RU2634914C2 - Method for mycotoxines biotechbregation - Google Patents

Method for mycotoxines biotechbregation Download PDF

Info

Publication number
RU2634914C2
RU2634914C2 RU2016148169A RU2016148169A RU2634914C2 RU 2634914 C2 RU2634914 C2 RU 2634914C2 RU 2016148169 A RU2016148169 A RU 2016148169A RU 2016148169 A RU2016148169 A RU 2016148169A RU 2634914 C2 RU2634914 C2 RU 2634914C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mycotoxins
enzyme
hydrolysis
mycotoxin
oph
Prior art date
Application number
RU2016148169A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2016148169A (en
Inventor
Елена Николаевна Ефременко
Илья Владимирович Лягин
Айсель Гюльхан кызы Асланлы
Татьяна Абрамовна Махлис
Original Assignee
Елена Николаевна Ефременко
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Елена Николаевна Ефременко filed Critical Елена Николаевна Ефременко
Priority to RU2016148169A priority Critical patent/RU2634914C2/en
Publication of RU2016148169A publication Critical patent/RU2016148169A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2634914C2 publication Critical patent/RU2634914C2/en

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/10Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/16Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: this method is based on the use of a hexahistidine-containing organophosphate hydrolase exhibiting high lactonase activity with a broad spectrum of action, which is administered as a highly purified soluble or rehydrated lyophilized preparation, or an enzyme polyelectrolyte complex, or an immobilized enzyme preparation, or a cellular homogenate supernatant in a mycotoxin-containing reaction medium in a concentration of up to 0.5 g/kg or 0.5 g/l, followed by a lactone hydrolysis process up to 95-100%. The method allows to use the same enzyme to neutralise not one but several different mycotoxins having a lactone ring, including individual mycotoxins, patulin and sterigmatocystin, for which no analogous enzymatic decomposition is known at all, and also allows to use various catalytic forms of enzymes, allowing to keep its stability of action in a wide range of pH and in environments with different, including extremely high and extremely toxic, mycotoxins concentration.
EFFECT: increased rate of effective mycotoxins decomposition with a reduction in the time required for this,.
6 ex

Description

Изобретение относится к области биологического обезвреживания микотоксинов, являющихся продуктами метаболизма грибов, поражающими и загрязняющими сельскохозяйственное сырье, продукты питания, корма для животных как в процессе выращивания сельскохозяйственных культур, так и при хранении продуктов их переработки, а именно изобретение относится к способу ферментативного гидролиза микотоксинов, молекулы которых содержат лактонное кольцо (зеараленона, патулина, дезоксиниваленола, стеригматоцистина - метаболического предшественника афлатоксинов), как в виде чистых веществ, так и в составе сложных по химическому составу сред, в том числе в сельскохозяйственном сырье, кормах для животных, продуктах питания.The invention relates to the field of biological disposal of mycotoxins, which are products of fungi metabolism, affecting and polluting agricultural raw materials, food, animal feed both in the process of growing crops and during storage of their processed products, namely, the invention relates to a method for enzymatic hydrolysis of mycotoxins, whose molecules contain a lactone ring (zearalenone, patulin, deoxynivalenol, sterigmatocystin, a metabolic precursor of latoksinov), both as pure substances and as a part of complex chemical composition of fluids, including the agricultural raw materials, for animal feed, foodstuffs.

Как правило, микотоксины отличаются высокой стабильностью и не разрушаются при высокой температуре, в силу чего могут сохраняться даже в прошедших термическую обработку продуктах питания и кормах. Микотоксины представляют серьезную опасность для здоровья человека и животных, так как при попадании в организм позвоночных эти соединения оказывают канцерогенное, эстрогенное, нейродегенеративное, иммуно-супрессивное и тератогенное воздействие, вызывая разного рода острые и тяжелые хронические заболевания [Zain М.Е. Impact of mycotoxins on humans and animals // J. Saudi Chemical Society, 2011, 15, 129-144; DaRocha M.E.B., Freire F.D.O., Maia F.B.F., Guedes M.I.F., Rondina D. Mycotoxins and their effects on human and animal health. // Food Control, 2014, 36, 159-165].As a rule, mycotoxins are highly stable and do not break down at high temperatures, which is why they can be stored even in heat-treated food and feed. Mycotoxins pose a serious danger to human and animal health, since when they enter the body of vertebrates, these compounds have a carcinogenic, estrogenic, neurodegenerative, immunosuppressive and teratogenic effects, causing various kinds of acute and severe chronic diseases [Zain M.E. Impact of mycotoxins on animals and animals // J. Saudi Chemical Society, 2011, 15, 129-144; DaRocha M.E.B., Freire F.D.O., Maia F.B.F., Guedes M.I.F., Rondina D. Mycotoxins and their effects on human and animal health. // Food Control, 2014, 36, 159-165].

К числу наиболее токсичных среди известных микотоксинов относятся дезоксиниваленол (ДОН), зеараленон (ЗЕА) и патулин (ПАТ), а также стеригматоцистин (СЦН) - микотоксин и предшественник синтеза других микотоксинов - афлатоксинов [Karlovsky P., Suman М., Berthiller F., Meester J.De, Eisenbrand G., Perrin I., Oswald I.P., Speijers G., Chiodini A., Recker Т., Dussort P. Impact of food processing and detoxification treatments on mycotoxin contamination // Mycotoxin Res (2016) 32: 179-205]:Among the most toxic of the known mycotoxins are deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZEA) and patulin (PAT), as well as sterigmatocystin (SCN) - mycotoxin and the precursor of the synthesis of other mycotoxins - aflatoxins [Karlovsky P., Suman M., Berthiller F. , Meester J. De, Eisenbrand G., Perrin I., Oswald IP, Speijers G., Chiodini A., Recker T., Dussort P. Impact of food processing and detoxification treatments on mycotoxin contamination // Mycotoxin Res (2016) 32 : 179-205]:

Figure 00000001
Figure 00000001

Среди способов биологического обезвреживания микотоксинов наибольший интерес вызывают ферментативные способы, так как ферменты катализируют природные процессы деструкции микотоксинов, которые протекают в условиях, благоприятных для окружающей среды, не требуют повышенных температур, атмосферного давления, присутствия агрессивных щелочных или кислотных реагентов, растворителей [Yan Zhu, Yousef I. Hassan, Christena Watts, Ting Zhou Innovative technologies for the mitigation of mycotoxins in animal feed and ingredients-A review of recent patents // Animal Feed Science & Technology (2016) 216: 19-29]. Действие ферментов имеет высокую специфическую направленность, и активность ферментов, как правило, выше, чем активность целых клеток микроорганизмов, применяемых для деградации микотоксинов, поскольку ферменты катализируют отдельные реакции, а не комплексы метаболических биохимических реакций. В отличие от микроорганизмов, ферменты не требуют наличия питательных веществ в средах, где проводится деструкция микотоксинов. Введение ферментов в среду с микотоксинами вместо интактных клеток [Патент US 008119172 В2, 2012, Microorganism for detoxification of mycotoxins, namely ochratoxins and/or zearalenons, as well as method and use thereof, A23L 1/28, C12N 1/00] существенно повышают безопасность таких процессов обработки и они, как белки, могут легко инактивироваться после разложения микотоксинов под действием различных факторов, тогда как в случае клеток микроорганизмов требуется обязательная стерилизация обрабатываемых сред.Among the methods of biological neutralization of mycotoxins, enzymatic methods are of greatest interest, since enzymes catalyze the natural processes of destruction of mycotoxins, which proceed under conditions favorable to the environment, do not require elevated temperatures, atmospheric pressure, the presence of aggressive alkaline or acid reagents, solvents [Yan Zhu, Yousef I. Hassan, Christena Watts, Ting Zhou Innovative technologies for the mitigation of mycotoxins in animal feed and ingredients-A review of recent patents // Animal Feed Science & Technology (2016) 216: 19-29]. The action of enzymes has a high specific orientation, and the activity of enzymes is usually higher than the activity of whole cells of microorganisms used for the degradation of mycotoxins, since enzymes catalyze individual reactions, rather than complexes of metabolic biochemical reactions. Unlike microorganisms, enzymes do not require nutrients in environments where mycotoxins are degraded. The introduction of enzymes into the medium with mycotoxins instead of intact cells [Patent US 008119172 B2, 2012, Microorganism for detoxification of mycotoxins, namely ochratoxins and / or zearalenons, as well as method and use thereof, A23L 1/28, C12N 1/00] significantly increase the safety of such processing processes and they, like proteins, can be easily inactivated after the decomposition of mycotoxins under the influence of various factors, whereas in the case of microorganism cells, mandatory sterilization of the treated media is required.

Поскольку разными мицелиальными грибами синтезируются различные по химической структуре микотоксины, то максимальный интерес составляют ферменты и способы биологического обезвреживания микотоксинов с их помощью, основанные на каталитическом действии ферментов, которые могут применяться для разрушения нескольких микотоксинов, то есть обладающих некоторой универсальностью действия. Так сегодня известен ряд способов биологического обезвреживания ряда микотоксинов, основанных на использовании окислительно-восстановительных ферментов, в частности, лакказы, цитохрома Р-450, F420-зависимой оксидоредуктазы, Mn-пероксидазы [Wu Y.Z., Lu F.P., Jiang H.L., Tan СР., Yao D.S., Xie C.F., Liu D.L. The furofuran-ring selectivity, hydrogen peroxide production and low Km value are the three elements for highly effective detoxification of aflatoxin oxidase. // Food Chem. Toxicol., 2015, v.76, p.125-131; J.F. Alberts, W.C.A. Gelderblom, A. Botha, W.H. van Zyl Degradation of aflatoxin B1 by fungal laccase enzymes International Journal of Food Microbiology 135 (2009) 47-52; Патент WO 2009077447 A1 Process for degrading zearalenone in a feed product employing laccase (2009), C12P 1/00, A23K 1/00, A23L 1/03].Since mycotoxins different in chemical structure are synthesized by different mycelial fungi, the enzymes and methods for the biological neutralization of mycotoxins with their help are based on the catalytic action of enzymes that can be used to destroy several mycotoxins, that is, with some universality of action. So today, a number of methods are known for the biological neutralization of a number of mycotoxins based on the use of redox enzymes, in particular, laccase, cytochrome P-450, F420-dependent oxidoreductase, Mn peroxidase [Wu YZ, Lu FP, Jiang HL, Tan CP., Yao DS, Xie CF, Liu DL The furofuran-ring selectivity, hydrogen peroxide production and low Km value are the three elements for highly effective detoxification of aflatoxin oxidase. // Food Chem. Toxicol., 2015, v. 76, p. 125-131; J.F. Alberts, W.C.A. Gelderblom, A. Botha, W.H. van Zyl Degradation of aflatoxin B1 by fungal laccase enzymes International Journal of Food Microbiology 135 (2009) 47-52; Patent WO 2009077447 A1 Process for degrading zearalenone in a feed product employing laccase (2009), C12P 1/00, A23K 1/00, A23L 1/03].

Несмотря на то, что эффективность этих способов биологического обезвреживания микотоксинов, основанных на ферментативных окислительных процессах, является относительно высокой (так, например, за 48 часов достигается максимальная (90%-ная) деградация микотоксина при его концентрации 312 мг/л, то есть скорость разложения микотоксина составляет 5,85 мг/л/ч) [Yehia R.S. Aflatoxin detoxification by manganese peroxidase purified from Pleurotus ostreatus. // Braz. J. Microbiol., 2014, v. 45(1), p. 127-3], эти способы обладают рядом существенных недостатков: нестабильность самих применяемых ферментов, требования к особым условиям их хранения и использования в способах обезвреживания микотоксинов (применение дополнительных дорогостоящих редокс-медиаторов, введение перекиси водорода в среду, необходимость обеспечения повышенных концентраций кислорода в средах, содержащих микотоксины) и др. Однако главный из недостатков заключается в том, что в результате применения этих окислительных способов ферментативной обработки микотоксинов образуются продукты не менее, а иногда и более токсичные, чем исходные токсины [Н. Zeinvand-Lorestani, O. Sabzevari, N. Setayesh, M. Amini, A. Nili-Ahmadabad, M. A.aramarzi Comparative study of in vitro prooxidative properties and genotoxicity induced by aflatoxin B1 and its laccase-mediated detoxification products // Chemosphere 135 (2015) 1-6; P. Karlovsky Biological Detoxification of Fungal Toxins and its Use in Plant Breeding, Feed and Food ProductionNat. // Toxins (1999) 7: 1-23].Despite the fact that the effectiveness of these methods of biological treatment of mycotoxins based on enzymatic oxidative processes is relatively high (for example, in 48 hours, the maximum (90%) degradation of mycotoxin is achieved at a concentration of 312 mg / l, i.e. decomposition of mycotoxin is 5.85 mg / l / h) [Yehia RS Aflatoxin detoxification by manganese peroxidase purified from Pleurotus ostreatus. // Braz. J. Microbiol., 2014, v. 45 (1), p. 127-3], these methods have a number of significant drawbacks: the instability of the enzymes used themselves, the requirements for special conditions for their storage and use in the methods of neutralizing mycotoxins (the use of additional expensive redox mediators, the introduction of hydrogen peroxide in the medium, the need to provide increased oxygen concentrations in the media containing mycotoxins), etc. However, the main disadvantage is that as a result of the application of these oxidative methods, the enzymatic treatment of mycotoxins in products are formed no less, and sometimes more toxic, than the initial toxins [N. Zeinvand-Lorestani, O. Sabzevari, N. Setayesh, M. Amini, A. Nili-Ahmadabad, MAaramarzi Comparative study of in vitro prooxidative properties and genotoxicity induced by aflatoxin B1 and its laccase-mediated detoxification products // Chemosphere 135 (2015 ) 1-6; P. Karlovsky Biological Detoxification of Fungal Toxins and its Use in Plant Breeding, Feed and Food Production Nat. // Toxins (1999) 7: 1-23].

Токсичность микотоксинов определяется совокупностью токсических групп, присутствующих в структуре их молекул, и в этой связи они имеют структурное сходство. Так, общая токсичность дезоксиниваленола, зеараленона, патулина и стеригматоцистина определяется наличием лактонного кольца в молекуле этих микотоксинов. В этой связи высок интерес к ферментам, способным осуществлять трансформацию именно этого лактонного кольца в структуре микотоксинов с получением продуктов трансформации, не обладающих токсичностью исходного вещества. К числу таких ферментов, катализирующих гидролиз эфирной связи в лактонном кольце относятся лактоназы.The toxicity of mycotoxins is determined by the combination of toxic groups present in the structure of their molecules, and in this regard they have structural similarities. So, the general toxicity of deoxynivalenol, zearalenone, patulin and sterigmatocystin is determined by the presence of a lactone ring in the molecule of these mycotoxins. In this regard, there is great interest in enzymes capable of transforming precisely this lactone ring in the structure of mycotoxins to obtain transformation products that do not have toxicity of the starting material. Among these enzymes that catalyze the hydrolysis of the ether bond in the lactone ring are lactonases.

Так, известен способ биологического обезвреживания такого микотоксина как зеараленон, основанный на гидролизе лактонного кольца в молекуле зеаралинона лактоназой, за которым следует спонтанное декарбоксилирование [Takahashi-Ando, N., Kimura, М., Kakeya, Н., Osada, Н., Yamaguchi, I., A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone: enzyme purification and gene cloning. Biochemical journal, (2002), 365, 1-6; Takahashi-Ando, N.. Ohsato Sh, Shibata Т., Hamamoto H. Metabolism of Zearalenone by Genetically Modified Organisms Expressing the Detoxification Gene from Clonostachys rosea. App. Environ. Microbiol., 2004 Vol. 70, No. 6 p. 3239-3245]. Данный способ позволяет при 30°C достичь 100% эффективности биообезвреживания зеараленона при его исходной концентрации 43,4 мг/л за 38 часов в присутствии рекомбинантной полигистидинсодержащей лактоназы при внесении ее в виде высокоочищенного фермента в среду с микотоксином (Tris-HCl буфер, pH 7.5) в концентрации 1,2 мг/л [Е. Vekiru, S. Fruhauf, С. Hametner, G. Schatzmayr, R. Krska 1, W.D. Moll, R. Schuhmacher Isolation and characterisation of enzymatic zearalenone hydrolysis reaction products // World Mycotoxin J., 2016; 9 (3): 353-363]. Использование рекомбинантной лактоназы для применения этого способа на практике позволяет осуществлять наработку фермента в необходимом количестве и проводить его очистку до максимального уровня каталитической активности. Однако существенными недостатками этого способа является низкая скорость гидролиза зеараленона (1,142 мг/л/ч) и возможность использования по этому способу фермента только для гидролиза одного микотоксина - зеараленона. Для других микотоксинов, одержащих лактонное кольцо в своей структуре (патулина, дезоксиниваленола и стеригматоцистина) аналогичных реакций разложения под действием того же фермента не показано.Thus, there is a method for the biological neutralization of such a mycotoxin as zearalenone, based on the hydrolysis of a lactone ring in a zearalinone molecule with a lactonase, followed by spontaneous decarboxylation [Takahashi-Ando, N., Kimura, M., Kakeya, N., Osada, N., Yamaguchi , I., A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone: enzyme purification and gene cloning. Biochemical journal, (2002), 365, 1-6; Takahashi-Ando, N .. Ohsato Sh, Shibata T., Hamamoto H. Metabolism of Zearalenone by Genetically Modified Organisms Expressing the Detoxification Gene from Clonostachys rosea. App. Environ. Microbiol., 2004 Vol. 70, No. 6 p. 3239-3245]. This method allows at 30 ° C to achieve 100% biodegradation efficiency of zearalenone at its initial concentration of 43.4 mg / l for 38 hours in the presence of a recombinant polyhistidine-containing lactonase when it is added as a highly purified enzyme to a medium with mycotoxin (Tris-HCl buffer, pH 7.5 ) at a concentration of 1.2 mg / l [E. Vekiru, S. Fruhauf, C. Hametner, G. Schatzmayr, R. Krska 1, W.D. Moll, R. Schuhmacher Isolation and characterization of enzymatic zearalenone hydrolysis reaction products // World Mycotoxin J., 2016; 9 (3): 353-363]. The use of recombinant lactonase for the application of this method in practice allows the production of the enzyme in the required amount and its purification to the maximum level of catalytic activity. However, significant disadvantages of this method are the low rate of hydrolysis of zearalenone (1.142 mg / l / h) and the possibility of using the enzyme in this method only for the hydrolysis of one mycotoxin - zearalenone. For other mycotoxins containing a lactone ring in their structure (patulin, deoxynivalenol and sterigmatocystin), similar decomposition reactions under the action of the same enzyme are not shown.

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу биологического обезвреживания микотоксина (зеараленона), молекула которого содержит лактонное кольцо, на основе его ферментативного гидролиза под действием фермента, обладающего лактоназной активностью, принято за прототип.This technical solution, as the closest to the claimed method for the biological neutralization of mycotoxin (zearalenone), the molecule of which contains a lactone ring, based on its enzymatic hydrolysis by an enzyme with lactonase activity, is taken as a prototype.

Задачей предлагаемого изобретения является способ биологического обезвреживания микотоксинов, молекулы которых содержат лактонное кольцо, на основе их ферментативного гидролиза под действием фермента с лактоназной активностью, осуществляющего высокоэффективную деструкцию микотоксинов как в виде чистых веществ, так и в составе сложных по химическому составу сред, в том числе в сельскохозяйственном сырье, кормах для животных, продуктах питания.The objective of the invention is a method for the biological neutralization of mycotoxins, the molecules of which contain a lactone ring, based on their enzymatic hydrolysis under the action of an enzyme with lactonase activity, which carries out highly effective destruction of mycotoxins both in the form of pure substances and as part of media with a complex chemical composition, including in agricultural raw materials, animal feed, food.

Поставленная задача решается тем, что гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза (His6-OPH), проявляющая лактоназную активность, вводится в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, или ферментного полиэлектролитического комплекса, или препарата иммобилизованного фермента, а также в виде супернатанта клеточного гомогената в реакционную смесь, содержащую при pH 6,5-10,5 до 0,5 г/кг или 0,5 г/л микотоксина, имеющего в своей структуре лактонное кольцо.The problem is solved in that the hexahistidine-containing organophosphate hydrolase (His 6 -OPH), showing lactonase activity, is introduced as a highly purified soluble or rehydrated lyophilized preparation, or an enzyme polyelectrolyte complex, or an immobilized enzyme preparation, as well as in the supernatant of the cell homogen containing at a pH of 6.5-10.5 to 0.5 g / kg or 0.5 g / l of mycotoxin having a lactone ring in its structure.

Применение фермента His6-OPH, проявляющего более высокую лактоназную активность с расширенным субстратным спектром действия в сравнении с природными лактоназами [Sirotkina M.S., Efremenko E.N. Rhodococcus lactonase with organophosphate hydrolase (OPH) activity and His6-tagged OPH with lactonase activity: evolutionary proximity of the enzymes and new possibilities in their application. // Appl. Microb. Biotech., 2014, 98 (6), p. 2647-2656], гарантирует возможность масштабирования предлагаемого способа биологического обезвреживания различных микотоксинов, содержащих лактонное кольцо, так как применение простой процедуры выделения фермента с использованием металлохелатирующей хроматографии [Efremenko Е., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. Purification of His6-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microb. Biotech., 2006, 70 (5), p. 558-563] обеспечивает возможность его получения в промышленных количествах при использовании штамма Escherichia coli ЦКМИБХ-29 [Патент РФ №2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH, кодирующая полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, и штамм бактерий E. coli - продуцент полипептида со свойствами органофосфатгидролазы. C12N 1/21, 15/52, 15/70].The use of His 6- OPH enzyme, which exhibits a higher lactase activity with an extended substrate spectrum of activity compared to natural lactonases [Sirotkina MS, Efremenko EN Rhodococcus lactonase with organophosphate hydrolase (OPH) activity and His 6 -tagged OPH with lactonase activity: evolutionary proximity of the enzymes and new possibilities in their application. // Appl. Microb. Biotech., 2014, 98 (6), p. 2647-2656], guarantees the possibility of scaling the proposed method for the biological neutralization of various mycotoxins containing a lactone ring, since the use of a simple enzyme isolation procedure using metal chelating chromatography [Efremenko E., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. Purification of His 6 -organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microb. Biotech., 2006, 70 (5), p. 558-563] provides the possibility of its production in industrial quantities using the Escherichia coli strain TSKMIBH-29 [RF Patent No. 2255975 (2005) Recombinant plasmid DNA pTES-His-OPH encoding a polypeptide with the properties of organophosphate hydrolase and a bacterial strain E. coli producing polypeptide with the properties of organophosphate hydrolase. C12N 1/21, 15/52, 15/70].

Предлагаемый к применению фермент His6-OPH вместо природных и рекомбинантных полигистидинсодержащих лактоназ характеризуется улучшенными каталитическими характеристиками по различным лактонсодержащим субстратам, что должно обеспечить существенное улучшение показателей процесса биологического обезвреживания микотоксинов (увеличение скорости их деструкции), а также гарантирует расширение перечня микотоксинов, содержащих лактонное кольцо, подвергающихся ферментативному гидролизу.The His 6 -OPH enzyme proposed for use instead of natural and recombinant polyhistidine-containing lactonases is characterized by improved catalytic characteristics for various lactone-containing substrates, which should provide a significant improvement in the performance of the biological treatment of mycotoxins (increase the rate of their destruction), and also guarantees the expansion of the list of mycotoxins containing the lactone ring subjected to enzymatic hydrolysis.

Заявляемый способ биологического обезвреживания микотоксинов осуществляется тем, что к среде, содержащей микотоксин, имеющий в своем строении лактонное кольцо, и находящийся в среде при pH 6,5-10,5 в концентрации до 0,5 г/кг или 0,5 г/л в виде чистого вещества или в сложных по химическому составу смесях и композициях, в том числе в сельскохозяйственном сырье, кормах для животных, продуктах питания, привносится ферментный препарат гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы (His6-OPH), проявляющей лактоназную активность, в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, или ферментного полиэлектролитического комплекса, или препарата иммобилизованного фермента, а также в виде супернатанта клеточного гомогената так, чтобы он обеспечивал 100% гидролиз микотоксина в течение минимального времени.The inventive method of biological disposal of mycotoxins is carried out by the fact that the medium containing mycotoxin, having in its structure a lactone ring, and located in the medium at a pH of 6.5-10.5 in a concentration of up to 0.5 g / kg or 0.5 g / l in the form of pure substances or in the chemical composition of complex mixtures and compositions, including the agricultural raw materials, for animal feed, foodstuffs, is introduced enzyme preparation geksagistidinsoderzhaschey organophosphate (His 6 -OPH), laktonaznuyu exhibiting activity in the form of highly purified astvorimogo or rehydrated lyophilized preparation or an enzyme polielektroliticheskogo complex or of the immobilized enzyme preparation, as well as in a supernatant of the cell homogenate so as to provide 100% hydrolysis of the mycotoxin in a minimum time.

Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является:The essential technical result of the claimed invention is:

- проведение биологического обезвреживания микотоксинов, имеющих в своем строении лактонное кольцо, в сложных по химическому составу средах, а не только в виде чистых веществ,- carrying out the biological neutralization of mycotoxins having a lactone ring in their structure in complex chemical composition media, and not only in the form of pure substances,

- значительное увеличение скорости эффективного разложения микотоксинов при сокращении времени, необходимого для их 95-100%-ного разложения.- a significant increase in the rate of effective decomposition of mycotoxins while reducing the time required for their 95-100% decomposition.

Заявляемое техническое решение позволяет решить существенную экологическую и экономическую проблему, связанную с обезвреживанием микотоксинов и сохранением возможности использования или безопасной последующей утилизации сельскохозяйственного сырья или продуктов его переработки.The claimed technical solution allows to solve a significant environmental and economic problem associated with the disposal of mycotoxins and maintaining the possibility of using or safe subsequent disposal of agricultural raw materials or products of its processing.

Предлагаемый способ в отличие от аналогов и прототипа позволяет осуществить высокоэффективное биологическое обезвреживание не одного, а нескольких различных микотоксинов, имеющих лактонное кольцо, с использованием одного и того же фермента, благодаря чему может быть существенно упрощено решение проблемы разложения и детоксификации микотоксинов, продуцируемых разными микроскопическими грибами, на практике. Кроме того, способ позволяет осуществить разложение отдельных микотоксинов (патулина и стеригматоцистина), для которых вообще неизвестно аналогичное ферментативное разложение.The proposed method, unlike analogues and prototype, allows for highly effective biological neutralization of not one but several different mycotoxins having a lactone ring using the same enzyme, which can significantly simplify the solution of the decomposition and detoxification of mycotoxins produced by various microscopic fungi , on practice. In addition, the method allows the decomposition of individual mycotoxins (patulin and sterigmatocystin), for which a similar enzymatic decomposition is generally unknown.

Заявляемый способ предполагает возможность применения различных каталитических форм фермента His6-OPH, позволяющих сохранять стабильность действия фермента, в том числе в широком диапазоне pH и в средах с разными, в том числе и экстремально высокими и чрезвычайно токсичными концентрациями микотоксинов в присутствии накапливающихся продуктов их гидролиза, образование которых способствует снижению pH среды.The inventive method suggests the possibility of using various catalytic forms of the enzyme His 6 -OPH, allowing to maintain the stability of the enzyme, including in a wide pH range and in media with different, including extremely high and extremely toxic concentrations of mycotoxins in the presence of accumulating products of their hydrolysis , the formation of which helps to reduce the pH of the environment.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.The following are specific examples of the implementation of the proposed technical solution.

Пример 1. Гидролиз зеараленона в виде чистого вещества под действием полигистидинсодержащей органойфосфатгидролазы His6-OPH, вводимой в реакцию виде раствора высокоочищенного ферментаExample 1. The hydrolysis of zearalenone in the form of a pure substance under the action of a polyhistidine-containing organophosphate hydrolase His 6 -OPH, introduced into the reaction as a solution of highly purified enzyme

Для получения высокоочищенного фермента His-OPH выращивают клетки бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29 [Патент РФ №2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH, кодирующая полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, и штамм бактерий E. coli - продуцент полипептида со свойствами органофосфатгидролазы. C12N 1/21, 15/52, 15/70] на среде следующего состава: триптон - 12,0 г/л, дрожжевой экстракт - 24,0 г/л, глицерин - 4,0 мл/л, KH2PO4 - 6,95 г/л, K2HPO4×3H2O- 12,54 г/л, в которую добавляют CoCl2×6H2O (10-4 М), а также ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). 16-часовой инокулят вносят в колбу, содержащую 100 мл питательной среды, биомассу клеток выращивают при 30°C и постоянном перемешивании (200 об/мин) до тех пор, пока оптическая плотность при длине волны 540 нм не достигнет 0,6, после чего добавляют изопропил-β,D-галактопиранозит (0,4 мМ) как индуктор синтеза целевого фермента. После этого клетки культивируют в течение 12 ч. Полученную биомассу отделяют центрифугированием (5000 g, 15 мин), взвешивают и ресуспендируют в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 300 мМ хлорида натрия. Клетки разрушают обработкой ультразвуком (частота 44 кГц) и осадок клеточного дебриса отделяют центрифугированием (15000 g, 30 мин). К супернатанту добавляют равный объем 50% суспензии Ni-NTA агарозы в 50 мМ фосфатном буфере (pH 6,5) и перемешивают. Хроматографическую колонку заполняют полученной суспензией, промывают элюирующим буфером (50 мМ раствор фосфата натрия (pH 6,0), содержащий 300 мМ хлорид натрия) и элюируют фермент с колонки градиентным раствором имидазола (от 0 до 0,5 М). Полученные фракции, содержащие His6-OPH, объединяют и подвергают диализу против 20 мМ фосфатно-карбонатного буфера (pH 8,5). В результате получают высокоочищенный препарат His-OPH с концентрацией 1 мг белка/мл и 98% гомогенностью по белку.To obtain a highly purified His-OPH enzyme, Escherichia coli bacterial cells are grown. CCMIBCH 29 [RF Patent No. 2255975 (2005) Recombinant plasmid DNA pTES-His-OPH encoding a polypeptide with the properties of organophosphate hydrolase and a bacterial strain E. coli that produces a polypeptide with organophosphate properties. C12N 1/21, 15/52, 15/70] on a medium of the following composition: tryptone - 12.0 g / l, yeast extract - 24.0 g / l, glycerin - 4.0 ml / l, KH 2 PO 4 6.95 g / l, K 2 HPO 4 × 3H 2 O - 12.54 g / l, to which CoCl 2 × 6H 2 O (10 -4 M), as well as ampicillin (100 μg / ml) are added and kanamycin (25 μg / ml). A 16-hour inoculum is introduced into a flask containing 100 ml of nutrient medium, the cell biomass is grown at 30 ° C with constant stirring (200 rpm) until the optical density at a wavelength of 540 nm reaches 0.6, after which add isopropyl-β, D-galactopyranosite (0.4 mmol) as an inducer of the synthesis of the target enzyme. After this, the cells were cultured for 12 hours. The resulting biomass was separated by centrifugation (5000 g, 15 min), weighed and resuspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 300 mM sodium chloride. Cells are destroyed by sonication (frequency 44 kHz) and the sediment of cell debris is separated by centrifugation (15000 g, 30 min). An equal volume of a 50% suspension of Ni-NTA agarose in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) was added to the supernatant and mixed. The chromatographic column was filled with the resulting suspension, washed with an elution buffer (50 mM sodium phosphate solution (pH 6.0) containing 300 mM sodium chloride), and the enzyme was eluted from the column with an imidazole gradient solution (0 to 0.5 M). The resulting fractions containing His 6 -OPH were combined and dialyzed against 20 mM phosphate-carbonate buffer (pH 8.5). The result is a highly purified His-OPH preparation with a concentration of 1 mg protein / ml and 98% protein homogeneity.

Для проведения гидролиза микотоксина в герметичную емкость, содержащую 45 мг зеараленона в 1 л 50 мМ Трис-HCl-буфера (pH 7,5), используемого для гидролиза зеараленона как в прототипе, вводят 1,2 мл высокоочищенного препарата фермента His6-OPH, чтобы концентрация фермента была 1,2 мг/л, как в прототипе с гистидинсодержащей лактоназой, и оставляют при температуре 30°C без перемешивания. Через 3 часа устанавливают 100% гидролиз зеараленона. Таким образом, скорость гидролиза чистого зеараленона в тех же условиях, что указаны в прототипе, составляет 15 мг/л/ч против 1,142 мг/л/ч, то есть в 13 раз больше. При этом исходно на 1 мг белка приходится 37,5 мг зеараленона (в прототипе - 36,2 мг). Время полного гидролиза исходной концентрации зеараленона сокращено с 38 ч (как в прототипе) до 3 часов, то есть в 12,6 раза.To carry out the hydrolysis of mycotoxin in a sealed container containing 45 mg of zearalenone in 1 l of 50 mm Tris-HCl buffer (pH 7.5) used for the hydrolysis of zearalenone as in the prototype, 1.2 ml of a highly purified preparation of the enzyme His 6 -OPH is introduced. so that the concentration of the enzyme was 1.2 mg / l, as in the prototype with histidine-containing lactonase, and left at a temperature of 30 ° C without stirring. After 3 hours, 100% hydrolysis of zearalenone was established. Thus, the hydrolysis rate of pure zearalenone under the same conditions as indicated in the prototype is 15 mg / l / h versus 1.142 mg / l / h, that is 13 times more. In this case, initially, 1.5 mg of protein accounts for 37.5 mg of zearalenone (36.2 mg in the prototype). The time of complete hydrolysis of the initial concentration of zearalenone was reduced from 38 hours (as in the prototype) to 3 hours, that is, 12.6 times.

Пример 2. Гидролиз зеараленона в составе измельченного зерна пшеницы под действием His6-OPH, вводимой в реакцию виде регидратированного лиофилизованного препаратаExample 2. The hydrolysis of zearalenone in the composition of the crushed wheat grain under the action of His 6 -OPH, introduced into the reaction as a rehydrated lyophilized preparation

Для получения лиофильно высушенного препарата His6-OPH, раствор высокоочищенного фермента His6-OPH с 98% гомогенностью по белку, исходно полученный, как описано в Примере 1, замораживают при -20°C и высушивают на лиофильной сушилке при остаточном давлении в камере сублиматора 0,2-0,3 мБ до остаточной влажности препарата 6%. Лиофилизованный препарат His6-OPH перед использованием в процессе гидролиза микотоксина регидратируют, для этого навеску сухого препарата растворяют в 20 мМ фосфатно-карбонатном буфере (pH 8,5) так, чтобы получить концентрацию 5 мг белка на 1 мл раствора.To obtain a freeze-dried preparation of His 6 -OPH, a solution of highly purified His 6 -OPH enzyme with 98% protein homogeneity, initially obtained as described in Example 1, was frozen at -20 ° C and dried on a freeze dryer under a residual pressure in a sublimator chamber 0.2-0.3 mB to a residual moisture content of 6%. The lyophilized preparation His 6 -OPH is rehydrated before use during the hydrolysis of mycotoxin. For this purpose, a sample of the dry preparation is dissolved in 20 mM phosphate-carbonate buffer (pH 8.5) so as to obtain a concentration of 5 mg protein per 1 ml of solution.

Для проведения гидролиза зеараленона при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 1 кг измельченного зерна с влажностью 84%, вводят раствор чистого вещества зеараленона в 100 мл 20 мМ фосфатно-карбонатного буфера (pH 8,5) так, чтобы получить концентрацию зеараленона 500 мг/кг зерна, и добавляют 2 мл регидратированного лиофилизованного препарата His-OPH. Через 4 часа устанавливают 100% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 125 мг/л/ч, при этом исходно на 1 мг белка приходится 12,5 мг зеараленона.To carry out the hydrolysis of zearalenone at a temperature of 20 ° C, a solution of the pure substance of zearalenone in 100 ml of 20 mM phosphate-carbonate buffer (pH 8.5) is introduced into an airtight container containing 1 kg of crushed grain with a moisture content of 84% so as to obtain a concentration of zearalenone 500 mg / kg grain, and 2 ml of rehydrated lyophilized His-OPH preparation was added. After 4 hours, 100% hydrolysis of mycotoxin is established. Thus, the rate of hydrolysis of mycotoxin is 125 mg / l / h, with 12.5 mg of zearalenone being the initial 1 mg of protein.

Пример 3. Гидролиз дезоксиниваленола в кормовом силосе под действием His6-OPH, вводимой в реакцию в виде раствора высокоочищенного ферментаExample 3. The hydrolysis of deoxynivalenol in feed silo under the action of His 6 -OPH, introduced into the reaction in the form of a solution of highly purified enzyme

Для гидролиза дезоксиниваленола в составе кормового силоса согласно заявляемому способу используют раствор высокоочищенного фермента His6-ОРН, полученный, как описано в Примере 1. Для проведения гидролиза дезоксиниваленола при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 1 кг силоса вводят раствор чистого вещества дезоксиниваленола в 50 мл 50 мМ карбонатного буфера (pH 10,5) так, чтобы получить концентрацию зеараленона 250 мг/кг силоса, и добавляют 5 мл раствора His6-ОРН. Через 4 часа устанавливают 100% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 62,5 мг/л/ч, при этом исходно на 1 мг белка приходится 50 мг дезоксиниваленола.For the hydrolysis of deoxynivalenol in the composition of the feed silo according to the claimed method, a highly purified His 6 -OPH enzyme solution obtained as described in Example 1 is used. To carry out the hydrolysis of deoxynivalenol at a temperature of 20 ° C, a solution of the pure deoxynivalenol substance is introduced into a sealed container containing 1 kg of silo 50 ml of 50 mM carbonate buffer (pH 10.5) so as to obtain a zearalenone concentration of 250 mg / kg silage, and 5 ml of His 6 -ORH solution was added. After 4 hours, 100% hydrolysis of mycotoxin is established. Thus, the rate of hydrolysis of mycotoxin is 62.5 mg / l / h, while the initial dose of 1 mg of protein is 50 mg of deoxynivalenol.

Пример 4. Гидролиз патулина в составе зернового комбикорма под действием His6-OPH, вводимой в реакцию в составе супернатанта клеточного гомогенатаExample 4. Hydrolysis of patulin in the composition of grain feed under the action of His 6 -OPH, introduced into the reaction as part of the supernatant of cell homogenate

Для гидролиза патулина согласно заявляемому способу, используют препарат His6-OPH, исходно полученный, как описано в Примере 1 до стадии отделения осадка клеточного гомогената центрифугированием (15000 g, 30 мин), получаемого после обработки клеток ультразвуком (частота 44 кГц). Таким образом, фермент His6-OPH получают в составе супернатанта в среде 50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5) после отделения клеточного дебриса. Супернатант, имеющий общее содержание белка 150 мг/мл, далее используют для гидролиза микотоксина. Компьютерная обработка с помощью Sigma Gel Program результатов электрофоретического анализа, проведенного в SDS-полиакриламидном геле, белкового состава полученного препарата, показывает, что His6-OPH в общем составе белков при такой процедуре получения супернатанта клеточного гомогената составляет 12%, то есть 18 мг/мл супернатанта клеточного гомогената.For hydrolysis of patulin according to the claimed method, His 6- OPH preparation is used, initially prepared as described in Example 1 prior to the step of separating the cell homogenate precipitate by centrifugation (15000 g, 30 min) obtained after the treatment of the cells with ultrasound (frequency 44 kHz). Thus, the His 6 -OPH enzyme is obtained as a supernatant in 50 mM phosphate buffer (pH 6.5) after separation of cell debris. The supernatant having a total protein content of 150 mg / ml is then used for the hydrolysis of mycotoxin. Computer processing using the Sigma Gel Program of the results of electrophoretic analysis, carried out in SDS-polyacrylamide gel, of the protein composition of the obtained preparation, shows that His 6 -OPH in the total protein composition in this procedure for obtaining the cell homogenate supernatant is 12%, i.e. 18 mg / ml of cell homogenate supernatant.

Для проведения гидролиза патулина при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 1 кг зернового комбикорма, с 50 мг микотоксина на 1 кг корма, вводят 200 мл предварительно разбавленного в 1000 раз супернатанта, содержащего His6-OPH. Разбавление проводят 50 мМ фосфатным буфером (pH 6,5). Через 2 часа устанавливают 100% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 25 мг/л/ч, при этом исходно на 1 мг неочищенного белка приходится 13,8 мг патулина.To carry out the hydrolysis of patulin at a temperature of 20 ° C, 200 ml of a supernatant containing His 6 -OPH pre-diluted 1000 times are introduced into a sealed container containing 1 kg of grain feed, with 50 mg of mycotoxin per 1 kg of feed. Dilution is carried out with 50 mM phosphate buffer (pH 6.5). After 2 hours, 100% hydrolysis of mycotoxin is established. Thus, the rate of hydrolysis of mycotoxin is 25 mg / l / h, with 13.8 mg of patulin initially per 1 mg of crude protein.

Пример 5. Гидролиз стеригматоцистина в виде чистого вещества под действием His6-OPH, вводимой в реакцию в виде ферментного полиэлектролитного комплексаExample 5. The hydrolysis of sterigmatocystin in the form of a pure substance under the action of His 6 -OPH, introduced into the reaction in the form of an enzyme polyelectrolyte complex

Для гидролиза стеригматоцистина в составе кормового силоса согласно заявляемому способу используют в виде ферментного нековалентного полиэлектролитного комплекса, который получают, как описано в Петенте РФ №2525658 (2014) «Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo» (C12N 9/16, A62D 3/00, A61K 38/46) при использовании раствора высокоочищенного фермента His6-OPH, полученного, как описано в Примере 1, и блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты - ПЭГ119-ПГК50 (MW=13 кг/моль), взятых в соотношении «фермент:полианион» в зарядовом соотношении 1:5. Для проведения гидролиза стеригматоцистина при температуре 25°C в герметичную емкость, содержащую 1 л раствора чистого вещества стеригматоцистина в 50 мМ карбонатном буфере (pH 10,5) в концентрации 500 мг/л, добавляют 5 мл ферментного полиэлектролитного комплекса His6-OPH. Через 2 часа устанавливают 95% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 237,5 мг/л/ч.For the hydrolysis of sterigmatocystin in the composition of the feed silo according to the claimed method, they are used in the form of an enzymatic non-covalent polyelectrolyte complex, which is obtained as described in Petent RF No. 2525658 (2014) “Nanoscale enzymatic biocatalyst for detoxification of organophosphorus compounds in vivo” (C12N 9/16, A62D 3 / 00, A61K 38/46) using a highly purified His 6 -OPH enzyme solution prepared as described in Example 1 and a block copolymer of polyethylene glycol and polyglutamic acid — PEG 119 -PHC 50 (M W = 13 kg / mol), taken in the ratio enzyme: polyanion in a charge ratio of 1: 5. To hydrolyze sterigmatocystin at a temperature of 25 ° C, 5 ml of His 6 -OPH enzyme polyelectrolyte complex is added to a sealed container containing 1 l of a solution of pure sterigmatocystin in 50 mM carbonate buffer (pH 10.5) at a concentration of 500 mg / l. After 2 hours, 95% hydrolysis of mycotoxin is established. Thus, the rate of hydrolysis of mycotoxin is 237.5 mg / l / h.

Пример 6. Гидролиз патулина в составе комбикорма для рыб под действием высокоочищенного фермента His6-OPH, иммобилизованного методом сорбции на природном цеолите, обработанном низкотемпературной плазмойExample 6. Hydrolysis of patulin in compound feed for fish under the influence of highly purified His 6 -OPH enzyme immobilized by sorption on natural zeolite treated with low-temperature plasma

Для гидролиза патулина в составе комбикорма для рыб, согласно заявляемому способу, используют препарат His6-OPH, исходно полученный, как описано в Примере 1. Для иммобилизации фермента методом сорбции на природном цеолите, обработанном низкотемпературной плазмой, применяют известный способ [Maslova O.V., Stepanov N.A., Grigor'eva A.I., Bruyako M.G., Efremenko E.N. New effective enzymatic biopreparations based on application of mineral carriers treated by low-temperature plasma for destruction of organophosphates in soil. // Intern. J. Pharmacy &Technology, 2016, V. 8 (4), in press], согласно которому 50 мл высокоочищенного фермента His6-OPH смешивают с 10 г минерального носителя, модифицированного с помощью низкотемпературной плазмы [Заявка о выдаче Патента РФ на изобретение №2016126954 от 05.07.2016], и экспонируют при 8°C в течение 6 часов при периодическом перемешивании. После этого носитель с иммобилизованным на нем методом сорбции ферментом промывают 10 мМ раствором NaHCO3 (pH 7.5) до постоянной остаточной ферментативной активности.For the hydrolysis of patulin in the compound feed for fish, according to the claimed method, the preparation His 6- OPH is used, initially prepared as described in Example 1. To immobilize the enzyme by sorption on natural zeolite treated with low-temperature plasma, the known method is used [Maslova OV, Stepanov NA, Grigor'eva AI, Bruyako MG, Efremenko EN New effective enzymatic biopreparations based on application of mineral carriers treated by low temperature plasma for destruction of organophosphates in soil. // Intern. J. Pharmacy & Technology, 2016, V. 8 (4), in press], according to which 50 ml of the highly purified His 6 -OPH enzyme is mixed with 10 g of a mineral carrier modified with a low-temperature plasma [RF Patent Application No. 2016126954 from 07/05/2016], and exposed at 8 ° C for 6 hours with periodic stirring. After that, the carrier with the enzyme immobilized by the sorption method is washed with 10 mM NaHCO 3 solution (pH 7.5) until the residual enzymatic activity is constant.

Для проведения гидролиза патулина при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 300 г измельченного овса с 5 мг микотоксина, вводят полученные 10 г минерального носителя, содержащего His6-OPH, тщательно перемешивают до равномерного распределения иммобилизованного фермента в обрабатываемой среде, добавляют 50 мл 10 мМ карбонатного буфера (pH 10,5) и вновь перемешивают. Через 0,5 часа устанавливают 100% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 10 мг/л/ч.To carry out the hydrolysis of patulin at a temperature of 20 ° C, 10 g of a mineral carrier containing His 6- OPH are introduced into a sealed container containing 300 g of ground oats with 5 mg of mycotoxin, mixed thoroughly until the immobilized enzyme is evenly distributed in the treated medium, 50 ml 10 mM carbonate buffer (pH 10.5) and mixed again. After 0.5 hours, 100% hydrolysis of mycotoxin is established. Thus, the rate of hydrolysis of mycotoxin is 10 mg / l / h.

Claims (1)

Способ биологического обезвреживания микотоксинов, имеющих в своем строении лактонное кольцо, на основе их ферментативного гидролиза под действием фермента, обладающего лактоназной активностью, отличающийся тем, что для гидролиза микотоксинов при рН 6,5-10,5 используют гексагистидинсодержащую органофосфатгидролазу, проявляющую лактоназную активность, которую вводят в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, или ферментного полиэлектролитического комплекса, или препарата иммобилизованного фермента, или супернатанта клеточного гомогената в реакционную среду, содержащую в виде чистого вещества или в виде составной части сложных по химическому составу композиций, в том числе в составе сельскохозяйственного сырья, кормов для животных, продуктов питания в концентрации до 0,5 г/кг или 0,5 г/л микотоксина, имеющего в своей структуре лактонное кольцо, с последующим проведением процесса гидролиза лактона до 95-100%.A method for the biological neutralization of mycotoxins having a lactone ring in their structure, based on their enzymatic hydrolysis under the action of an enzyme having lactonase activity, characterized in that for the hydrolysis of mycotoxins at pH 6.5-10.5, a hexahistidine-containing organophosphate hydrolase exhibiting lactonase activity is used, which administered in the form of a highly purified soluble or rehydrated lyophilized preparation, or an enzyme polyelectrolytic complex, or an immobilized preparation enzyme, or supernatant of cellular homogenate into the reaction medium, containing as a pure substance or as an integral part of complex chemical compositions, including agricultural raw materials, animal feed, food products in a concentration of up to 0.5 g / kg or 0.5 g / l of mycotoxin having a lactone ring in its structure, followed by the hydrolysis of lactone to 95-100%.
RU2016148169A 2016-12-08 2016-12-08 Method for mycotoxines biotechbregation RU2634914C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016148169A RU2634914C2 (en) 2016-12-08 2016-12-08 Method for mycotoxines biotechbregation

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016148169A RU2634914C2 (en) 2016-12-08 2016-12-08 Method for mycotoxines biotechbregation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2016148169A RU2016148169A (en) 2017-04-21
RU2634914C2 true RU2634914C2 (en) 2017-11-08

Family

ID=58642020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016148169A RU2634914C2 (en) 2016-12-08 2016-12-08 Method for mycotoxines biotechbregation

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2634914C2 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4262397A1 (en) * 2020-12-16 2023-10-25 Migal Galilee Research Institute Ltd. Lactonase and stabilized mutants thereof for treating fungal infections in plants

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2255975C1 (en) * 2003-12-19 2005-07-10 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова (Химфак МГУ) Recombinant plasmid dna ptes-his-oph and producer of oligohistidine-containing organophosphate hydrolase
WO2009077447A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-25 Novozymes A/S Process for degrading zearalenone in a feed product employing laccase
US8119172B2 (en) * 2001-12-20 2012-02-21 Erber Aktiengesellschaft Microorganism for biological detoxification of mycotoxins, namely ochratoxins and/or zearalenons, as well as method and use thereof
EA020684B1 (en) * 2009-10-07 2015-01-30 Дмитрий Фёдорович Тихомиров Preparation for clearance of mycotoxins based on biomass of filamentous fungi and use thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8119172B2 (en) * 2001-12-20 2012-02-21 Erber Aktiengesellschaft Microorganism for biological detoxification of mycotoxins, namely ochratoxins and/or zearalenons, as well as method and use thereof
RU2255975C1 (en) * 2003-12-19 2005-07-10 Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова (Химфак МГУ) Recombinant plasmid dna ptes-his-oph and producer of oligohistidine-containing organophosphate hydrolase
WO2009077447A1 (en) * 2007-12-14 2009-06-25 Novozymes A/S Process for degrading zearalenone in a feed product employing laccase
EA020684B1 (en) * 2009-10-07 2015-01-30 Дмитрий Фёдорович Тихомиров Preparation for clearance of mycotoxins based on biomass of filamentous fungi and use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Е. VEKIRU, S. FRUHAUF, С. HAMETNER, G. SCHATZMAYR, R. KRSKA 1, W.D. MOLL, R. SCHUHMACHER "Isolation and characterisation of enzymatic zearalenone hydrolysis reaction products" // World Mycotoxin J., 2016; 9 (3): 353-363. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016148169A (en) 2017-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10149489B2 (en) Polypeptide for hydrolytic cleavage of zearalenone and/or zearalenone derivatives, isolated polynucleotide thereof as well as a polypeptide containing an additive, use of same as well as a process
EP2776562B1 (en) Biodegradable immobilized enzymes and methods of making the same
Junior et al. Sequential degradation of raw vinasse by a laccase enzyme producing fungus Pleurotus sajor-caju and its ATPS purification
WO2019219396A1 (en) Method of isolating lipids from a lysed lipids containing biomass by emulsion inversion
EP2326713A1 (en) Method for the production of an additive for the enzymatic decomposition of mycotoxins, additive, and use thereof
Costa-Silva et al. Enhancement lipase activity via immobilization onto chitosan beads used as seed particles during fluidized bed drying: Application in butyl butyrate production
JP5248676B2 (en) Protein complex having asymmetric oxidation reaction and method for producing the same
RU2634914C2 (en) Method for mycotoxines biotechbregation
EA020684B1 (en) Preparation for clearance of mycotoxins based on biomass of filamentous fungi and use thereof
WO2014056007A2 (en) Enzyme preparation for transforming ergopeptines, method therefor and animal feed and feed supplement or silage supplement containing said preparation
EP2240569B1 (en) Lovastatin esterase enzyme immobilized on solid support, process for enzyme immobilization, biocatalytic flow reactor and process for preparation and/or purification of simvastatin
Nurkhasanah Preliminary study on keratinase fermentation by Bacillus sp. MD24 under solid state fermentation
RU2460771C1 (en) Method of extracting biologically active substances from biomass of unicellular algae of chlorella species
Efremenko et al. Development of functional materials with specific activities for degradation of toxins
JPH0638745A (en) Neutral phytase and its production
Kavakcıoğlu et al. Aqueous two-phase system purification for superoxide dismutase induced by menadione from Phanerochaete chrysosporium
Tramper et al. Xanthine oxidase activity of arthrobacter x-4 cells immobilized in glutaraldehyde-crosslinked gelatin
Kurochkina et al. Enzymatic synthesis of beta-lactam antibiotics. Analytical review
RU2648169C1 (en) Enzymic biocatalyst with antioxidant activity for detoxification of phosphororhange compounds
KR101898660B1 (en) Bacillus licheniformis strain SN1 and environmentally sustainable food waste processing microbial agent
RU2804526C1 (en) Method for producing immobilized bacterial cell preparation with amylase and lipase activity
CN112680371A (en) Candida utilis double-gene co-expression strain for hydrolyzing protein components in kitchen waste and construction method thereof
JPH05268952A (en) Preparation of lipase formulation
Masi et al. Alkaline protease from Bacillus cereus was characterized and optimized for eco-friendly degradation of feathers
Kyzeková et al. —recombinant enzyme producent for environment treatment