than 200% depending on the power of the ultrasonic dispersant. Thus, there is no need to introduce thickeners such as CMC or GPC and additional stabilizers such as surfactants foreign to the human body in the implant formulation.
Известны различные твердофазные способы получения биоактивных композитов на основе гиалуроновой кислоты или ее соли [патент RU 2416389 С1, опубл. 20.04.2011, патент RU 2532032 С1, опубл. 27.10.2014 и др.].There are various solid-phase methods for producing bioactive composites based on hyaluronic acid or its salt [patent RU 2416389 C1, publ. 04/20/2011, patent RU 2532032 C1, publ. 10/27/2014 and others.].
Однако из уровня техники не известен способ получения биоактивного композита для наращивания ткани, включающего гиалуроновую кислоту или ее соль в качестве матрицы и микрочастицы полилактида или его сополимеров с гликолидом как наполнитель. А также не известен способ получения имплантата на основе этого композита.However, the prior art does not know a method for producing a bioactive composite for tissue growth, including hyaluronic acid or its salt as a matrix and microparticles of polylactide or its copolymers with glycolide as a filler. And also, a method for producing an implant based on this composite is not known.
Задачей предлагаемой группы изобретений является создание экологически безопасного, принципиально нового способа получения в одностадийном режиме биоактивного композита для наращивания ткани на основе гиалуроновой кислоты или ее соли, наполненной микрочастицами полилактида или его сополимеров с гликолидом, способного образовывать имплантаты в виде гидрогеля, а также - способа получения имплантата на основе этого композита.The objective of the proposed group of inventions is to create an environmentally safe, fundamentally new method for producing a bioactive composite in one-step mode for tissue growth based on hyaluronic acid or its salt, filled with microparticles of polylactide or its copolymers with glycolide, capable of forming implants in the form of a hydrogel, and also a method for producing implant based on this composite.
Для решения поставленной задачи предложен способ получения биоактивного композита для наращивания ткани, включающего гиалуроновую кислоту или ее соль в качестве матрицы и микрочастицы полилактида или его сополимеров с гликолидом как наполнитель, заключающийся в том, что осуществляют взаимодействие твердофазных порошков гиалуроновой кислоты или ее соли и полилактида или его сополимеров с гликолидом в условиях одновременного воздействия давления в пределах от 20 до 50 МПа и деформации сдвига в механохимическом реакторе при температуре от 20 до -20°С.To solve this problem, a method for producing a bioactive composite for tissue growth, including hyaluronic acid or its salt as a matrix and microparticles of polylactide or its copolymers with glycolide as a filler, which involves the interaction of solid-phase powders of hyaluronic acid or its salt and polylactide or its copolymers with glycolide under conditions of simultaneous pressure in the range from 20 to 50 MPa and shear strain in a mechanochemical reactor at a temperature from 20 to -20 ° C.
В качестве соли гиалуроновой кислоты используют соль, выбранную из ряда: тетраалкиламмониевая, литиевая, натриевая, калиевая, кальциевая, магниевая, бариевая, цинковая, алюминиевая, медная, золотая или смешанная соль гиалуроновой кислоты из вышеуказанного ряда или гидросоль гиалуроновой кислоты.As a salt of hyaluronic acid, a salt selected from the series: tetraalkylammonium, lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, barium, zinc, aluminum, copper, gold or a mixed salt of hyaluronic acid from the above series or a hyaluronic acid hydrosalt is used.
Солью гиалуроновой кислоты является натриевая соль, или смешанная соль, или гидронатриевая соль.The salt of hyaluronic acid is a sodium salt, or a mixed salt, or a sodium salt.
Молекулярная масса гиалуроновой кислоты составляет от 2 до 3000 кД.The molecular weight of hyaluronic acid is from 2 to 3000 kD.
Предпочтительно используют натриевую соль гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 2200 кД.Preferably, the sodium salt of hyaluronic acid with a molecular weight of 2200 kD is used.
В качестве полилактида используют L-полилактид, D-полилактид, D,L-полилактид.As polylactide, L-polylactide, D-polylactide, D, L-polylactide are used.
Молекулярная масса полилактида составляет от 2 до 300 кД.The molecular weight of polylactide is from 2 to 300 kD.
Предпочтительно используют D,L-полилактид с молекулярной массой 15-60 кД.Preferably, D, L-polylactide with a molecular weight of 15-60 kD is used.
Мольное соотношение соли гиалуроновой кислоты к полилактиду находится в пределах от 1:0,15 до 1:1,20.The molar ratio of the salt of hyaluronic acid to polylactide is in the range from 1: 0.15 to 1: 1.20.
К основным компонентам композита может быть дополнительно введен сухой фосфатный буфер в качестве наполнителя. Для приготовления фосфатных буферов используют гидрофосфаты калия или натрия и дигидрофосфаты калия или натрия, а также вспомогательные вещества хлорид калия или хлорид натрия соответственно. Состав каждого из буферов выбирается такой, чтобы значение рН было от 6.5 до 8.Dry phosphate buffer can be added to the main components of the composite as a filler. To prepare phosphate buffers, potassium or sodium hydrogen phosphates and potassium or sodium dihydrogen phosphates are used, as well as excipients potassium chloride or sodium chloride, respectively. The composition of each of the buffers is chosen so that the pH value is from 6.5 to 8.
В качестве сополимера полилактида с гликолидом используют сополимеры с соотношением лактид:гликолид от 98:2 до 2:98.As a copolymer of polylactide with glycolide, copolymers with a lactide: glycolide ratio of from 98: 2 to 2:98 are used.
Молекулярная масса сополимера полилактида с гликолидом составляет от 2 до 300 кД.The molecular weight of the copolymer of polylactide with glycolide is from 2 to 300 kD.
Предложен также биоактивный композит для наращивания ткани, включающий гиалуроновую кислоту или ее соль в качестве матрицы и микрочастицы полилактида или его сополимеров с гликолидом как наполнитель, полученный вышеуказанным способом.Also proposed is a bioactive composite for tissue growth, including hyaluronic acid or its salt as a matrix and microparticles of polylactide or its copolymers with glycolide as a filler obtained by the above method.
Предложен также способ получения имплантата для подкожного или внутрикожного введения человеку в виде инъекции, содержащего биологически разрушающиеся микрочастицы полилактида или его сополимеров с гликолидом в виде суспензии в геле гиалуроновой кислоты или ее соли, заключающийся в том, что к биоактивному композиту добавляют воду или буферный водный раствор.A method for producing an implant for subcutaneous or intradermal administration to humans in the form of an injection containing biologically degradable microparticles of polylactide or its copolymers with glycolide in the form of a suspension in a gel of hyaluronic acid or its salt is also proposed, which consists in adding water or a buffer aqueous solution to the bioactive composite .
Способ получения биоактивного композита на основе гиалуроновой кислоты и микрочастиц полилактида или его сополимеров с гликолидом осуществляют в одностадийном технологическом режиме в отсутствие жидкой среды, без больших энерго-, трудо- и водозатрат, и получение при этом целевых продуктов с высоким выходом и необходимым содержанием наполнителя (полилактида или его сополимеров с гликолидом). При этом степень наполнения композита полилактидом или его сополимерами с гликолидом составляет от 3 до 20 мас.%. Микрочастицы имеют размер от 1 до 100 мкм, при этом частиц с размером 2-10 мкм (92%), 10-30 мкм (8%) и с размером частиц ≥100 мкм (0,1%).A method for producing a bioactive composite based on hyaluronic acid and microparticles of polylactide or its copolymers with glycolide is carried out in a single-stage technological mode in the absence of a liquid medium, without large energy, labor and water costs, and obtaining the target products with a high yield and the required filler content ( polylactide or its copolymers with glycolide). The degree of filling of the composite with polylactide or its copolymers with glycolide is from 3 to 20 wt.%. The microparticles have a size of 1 to 100 microns, with particles with a size of 2-10 microns (92%), 10-30 microns (8%) and with a particle size of ≥100 microns (0.1%).
Таким образом, предлагаемый нами подход - это создание двухфазных наполнителей (филлеров) гиалуроновой кислоты с диспергированными до заданного размера в твердой фазе нерастворимыми в воде биополимерами, а именно микросферами полимолочной кислоты (полилактида) или ее сополимеров. Такие системы, образуют гидрогели и могут быть введены в организм. Как результат - регенерация и репарация ткани с минимальным хирургическим вмешательством. Гидрогели с высоконаполненными частицами полимолочной кислоты или ее сополимеров имеют структурное сходство с компонентами организма и считаются биосовместимыми. Гидрогелевые имплантаты нашли многочисленное применение в тканевой инженерии, в том числе традиционной эстетической, пластической и реконструкционной косметологии. Следует отметить, что при этом при добавлении воды или буферного раствора больше необходимого (эффективного для образования гидрогеля) количества, биоактивный композит способен растворятся в воде или в буферном водном растворе (например, калий-фосфатном буферном растворе, натрий-фосфатном буферном растворе) с образованием суспензии микрочастиц полилактида или его сополимеров в растворе гиалуроновой кислоты или ее соли.Thus, our approach is the creation of biphasic fillers (fillers) of hyaluronic acid with water-insoluble biopolymers dispersed to a given size in the solid phase, namely, microspheres of polylactic acid (polylactide) or its copolymers. Such systems form hydrogels and can be introduced into the body. As a result, tissue regeneration and repair with minimal surgical intervention. Hydrogels with highly filled particles of polylactic acid or its copolymers have structural similarities with the components of the body and are considered biocompatible. Hydrogel implants have found numerous applications in tissue engineering, including traditional aesthetic, plastic and reconstructive cosmetology. It should be noted that when adding water or a buffer solution more than the required amount (effective for the formation of a hydrogel), the bioactive composite is able to dissolve in water or in a buffer aqueous solution (for example, potassium phosphate buffer solution, sodium phosphate buffer solution) with the formation suspensions of microparticles of polylactide or its copolymers in a solution of hyaluronic acid or its salt.
Группа изобретений проиллюстрирована следующими примерами.The group of inventions is illustrated by the following examples.
Пример 1. Мольное соотношение ГК:PLA=1:0,17Example 1. The molar ratio of HA: PLA = 1: 0.17
48,5 г (12,1⋅10-2 моль) порошкообразной натриевой соли ГК и 1,5 г (20,8⋅10-3 моль) полилактида гомогенизируют в пьяной бочке в течение 1 часа 30 мин. Затем однородную порошкообразную смесь подают в зону питания двухшнекового компаудера (экструдера), где материал захватывают транспортирующие элементы и перемещают его по длине цилиндра при вращении. Во второй и третьей зоне материал подвергается деформации сдвига, благодаря смесительным элементам, состоящим из кулачков, набранных по пять штук с углом поворота между кулачками 45°, 90° и 45° (обратный). Размещение элементов под разными углами способствует образованию запоров в движении материала и вследствие этого его лучшему перемешиванию и физическим воздействиям. Эффект смешения массы увеличивается за счет ее смещения как в радиальном, так и в осевом направлениях.48.5 g (12.1 · 10 -2 mol) of HA powdered sodium salt and 1.5 g (20.8 · 10 -3 mol) of polylactide are homogenized in a drunk barrel for 1 hour and 30 minutes. Then a homogeneous powder mixture is fed into the feed zone of a twin-screw compauder (extruder), where the material is captured by transporting elements and moved along the length of the cylinder during rotation. In the second and third zones, the material undergoes shear deformation due to mixing elements consisting of cams composed of five pieces with an angle of rotation between cams of 45 °, 90 ° and 45 ° (reverse). Placing elements at different angles contributes to the formation of constipation in the movement of the material and, as a result, its better mixing and physical influences. The effect of mixing the mass increases due to its displacement in both radial and axial directions.
Компаудер имеет измеритель скорости вращения шнеков, показания которого пропорциональны величине потребляемого напряжения, и измерителем нагрузки на шнеках, показывающим величину постоянного тока привода в процентах (%).The compauder has a screw rotational speed meter, the readings of which are proportional to the consumed voltage, and a screw load meter, which shows the value of the direct current of the drive in percent (%).
Процесс проводится при автоматической загрузке материала, скорость подачи композиционной смеси поддерживалась такой, чтобы удерживать заданный уровень нагрузки на шнеках. Скорости вращения шнеков выбирали в пределе от 5÷30 об⋅мин-1. Нагрузка (по току): без нагрузки - 5%, а в режиме твердотельного реакционного смешения оптимально поддерживается 10÷12%. Температура в первой зоне, во второй и в третьей зоне составляет 5°С. Цикл повторяется 2 раза. Продолжительность процесса составляет 1,5 минуты при давлении 20 МПа. Выход продукта составляет 48,0 г (96,0%). Размер частиц PLA составляет 2-10 мкм (70%), 10-30 мкм (25%) и фракция PLA, где размер частиц >100 мкм (5%). Степень наполнения композита PLA составляет 3,0 мас.%.The process is carried out with automatic loading of the material, the feed rate of the composite mixture was maintained such as to maintain a predetermined load level on the screws. The rotational speeds of the screws were selected in the range from 5 ÷ 30 rpm -1 . Load (current): without load - 5%, and in the solid-state reaction mixing mode, 10 ÷ 12% is optimally supported. The temperature in the first zone, in the second and in the third zone is 5 ° C. The cycle is repeated 2 times. The duration of the process is 1.5 minutes at a pressure of 20 MPa. The product yield is 48.0 g (96.0%). The particle size of the PLA is 2-10 μm (70%), 10-30 μm (25%) and the PLA fraction, where the particle size is> 100 μm (5%). The degree of filling of the PLA composite is 3.0 wt.%.
Пример 2.Example 2
Выполнен аналогично примеру 1, однако в отличие от него мольное соотношение порошкообразной натриевой соли ГК:PLA=1:0,29. Тогда берем 237,5 г (59,2⋅10-2 моль) порошкообразной натриевой соли ГК и 12,5 г (173,6⋅10-3 моль) полилактида.Performed similarly to example 1, however, in contrast to it, the molar ratio of the powdered sodium salt of HA: PLA = 1: 0.29. Then we take 237.5 g (59.2⋅10 -2 mol) of powdered sodium salt of HA and 12.5 g (173.6⋅10 -3 mol) of polylactide.
Продолжительность процесса составляет 4.5 минуты при давлении 20 МПа. Выход продукта составляет 246,5 г (98,6%). Размер частиц PLA составляет 2-10 мкм (70%), 10-30 мкм (25%) и фракция PLA, где размер частиц >100 мкм (5%). Степень наполнения композита PLA составляет 5,0 мас.%.The duration of the process is 4.5 minutes at a pressure of 20 MPa. The product yield is 246.5 g (98.6%). The particle size of the PLA is 2-10 μm (70%), 10-30 μm (25%) and the PLA fraction, where the particle size is> 100 μm (5%). The degree of filling of the PLA composite is 5.0 wt.%.
Пример 3.Example 3
Выполнен аналогично примеру 1, однако, в отличие от него мольное соотношение порошкообразной натриевой соли ГК:PLA=1:0,61. Тогда берем 540,0 г (1,35 моль) порошкообразной натриевой соли ГК и 60,0 г (0,83 моль) полилактида.Performed similarly to example 1, however, in contrast to it, the molar ratio of the powdered sodium salt of HA: PLA = 1: 0.61. Then we take 540.0 g (1.35 mol) of powdered sodium salt of HA and 60.0 g (0.83 mol) of polylactide.
Цикл повторяется 2 раза. Продолжительность процесса составляет 8 минут при давлении 20 МПа. Выход продукта составляет 597,0 г (99,5%). Размер частиц PLA составляет 2-10 мкм (45%), 10-30 мкм (35%) и фракция PLA, где размер частиц >100 мкм (20%). Степень наполнения композита PLA составляет 10,0 мас.%.The cycle is repeated 2 times. The duration of the process is 8 minutes at a pressure of 20 MPa. The product yield is 597.0 g (99.5%). The particle size of the PLA is 2-10 μm (45%), 10-30 μm (35%) and the PLA fraction, where the particle size is> 100 μm (20%). The degree of filling of the PLA composite is 10.0 wt.%.
Пример 4.Example 4
Выполнен аналогично примеру 1, однако, в отличие от него мольное соотношение порошкообразной натриевой соли ГК:PLA=1:1,39. Тогда берем 8 кг (19,95 моль) порошкообразной натриевой соли ГК и 2 кг (27,78 моль) полилактида.Performed similarly to example 1, however, in contrast to it, the molar ratio of the powdered sodium salt of HA: PLA = 1: 1.39. Then we take 8 kg (19.95 mol) of powdered sodium salt of HA and 2 kg (27.78 mol) of polylactide.
Цикл повторяется 2 раза. Скорость вращения шнеков составляла 80 об⋅мин-1. Продолжительность процесса - 18 минут при давлении 20 МПа. Выход продукта составляет 597,0 г (99,97%). Размер частиц PLA составляет 2-10 мкм (45%), 10-30 мкм (35%) и фракция PLA, где размер частиц >100 мкм (20%).. Степень наполнения композита PLA составляет 20,0 мас.%.The cycle is repeated 2 times. The screw rotation speed was 80 rpm -1 . The duration of the process is 18 minutes at a pressure of 20 MPa. The product yield is 597.0 g (99.97%). The particle size of the PLA is 2-10 μm (45%), 10-30 μm (35%) and the PLA fraction, where the particle size is> 100 μm (20%) .. The degree of filling of the PLA composite is 20.0 wt.%.
Пример 5.Example 5
Выполнен аналогично примеру 3, однако, в отличие от него процесс в режиме твердотельного реакционного смешения проводится при нагрузке 20÷25%. Продолжительность процесса составляет 7.5 минуты при давлении 50 МПа. Выход продукта составляет 597,0 г (99,5%). Размер частиц PLA составляет 2-10 мкм (35%), 10-30 мкм (35%) и фракция PLA, где размер частиц>100 мкм (30%). Степень наполнения композита PLA составляет 10,0 мас.%.Performed similarly to example 3, however, in contrast to it, the process in the solid state reaction mixing mode is carried out at a load of 20 ÷ 25%. The duration of the process is 7.5 minutes at a pressure of 50 MPa. The product yield is 597.0 g (99.5%). The particle size of the PLA is 2-10 μm (35%), 10-30 μm (35%) and the PLA fraction, where the particle size is> 100 μm (30%). The degree of filling of the PLA composite is 10.0 wt.%.
Пример 6.Example 6
Выполнен аналогично примеру 3, однако, в отличие от него цикл повторяется 7 раз. Продолжительность процесса составляет 16.5 минуты при давлении 20 МПа. Выход продукта составляет 597,0 г (99,5%). Размер частиц PLA составляет 2-10 мкм (60%), 10-30 мкм (25%) и фракция PLA, где размер частиц >100 мкм (15%). Степень наполнения композита PLA составляет 10,0 мас.%.Performed similarly to example 3, however, in contrast to it, the cycle is repeated 7 times. The duration of the process is 16.5 minutes at a pressure of 20 MPa. The product yield is 597.0 g (99.5%). The particle size of the PLA is 2-10 μm (60%), 10-30 μm (25%) and the PLA fraction, where the particle size is> 100 μm (15%). The degree of filling of the PLA composite is 10.0 wt.%.
Пример 7.Example 7
Выполнен аналогично примеру 1, однако, в отличие от него перед тем, как смешать ГК с PLA проводят предварительную стадию экструзии порошкообразной ПМК.Performed similarly to example 1, however, in contrast to it, before mixing HA with PLA, a preliminary stage of extrusion of powdered PMA is carried out.
Исходный порошок PLA (2-10 мкм) в количестве 45 г (625⋅10-3 моль) подают в зону питания двухшнекового компаудера (экструдера), где материал захватывают транспортирующие элементы и перемещают его по длине цилиндра при вращении. Во второй и третьей зоне материал подвергается деформации сдвига, благодаря смесительным элементам, состоящим из кулачков, набранных по пять штук с углом поворота между кулачками 45°, 90° и 45° (обратный). Размещение элементов под разными углами способствует образованию запоров в движении материала и физическим воздействиям.The initial PLA powder (2-10 μm) in an amount of 45 g (625-10 -3 mol) is fed into the feed zone of a twin-screw compauder (extruder), where the transporting elements capture the material and move it along the length of the cylinder during rotation. In the second and third zones, the material undergoes shear deformation due to mixing elements consisting of cams composed of five pieces with an angle of rotation between cams of 45 °, 90 ° and 45 ° (reverse). Placing elements at different angles contributes to the formation of constipation in the movement of the material and physical influences.
Процесс проводится при автоматической загрузке материала, скорость подачи композиционной смеси поддерживалась такой, чтобы удерживать заданный уровень нагрузки на шнеках. Скорости вращения шнеков выбирали в пределе от 5÷30 об⋅мин-1. Нагрузка (по току): без нагрузки - 5%, а в режиме твердотельного реакционного смешения оптимально поддерживается 10÷12%. Температура в первой зоне, во второй и в третьей зоне составляет 5°С. Цикл повторяется 2 раза. Выход продукта составляет 43,0 г (95,6%). Продолжительность процесса составляет 4.5 минуты при давлении 20 МПа. Размер частиц PLA составляет 20-150 мкм. Полученная композиция просеивается на ситах с размером отверстия на свету 100 мкм (0,1 мм). Затем отобранная фракция PLA (20-80 мкм) в количестве 40 г (555,6⋅10-3) и 387,0 г (965,2⋅10-3 моль) порошкообразной натриевой соли ГК гомогенизируют в пьяной бочке и экструдируют согласно примеру 1. Выход продукта составляет 425,7 г (99,7%). Размер частиц PLA составляет 20-80 мкм. Степень наполнения композита PLA составляет 9,4 мас.%.The process is carried out with automatic loading of the material, the feed rate of the composite mixture was maintained such as to maintain a predetermined load level on the screws. The rotational speeds of the screws were selected in the range from 5 ÷ 30 rpm -1 . Load (current): without load - 5%, and in the solid-state reaction mixing mode, 10 ÷ 12% is optimally supported. The temperature in the first zone, in the second and in the third zone is 5 ° C. The cycle is repeated 2 times. The product yield is 43.0 g (95.6%). The duration of the process is 4.5 minutes at a pressure of 20 MPa. The particle size of the PLA is 20-150 microns. The resulting composition is sieved on sieves with a hole size in the light of 100 μm (0.1 mm). Then, the selected PLA fraction (20-80 μm) in an amount of 40 g (555.6⋅10 -3 mol) and 387.0 g (965.2⋅10 -3 mol) of HA powdered sodium salt are homogenized in a drunk barrel and extruded according to the example 1. The product yield is 425.7 g (99.7%). The particle size of the PLA is 20-80 microns. The degree of filling of the PLA composite is 9.4 wt.%.
Пример 8.Example 8
Выполнен аналогично примеру 7, однако, в отличие от него полученная композиция просеивается на ситах с размером отверстия на свету 50 мкм (0,05 мм). В результате получаем фракцию PLA (20-40 мкм) в количестве 30 г, которую гомогенизируют в пьяной бочке с 387,0 г (965,2⋅10-3 моль) порошкообразной натриевой соли ГК и экструдируют согласно примеру 1. Выход продукта составляет 415,0 г (99,5%). Размер частиц PLA составляет 2-10 мкм (10%), 20-40 мкм (90%). Степень наполнения композита PLA составляет 7,2 мас.%.Performed similarly to example 7, however, in contrast to it, the resulting composition is sieved on sieves with a hole size in the light of 50 μm (0.05 mm). As a result, we obtain a PLA fraction (20–40 μm) in an amount of 30 g, which is homogenized in a drunk barrel with 387.0 g (965.2 × 10 -3 mol) of HA powder sodium salt and extruded according to Example 1. The product yield is 415 0 g (99.5%). The particle size of the PLA is 2-10 microns (10%), 20-40 microns (90%). The degree of filling of the PLA composite is 7.2 wt.%.
Пример 9.Example 9
Выполнен аналогично примеру 3, однако, в отличие от него мольное соотношение порошкообразной натриевой соли ГК:PLA =1:0,62. Тогда берем 810,0 г (2,02 моль) порошкообразной натриевой соли ГК и 90,0 г (1,25 моль) полилактида. Для повышения монодисперстности композиции ГК-PLA в систему вводят наполнитель - фосфатный буфер в количестве 1458 г. Соотношение ГК:фосфатный буфер =1:1,8 по массе.Performed similarly to example 3, however, in contrast to it, the molar ratio of the powdered sodium salt of HA: PLA = 1: 0.62. Then we take 810.0 g (2.02 mol) of powdered sodium salt of HA and 90.0 g (1.25 mol) of polylactide. To increase the monodispersity of the GK-PLA composition, a filler, a phosphate buffer in the amount of 1458, is introduced into the system. The ratio of HA: phosphate buffer = 1: 1.8 by weight.
Цикл повторяется 2 раза. Продолжительность процесса составляет 8 минут при давлении 20 МПа. Выход продукта составляет 597,0 г (99,5%). Размер частиц PLA составляет 2-10 мкм (92%), 10-30 мкм (8%) и фракция PLA, где размер частиц >100 мкм (0,1%). Степень наполнения композита PLA составляет 10,0 мас.%. Наличие в композиции фосфатов способствует получению более монодисперсного состава и образованию межмолекулярных водородных связей ГК-фосфат-ГК, обеспечивая, тем самым, повышение вязкости за счет межмолекулярных сшивок ГК и стабильность дисперсии в водной фазе. Стабильность дисперсии в водной среде при подкожном введении позволяет достигнуть достаточно продолжительный эстетический эффект.The cycle is repeated 2 times. The duration of the process is 8 minutes at a pressure of 20 MPa. The product yield is 597.0 g (99.5%). The particle size of the PLA is 2-10 μm (92%), 10-30 μm (8%) and the PLA fraction, where the particle size is> 100 μm (0.1%). The degree of filling of the PLA composite is 10.0 wt.%. The presence of phosphates in the composition promotes a more monodisperse composition and the formation of intermolecular hydrogen bonds GK-phosphate-GK, thereby ensuring an increase in viscosity due to intermolecular crosslinking of HA and the dispersion stability in the aqueous phase. The stability of the dispersion in the aquatic environment with subcutaneous administration allows to achieve a sufficiently long aesthetic effect.
Пример 10.Example 10
Выполнен аналогично примеру 3, однако, в отличие от него берем 720,0 г (1,75 моль) порошкообразной цинковой соли ГК и 80,0 г (0,83 моль) полилактида. Температурный режим в первой зоне составляет 10°С, во второй -5°С и в третьей зоне составляет -20°С.Performed similarly to example 3, however, in contrast to it, we take 720.0 g (1.75 mol) of powdered zinc salt of HA and 80.0 g (0.83 mol) of polylactide. The temperature regime in the first zone is 10 ° C, in the second -5 ° C and in the third zone is -20 ° C.
Цикл повторяется 2 раза. Продолжительность процесса составляет 8 минут при давлении 50 МПа. Выход продукта составляет 597,0 г (99,5%). Размер частиц сополимера полилактид-гликолид составляет 2-5 мкм (80%), 8-10 мкм (20%) и фракция сополимера полилактид-гликолид, где размер частиц >100 мкм (0,1%). Степень наполнения композита сополимером полилактид-гликолид составляет 10,0 мас.%.The cycle is repeated 2 times. The duration of the process is 8 minutes at a pressure of 50 MPa. The product yield is 597.0 g (99.5%). The particle size of the polylactide-glycolide copolymer is 2-5 μm (80%), 8-10 μm (20%) and the fraction of the polylactide-glycolide copolymer, where the particle size is> 100 μm (0.1%). The degree of filling of the composite with the polylactide-glycolide copolymer is 10.0 wt.%.
Пример 11.Example 11
Полученные биоактивные композиты (см. примеры 1-10) способны образовывать гидрогели при добавлении к ним необходимого количества воды или буферного водного раствора. Для приготовления имплантата в виде гидрогеля необходимо растворить в заданном количестве дистиллированной воды заданное количество композита, используя следующую формулу:The resulting bioactive composites (see examples 1-10) are able to form hydrogels by adding to them the required amount of water or a buffer aqueous solution. To prepare the implant in the form of a hydrogel, it is necessary to dissolve a predetermined amount of the composite in a given amount of distilled water using the following formula:
m (композита, грамм смеси)=С1/С2 * V, гдеm (composite, grams of mixture) = C1 / C2 * V, where
m - абсолютно сухая навеска композита, необходимая для приготовления имплантата заданной концентрации по гиалуроновой кислоте, граммm - absolutely dry sample of the composite, necessary for the preparation of the implant of a given concentration of hyaluronic acid, grams
С1 - заданная концентрация имплантата по гиалуроновой кислоте, %C1 - a given implant concentration in hyaluronic acid,%
С2 - концентрация гиалуроновой кислоты в абсолютно сухом композите, %C2 - concentration of hyaluronic acid in a completely dry composite,%
V - заданный объем имплантата, мл.V is the given volume of the implant, ml.
По результатам исследований оптимальное содержание PLA в композиции с ГК составило ~10% от всей смеси.According to research results, the optimal PLA content in the composition with HA was ~ 10% of the total mixture.
Поскольку основное действие имплантата направлено на восстановление подкожной ткани, то для оценки метаболической активности клеток (фибробластов и макрофагов) был сделан МТТ-анализ. Исследования проведены для составов, описанных в примерах 1-4 и 9.Since the main effect of the implant is aimed at restoring subcutaneous tissue, an MTT analysis was performed to evaluate the metabolic activity of cells (fibroblasts and macrophages). Studies were conducted for the compositions described in examples 1-4 and 9.
Результаты исследования поясняются графическими изображениями.The results of the study are illustrated by graphic images.
Фиг. 1 - Относительная жизнеспособность клеток линии L929 после 24 ч культивирования в присутствии суспензии PLA/ГК: в зависимости от концентрации суспензии (а) и содержания PLA в составе суспензии (б).FIG. 1 - Relative viability of L929 cells after 24 hours of cultivation in the presence of a suspension of PLA / HA: depending on the concentration of the suspension (a) and the content of PLA in the composition of the suspension (b).
Фиг. 2 - Относительная жизнеспособность клеток линии RAW 264.7 после 24 ч культивирования в присутствии суспензии PLA/ГК: в зависимости от концентрации суспензии (а) и содержания PLA в составе суспензии (б).FIG. 2 - Relative viability of RAW 264.7 cells after 24 hours of cultivation in the presence of a PLA / HA suspension: depending on the concentration of the suspension (a) and the content of PLA in the composition of the suspension (b).
Фиг. 3 - I группа - корректоформ М (ГК+полимолочная кислота) - 3 сутки. Фрагменты слабоокрашенной ГК разделены фибрином, макрофагами и фибробластами. Внизу в центре - частица PLA, окруженная скоплением макрофагов и нейтрофилов. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение X 400.FIG. 3 - I group - correction form M (HA + polylactic acid) - 3 days. Fragments of slightly colored HA are separated by fibrin, macrophages and fibroblasts. Below in the center is a PLA particle surrounded by a cluster of macrophages and neutrophils. Hematoxylin and eosin stain, magnification X 400.
Фиг. 4 - I группа - корректоформ М (ГК+полимолочная кислота) - 3 сутки. В центре частицы полимолочной кислоты, окруженные макрофагами. Вокруг - ячейки со слабоокрашенной ГК, разделенные между собой фибрином, макрофагами и фибробластами. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение X 400.FIG. 4 - I group - corrective form M (HA + polylactic acid) - 3 days. In the center are polylactic acid particles surrounded by macrophages. Around - cells with slightly colored HA, separated by fibrin, macrophages and fibroblasts. Hematoxylin and eosin stain, magnification X 400.
Фиг. 5 - I группа - корректоформ М (ГК+полимолочная кислота) - 3 сутки. Грануляционная ткань, врастающая в фибрин. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение X 400.FIG. 5 - I group - corrective form M (HA + polylactic acid) - 3 days. Granulation tissue growing into fibrin. Hematoxylin and eosin stain, magnification X 400.
Фиг.6 - I группа - корректоформ М: ГК+полимолочная кислота - 10 сутки. Участки фиброзированной грануляционной ткани в жировой клетчатке на месте введения корректоформа М. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение X 400.6 - group I - proofread M: HA + polylactic acid - 10 days. Sites of fibrosed granulation tissue in adipose tissue at the injection site of the corrective form M. Stained with hematoxylin and eosin, magnification X 400.
Фиг. 7 - I группа - корректоформ М (ГК+полимолочная кислота) - 30 сутки. Участок жировой клетчатки с многочисленными частицами PLA, которые подвергаются макрофагальной резорбции, и отдельными ячейками с ГК. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение X 400.FIG. 7 - I group - correction form M (HA + polylactic acid) - 30 days. An area of adipose tissue with numerous particles of PLA that undergo macrophage resorption, and individual cells with HA. Hematoxylin and eosin stain, magnification X 400.
Фиг. 8 - I группа - корректоформ М (ГК+полимолочная кислота) - 90 сутки. Участок жировой клетчатки с частицами PLA, окруженный тонкой соединительно-тканной микрокапсулой. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение X 400.FIG. 8 - I group - corrective form M (HA + polylactic acid) - 90 days. A portion of adipose tissue with PLA particles surrounded by a thin connective tissue microcapsule. Hematoxylin and eosin stain, magnification X 400.
В исследованиях in vitro было показано, что жизнеспособность клеток зависит от содержания частиц в суспензии, и ее концентрации. Так, жизнеспособность клеток линии L929 увеличивалась при снижении концентрации суспензии в среде (Фиг. 1 и 2). При этом наблюдалось значительное повышение жизнеспособности клеток (от 110 до 120%) при низких (1 и 2.5 мг/мл) концентрациях суспензий (Фиг. 1 б). Кроме того, увеличение содержания PLA в смеси приводило к увеличению жизнеспособности клеток L929. Максимальная жизнеспособность наблюдалась после инкубации клеток линии L929 с суспензией, содержащей 10% PLA и суспензией, содержащей 10% PLА с Н3РО4, а увеличение содержания PLA до 20% приводило к снижению жизнеспособности клеток (по сравнению с содержанием PLA 10%). При увеличении концентрации суспензии в среде до 10 мг/мл происходило некоторое снижение жизнеспособности клеток, однако оно было незначительным (до 90%).In vitro studies have shown that cell viability depends on the content of particles in the suspension and its concentration. Thus, the viability of the L929 cell line increased with decreasing concentration of the suspension in the medium (Figs. 1 and 2). At the same time, a significant increase in cell viability (from 110 to 120%) was observed at low (1 and 2.5 mg / ml) concentrations of suspensions (Fig. 1 b). In addition, an increase in the PLA content in the mixture led to an increase in the viability of L929 cells. Maximum viability was observed after incubation of L929 cells with a suspension containing 10% PLA and a suspension containing 10% PLA with H 3 PO 4 , and an increase in PLA content to 20% led to a decrease in cell viability (compared to 10% PLA). With an increase in the concentration of the suspension in the medium to 10 mg / ml, there was a slight decrease in cell viability, however, it was insignificant (up to 90%).
В случае клеток линии RAW 264.7 при увеличении концентрации суспензии в среде (или р-ра ГК) жизнеспособность клеток падала (до 70%). При этом никаких внешних различий в морфологии и плотности клеточного монослоя в случае клеток обеих линий выявлено не было.In the case of RAW 264.7 cells, with an increase in the concentration of the suspension in the medium (or G-R), cell viability decreased (up to 70%). Moreover, no external differences in the morphology and density of the cell monolayer in the case of cells of both lines were detected.
Нужно отметить, что увеличение содержания частиц PLA в суспензии без ГК, не оказывало влияния на жизнеспособность клеток L929 (Фиг. 1 б), она колебалась около значения 95% для всех изученных концентраций PLA. В случае же линии RAW 264.7 жизнеспособность клеток напрямую зависела от концентрации частиц PLA и снижалась в случае наибольшей концентрации частиц до 50%.It should be noted that the increase in the content of PLA particles in the suspension without HA did not affect the viability of L929 cells (Fig. 1 b); it fluctuated around 95% for all studied PLA concentrations. In the case of the RAW 264.7 line, cell viability depended directly on the concentration of PLA particles and decreased in the case of the highest particle concentration to 50%.
Таким образом, оптимальное содержание PLA в композиции с ГК составило ~10% от всей смеси (пример 3).Thus, the optimal PLA content in the composition with HA was ~ 10% of the total mixture (example 3).
Оценку поведения имплантата, приготовленного из композита, по примеру 3 - возможность резорбции и тканевая реакция при введении имплантата в подкожно-жировую клетчатку выполнены на 36 белых лабораторных крысах-самцах массой тела 140-150 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, по 3 особи в клетке, кормление - комплексным гранулированным лабораторным кормом при постоянном свободном доступе к воде.Evaluation of the behavior of the implant prepared from the composite, according to example 3 - the possibility of resorption and tissue reaction with the introduction of the implant into the subcutaneous fat was performed on 36 white laboratory male rats weighing 140-150 g. Animals were kept under standard vivarium conditions, 3 individuals in a cage, feeding - with a complex granular laboratory feed with constant free access to water.
Методика эксперимента: животным, наркотизированным комбинацией «золетил-рометар», в межлопаточной области спины слева от средней линии подкожно стерильной иглой вводили по 1-1,5 мл изучаемых гель-суспензий.Experimental procedure: 1-1.5 ml of the studied gel suspensions were injected subcutaneously with a sterile needle into the interscapular region of the back to the left of the midline in animals anesthetized with the Zoetil-Rometar combination.
Выполнено 3 группы исследований по 12 животных в каждой.Completed 3 research groups of 12 animals each.
Животных выводили из опыта через 3; 10; 30 и 90 суток после введения материала.Animals were removed from the experiment after 3; 10; 30 and 90 days after the introduction of the material.
Визуально оценивали макроскопическую картину состояния имплантированных гелей и окружающих тканей. Инкапсулированные имплантаты геля иссекали вместе с окружающими тканями. Отобранный для гистологического исследования материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, проводили через спирты возрастающей концентрации, заливали в парафин. Микротомные срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Изучение и анализ гистологических препаратов проводили с использованием светового микроскопа Olympus ВХ51, оснащенного цифровой видеокамерой SDU («Спецтелетехника», Россия). Микрофотографирование гистологических препаратов проводилось помощью этой камеры и программы Launch Cam_View.A macroscopic picture of the state of the implanted gels and surrounding tissues was visually evaluated. The encapsulated gel implants were excised along with the surrounding tissues. The material selected for histological examination was fixed in a 10% solution of neutral formalin, passed through alcohols of increasing concentration, and embedded in paraffin. Microtome sections 4-6 μm thick were stained with hematoxylin and eosin. The study and analysis of histological preparations was carried out using an Olympus BX51 light microscope equipped with an SDU digital video camera (Spectelehnika, Russia). Microphotography of histological preparations was carried out using this camera and the Launch Cam_View program.
Результаты макроскопического и гистологического изучения имплантата гель-суспензий гиалуроновой кислотыResults of macroscopic and histological studies of the implant of hyaluronic acid gel suspensions
Макроскопически на 3 сутки гель-суспензия ГК-PLA обнаружен в месте введения в виде компактных плоских пластин, сохранивших прозрачность. Окружающие ткани не изменены.Macroscopically on
Гистологически на 3 сутки после введения материала в подкожной клетчатке образуется крупная гранулема, состоящая из имплантата и грануляционной ткани, формирующейся вокруг имплантата и между его фрагментами. ГК разволокнена на отдельные мелкие фрагменты, окруженные либо фибрином, либо тонкими тяжами макрофагов и фибробластов вместе с фибрином. ГК в основном гомогенна и слабо окрашена, местами она мелкоячеиста (Фиг. 3). В ней видны частицы различных размеров (в среднем от 100 мк), состоящие из полимолочной кислоты (Фиг. 4). Полимолочная кислота не окрашивается гематоксилином и эозином, но она несколько более плотная, чем ГК. Вокруг частиц PLA образуются скопления макрофагов с единичными нейтрофилами (см. Фиг. 3 и 4).Histologically, on the 3rd day after the introduction of the material, a large granuloma is formed in the subcutaneous tissue, consisting of an implant and granulation tissue that forms around the implant and between its fragments. HA is dispersed into individual small fragments surrounded by either fibrin or thin strands of macrophages and fibroblasts along with fibrin. HA is mainly homogeneous and weakly stained, in places it is finely meshed (Fig. 3). It shows particles of various sizes (on average from 100 microns), consisting of polylactic acid (Fig. 4). Polylactic acid is not stained with hematoxylin and eosin, but it is somewhat more dense than HA. Around the PLA particles, clusters of macrophages with single neutrophils form (see Figs. 3 and 4).
Кроме таких участков видны поля формирующейся грануляционной ткани, окружающей имплантат (Фиг. 5). Они состоят из тяжей фибробластов и новообразованных сосудов капиллярного типа, а также многочисленных макрофагов и лимфоцитов с единичными нейтрофилами. Фибробласты и сосуды грануляционной ткани врастают в фибрин и ГК. В самой грануляционной ткани частиц PLA не обнаруживаются.In addition to such areas, the fields of the emerging granulation tissue surrounding the implant are visible (Fig. 5). They consist of cords of fibroblasts and newly formed vessels of the capillary type, as well as numerous macrophages and lymphocytes with single neutrophils. Fibroblasts and vessels of granulation tissue grow into fibrin and HA. No particles of PLA are found in the granulation tissue itself.
На 10 сутки при визуальном осмотре имплантат присутствует в месте введения в виде компактного округлого образования плотноэластической консистенции, окруженного капсулой.On
Гистологически на месте введения материала видна жировая клетчатка и капсула, в которой выявляются очаги фиброзирующейся грануляционной ткани (Фиг. 6). Эта ткань состоит из тяжей фибробластов, коллагеновых волокон и небольшого количества макрофагов. Местами обнаруживаются частицы PLA, окруженные макрофагами и фибробластами.Histologically, at the injection site, fatty tissue and a capsule are visible, in which foci of fibrosing granulation tissue are detected (Fig. 6). This tissue consists of strands of fibroblasts, collagen fibers and a small number of macrophages. Locally, PLA particles are found surrounded by macrophages and fibroblasts.
На 30 сутки при осмотре места имплантации определяются уплотнения в виде конгломератов неопределенной формы, несколько уменьшенного объема по сравнению с первоначальным имплантатом.On the 30th day, when examining the implantation site, seals are determined in the form of conglomerates of an indefinite shape, a slightly reduced volume compared to the initial implant.
Гистологически у двух животных из трех на месте введения обнаружена жировая клетчатка, а в ней участки фиброза (коллагеновые волокна и фибробласты) с единичными частицами PLA. Гистологическая картина близка к вышеописанной на 10 сутки. У одного животного в жировой клетчатке осталась более крупная гранулема, которая сформирована из менее зрелой грануляционной ткани, состоящей из многочисленных сосудов, макрофагов, лимфоцитов и фибробластов (Фиг. 7). В этой ткани сохранились еще немногочисленные мелкие ячейки, содержащие прозрачную ГК, а также увеличенное количество частиц PLA. При этом PLA начинает становиться менее плотной и с нечеткими границами. Таким образом, частицы PLA подвергаются макрофагальной резорбции.Histologically, in two of the three animals, fatty tissue was found at the injection site, and in it there were fibrosis sites (collagen fibers and fibroblasts) with single particles of PLA. The histological picture is close to the above on the 10th day. In one animal, a larger granuloma remained in the fatty tissue, which was formed from a less mature granulation tissue, consisting of numerous vessels, macrophages, lymphocytes and fibroblasts (Fig. 7). In this tissue, there are still a few small cells containing transparent HA, as well as an increased number of PLA particles. In this case, the PLA begins to become less dense and with fuzzy boundaries. Thus, PLA particles undergo macrophage resorption.
На 90 сутки в месте введения отмечены уплотнения в заметно уменьшенном объеме.On the 90th day at the injection site, compaction was noted in a markedly reduced volume.
Гистологически у двух животных из трех на месте введения препарата обнаруживается жировая ткань с очень небольшими участками фиброза и единичными частицами PLA. У одного животного участки фиброзированной жировой клетчатки встречаются чаще, они более крупные и содержат сравнительно большое количество частиц PLA (Фиг. 8). Некоторые частицы располагаются близко друг другу и окружены очень тонкой соединительно-тканной микрокапсулой, содержащей немногочисленные коллагеновые волокна, макрофаги и фибробласты, реже единичные многоядерные гигантские клетки инородных тел.Histologically, in two of the three animals, adipose tissue with very small areas of fibrosis and single PLA particles was found at the injection site. In one animal, areas of fibrosed fatty tissue are more common, they are larger and contain a relatively large number of PLA particles (Fig. 8). Some particles are located close to each other and are surrounded by a very thin connective tissue microcapsule containing a few collagen fibers, macrophages and fibroblasts, less often single multinuclear giant cells of foreign bodies.
Таким образом,In this way,
1. Все препараты после имплантации под кожу крысам вызывают умеренную воспалительную реакцию, затем - пролиферативную реакцию, формирование грануляционной ткани и образование соединительнотканной капсулы вокруг имплантата. Эта капсула созревает, а грануляционная ткань постепенно прорастает внутрь имплантата, разделяя гель на фрагменты. ГК с различной скоростью резорбируется макрофагами и лизируется под воздействием тканевых гиалуронидаз. Полимерные частицы, суспендированные в геле, сохраняются дольше.1. All preparations after implantation under the skin of rats cause a moderate inflammatory reaction, then a proliferative reaction, the formation of granulation tissue and the formation of a connective tissue capsule around the implant. This capsule matures and granulation tissue gradually grows inside the implant, dividing the gel into fragments. HA with different rates is resorbed by macrophages and lysed under the influence of tissue hyaluronidases. The polymer particles suspended in the gel last longer.
2. Скорость рассасывания гиалуроновой кислоты и суспендированных в ней частиц, а также особенности тканевой реакции различны.2. The rate of resorption of hyaluronic acid and particles suspended in it, as well as the characteristics of the tissue reaction are different.
3. Окруженный капсулой, гель остается в месте введения до конца наблюдений (90 суток). При этом в полости капсулы, окружающей гель скапливается фибринозный экссудат.3. Surrounded by the capsule, the gel remains at the injection site until the end of the observation (90 days). At the same time, fibrinous exudate accumulates in the cavity of the capsule surrounding the gel.
4. При имплантации в подкожную клетчатку вызывает наиболее выраженную тканевую реакцию. Уже на 3-и сутки имплантат начинает прорастать грануляционной тканью. Гиалуроновая кислота резорбируется постепенно, к 30-м суткам остаются лишь ее следы. Частицы полимолочной кислоты также постепенно резорбируются макрофагами, но через 30 суток после имплантации они еще присутствуют в толще фиброзно-рубцовой ткани, замещающей имплантат.4. When implanted into the subcutaneous tissue, it causes the most pronounced tissue reaction. Already on the 3rd day, the implant begins to grow with granulation tissue. Hyaluronic acid is resorbed gradually, by the 30th day only traces of it remain. Particles of polylactic acid are also gradually resorbed by macrophages, but 30 days after implantation, they are still present in the thickness of the fibro-scar tissue replacing the implant.
Имплантат обладает эффектами бифазных филлеров, и при этом равномерно интегрируется в тканях как монофазный гель. Неоспоримым преимуществом имплантата является его пластичность, идеальная интеграция в тканях, хорошее удержание объема и комфортность при введении для испытуемого даже без использования анестезии.The implant has the effects of biphasic fillers, and at the same time it integrates evenly in tissues like a monophasic gel. The indisputable advantage of the implant is its plasticity, perfect integration in the tissues, good volume retention and comfort when administered to the subject even without the use of anesthesia.
Особенности и преимуществаFeatures and Benefits
- Стойкое филинговое действие, высокая пластичность, равномерная биодеградация.- Persistent filing action, high ductility, uniform biodegradation.
- Быстрый результат после процедуры, не требующий докоррекции.- Fast result after the procedure, which does not require further correction.
- Отсутствие выраженного отека.- Lack of pronounced edema.
- Максимально комфортно и безболезненно для пациента.- The most comfortable and painless for the patient.
Инновационный высокопластичный имплантат гарантированно восполняет необходимый объем, легко проходя через иглы и канюли небольшого диаметра.An innovative high-plastic implant is guaranteed to fill the required volume, easily passing through small diameter needles and cannulas.
Claims (14)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016137673A RU2641053C1 (en) | 2016-09-21 | 2016-09-21 | Solid phase method for production of bioactive composite for tissue growing based on hyaluronic acid or polylactide microparticles and its copolymers, and method for manufacture of implant based on this composite |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016137673A RU2641053C1 (en) | 2016-09-21 | 2016-09-21 | Solid phase method for production of bioactive composite for tissue growing based on hyaluronic acid or polylactide microparticles and its copolymers, and method for manufacture of implant based on this composite |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2641053C1 true RU2641053C1 (en) | 2018-01-15 |
Family
ID=68235647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016137673A RU2641053C1 (en) | 2016-09-21 | 2016-09-21 | Solid phase method for production of bioactive composite for tissue growing based on hyaluronic acid or polylactide microparticles and its copolymers, and method for manufacture of implant based on this composite |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2641053C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2710074C1 (en) * | 2019-10-02 | 2019-12-24 | Общество с ограниченной ответственностью "МедикалСайнс" | Hydrogel water-soluble composition based on hyaluronic acid and polyvalent metal ions and a method for production thereof |
| RU2745123C1 (en) * | 2020-07-02 | 2021-03-22 | Общество с ограниченной ответственностью "МедикалСайнс" | Bioactive composition based on a cross-linked hyaluronic acid salt containing quercetin and a method for its preparation |
| RU2745124C1 (en) * | 2020-07-02 | 2021-03-22 | Общество с ограниченной ответственностью "МедикалСайнс" | Bioactive composition based on a crosslinked hyaluronic acid salt containing resveratrol and a method of its preparation |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2214283C2 (en) * | 1997-06-13 | 2003-10-20 | Авентис Фармасьютикалз Холдингз Инк. | Implant for subcutaneous or intracutaneous injection |
| RU2416389C1 (en) * | 2009-10-26 | 2011-04-20 | Учреждение Российской академии наук Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН (ИСПМ РАН) | Solid-phase method of producing bioactive nanocomposite |
| RU2532032C1 (en) * | 2013-03-21 | 2014-10-27 | Сергей Алексеевич Успенский | Solid-phase method of producing water-soluble bioactive nanocomposite based on melanin-modified hyaluronic acid salt and gold nanoparticles |
-
2016
- 2016-09-21 RU RU2016137673A patent/RU2641053C1/en active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2214283C2 (en) * | 1997-06-13 | 2003-10-20 | Авентис Фармасьютикалз Холдингз Инк. | Implant for subcutaneous or intracutaneous injection |
| RU2416389C1 (en) * | 2009-10-26 | 2011-04-20 | Учреждение Российской академии наук Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН (ИСПМ РАН) | Solid-phase method of producing bioactive nanocomposite |
| RU2532032C1 (en) * | 2013-03-21 | 2014-10-27 | Сергей Алексеевич Успенский | Solid-phase method of producing water-soluble bioactive nanocomposite based on melanin-modified hyaluronic acid salt and gold nanoparticles |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2710074C1 (en) * | 2019-10-02 | 2019-12-24 | Общество с ограниченной ответственностью "МедикалСайнс" | Hydrogel water-soluble composition based on hyaluronic acid and polyvalent metal ions and a method for production thereof |
| RU2745123C1 (en) * | 2020-07-02 | 2021-03-22 | Общество с ограниченной ответственностью "МедикалСайнс" | Bioactive composition based on a cross-linked hyaluronic acid salt containing quercetin and a method for its preparation |
| RU2745124C1 (en) * | 2020-07-02 | 2021-03-22 | Общество с ограниченной ответственностью "МедикалСайнс" | Bioactive composition based on a crosslinked hyaluronic acid salt containing resveratrol and a method of its preparation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pires et al. | Polymer-based biomaterials for pharmaceutical and biomedical applications: A focus on topical drug administration | |
| Eldeeb et al. | Biomaterials for tissue engineering applications and current updates in the field: A comprehensive review | |
| ES2647227T3 (en) | Method for crosslinking hyaluronic acid; method of preparing an injectable hydrogel; hydrogel obtained; use of the gel obtained | |
| ES2443045T3 (en) | Silk fibroin hydrogels and their uses | |
| Kouhi et al. | Injectable gellan gum/lignocellulose nanofibrils hydrogels enriched with melatonin loaded forsterite nanoparticles for cartilage tissue engineering: Fabrication, characterization and cell culture studies | |
| US20040047892A1 (en) | Filler composition for soft tissue augmentation and reconstructive surgery | |
| Adali et al. | The chondrocyte cell proliferation of a chitosan/silk fibroin/egg shell membrane hydrogels | |
| KR20170123099A (en) | Dermal Filler Composition Containing Polycaprolactone And Hyaluronic Acid | |
| ES2746252T3 (en) | Homogeneous aqueous solution of chitosan for injection | |
| JP2001513367A (en) | Temperature-controlled pH-dependent formation of ionic polysaccharide gels | |
| JP2000516839A (en) | Subcutaneous or intradermal implants | |
| AU2011208709B2 (en) | Hydrogel of microspheres | |
| EP3285781B1 (en) | Homogeneous aqueous solution of injectable chitosan having a ph close to physiological ph | |
| RU2641053C1 (en) | Solid phase method for production of bioactive composite for tissue growing based on hyaluronic acid or polylactide microparticles and its copolymers, and method for manufacture of implant based on this composite | |
| RU2315627C2 (en) | Injecting ceramic-based implants for filling of crinkles, skin cavity and cicatrices and method for production thereof | |
| Bonani et al. | Natural origin materials for osteochondral tissue engineering | |
| CN110624103B (en) | Biomaterial device and topical composition for the treatment of skin abnormalities | |
| Wan et al. | Bulk erosion degradation mechanism for poly (1, 8-octanediol-co-citrate) elastomer: an in vivo and in vitro investigation | |
| EP1333869A2 (en) | Filler composition for soft tissue augmentation | |
| ES2906715T3 (en) | Biomaterial devices for guided tissue regeneration | |
| Maurya et al. | Smart Polymeric Biomaterials in Tissue Engineering | |
| KR20160046570A (en) | Drug delivery systems for treatment or prevention of inflammatory diseases or pain and methods for manufacturing the same | |
| Kim et al. | Hydrogels as filler materials | |
| Bartoli et al. | Recent Advancements in Polymers for Biomedical Applications | |
| Tamboli et al. | Biodegradable polymers for ophthalmic applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190922 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20200727 |