RU2638131C1 - Photosensitize based on carbocyanine dye for photodynamic therapy of tumours - Google Patents
Photosensitize based on carbocyanine dye for photodynamic therapy of tumours Download PDFInfo
- Publication number
- RU2638131C1 RU2638131C1 RU2016150835A RU2016150835A RU2638131C1 RU 2638131 C1 RU2638131 C1 RU 2638131C1 RU 2016150835 A RU2016150835 A RU 2016150835A RU 2016150835 A RU2016150835 A RU 2016150835A RU 2638131 C1 RU2638131 C1 RU 2638131C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- dye
- complex
- tumor
- drug
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 24
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 8
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 22
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 claims description 2
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 abstract description 15
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 abstract description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 9
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 abstract description 8
- 101000827785 Homo sapiens Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 abstract description 4
- 101000848653 Homo sapiens Tripartite motif-containing protein 26 Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 102000046101 human AFP Human genes 0.000 abstract description 4
- 230000001443 photoexcitation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 abstract 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 101100452003 Caenorhabditis elegans ape-1 gene Proteins 0.000 description 30
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 13
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 9
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 6
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 201000011519 neuroendocrine tumor Diseases 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M pinacyanol iodide Chemical group [I-].C1=CC2=CC=CC=C2N(CC)C1=CC=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=[N+]1CC QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC=NC2=C1 IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- -1 for example Chemical class 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000002165 photosensitisation Effects 0.000 description 2
- IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N phthalocyanine Chemical compound N1C(N=C2C3=CC=CC=C3C(N=C3C4=CC=CC=C4C(=N4)N3)=N2)=C(C=CC=C2)C2=C1N=C1C2=CC=CC=C2C4=N1 IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 1
- HIYWOHBEPVGIQN-UHFFFAOYSA-N 1h-benzo[g]indole Chemical compound C1=CC=CC2=C(NC=C3)C3=CC=C21 HIYWOHBEPVGIQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 1
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 1
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical class C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGOSWYKAUGNTMU-UHFFFAOYSA-N Cl.NCCC1=CC=C(CS(F)(=O)=O)C=C1 Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(CS(F)(=O)=O)C=C1 JGOSWYKAUGNTMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 150000004036 bacteriochlorins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 150000004035 chlorins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- BTXNYTINYBABQR-UHFFFAOYSA-N hypericin Chemical compound C12=C(O)C=C(O)C(C(C=3C(O)=CC(C)=C4C=33)=O)=C2C3=C2C3=C4C(C)=CC(O)=C3C(=O)C3=C(O)C=C(O)C1=C32 BTXNYTINYBABQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940005608 hypericin Drugs 0.000 description 1
- PHOKTTKFQUYZPI-UHFFFAOYSA-N hypericin Natural products Cc1cc(O)c2c3C(=O)C(=Cc4c(O)c5c(O)cc(O)c6c7C(=O)C(=Cc8c(C)c1c2c(c78)c(c34)c56)O)O PHOKTTKFQUYZPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine group Chemical group N1=CCC2=CC=CC=C12 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 150000002678 macrocyclic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical group C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229960002700 octreotide Drugs 0.000 description 1
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- SSKVDVBQSWQEGJ-UHFFFAOYSA-N pseudohypericin Natural products C12=C(O)C=C(O)C(C(C=3C(O)=CC(O)=C4C=33)=O)=C2C3=C2C3=C4C(C)=CC(O)=C3C(=O)C3=C(O)C=C(O)C1=C32 SSKVDVBQSWQEGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical group O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2121/00—Preparations for use in therapy
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к созданию фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний, и может быть использовано для разработки новых препаратов, обладающих высокой селективностью и эффективностью терапевтического воздействия.The invention relates to the field of biotechnology and medicine, in particular to the creation of photosensitizers (PS) for photodynamic therapy (PDT) of cancer, and can be used to develop new drugs with high selectivity and therapeutic effect.
Фотодинамическая терапия представляет собой метод терапии опухолей, основанный на одновременном использовании двух факторов, совместно вызывающих уничтожение раковых клеток: введения фотосенсибилизатора и локального облучения светом определенной длины волны видимого или ИК-диапазона. Поскольку непосредственной причиной смертельного повреждения опухолевой клетки являются активные (синглетные) формы кислорода, эффективность ФДТ напрямую зависит от наличия и концентрации кислорода в опухолевой ткани.Photodynamic therapy is a tumor therapy method based on the simultaneous use of two factors that together cause the destruction of cancer cells: the introduction of a photosensitizer and local exposure to light of a certain wavelength of the visible or infrared range. Since the direct cause of fatal damage to the tumor cell is the active (singlet) form of oxygen, the effectiveness of PDT is directly dependent on the presence and concentration of oxygen in the tumor tissue.
Процедура ФДТ выполняется в виде двух последовательных этапов: на первом этапе внутривенно или местно вводится фотосенсибилизатор, который за счет пассивного биораспределения или энергозависимого транспорта избирательно накапливается в опухоли; на втором этапе проводится облучение источником света с длиной волны, максимально соответствующей спектру поглощения ФС. Эффективный ФС должен хорошо растворяться в водной среде и интенсивно поглощать свет в так называемом фототерапевтическом окне - в области наибольшей спектральной прозрачности тканей (650-850 нм), передавая поглощенную световую энергию на кислород, который в результате переходит в триплетное возбужденное состояние, окисляет биомолекулы и вызывает гибель клеток. Возможен также альтернативный путь генерации активной формы кислорода - супероксиданион-радикала, за счет прямой передачи электрона с триплетного состояния красителя на молекулярный кислород.The PDT procedure is performed in two consecutive stages: at the first stage, a photosensitizer is injected intravenously or locally, which selectively accumulates in the tumor due to passive biodistribution or energy-dependent transport; at the second stage, the light source is irradiated with a wavelength that is most consistent with the absorption spectrum of the FS. An effective PS should dissolve well in an aqueous medium and absorb light intensively in the so-called phototherapeutic window - in the region of the highest spectral transparency of tissues (650-850 nm), transferring the absorbed light energy to oxygen, which as a result goes into a triplet excited state, oxidizes biomolecules and causes cell death. An alternative way of generating the active form of oxygen — the superoxidion radical — is also possible due to direct electron transfer from the triplet state of the dye to molecular oxygen.
При любой из описанных схем эффективный ФС должен давать максимальный выход триплетного возбужденного состояния при фотовозбуждении за счет перехода из первичного короткоживущего синглетного состояния. Красители, не способные переходить в триплетное состояние, рассеивают поглощенную энергию в виде тепловых колебаний и не пригодны для использования в качестве ФС, хотя они могут обладать при этом высоким квантовым выходом флуоресценции [Schaberle F.A. et al., Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2009, 72(4), 863-867]. Предсказать способность красителя переходить в триплетное состояние на основании известного строения молекулы невозможно.In any of the described schemes, an effective FS should give the maximum yield of the triplet excited state upon photoexcitation due to the transition from the primary short-lived singlet state. Dyes that are not able to transition to the triplet state scatter the absorbed energy in the form of thermal vibrations and are not suitable for use as a PS, although they may have a high fluorescence quantum yield [Schaberle F.A. et al., Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2009, 72 (4), 863-867]. It is impossible to predict the ability of a dye to transition to a triplet state based on the known molecular structure.
В качестве фотосенсибилизаторов для применения в ФДТ предложено множество препаратов, относящихся к разным классам химических соединений, например фуллерены [Li Q. et al., Nanosci. Nanotechnol. 2016, 16(6): 5592-5597; Yu C. et al. J. Nanosci. Nanotechnol. 2016, 16(1): 171-181], цианины [Shi C. et al., J. Biomed Opt. 2016, 21(5): 50901], гиперицин [Huntosova V. & Stroffekova K. Cancers (Basel) 2016, 8(10), pii: E93], неорганические композиции со свойствами полупроводников (квантовые точки) [Colombeau L. et al., Top Curr. Chem. 2016, 370, 113-134]. Однако в настоящее время в практике ФДТ наиболее широко применяют ФС, в состав которых входят тетрапиррольные макроциклы, в частности порфирины, хлорины, бактериохлорины, фталоцианины. Красители, как правило, используют в форме комплексов с белком-носителем, способствующим повышению биодоступности, специфичности и эффективности терапевтического воздействия препаратов. Один из известных подходов связан с использованием в качестве белка-носителя сывороточного альбумина, который образует с гидрофобными молекулами противоопухолевых агентов растворимые в плазме крови прочные комплексы, обладающие высокой тропностью к опухолям вследствие высокого уровня катаболической активности опухолевых клеток по сравнению с собственными клетками организма. [Mishra P.P. et al., J. Phys. Chem. B. 2006, 110, 21238]. Так, например, в патенте США [US 9211283 В2, опубл. 15.12.2015] описана система, основанная на доставке в опухоль гидрофобного тетрапиррольного фотосенсибилизатора в форме наночастиц, включающих ФС-препарат, стабилизированный человеческим сывороточным альбумином (ЧСА). В публикации [WO 2012006780 А1, опубл. 2012] описан ФС, представляющий собой комплекс фталоцианина с сывороточным альбумином. Использование сывороточного альбумина в композициях с ФС позволяет стабилизировать плохо растворимые в водной среде соединения, а также повысить эффективность их накопления в опухоли, однако при этом не обеспечивается необходимая селективность доставки ФС в опухоль, поскольку ЧСА поглощается не только опухолями, но и здоровыми тканями, хотя и с меньшей, по сравнению с опухолью, скоростью.As a photosensitizer for use in PDT, many drugs are proposed that belong to different classes of chemical compounds, for example, fullerenes [Li Q. et al., Nanosci. Nanotechnol. 2016, 16 (6): 5592-5597; Yu C. et al. J. Nanosci. Nanotechnol. 2016, 16 (1): 171-181], cyanines [Shi C. et al., J. Biomed Opt. 2016, 21 (5): 50901], hypericin [Huntosova V. & Stroffekova K. Cancers (Basel) 2016, 8 (10), pii: E93], inorganic compositions with the properties of semiconductors (quantum dots) [Colombeau L. et al ., Top Curr. Chem. 2016, 370, 113-134]. However, at present, in the practice of PDT, PS is most widely used, which include tetrapyrrole macrocycles, in particular porphyrins, chlorins, bacteriochlorins, and phthalocyanines. Dyes, as a rule, are used in the form of complexes with a carrier protein, which enhances the bioavailability, specificity and effectiveness of the therapeutic effect of the preparations. One of the well-known approaches involves the use of serum albumin as a carrier protein, which forms, with hydrophobic molecules of antitumor agents, plasma-soluble durable complexes with high tropism for tumors due to the high level of catabolic activity of tumor cells compared to the body's own cells. [Mishra P.P. et al., J. Phys. Chem. B. 2006, 110, 21238]. So, for example, in US patent [US 9211283 B2, publ. 12/15/2015] a system is described based on the delivery to the tumor of a hydrophobic tetrapyrrole photosensitizer in the form of nanoparticles, including a FS preparation stabilized by human serum albumin (HSA). In the publication [WO 2012006780 A1, publ. 2012] described FS, which is a complex of phthalocyanine with serum albumin. The use of serum albumin in compositions with PS makes it possible to stabilize compounds poorly soluble in the aqueous medium and to increase the efficiency of their accumulation in the tumor, however, the required selectivity of PS delivery to the tumor is not ensured, since HSA is absorbed not only by tumors, but also by healthy tissues, although and with a lower speed compared to the tumor.
Анализ уровня техники показывает, что такой класс фотохимически активных соединений, как карбоцианиновые красители, до сих пор не нашел практического применения в фотодинамической терапии опухолей. В качестве прототипа нами взят практически единственный, известный препарат для диагностики и фотодинамической терапии нейроэндокринных опухолей, содержащий карбоцианиновый краситель, описанный в группе патентов [US 7510700 В2, опубл. 31.03.2009, US 7252815 В2, опубл. 07.08.2007 и др.]. Согласно прототипу опухолеспецифичный фототерапевтический и фотодиагностический препарат представляет собой ковалентный комплекс (биоконъюгат), включающий три различающихся функционально компонента: в качестве визуализирующего компонента он содержит бензиндольный карбоцианиновый краситель, в структуре молекулы которого имеются химически активные электрофильные группы, позволяющие ковалентно присоединять молекулу фотосенсибилизатора для ФДТ и сайт-специфичные средства адресной доставки препарата в опухоль. Следует отметить, что входящий в состав комплекса карбоцианиновый краситель по замыслу авторов предназначен для ковалентной сшивки компонентов между собой, а также для визуализации опухолевого процесса в диагностических исследованиях. Способность карбоцианинового красителя выполнять функцию фотосенсибилизирующего агента авторами не рассматривается. ФС-активность комплекса обеспечивается присутствием в его составе классического фотосенсибилизатора тетрапиррольного типа 2-[1-гексилоксиэтил]-2-дивинилпирофеофорбид-α (НРРН). В качестве средства адресной доставки препарата в опухоль прототип включает синтетический полипептид октреотид или бомбезин - аналоги соматостатина, обладающего сродством к поверхностным рецепторам нейроэндокринных опухолей. Несмотря на то что авторам удалось получить приемлемый выход предложенного ими трехкомпонентного конъюгата, очевидно, что использование в структуре препарата одновременно трех сложных компонентов, включая 8-10-членные пептиды, получаемые твердофазным синтезом, выводит себестоимость его получения на уровень, в десятки раз превышающий затраты на получение любого традиционного ФС тетрапиррольного или фталоцианинового типа. Для синтеза биоконъюгата необходимо получать промежуточные активированные формы компонентов путем введения изотиоцинатной или сукцинимидной групп, необходимых для ковалентной сшивки. Это не только усложняет и удорожает синтез, но и приводит к возникновению небиогенных ковалентных связей в месте сочленения пептида с активированным красителем, что неизбежно повышает побочную токсичность фотосенсибилизатора. К недостаткам этого технического решения также следует отнести высокое сродство НРРН к сывороточному альбумину, которое, как известно, характерно для соединений этого класса. Концентрация альбумина в плазме крови на несколько порядков превышает концентрацию рецепторов опухолеспецифичных пептидов на поверхности клеток нейроэндокринных желез и опухолевых тканей, образующихся при их злокачественном перерождении. Из-за этого практически весь конъюгат при попадании в кровь окажется связанным альбумином, эффективно поглощаемым различными типами нормальных клеток организма человека. В результате специфичность доставки препарата в опухоль на практике будет мало отличаться от специфичности мономерного НРРН, несмотря на существенно более высокую стоимость конъюгата по сравнению с мономерным красителем. Недостатком аналога также является узкий спектр терапевтической активности, ограниченный опухолями нейроэндокринной природы, составляющими около 0,1% от встречающихся на практике онкологических заболеваний [Rose D.B. et al., J. Med. Econ. 2016, 16, 1-19].An analysis of the prior art shows that a class of photochemically active compounds such as carbocyanine dyes has not yet found practical application in the photodynamic therapy of tumors. As a prototype, we took almost the only known drug for the diagnosis and photodynamic therapy of neuroendocrine tumors containing the carbocyanine dye described in the group of patents [US 7510700 B2, publ. 03/31/2009, US 7252815 B2, publ. 08/07/2007 and others]. According to the prototype, a tumor-specific phototherapeutic and photodiagnostic preparation is a covalent complex (bioconjugate), which includes three functionally different components: as a visualizing component, it contains a benzindole carbocyanine dye, in the molecule structure of which there are chemically active electrophilic groups that allow covalently attach the photosensitizer molecule to the PD -specific means of targeted delivery of the drug to the tumor. It should be noted that the carbocyanine dye, which is part of the complex, is intended by the authors to covalently cross-link components together, as well as to visualize the tumor process in diagnostic studies. The ability of the carbocyanine dye to act as a photosensitizing agent is not considered by the authors. The PS activity of the complex is ensured by the presence in its composition of the classic tetrapyrrole-type photosensitizer 2- [1-hexyloxyethyl] -2-divinylpyrofeophorbid-α (NRPH). As a means of targeted delivery of the drug to the tumor, the prototype includes a synthetic octreotide or bombesin polypeptide - analogues of somatostatin, which has an affinity for surface receptors of neuroendocrine tumors. Despite the fact that the authors managed to obtain an acceptable yield of the three-component conjugate they proposed, it is obvious that the use of three complex components at the same time in the drug structure, including 8-10-membered peptides obtained by solid-phase synthesis, displays the cost of its production at a level ten times higher than the cost to receive any traditional tetrapyrrole or phthalocyanine type PS. For the synthesis of a bioconjugate, it is necessary to obtain intermediate activated forms of the components by introducing the isothiocinate or succinimide groups necessary for covalent crosslinking. This not only complicates and increases the cost of synthesis, but also leads to the appearance of non-biogenic covalent bonds at the junction of the peptide with the activated dye, which inevitably increases the side toxicity of the photosensitizer. The disadvantages of this technical solution should also include the high affinity of NRH for serum albumin, which, as you know, is typical for compounds of this class. The concentration of albumin in blood plasma is several orders of magnitude higher than the concentration of receptors of tumor-specific peptides on the surface of cells of neuroendocrine glands and tumor tissues formed during their malignant degeneration. Because of this, almost the entire conjugate, when it enters the bloodstream, will be bound by albumin, which is effectively absorbed by various types of normal cells of the human body. As a result, the specificity of drug delivery to the tumor in practice will differ little from the specificity of monomeric NRH, despite the significantly higher cost of the conjugate compared to the monomeric dye. A disadvantage of the analogue is also a narrow spectrum of therapeutic activity, limited to neuroendocrine tumors of nature, accounting for about 0.1% of the oncological diseases encountered in practice [Rose D.B. et al., J. Med. Econ. 2016, 16, 1-19].
Техническая проблема, решение которой обеспечивается данным изобретением - расширение арсенала средств для фотодинамической терапии опухолей за счет введения в практику нового фотосенсибилизатора на основе красителя карбоцианиновой группы.The technical problem, the solution of which is provided by this invention, is the expansion of the arsenal of means for the photodynamic therapy of tumors due to the introduction of a new photosensitizer based on the dye of the carbocyanine group.
Сущность изобретения состоит в том, что новый фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии опухолей представляет собой комплекс, включающий карбоцианиновый краситель и средство адресной доставки препарата в опухоль, отличающийся тем, что в качестве карбоцианинового красителя комплекс включает 2,6-бис-(3,7-ди-N-метил-бенз[1,2-d:4,3-d']бистиазол-)-[N-метил-3,3'-диметил-индокарбоцианина] перхлорат, в качества средства адресной доставки препарата в опухоль комплекс включает ренатурированный ступенчатым диализом рекомбинантный белок АрЕ1, характеризующийся аминокислотной последовательностью рецептор-связывающего домена 3 альфа-фетопротеина человека rhAFP3d с присоединенным к С-концу фрагментом, состоящим из последовательности, включающей 22 остатка глутаминовой кислоты и аффинную метку 6His-таг, при этом комплекс образован за счет нековалентных межмолекулярных взаимодействий между названным карбоцианиновым красителем и названным средством адресной доставки препарата в опухоль.The essence of the invention lies in the fact that the new photosensitizer for the photodynamic treatment of tumors is a complex comprising a carbocyanine dye and a means for targeted delivery of the drug to the tumor, characterized in that the complex includes 2,6-bis (3,7-di -N-methyl-benz [1,2-d: 4,3-d '] bistiazole -) - [N-methyl-3,3'-dimethyl-indocarbocyanine] perchlorate; as a means of targeted delivery of the drug to the tumor, the complex includes recombinant ApE1 recombinant protein renatured by step dialysis, character produced by the amino acid sequence of the receptor-binding
Соединение 2,6-бис-(3,7-ди-N-метил-бенз[1,2-d:4,3-d']бистиазол-)-[N-метил-3,3'-диметил-индокарбоцианина] перхлорат (далее - БКЦ) имеет молекулярную массу 718 г/моль и относится к бискарбоцианиновым полиметиновым красителям. Строение молекулы БКЦ и спектр поглощения в 96% этаноле показаны на Фиг. 1. Молекула БКЦ обладает симметричной структурой, включает хромофоры индоленинового и бензтиазольного типа, сопряженные друг с другом через цепочку метановых групп, и несет два положительных заряда при физиологических значениях рН. БКЦ мало растворим в воде, хорошо растворим в полярных органических растворителях, например 96% этаноле и диметалсульфоксиде (ДМСО). Получение БКЦ описано в работе [Киприанов А.И. и Мушкало И.Л., Журн. Орг. Хим., 1965, 1(4), 744-750]. Известно применение этого соединения в качестве фотосенсибилизатора галогенидов серебра, применяемых в цветной фотографии [Дядюша Е.Е. и соавт., Журн. Научн. Прикл. Фотограф. Кинематограф., 1981, 26, 174].
Проведенные авторами исследования фотохимических свойств красителя БКЦ показали, что при прямом фотовозбуждении раствора красителя БКЦ в этаноле образуется короткоживущий интермедиат триплетной природы с максимумом поглощения при 640 нм, который эффективно тушится кислородом. При концентрации кислорода в этиловом спирте 2×10-3 М это приводит к сокращению времени жизни триплета до 1 мкс. Прямое доказательство способности БКЦ переходить в триплетное состояние получено в экспериментах по Т-Т переносу энергии от донора (антрацен) на молекулу БКЦ при УФ-фотовозбуждении, в которых наблюдалось сенсибилизированное заселение триплетного уровня молекулы красителя с одновременным тушением триплета донора. Эти результаты доказывают, что в гидрофобном окружении молекула БКЦ приобретает способность переходить в триплетное состояние, что является необходимой предпосылкой для возможности использования БКЦ в качестве фотосенсибилизатора. Аналогичные процессы имеют место и при образовании нековалентного комплекса молекулы красителя с белком, что, как будет показано ниже, проявляется в повышении квантового выхода флуоресценции и непосредственно связанного с ним выхода триплетного возбужденного состояния [Schaberle F.A. et al. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2009, 72(4), 863-867].A study of the photochemical properties of the BCC dye by the authors showed that with direct photoexcitation of a solution of the BCC dye in ethanol, a short-lived triplet intermediate with an absorption maximum at 640 nm is formed, which is effectively quenched with oxygen. When the oxygen concentration in ethyl alcohol is 2 × 10 −3 M, this leads to a reduction in the triplet lifetime to 1 μs. Direct evidence of the ability of BCC to transition to the triplet state was obtained in experiments on TT transfer of energy from a donor (anthracene) to a BCC molecule under UV photoexcitation, in which sensitized population of the triplet level of the dye molecule was observed with simultaneous quenching of the donor triplet. These results prove that in a hydrophobic environment, the BCC molecule acquires the ability to transition to the triplet state, which is a necessary prerequisite for the possibility of using BCC as a photosensitizer. Similar processes take place during the formation of a non-covalent complex of a dye molecule with a protein, which, as will be shown below, is manifested in an increase in the quantum yield of fluorescence and the directly associated yield of a triplet excited state [Schaberle FA et al. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2009, 72 (4), 863-867].
Выбор соединения 2,6-бис-(3,7-ди-N-метил-бенз[1,2-d:4,3-d']бистиазол-)-[N-метил-3,3'-диметил-индокарбоцианина] перхлорат в качестве потенциального ФС основан также на результатах, описанных в работе [Murakami L.S. et al. Biochim. Biophys. Acta. 2015, 1850(6), 1150-1157], в которой показано, что в среде культивирования опухолевых клеток меланомы in vitro вещество накапливается в них и вызывает их фотоиндуцированную гибель. После инкубирования в течение 5 часов препарата в концентрации 5 мкМ с клетками меланомы в среде, содержащей около 100 мкМ сывороточного альбумина в составе добавленной в нее фетальной сыворотки, и последующего облучения светом с длиной волны 500 нм, фотоиндуцированная гибель клеток составляет 100%. В качестве биологической особенности соединения показана его тропность к митохондриям клеток и его способность накапливаться в перинуклеарном пространстве. В совокупности эти факты показывают принципиальную возможность применения данного соединения в качестве фотосенсибилизатора для разрушения раковых клеток, однако для реализации этой возможности - создания эффективного фотосенсибилизирующего средства для практического применения в ФДТ, требуется преодолеть следующие ограничения:Choice of
- растворимость соединения в водных средах составляет менее 1 мкМ, что недостаточно для использования его в свободном виде, поскольку для достижения терапевтического эффекта потребуются высокие дозы препарата;- the solubility of the compound in aqueous media is less than 1 μM, which is not enough to use it in its free form, since high doses of the drug will be required to achieve a therapeutic effect;
- соединение показывает незначительный квантовый выход триплетного состояния в водных средах, что определяет его неприемлемо низкую для практического применения фотосенсибилизирующую способность в свободном состоянии;- the compound shows an insignificant quantum yield of the triplet state in aqueous media, which determines its unacceptably low photosensitizing ability in the free state for practical use;
- необходимо обеспечить специфичность действия препарата in vivo путем адресной доставки соединения в опухолевую ткань.- it is necessary to ensure the specificity of the action of the drug in vivo by targeted delivery of the compound to the tumor tissue.
В отличие от используемых в настоящее время в практике ФДТ фталоцианинов, имеющих четыре циклически расположенные индолениновые группировки, и полностью аналогичных по своим фотохимическим характеристикам тетрапирролам структура карбоцианинов, и БКЦ в частности, характеризуется линейным расположением полиметиновых цепей, соединяющих гетероароматические хромофорные группы. В водной среде полиметиновая цепь чрезвычайно подвижна и не обеспечивает сопряжения хромофоров, необходимого для достижения высокого квантового выхода флуоресценции, и линейно зависящего от него, выхода триплетного состояния (если оно возможно для конкретной структуры). Кроме того, в водных средах из-за высокой гидрофобности происходит димеризация, увеличивающая число степеней свободы тепловых колебаний молекулы красителя и снижающая тем самым квантовый выход флуоресценции и выход триплетного состояния. В окружении растворителей, менее полярных, чем вода, например в этаноле, ДМСО, глицерине, происходит фиксация полиметиновой цепи и разрушение димеров, что приводит к резкому увеличению квантового выхода флуоресценции и триплетного состояния [Schaberle F.A. et al. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2009, 72(4), 863-867].In contrast to the PDT of phthalocyanines currently used in practice, which have four cyclically located indolenine groups and are completely similar in their photochemical characteristics to tetrapyrroles, the structure of carbocyanines, and BCC in particular, is characterized by a linear arrangement of polymethine chains connecting heteroaromatic chromophore groups. In an aqueous medium, the polymethine chain is extremely mobile and does not provide the conjugation of chromophores necessary to achieve a high quantum yield of fluorescence, and linearly dependent on it, the output of the triplet state (if it is possible for a particular structure). In addition, dimerization occurs in aqueous media because of the high hydrophobicity, increasing the number of degrees of freedom of thermal vibrations of the dye molecule and thereby reducing the quantum yield of fluorescence and the yield of the triplet state. Surrounded by solvents less polar than water, for example, in ethanol, DMSO, glycerol, fixation of the polymethine chain and destruction of dimers occurs, which leads to a sharp increase in the quantum yield of fluorescence and the triplet state [Schaberle F.A. et al. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2009, 72 (4), 863-867].
В Табл. 1 приведены данные по растворимости и квантовому выходу флуоресценции ϕфл 2,6-бис-(3,7-ди-N-метил-бенз[1,2-d:4,3-d']бистиазол)-[N-метил-3,3'-диметил-индокарбоцианин] перхлората в различных средах. Значения ϕфл определены, как описано в работе [Schaberle F.A. et al. Spectrochim. Acta A Mol. Biomol. Spectrosc. 2009, 72(4), 863-867].In Tab. 1 shows data on the solubility and quantum yield of
Эти данные показывают, что практическое применение БКЦ в свободной форме в качестве фотосенсибилизирующего средства для ФДТ невозможно, поскольку в организме в водной среде он не будет обеспечивать необходимого уровня фотоактивности.These data show that the practical use of BCC in free form as a photosensitizing agent for PDT is impossible, since in the body in the aquatic environment it will not provide the necessary level of photoactivity.
Общеизвестный подход к повышению эффективности и специфичности противоопухолевых средств основан на получении ковалентных комплексов путем химической сшивки молекул действующего вещества с активированными молекулами белков-носителей, обеспечивающих векторную доставку препарата в опухоль. Примером такого подхода для получения фотосенсибилизатора для ФДТ является техническое решение, рассмотренное выше в качестве прототипа. В отличие от прототипа в настоящем изобретении проблема перевода потенциально эффективного в качестве ФС соединения в пригодную для практического применения форму решена путем получения нековалентного комплекса типа «гость - хозяин», в котором молекула красителя образует комплекс с белком-носителем за счет межмолекулярных нековалентных взаимодействий. Наряду с гидрофобными взаимодействиями между молекулой красителя и участком молекулы белка, характеризующимся наличием «гидрофобного кармана», прочность нековалентного комплекса дополнительно обусловлена кулоновским взаимодействием между противоположно заряженными участками молекул красителя и белка.A well-known approach to increasing the effectiveness and specificity of antitumor drugs is based on the preparation of covalent complexes by chemical crosslinking of the active substance molecules with activated carrier protein molecules, which ensure vector delivery of the drug to the tumor. An example of this approach to obtain a photosensitizer for PDT is the technical solution discussed above as a prototype. In contrast to the prototype in the present invention, the problem of converting a potentially effective FS compound into a form suitable for practical use is solved by obtaining a non-covalent guest-host complex in which the dye molecule forms a complex with a carrier protein due to intermolecular non-covalent interactions. Along with hydrophobic interactions between a dye molecule and a portion of a protein molecule, characterized by the presence of a "hydrophobic pocket", the strength of the non-covalent complex is additionally due to the Coulomb interaction between oppositely charged sections of the dye and protein molecules.
В качестве белка-носителя взят химерный рекомбинантный белок АрЕ1 (молекулярная масса около 30 кДа), характеризующийся аминокислотной последовательностью рецептор-связывающего домена 3 альфа-фетопротеина (АФП) человека rhAFP3d с присоединенной к С-концу искусственной последовательностью, включающей 22 тандемно расположенных остатка глутаминовой кислоты и аффинную метку 6His-таг. Получение, свойства и аминокислотная последовательность белка АрЕ1, показанная на Фиг. 2, описаны в работе [Pozdniakova N.V. et al., J. Biomed. Biotechnol, 2012, art. ID 469756, 5 pages doi:10.1155/2012/469756]. По данным авторов, белок ApE1, аналогично рецептор-связывающему домену 3 альфа-фетопротеина человека, эффективно связывается рецепторами АФП опухолевых клеток. Наличие в молекуле белка аффинной метки 6His-таг облегчает его очистку металло-хелатной хроматографией, позволяющей получить белок высокой степени очистки, пригодной для парентерального применения. Последовательность из 22 тандемно расположенных остатков глутаминовой кислоты, сообщающая структуре мощный отрицательный заряд, способствует улучшению выхода ренатурации ApE1 in vitro, препятствуя межмолекулярной агрегации. Последовательность альфа-фетопротеина человека, включающая аминокислотные остатки с 404 по 609 полноразмерного белка, депонирована в базе данных NCBI Gene Bank Protein под названием rhAFP.The carrier protein was the chimeric recombinant protein ApE1 (molecular weight about 30 kDa), characterized by the amino acid sequence of the receptor-binding
Белок получают с помощью процедуры ренатурации in vitro телец включения, образующихся в клетках рекомбинантного штамма Е. coli, получаемого путем введения плазмиды pAFP28D3PolyGlu [Pozdniakova N.V. et al., J. Biomed. Biotechnol, 2012, art. ID 469756, 5 pages doi:10.1155/2012/469756] в коммерчески доступный штамм-хозяин BL21 (DE3).The protein is obtained using the in vitro renaturation procedure of inclusion bodies formed in cells of the recombinant E. coli strain obtained by introducing the plasmid pAFP28D3PolyGlu [Pozdniakova N.V. et al., J. Biomed. Biotechnol, 2012, art.
Сведений об использовании белка ApE1 для получения нековалентных комплексов с фотоактивными соединениями карбоцианиновой группы в уровне техники нами не обнаружено.Information on the use of the ApE1 protein for the preparation of non-covalent complexes with photoactive compounds of the carbocyanine group in the prior art was not found by us.
Нами показано, что при взаимодействии карбоцианинового красителя 2,6-бис-(3,7-ди-N-метил-бенз[1,2-d:4,3-d']бистиазол-)-[N-метил-3,3'-диметил-индокарбоцианин] перхлората, растворенного в ДМСО, с водным раствором белка ApE1 образуется растворимый в воде комплекс, характеризующийся резким, 100-кратным по сравнению со свободным красителем, повышением квантового выхода флуоресценции и триплетного состояния. Образующийся комплекс имеет нековалентную природу, т.к. формируется за счет нековалентного связывания гидрофобной молекулы красителя в «гидрофобном кармане», который имеется в структуре белка ApE1, подобно области гидрофобного связывания в молекуле АФП. Дополнительным комплексообразующим фактором может являться кулоновское взаимодействие между отрицательно заряженными остатками Glu и положительно заряженными молекулами красителя. Связывание молекулы красителя белком сопровождается разрушением димеров, существующих в водном окружении, и фиксацией полиметиновой цепи. В совокупности, как и в случае попадания в среду органического растворителя, это приводит к эффективному сопряжению хромофорных циклов в молекуле и, как следствие, к резкому возрастанию квантового выхода флуоресценции и повышению выхода триплетного возбужденного состояния.We have shown that the interaction of the
Перечень графических изображений, иллюстрирующих изобретения, приведен нижеA list of graphic images illustrating the invention is given below.
Фиг. 1. Строение молекулы красителя 2,6-бис-(3,7-ди-N-метил-бенз[1,2-d:4,3-d']бистиазол-)-[N-метил-3,3'-диметил-индокарбоцианин] перхлората (БКЦ) и спектр его поглощения в 96% этаноле (концентрация 12 мкМ).FIG. 1. The structure of the
Фиг. 2. Аминокислотная последовательность белка ApE1 [Pozdniakova N.V. et al., J. Biomed. Biotechnol, 2012, art. ID 469756, 5 pages doi:10.1155/2012/469756].FIG. 2. The amino acid sequence of the ApE1 protein [Pozdniakova N.V. et al., J. Biomed. Biotechnol, 2012, art.
Фиг. 3. Электрофореграммы фракций клеточного лизата штамма Е. coli В121 (DE3), полученные в ходе препаративной очистки белка ApE1 (диск-электрофорез в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле, окрашенном R-250):FIG. 3. Electrophoregrams of fractions of cell lysate of E. coli strain B121 (DE3) obtained during preparative purification of ApE1 protein (disk electrophoresis in 12.5% denaturing polyacrylamide gel stained with R-250):
1 - стандарты молекулярных масс (14,4-18,4-25,0-35,0-45,0-66,2-116,0 кДа);1 - molecular weight standards (14.4-18.4-25.0-35.0-45.0-66.2-116.0 kDa);
2 - биомасса продуцента до индукции;2 - producer biomass before induction;
3 - биомасса продуцента после индукции;3 - producer biomass after induction;
4 - осветленный лизат перед нанесением на ионообменную смолу;4 - clarified lysate before application to the ion exchange resin;
5 - фракция не связавшихся с ионообменной смолой примесей;5 - fraction of impurities not bound to the ion exchange resin;
6 - элюат после ионообменной хроматографии;6 - eluate after ion exchange chromatography;
7 - фракция примесей, не связавшихся с Ni-NTA сефарозой;7 - fraction of impurities not bound to Ni-NTA Sepharose;
8 - элюат после металло-хелатной хроматографии.8 - eluate after metal-chelate chromatography.
Дорожки 2 и 3 нормализованы по оптической плотности биомассы при 600 нм, дорожки 4-8 нормализованы по суммарной концентрации белка, определенной модифицированным методом Лоури с бицинхониновой кислотой.
Фиг. 4. Зависимость доли красителя БКЦ, связанного с белком (θ), от концентрации белка в буферном растворе:FIG. 4. The dependence of the proportion of the dye BCC associated with the protein (θ), on the concentration of protein in the buffer solution:
Кривая 1 соответствует комплексу БКЦ с ApE1;
Кривая 2 соответствует комплексу БКЦ с ЧСА.
Изобретение осуществляют следующим образом.The invention is as follows.
Получение белка ApE1Obtaining ApE1 Protein
Получение биомассы рекомбинантного штамма Е. coli BL-21 (DE3), содержащего плазмиду pAFP28D3PolyGlu.Obtaining the biomass of a recombinant E. coli strain BL-21 (DE3) containing the plasmid pAFP28D3PolyGlu.
Базовым штаммом для получения белка ApE1 является штамм Е. coli BL-21 (DE3) (New England Biolabs, кат. № C2527). Для получения штамма-продуцента перед каждой препаративной процедурой проводят трансформацию, вводя в базовый штамм BL21 (DE3) коллекционную ДНК плазмиды pAFP28D3PolyGlu. Трансформанты отбирают на агаризованной селективной среде с добавлением 50 мкг/мл канамицина. Колонию трансформанта возрастом не более 24 часов с момента засева чашки после трансформации засевают микробиологической петлей в пробирку с 3 мл среды LB с добавлением 50 мкг/мл канамицина и выращивают в течение 12-16 часов при 37°С при интенсивной аэрации. Выросшую культуру немедленно используют в качестве посевного материала, пересевая ее в теплую питательную среду из расчета 5 мл культуры на 1 литр среды.The base strain for producing ApE1 protein is E. coli strain BL-21 (DE3) (New England Biolabs, cat. No. C2527). To obtain a producer strain, a transformation is carried out before each preparative procedure by introducing into the BL21 (DE3) base strain the collection DNA of plasmid pAFP28D3PolyGlu. Transformants were selected on an agarized selective medium supplemented with 50 μg / ml kanamycin. A colony of the transformant not older than 24 hours from the time of inoculation of the plate after transformation is seeded with a microbiological loop in a test tube with 3 ml of LB medium with the addition of 50 μg / ml kanamycin and grown for 12-16 hours at 37 ° C with intensive aeration. The grown culture is immediately used as a seed, transferring it to a warm nutrient medium at the rate of 5 ml of culture per 1 liter of medium.
Биомассу рекомбинантного штамма получают культивированием в течение 24 часов при комнатной температуре на барботажной установке на среде ZYP5052 состава: триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; добавка 5052 (50×) - глицерин 250 г/л, D-глюкоза 25 г/л, лактоза 100 г/л; добавка NPS (20×) - (NH4)2SO4 66 г/л, KH2PO4 136 г/л, Na2HPO4 142 г/л; MgSO4 1 мМ; раствор смеси микроэлементов; тиамин 2 мкг/мл; канамицин 50 мкг/мл. Внесения индуктора экспрессии не требуется, так как активация синтеза целевого белка в данной системе происходит автоматически при переходе на утилизацию лактозы, как основного источника углерода. После наращивания биомассу собирают центрифугированием и хранят при -20°С.The biomass of the recombinant strain is obtained by culturing for 24 hours at room temperature on a bubbler plant on ZYP5052 medium of the composition: tryptone 10 g / l; yeast extract 5 g / l; additive 5052 (50 ×) - glycerin 250 g / l, D-glucose 25 g / l, lactose 100 g / l; additive NPS (20 ×) - (NH 4 ) 2 SO 4 66 g / l, KH 2 PO 4 136 g / l, Na 2 HPO 4 142 g / l;
Для детекции целевого белка в биомассе отбирают образцы для электрофореза в полиакриламидном геле через 3 часа после пересева. Результаты показаны на Фиг. 3: дорожка 2 - до индукции, дорожка 3 - после индукции,To detect the target protein in biomass, samples were taken for
Гомогенизация биомассыHomogenization of biomass
Биомассу (10 мл влажного осадка) лизируют в 50 мл буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 2 мМ AEBSF (4-(2-аминоэтил)бензилсульфонилфторида гидрохлорид), 1 мМ ЭДТА, 0,5 мг/мл лизоцима в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Разрушение клеток проводят ультразвуком на ледяной бане при мощности воздействия 350 W в режиме 10 с, 14 раз. Далее лизат замораживают и через сутки повторяют процедуру. Полученный лизат осветляют центрифугированием для освобождения от клеточного дебриса и добавляют навеску мочевины до конечной концентрации 8 М и β-меркаптоэтанол до конечной концентрации 50 мМ, после чего инкубируют 30 мин в денатурирующих условиях при комнатной температуре. После окончания инкубации лизат осветляют центрифугированием, отбирают супернатант и используют его для дальнейшей очистки.Biomass (10 ml wet cake) was lysed in 50 ml buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 2 mM AEBSF (4- (2-aminoethyl) benzylsulfonyl fluoride hydrochloride), 1 mM EDTA, 0.5 mg / ml lysozyme for 1.5 hours at room temperature. The destruction of cells is carried out by ultrasound in an ice bath at an exposure power of 350 W in 10 s mode, 14 times. Then the lysate is frozen and the procedure is repeated in a day. The resulting lysate is clarified by centrifugation to remove cell debris and a weighed portion of urea is added to a final concentration of 8 M and β-mercaptoethanol to a final concentration of 50 mM, after which they are incubated for 30 min under denaturing conditions at room temperature. After incubation, the lysate is clarified by centrifugation, the supernatant is taken and used for further purification.
Выделение и очистка белкаProtein Isolation and Purification
Очистку проводят методом ионообменной хроматографии (этап 1), а затем методом металло-хелатной хроматографии (этап 2). Ионообменную хроматографию проводят на колонке со смолой DEAE-сефароза CL-6B (35 мл). Колонку уравновешивают буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 8 М мочевину, 50 мМ β-меркаптоэтанол, 0.1 М NaCl. На колонку наносят 75 мл осветленного лизата при комнатной температуре в течение 1 часа. Колонку промывают 250 мл буфера [20 мМ Трис-HCl 9,0, 8 М мочевина, 50 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 М NaCl], после чего элюируют целевой белок буфером [20 мМ Трис-HCl, рН 9,0, 8 М мочевина, 50 мМ β-меркаптоэтанол, 0,5 М NaCl] (60 мл). Металло-хелатную хроматографию проводят с использованием смолы Ni-NTA Sepharose-FF. Колонку уравновешивают буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 8 М мочевину, 50 мМ β-меркаптоэтанол и 10 мМ имидазол. Элюат (60 мл), полученный на этапе 1, наносят на смолу при комнатной температуре в течение 40 минут. Колонку промывают 250 мл буфера (20 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 8 М мочевина, 50 мМ β-меркаптоэтанол, 10 мМ имидазол и 0,3 М NaCl). Элюцию проводят 50 мл буфера (20 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 8 М мочевина, 50 мМ β-меркаптоэтанол и 0,5 М имидазол), собирают элюат (общий объем 30 мл).The purification is carried out by ion exchange chromatography (step 1), and then by metal chelate chromatography (step 2). Ion exchange chromatography was performed on a column of DEAE-Sepharose CL-6B resin (35 ml). The column is equilibrated with a buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 9.0), 8 M urea, 50 mM β-mercaptoethanol, 0.1 M NaCl. 75 ml of clarified lysate are applied to the column at room temperature for 1 hour. The column was washed with 250 ml of buffer [20 mM Tris-HCl 9.0, 8 M urea, 50 mM β-mercaptoethanol, 0.1 M NaCl], after which the target protein was eluted with buffer [20 mM Tris-HCl, pH 9.0, 8 M urea, 50 mM β-mercaptoethanol, 0.5 M NaCl] (60 ml). Metal chelate chromatography was performed using a Ni-NTA Sepharose-FF resin. The column is equilibrated with buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 9.0), 8 M urea, 50 mM β-mercaptoethanol and 10 mM imidazole. The eluate (60 ml) obtained in
Ренатурация белкаProtein renaturation
Ренатурацию белка проводят ступенчатым диализом:Protein renaturation is carried out by step dialysis:
1) элюат, полученный на этапе 2 очистки, диализуют против буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 10 мМ β-меркаптоэтанол, в течение 4 часов при комнатной температуре и в течение 12 часов продолжают диализ против того же буфера при +4°С;1) the eluate obtained in
2) проводят диализ против буфера состава: (20 мМ Трис-HCl (рН 8,5), 5 мМ β-меркаптоэтанол) в течение 12 часов при +4°С;2) dialysis against a buffer composition: (20 mm Tris-HCl (pH 8.5), 5 mm β-mercaptoethanol) for 12 hours at + 4 ° C;
3) проводят диализ против фосфатно-солевого буфера (137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 4,3 мМ Na2HPO4; 1,47 мМ KH2PO4) рН 8,0 в течение 24 часов при +4°С;3) dialysis against phosphate-buffered saline (137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 4.3 mM Na 2 HPO 4 ; 1.47 mM KH 2 PO 4 ) pH 8.0 for 24 hours at + 4 ° FROM;
4) проводят диализ против фосфатно-солевого буфера (137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 4,3 мМ Na2HPO4; 1,47 мМ KH2PO4) рН 7,4 в течение 24 часов при +4°С.4) dialysis against phosphate-buffered saline (137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 4.3 mM Na 2 HPO 4 ; 1.47 mM KH 2 PO 4 ) pH 7.4 for 24 hours at + 4 ° FROM.
Полученный раствор белка с соблюдением требований асептики подвергают стерилизующей фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 нм, отбирают аликвоту для анализа и хранят в криопробирках до использования в течение 6 месяцев при температуре минус 20°С. Полноту ренатурации оценивают по исчезновению свободных сульфгидрильных групп в растворе белка, исходя из того, что в нативном состоянии ApE1 содержит 6 дисульфидных связей [Ellman G.L., Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82(1), 70-77].The resulting protein solution, subject to aseptic requirements, is subjected to sterilizing filtration through membrane filters with a pore diameter of 0.22 nm, an aliquot is taken for analysis and stored in cryovials for 6 months at a temperature of minus 20 ° C. The completeness of renaturation is evaluated by the disappearance of free sulfhydryl groups in the protein solution, based on the fact that in the native state ApE1 contains 6 disulfide bonds [Ellman G.L., Arch. Biochem. Biophys., 1959, 82 (1), 70-77].
На Фиг. 3 показаны электрофореграммы фракций клеточного лизата, полученные в ходе препаративной очистки белка ApE1 (диск-электрофорез в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле, окрашенном R-250). Концентрацию белка в каждой фракции определяют с помощью модифицированного метода Лоури с использованием бицинхониновой кислоты (Sigma-Aldrich, USA) и бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта согласно [Smith Р.K. et al., Anal Biochem. 1985, 150(1), 76-85]. Количество целевого белка ApE1 на разных стадиях очистки определяют методом денситометрии (Gel Analyzer 2010а) после электрофореза в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле, используя для калибровки стандартные растворы бычьего сывороточного альбумина. Выход целевого белка определяют как отношение доли целевого белка к общему белку отдельно в водорастворимой и водонерастворимой фракциях клеточного лизата. Содержание белка ApE1 в исходной культуре в разных экспериментах составляет 55-60 мг/на литр, выход очищенного целевого белка в пересчете на литр исходной культуры в среднем составляет около 35 мг. Таким образом, ренатурация белка с использованием описанной процедуры ступенчатого диализа позволяет получить выход белка, достигающий 65% от его исходного содержания в биомассе, что существенно превышает показатели выхода продукта, описанные в работе [Pozdniakova N.V. et al., J. Biomed. Biotechnol, 2012, art. ID 469756, 5 pages doi:10.1155/2012/469756].In FIG. 3 shows electrophoregrams of cell lysate fractions obtained during preparative purification of ApE1 protein (disk electrophoresis in 12.5% denaturing polyacrylamide gel stained with R-250). The protein concentration in each fraction is determined using a modified Lowry method using bicinchoninic acid (Sigma-Aldrich, USA) and bovine serum albumin as a standard according to [Smith P.K. et al., Anal Biochem. 1985, 150 (1), 76-85]. The amount of the desired ApE1 protein at different stages of purification is determined by densitometry (Gel Analyzer 2010a) after electrophoresis in a 12.5% denaturing polyacrylamide gel using standard bovine serum albumin solutions for calibration. The yield of the target protein is defined as the ratio of the proportion of the target protein to the total protein separately in the water-soluble and water-insoluble fractions of the cell lysate. The content of ApE1 protein in the initial culture in different experiments is 55-60 mg / liter, the yield of purified target protein in terms of liter of the initial culture is on average about 35 mg. Thus, protein renaturation using the described stepwise dialysis procedure allows to obtain a protein yield of up to 65% of its initial biomass content, which significantly exceeds the product yield indicators described in [Pozdniakova N.V. et al., J. Biomed. Biotechnol, 2012, art.
Краситель БКЦ получен, как описано в работе [Киприанов А.И. и Мушкало И.Л. Журн. Орг. Хим., 1965, 1(4), 744-750].Dye BCC obtained, as described in [Kiprianov A.I. and Mushkalo I.L. Zhurn. Org Chem., 1965, 1 (4), 744-750].
Нековалентный комплекс красителя с белком-носителем получают простым смешением растворов БКЦ в ДМСО и ApE1 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (0,2 М фосфат натрия, рН 7,4, 0,3 М NaCl) в требуемом соотношении. Подбор концентраций растворов белка и красителя осуществляют, исходя из требования обеспечения максимального выхода триплетного состояния при минимальном содержании свободного красителя в растворе.The non-covalent complex of the dye with the carrier protein is obtained by simple mixing of solutions of BCC in DMSO and ApE1 in phosphate-buffered saline (PBS) (0.2 M sodium phosphate, pH 7.4, 0.3 M NaCl) in the required ratio. The selection of concentrations of protein and dye solutions is carried out based on the requirement to ensure the maximum yield of the triplet state with a minimum content of free dye in the solution.
Для выяснения оптимального количественного соотношения компонентов проведено исследование зависимости квантового выхода флуоресценции образующегося комплекса от концентрации раствора белка при постоянной концентрации раствора красителя.To determine the optimal quantitative ratio of the components, a study was made of the dependence of the fluorescence quantum yield of the resulting complex on the concentration of the protein solution at a constant concentration of the dye solution.
Для приготовления базового (стокового) раствора красителя 5 мг сухого БКЦ растворяют в 1 мл тщательно осушенного ДМСО квалификации «для спектроскопии» при комнатной температуре. Истинная концентрация стокового раствора, определенная по спектру поглощения (см. Фиг. 1) с использованием величины коэффициента экстинкции 1,1×105 M-1см-1 при 590 нм [Борисевич Ю.Е. и соавт., Доклады Акад. Наук СССР, 1976, 228(2), 375], равна 10 мМ. Стоковый раствор красителя хранят при -20°С в темноте не более 3 месяцев.To prepare a basic (stock) dye solution, 5 mg of dry BCC is dissolved in 1 ml of carefully dried DMSO qualification “for spectroscopy” at room temperature. The true concentration of the stock solution, determined by the absorption spectrum (see Fig. 1) using the magnitude of the extinction coefficient of 1.1 × 10 5 M -1 cm -1 at 590 nm [Borisovich Yu.E. et al., Reports of Acad. Science of the USSR, 1976, 228 (2), 375], equal to 10 mm. The stock solution of the dye is stored at -20 ° C in the dark for no more than 3 months.
К аликвотам стокового раствора красителя объемом 800 мкл при комнатной температуре прибавляют растворы белка ApE1 в ФСБ с концентрацией от 0,1 до 12,8 мкМ. Объем доводят до 1000 мкл добавлением ФСБ, перемешивают в темноте в течение 20 мин, после чего немедленно используют для измерений. Определение квантового выхода флуоресценции ϕфл. проводят на флуориметре Panorama при длине волны возбуждающего света 514 нм с шагом сканирования 2 нм в диапазоне длин волн от 500 до 750 нм. Содержание ДМСО в образцах около 0,8% не оказывает существенного влияния на фотохимическую активность фотосенсибилизатора.Aliquots of 800 μl stock solution of the dye at room temperature are supplemented with ApE1 protein solutions in PBS with a concentration of 0.1 to 12.8 μM. The volume was adjusted to 1000 μl by the addition of PBS, stirred in the dark for 20 minutes, and then immediately used for measurements. Determination of the quantum yield of fluorescence ϕ fl. carried out on a Panorama fluorimeter at a wavelength of exciting light 514 nm with a scan step of 2 nm in the wavelength range from 500 to 750 nm. The content of DMSO in the samples of about 0.8% does not significantly affect the photochemical activity of the photosensitizer.
Было показано, что высокое значение квантового выхода флуоресценции ϕфл, напрямую коррелирующее с выходом триплетного состояния красителя, определяющего его эффективность, как потенциального фотосенсибилизатора, достигается при соотношении компонентов в смеси, близком к эквимолярному. Дальнейшее увеличение содержания белка в смеси сопровождается некоторым, относительно невысоким повышением ϕфл, однако использование высоких концентраций растворов белка экономически нецелесообразно, поскольку приведет к существенному удорожанию препарата при незначительном повышении его эффективности.It was shown that a high value of the fluorescence quantum yield ϕ fl , which directly correlates with the yield of the triplet state of the dye, which determines its effectiveness as a potential photosensitizer, is achieved when the ratio of components in the mixture is close to equimolar. A further increase in the protein content in the mixture is accompanied by some relatively low increase in ϕ fl , however, the use of high concentrations of protein solutions is not economically feasible, since it will lead to a significant increase in the cost of the drug with a slight increase in its effectiveness.
Поскольку in vivo молекулы фотосенсибилизатора находятся в окружении молекул сывороточного альбумина, содержание которого в крови составляет не менее 50 мг/мл, важное практическое значение приобретает вопрос об относительной устойчивости заявляемого нековалентного комплекса в присутствии ЧСА, конкурирующего с ApE1 за связывание с красителем. Для ответа на этот вопрос определены константы связывания К молекулы БКЦ с молекулами белков конкурентов по методу [Phillips D., Prog. Reaction Kinetics. 1997, 22 (3/4), 17]. На Фиг. 4 показаны зависимости доли красителя, связанного с белком (θ), от содержания в растворе белка при неизменной концентрации исходного раствора красителя. Кривая 1 соответствует комплексу БКЦ с ApE1, кривая 2 - комплексу БКЦ с ЧСА.Since in vivo the photosensitizer molecules are surrounded by serum albumin molecules, the content of which in the blood is at least 50 mg / ml, the question of the relative stability of the claimed non-covalent complex in the presence of HSA competing with ApE1 for binding to the dye is of great practical importance. To answer this question, the binding constants K of the BCC molecule with the protein molecules of competitors were determined by the method of [Phillips D., Prog. Reaction Kinetics. 1997, 22 (3/4), 17]. In FIG. Figure 4 shows the dependences of the proportion of the dye bound to the protein (θ) on the protein content in the solution at a constant concentration of the initial dye solution.
θ=K/(1+K),θ = K / (1 + K),
где K - константа связывания комплекса. Константу связывания К рассчитывают, исходя из того, что where K is the binding constant of the complex. The binding constant K is calculated based on the fact that
θ=(I-I0)/(I∞-I0),θ = (II 0 ) / (I ∞ -I 0 ),
где I0, I∞ и I - величины интенсивности флуоресценции при нулевом, полном и промежуточном насыщении красителя белком соответственно, измеренные при возбуждении светом длиной волны 514 нм. [Phillips D., Prog. Reaction Kinetics. 1997, 22 (3/4), 17]. Величину I∞ находят экстраполяцией экспериментальных значений к предельному значению при высоких концентрациях белка. Из полученных данных константы связывания К рассчитывают с помощью программного обеспечения GraphPadPrizm 6.0.where I 0 , I ∞, and I are the fluorescence intensities at zero, full, and intermediate saturation of the dye with protein, respectively, measured upon excitation with light at a wavelength of 514 nm. [Phillips D., Prog. Reaction Kinetics. 1997, 22 (3/4), 17]. The value of I ∞ is found by extrapolating the experimental values to the limiting value at high protein concentrations. From the data obtained, the binding constants K are calculated using GraphPadPrizm 6.0 software.
Полученные величины констант связывания комплексов БКЦ с ApE1 и с ЧСА сопоставлены в Табл. 2.The obtained values of the binding constants of BCC complexes with ApE1 and HSA are compared in Table. 2.
Как видно из таблицы, константа связывания красителя БКЦ с белком ApE1 более чем втрое превышает константу связывания красителя с человеческим сывороточным альбумином, что говорит о значительно более высокой прочности заявляемого комплекса по сравнению с комплексом с ЧСА. В составе заявляемого нековалентного комплекса БКЦ с белком-носителем ApE1 молекула красителя, локализованная в «гидрофобном кармане» белка-носителя, защищена от возможности связывания с сыворточным альбумином. Этот факт имеет важное практическое следствие, которое состоит в том, что при введении заявляемого препарата в кровоток in vivo он будет сохранять стабильность в присутствии большого количества сывороточного альбумина, концентрация которого в плазме крови достигает 50 мг/мл. Благодаря способности молекул ApE1 специфически связываться с клетками опухоли, обеспечивается специфичность и адресность доставки фотосенсибилизатора в опухолевую ткань. В результате препарат способен избирательно поглощаться клетками опухоли, а его проникновение в клетки здоровых тканей, имеющих высокое сродство к альбумину, минимизировано.As can be seen from the table, the binding constant of the BCC dye with the ApE1 protein is more than three times higher than the binding constant of the dye with human serum albumin, which indicates a significantly higher strength of the claimed complex compared to the complex with HSA. As part of the inventive non-covalent complex of BCC with the carrier protein ApE1, the dye molecule located in the "hydrophobic pocket" of the carrier protein is protected from the possibility of binding to serum albumin. This fact has an important practical consequence, which is that when the claimed drug is introduced into the bloodstream in vivo, it will remain stable in the presence of a large amount of serum albumin, the concentration of which in the blood plasma reaches 50 mg / ml. Due to the ability of ApE1 molecules to specifically bind to tumor cells, the specificity and targeting of the delivery of the photosensitizer to the tumor tissue is ensured. As a result, the drug is able to selectively be absorbed by the tumor cells, and its penetration into the cells of healthy tissues with high affinity for albumin is minimized.
Изменение квантового выхода ϕфл красителя при образовании комплекса (см. Табл. 2) оценивают величиной отношения интенсивности флуоресценции БКЦ в смеси с белком-носителем к интенсивности флуоресценции свободного красителя в буфере в отсутствие белка при одинаковой интенсивности возбуждающего излучения. Как видно из таблицы, образование нековалентного комплекса БКЦ с белком-носителем ApE1 сопровождается 100-кратным повышением квантового выхода флуоресценции красителя. Для комплекса БКЦ с сывороточным альбумином эта величина почти на 30% ниже. Высокий квантовый выход активного состояния красителя в составе комплекса позволяет снижать терапевтические дозировки фотосенсибилизатора и, как следствие, уменьшать его неспецифическую фотоиндуцированную активность в отношении нормальных клеток и внеклеточных структур организма.The change in the quantum yield ϕ of the dye fl during the formation of the complex (see Table 2) is estimated by the ratio of the BCC fluorescence intensity in the mixture with the carrier protein to the fluorescence intensity of the free dye in the buffer in the absence of protein at the same intensity of the exciting radiation. As can be seen from the table, the formation of a non-covalent complex of BCC with the carrier protein ApE1 is accompanied by a 100-fold increase in the quantum yield of dye fluorescence. For the BCC complex with serum albumin, this value is almost 30% lower. The high quantum yield of the active state of the dye in the complex allows to reduce the therapeutic dosage of the photosensitizer and, as a result, to reduce its non-specific photo-induced activity in relation to normal cells and extracellular structures of the body.
Кинетику флуоресценции красителя в свободном виде и в составе комплекса с белком исследовали, как описано в работе [Phillips D., Prog. Reaction Kinetics. 1997, 22 (3/4), 17]. Время жизни флуоресценции образцов τ1 и τ2 регистрируют на флуориметре FluoTime 300 (PicoQuantGmbH, Германия) с временным разрешением с функцией счета одиночных фотонов. Флуоресценцию возбуждают импульсным лазерным источником с длиной волны 510 нм и частотой импульсов 20 МГц. Сигнал регистрируют на длине волны 640 нм с разрешением 4 пс и накоплением до 10000 индивидуальных событий. Полученные данные обрабатывают с помощью программного обеспечения FluoFit (PicoQuantGmbH, Германия). Данные по динамике затухания флуоресценции, характеризуемой временами жизни флуоресценции τ1 и τ2 (см. Табл. 2), свидетельствуют о существовании двух альтернативных сайтов связывания красителя в молекуле ApE1. Аналогичный результат показывают и данные по временам жизни комплекса красителя с ЧСА. Однако если сайты связывания с более длительным временем жизни активированного состояния в молекулах обоих белков сходны по фотохимическим свойствам комплекса с красителем, то сайты с более коротким временем жизни существенно различны. Это говорит о том, что более высокая устойчивость заявленного комплекса по сравнению с комплексом красителя с ЧСА, по-видимому, достигается за счет высокоаффинного сайта связывания молекулы красителя с белком, тогда как структура низкоаффинного сайта обоих белков оказывается сходной. Вывод о наличии двух различных центров связывания молекулы красителя с белками подтверждается тем, что нарастание флуоресценции комплексов БКЦ с ApE1 и с ЧСА продолжается с разной скоростью при увеличении количества белка в растворе по отношению к содержанию красителя сверх эквимолярного.The kinetics of fluorescence of the dye in a free form and as part of a complex with a protein was studied as described in [Phillips D., Prog. Reaction Kinetics. 1997, 22 (3/4), 17]. Fluorescence lifetimes of samples τ 1 and τ 2 are recorded on a
Таким образом, приведенные выше результаты показывают, что заявляемый нековалентный комплекс красителя БКЦ с белком-носителем ApE1 обладает совокупностью свойств, позволяющих рассматривать его в качестве нового перспективного фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии опухолей:Thus, the above results show that the claimed non-covalent complex of the BCC dye with the protein carrier ApE1 has a combination of properties that allow us to consider it as a new promising photosensitizer for photodynamic therapy of tumors:
1. Хорошая растворимость в воде, приближающаяся к растворимости в водных растворах белка-носителя (около 1 мМ), позволяет использовать его для парентерального введения.1. Good solubility in water, approaching the solubility in aqueous solutions of the carrier protein (about 1 mm), allows you to use it for parenteral administration.
2. Достижение высокого выхода триплетного состояния обеспечивает высокую фотосенсибилизирующую и противоопухолевую активность препарата.2. Achieving a high yield of triplet state provides a high photosensitizing and antitumor activity of the drug.
3. Обеспечение целенаправленного транспорта фотосенсибилизатора в опухоль за счет сродства белка-носителя ApE1 к АФП-рецепторам на поверхности опухолевых клеток.3. Providing targeted transport of the photosensitizer to the tumor due to the affinity of the carrier protein ApE1 to AFP receptors on the surface of tumor cells.
4. Высокая специфичность фотосенсибилизатора к опухолевым клеткам в присутствии ЧСА.4. High specificity of the photosensitizer to tumor cells in the presence of HSA.
5. Низкая побочная токсичность за счет высокой устойчивости комплекса в присутствии ЧСА. Дополнительным фактором, снижающим токсичность, является то, что комплекс, в отличие от известных ковалентных конъюгатов низкомолекулярных биологически активных соединений с белками, не содержит небиогенных, не свойственных живому организму связей, возникающих при химической сшивке активированных молекул белка с молекулами противоопухолевого агента. Отсутствие в составе комплекса таких связей должно способствовать иммунологической совместимости при парентеральном введении препарата в организм.5. Low side toxicity due to the high stability of the complex in the presence of HSA. An additional factor that reduces toxicity is the fact that the complex, in contrast to the known covalent conjugates of low molecular weight biologically active compounds with proteins, does not contain non-biogenic, not characteristic of a living organism bonds arising from the chemical crosslinking of activated protein molecules with molecules of an antitumor agent. The absence of such bonds in the complex should contribute to immunological compatibility with parenteral administration of the drug into the body.
6. Можно полагать, что препарат должен обладать более широким спектром терапевтической активности в сравнении с прототипом, который позиционируется как средство для фотодинамической терапии опухолей нейроэндокринного характера, поскольку рецептор АФП присутствует на многих типах распространенных опухолей человека [Mizejewski G.J., Tumour Biol., 2013, 34(3), 1317-1336].6. It can be assumed that the drug should have a wider spectrum of therapeutic activity compared to the prototype, which is positioned as a means for the photodynamic treatment of neuroendocrine tumors, since the AFP receptor is present on many types of common human tumors [Mizejewski GJ, Tumour Biol., 2013, 34 (3), 1317-1336].
7. Получение комплекса не связано с дополнительными затратами труда и средств на синтез химически активированных интермедиатов, что выгодно отличает его от прототипа. Заявляемый нековалентный комплекс получают простым смешением раствора белка-носителя в физиологическом фосфатном буфере с раствором красителя в диметилсульфоксиде, при этом остаточное содержание ДМСО в итоговом растворе составляет не более 0,1%. При необходимости растворитель может быть полностью удален из препарата путем диализа или ультрафильтрации, так как устойчивость нековалентного комплекса в водной среде позволяет провести эту процедуру. Растворитель также может быть полностью удален лиофильной сушкой с получением твердой формы фотосенсибилизатора.7. Obtaining the complex is not associated with additional labor and funds for the synthesis of chemically activated intermediates, which distinguishes it from the prototype. The inventive non-covalent complex is obtained by simple mixing of a solution of a carrier protein in physiological phosphate buffer with a dye solution in dimethyl sulfoxide, and the residual DMSO content in the final solution is not more than 0.1%. If necessary, the solvent can be completely removed from the drug by dialysis or ultrafiltration, since the stability of the non-covalent complex in an aqueous medium allows this procedure to be carried out. The solvent can also be completely removed by freeze drying to obtain a solid form of the photosensitizer.
Учитывая лабильность комплекса на свету, о которой упоминалось выше, особенность практического применения предлагаемого фотосенсибилизатора в жидкой форме состоит в том, что заранее расфасованные, устойчивые при хранении растворы красителя и белка, содержащие требуемые количества реагентов, сливают непосредственно перед введением препарата. В случае применения сухой формы раствор фотосенсибилизатора в физиологическом буфере готовят непосредственно перед применением.Given the lability of the complex in the light, which was mentioned above, a feature of the practical application of the proposed photosensitizer in liquid form is that pre-packaged, storage-stable dye and protein solutions containing the required amounts of reagents are drained immediately before drug administration. In the case of using a dry form, a photosensitizer solution in physiological buffer is prepared immediately before use.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016150835A RU2638131C1 (en) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | Photosensitize based on carbocyanine dye for photodynamic therapy of tumours |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016150835A RU2638131C1 (en) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | Photosensitize based on carbocyanine dye for photodynamic therapy of tumours |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2638131C1 true RU2638131C1 (en) | 2017-12-11 |
Family
ID=60718687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016150835A RU2638131C1 (en) | 2016-12-23 | 2016-12-23 | Photosensitize based on carbocyanine dye for photodynamic therapy of tumours |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2638131C1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7510700B2 (en) * | 2001-10-17 | 2009-03-31 | Mallinckrodt Inc | Pathological tissue detection and treatment employing targeted benzoindole optical agents |
-
2016
- 2016-12-23 RU RU2016150835A patent/RU2638131C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7510700B2 (en) * | 2001-10-17 | 2009-03-31 | Mallinckrodt Inc | Pathological tissue detection and treatment employing targeted benzoindole optical agents |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Murakami L.S. et al. Photocytotoxicity of a cyanine dye with two chromophores toward melanoma and normal cells. Biochimica et Biophysica Acta. 2014. P.1-8. * |
| Murakami L.S. et al. Photocytotoxicity of a cyanine dye with two chromophores toward melanoma and normal cells. Biochimica et Biophysica Acta. 2014. P.1-8. Pozdniakova N.V. et al. New protein vector ApE1 for targeted delivery of anticancer drugs. Journal Biomedicine and Biotechnology, 2012. Р.1-5. * |
| Pozdniakova N.V. et al. New protein vector ApE1 for targeted delivery of anticancer drugs. Journal Biomedicine and Biotechnology, 2012. Р.1-5. Луговский А. А. и др. Свойства нового фотосенсибилизатора для лазерной фототерапии злокачественных новообразований. Квантовая электроника: Материалы Х Междунар. науч.-техн. конф., Минск, 2015. С.279-280. * |
| Луговский А. А. и др. Свойства нового фотосенсибилизатора для лазерной фототерапии злокачественных новообразований. Квантовая электроника: Материалы Х Междунар. науч.-техн. конф., Минск, 2015. С.279-280. Самцов М. П. и др. Флуоресцентная диагностика эффективности повреждения патологических тканей при ФДТ с фотосенсибилизатором Фотолон. VII Съезд Российского фотобиологического общества, Материалы съезда, Пущино, 2014. С.70. * |
| Самцов М. П. и др. Флуоресцентная диагностика эффективности повреждения патологических тканей при ФДТ с фотосенсибилизатором Фотолон. VII Съезд Российского фотобиологического общества, Материалы съезда, Пущино, 2014. С.70. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ilina et al. | Squaraine dyes: molecular design for different applications and remaining challenges | |
| Zhang et al. | Application of multifunctional BODIPY in photodynamic therapy | |
| Sandland et al. | Photosensitizer antibody–drug conjugates: past, present, and future | |
| Spikes | New trends in photobiology: Chlorins as photosensitizers in biology and medicine | |
| Qian et al. | A comparison of different photosensitizing dyes with respect to uptake C3H-tumors and tissues of mice | |
| Sekkat et al. | Like a bolt from the blue: phthalocyanines in biomedical optics | |
| Sutton et al. | Porphyrin, chlorin, and bacteriochlorin isothiocyanates: useful reagents for the synthesis of photoactive bioconjugates | |
| Stefflova et al. | Peptide-based pharmacomodulation of a cancer-targeted optical imaging and photodynamic therapy agent | |
| Bhatti et al. | Targeted photodynamic therapy with multiply‐loaded recombinant antibody fragments | |
| Chen et al. | Bacteriopurpurinimides: highly stable and potent photosensitizers for photodynamic therapy | |
| Choi et al. | Conjugation of a photosensitizer to an oligoarginine‐based cell‐penetrating peptide increases the efficacy of photodynamic therapy | |
| EP1189645B1 (en) | Non-covalent bioconjugates useful for diagnosis and therapy | |
| St Denis et al. | Synthesis, bioanalysis and biodistribution of photosensitizer conjugates for photodynamic therapy | |
| Shigemitsu et al. | Fluorescein-based type I supramolecular photosensitizer via induction of charge separation by self-assembly | |
| Yu et al. | A biotinylated and endoplasmic reticulum‐targeted glutathione‐responsive zinc (II) phthalocyanine for targeted photodynamic therapy | |
| Malacarne et al. | BODIPYs in PDT: a journey through the most interesting molecules produced in the last 10 years | |
| CN104800855A (en) | Tumor-targeting fusion protein drug vector for optical imaging and photodynamic therapy | |
| US7303926B2 (en) | Methods and compositions for dual phototherapy | |
| Belik et al. | Nanoparticles of water-soluble dyads based on amino acid fullerene C60 derivatives and pyropheophorbide: Synthesis, photophysical properties, and photodynamic activity | |
| US6740637B1 (en) | Chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives, their preparation and pharmaceutical compositions comprising them | |
| US20100075899A1 (en) | Targeted photodynamic therapy agent | |
| Xiong et al. | A benzophenoxazine-dyad as cancer indicator using for fluorescence-guided phototherapy | |
| RU2638131C1 (en) | Photosensitize based on carbocyanine dye for photodynamic therapy of tumours | |
| F Zhao et al. | Gallium phthalocyanine photosensitizers: carboxylation enhances the cellular uptake and improves the photodynamic therapy of cancers | |
| US8143013B2 (en) | Visible to near-infrared light probe using energy transfer between luciferase and an organic dye via a sugar chain |