RU2634861C9

RU2634861C9 - Methods for determination of immune complexes isotypic composition characteristics and their application in therapy and diagnostics

Info

Publication number: RU2634861C9
Application number: RU2015149694A
Authority: RU
Inventors: Михаил Валентинович Филатов; Сергей Борисович Ланда
Original assignee: Михаил Валентинович Филатов
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2018-02-14
Also published as: RU2634861C2; RU2015149694A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: includes: (a) provision of an initial sample of biological fluid from the subject; (b) obtaining of a dynamic light scattering spectrum (DLS) for this sample, that contains peaks corresponding to particles of different sizes that are present in the sample; (c) sample contacting with at least one substance that specifically binds to the immunoglobulins of one or more isotypes contained in the sample; (d) removal of the complexes containing the said substance to obtain a treated sample; (e) obtaining of a DLS spectrum of the treated sample obtained in step (d), which contains peaks corresponding to particles of different sizes that are present in the said treated sample; (e) comparison of the DLS spectrum obtained in step (b) with the spectrum obtained in step (e), based on the differences in the spectrum of the treated sample and the spectrum obtained for the initial sample, the characteristic of isotypic composition of the immune complexes present in the said biological fluid sample is determined. Diagnosis of a disease or condition in a subject based on the determination of the characteristic of the immune complexes isotypic composition in a biological fluid sample obtained from a subject and a kit for this diagnosis are also proposed.

EFFECT: increased diagnostic and predictive informativeness of detection of antigens significant for medical purposes in biological fluids.

35 cl, 5 dwg, 5 tbl, 6 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

Настоящее изобретение относится к области медицины и иммунологии. В частности, изобретение позволяет проводить анализ характеристик, в частности характеристик изотипического состава, иммунных комплексов при диагностике и лечении различных заболеваний.The present invention relates to the field of medicine and immunology. In particular, the invention allows the analysis of characteristics, in particular the characteristics of the isotypic composition, immune complexes in the diagnosis and treatment of various diseases.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND

Иммунные комплексы, или комплексы антиген-антитело - макромолекулярные структуры, образующиеся в результате специфического взаимодействия антигенов с бивалентными или мультивалентными антителами в биологических жидкостях организма. Данные комплексы, представляющие собой крупные молекулярные образования, состоящие из множества молекул антигена и антител, формируются как при эквивалентных соотношениях антигена или антитела, так при умеренном избытке антигена. Образование и удаление иммунных комплексов происходит в ходе развития гуморального иммунного ответа, что является одной из важных защитных реакций организма.Immune complexes, or antigen-antibody complexes, are macromolecular structures formed as a result of the specific interaction of antigens with bivalent or multivalent antibodies in body fluids. These complexes, which are large molecular formations consisting of many molecules of antigen and antibodies, are formed both at equivalent ratios of antigen or antibody, and with a moderate excess of antigen. The formation and removal of immune complexes occurs during the development of a humoral immune response, which is one of the important protective reactions of the body.

Содержание иммунных комплексов повышается в сыворотке крови и других биологических жидкостях при различных системных нарушениях, в том числе и при таких заболеваниях, как ревматологические и аутоиммунные заболевания, аллергические заболевания, вирусные, бактериальные и паразитарные инфекции, новообразования и аллергические реакции.The content of immune complexes increases in blood serum and other biological fluids with various systemic disorders, including diseases such as rheumatologic and autoimmune diseases, allergic diseases, viral, bacterial and parasitic infections, neoplasms and allergic reactions.

В области техники известны способы обнаружения иммунных комплексов, возникающих в плазме крови и других биологических жидкостях.Methods for detecting immune complexes arising in blood plasma and other biological fluids are known in the art.

Существующие способы анализа иммунных комплексов дают возможность определять лишь общее содержание указанных комплексов и не позволяют анализировать распределение иммунных комплексов по составу изотипов иммуноглобулинов, которые в них входят.Existing methods for the analysis of immune complexes make it possible to determine only the total content of these complexes and do not allow to analyze the distribution of immune complexes by the composition of the immunoglobulin isotypes that are included in them.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, раскрытый в патенте SU 1833818, включающий применение квазиупругого (динамического) светорассеяния для детекции продукта реакции связывания антигена со специфичными антителами. Описанный способ реализуют следующим образом. Специфичные к антигену антитела ковалентно связывают с частицами альдоенолдекстрана строго определенного молекулярного веса 500000 Да. Способом динамического светорассеяния (лазерной корреляционной спектроскопии - ЛКС) определяют коэффициент диффузии частиц альдоенолдекстрана с иммобилизованными на них антителами, который зависит от гидродинамического радиуса R_h указанных частиц. Поскольку размер частиц альдоенолдекстрана во много раз больше размера антител, иммобилизованных на нем, можно считать R_h альдоенолдекстрана с иммобилизованными на нем антителами равным R_h самого альдоенолдекстрана. Кроме того, поскольку вклад частиц определенного размера в суммарное рассеяние образца пропорционален 6 степени размера частиц и антитела, иммобилизованные на частицах декстрана, добавляют в исследуемый раствор в избытке, вкладами всех остальных фракций исследуемого раствора, в том числе и антигена можно пренебречь. Таким образом, использование частиц декстрана позволяет рассматривать биологическую жидкость, представляющую собой полидисперсную систему, как монодисперсную систему. В случае монодисперсной системы увеличивается точность обнаружения различий коэффициента диффузии образованного комплекса иммобилизованных антител с антигеном от коэффициента диффузии одного из субстратов - иммобилизованных на частицах альдоенолдекстрана антител. О присутствии антигена судят по увеличению размера частиц в реакционной смеси в результате связывания антигена с иммобилизованными на частицах альдоенолдекстрана антителами.Closest to the claimed method is the method disclosed in patent SU 1833818, comprising the use of quasi-elastic (dynamic) light scattering to detect the product of the antigen binding reaction with specific antibodies. The described method is implemented as follows. Antigen-specific antibodies are covalently bound to particles of a strictly defined molecular weight of 500,000 Da. Using the method of dynamic light scattering (laser correlation spectroscopy - LCS), the diffusion coefficient of aldoenoldextran particles with antibodies immobilized on them is determined, which depends on the hydrodynamic radius R _{h of} these particles. Since the particle size of aldoenoldextran is many times larger than the size of the antibodies immobilized on it, we can assume that R _{h of} aldoenoldextran with antibodies immobilized on it is equal to R _h of aldoenoldextran itself. In addition, since the contribution of particles of a certain size to the total scattering of the sample is proportional to the 6th degree of particle size and antibodies immobilized on dextran particles are added in excess to the test solution, the contributions of all other fractions of the test solution, including antigen, can be neglected. Thus, the use of dextran particles allows us to consider the biological fluid, which is a polydisperse system, as a monodisperse system. In the case of a monodisperse system, the accuracy of detecting differences in the diffusion coefficient of the formed complex of immobilized antibodies with antigen from the diffusion coefficient of one of the substrates - antibodies immobilized on aldoenoldextran particles increases. The presence of antigen is judged by the increase in particle size in the reaction mixture as a result of binding of the antigen to antibodies immobilized on aldoenoldextran particles.

Иммобилизация антител на частицах альдоенолдекстрана позволяет отслеживать изменения коэффициента диффузии в полученной монодисперсной системе и детектировать взаимодействия антител с антигеном по появлению в образце агрегатов частиц декстрана, связанных с антигеном. Такой подход обеспечивает высокую чувствительность способа обнаружения наличия антигена в биологической жидкости, в частности, минимальная детектируемая концентрация антигена составляет приблизительно 4 пг/мл, что в 100-1000 раз меньше, чем концентрация, детектируемая способами иммуноферментного анализа или радиоаллергосорбентного теста.The immobilization of antibodies on aldoenoldextran particles allows one to track changes in the diffusion coefficient in the obtained monodisperse system and to detect the interaction of antibodies with the antigen by the appearance of dextran particle aggregates associated with the antigen in the sample. This approach provides high sensitivity of the method for detecting the presence of antigen in biological fluid, in particular, the minimum detectable concentration of antigen is approximately 4 pg / ml, which is 100-1000 times less than the concentration detected by enzyme-linked immunosorbent assay or radioallergenic assay test.

Таким образом, указанный способ позволяет обнаруживать наличие в биологической жидкости определенного антигена, но не дает возможность получить информацию о присутствии в биологической жидкости иммунных комплексов, отслеживать изменение их количества при воздействии внешних факторов, а также не позволяет определять изотипы иммуноглобулинов, образующих эти комплексы.Thus, this method allows you to detect the presence of a specific antigen in the biological fluid, but does not allow you to obtain information about the presence of immune complexes in the biological fluid, track the change in their number when exposed to external factors, and also does not allow to determine the isotypes of the immunoglobulins that form these complexes.

Задачей настоящего изобретения является повышение диагностической и прогностической информативности способа выявления значимых для медицинских целей антигенов в биологических жидкостях путем получения сведений не только об образовании иммунных комплексов с присутствующими в исследуемых биологических жидкостях антителами, но и о наборе изотипов антител, связывающих указанные антигены.The objective of the present invention is to increase the diagnostic and prognostic informativeness of a method for detecting medically important antigens in biological fluids by obtaining information not only about the formation of immune complexes with antibodies present in the studied biological fluids, but also about a set of antibody isotypes that bind these antigens.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее краткое описание предлагает краткое описание настоящего изобретения, предназначенное для того, чтобы в сжатой форме обозначить предмет и сущность изобретения. Краткое описание представляют с пониманием того, что его не следует применять для толкования или ограничения объема или смыслового содержания формулы изобретения.This brief description provides a brief description of the present invention, in order to concisely indicate the subject and essence of the invention. A brief description is presented with the understanding that it should not be used to interpret or limit the scope or meaning of the claims.

Настоящее изобретение основано, в частности, на применении динамического светорассеяния и агентов, специфично взаимодействующих с иммуноглобулинами, например с иммуноглобулинами определенных изотипов. Характеристики иммунных комплексов (ИК) в биологической жидкости определяют с помощью динамического светорассеяния (ДСР) без их выделения из указанного образца. Такой подход позволяет получать новую информацию о функционировании системы гуморального иммунного ответа и создать новые, более информативные, способы диагностики заболеваний, связанных с аномалиями функционирования иммунной системы. Настоящее изобретение обеспечивает увеличение точности измерений и улучшение качества и надежности диагностики различных заболеваний и состояний.The present invention is based, in particular, on the use of dynamic light scattering and agents that specifically interact with immunoglobulins, for example, immunoglobulins of certain isotypes. The characteristics of the immune complexes (IR) in the biological fluid are determined using dynamic light scattering (DLS) without isolating them from the specified sample. This approach allows you to obtain new information about the functioning of the humoral immune response system and create new, more informative, methods for diagnosing diseases associated with abnormalities in the functioning of the immune system. The present invention provides an increase in measurement accuracy and an improvement in the quality and reliability of the diagnosis of various diseases and conditions.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов в результате агрегации указанных комплексов при специфичном связывании с агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid are determined by recording changes in the size of immune complexes as a result of aggregation of these complexes upon specific binding to an agent that specifically interacts with immunoglobulins.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации возникновения иммунных комплексов в результате взаимодействия иммуноглобулинов в указанном образце с агентом, который специфично взаимодействует с указанными иммуноглобулинами.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined by detecting the occurrence of immune complexes as a result of the interaction of immunoglobulins in said sample with an agent that specifically interacts with said immunoglobulins.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации увеличения размеров иммунных комплексов в результате взаимодействия иммуноглобулинов в указанном образце с агентом, который специфично взаимодействует с указанными иммуноглобулинами.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined by detecting an increase in the size of immune complexes resulting from the interaction of immunoglobulins in said sample with an agent that specifically interacts with said immunoglobulins.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют после удаления части ИК из образца с применением агента, специфично взаимодействующего с иммуноглобулинами, например с иммуноглобулинами определенных изотипов.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined after removing part of the IR from the sample using an agent that specifically interacts with immunoglobulins, for example, immunoglobulins of certain isotypes.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов в результате агрегации указанных комплексов при взаимодействии с моноклональными антителами к различным изотипам антител, входящих в состав иммунных комплексов.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid are determined by recording changes in the size of immune complexes as a result of aggregation of these complexes when interacting with monoclonal antibodies to various isotypes of antibodies that make up the immune complexes.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined by recording changes in the size of the immune complexes by comparing the results of analysis of the specified sample before and after bringing the specified sample into contact with the specified agent, which specifically interacts with immunoglobulins.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, например с иммуноглобулинами различных изотипов.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined by recording changes in the size of immune complexes by comparing the results of analysis of the specified sample before and after bringing the specified sample into contact with the specified agent, which specifically interacts with immunoglobulins, for example, immunoglobulins of various isotypes .

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения приведение указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, приводит к удалению указанных иммуноглобулинов из образца.In one embodiment of the invention, bringing said sample into contact with said agent that specifically interacts with immunoglobulins will remove said immunoglobulins from the sample.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения размеров иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, что приводит к удалению указанных иммуноглобулинов из образца.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined by recording changes in the size of the immune complexes by comparing the results of analysis of the specified sample before and after bringing the specified sample into contact with the specified agent, which specifically interacts with immunoglobulins, which leads to the removal of these immunoglobulins from the sample.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения вклада в светорассеяние иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined by recording changes in the contribution to the light scattering of immune complexes by comparing the results of analysis of the specified sample before and after bringing the specified sample into contact with the specified agent, which specifically interacts with immunoglobulins.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения вклада в светорассеяние иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, например с иммуноглобулинами различных изотипов.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined by recording changes in the contribution to the light scattering of immune complexes by comparing the results of analysis of the specified sample before and after bringing the specified sample into contact with the specified agent, which specifically interacts with immunoglobulins, for example, immunoglobulins various isotypes.

Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения характеристики и состав ИК в образце биологической жидкости определяют путем регистрации изменения вклада в светорассеяние иммунных комплексов путем сравнения результатов анализа указанного образца до и после приведения указанного образца в контакт с указанным агентом, который специфично взаимодействует с иммуноглобулинами, что приводит к удалению указанных иммуноглобулинов из образца.According to one embodiment of the present invention, the characteristics and composition of IR in a sample of biological fluid is determined by recording changes in the contribution to the light scattering of immune complexes by comparing the results of analysis of the specified sample before and after bringing the specified sample into contact with the specified agent, which specifically interacts with immunoglobulins, which leads to removing said immunoglobulins from the sample.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающий:According to one of the embodiments of the present invention, a method for determining the characteristics of the isotypic composition of immune complexes in a sample of biological fluid obtained from a subject, including:

(а) Обеспечение исходного образца биологической жидкости от субъекта;(a) Providing an initial sample of biological fluid from a subject;

(б) Получение для указанного образца спектра ДСР, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;(b) Obtaining for the specified sample a spectrum of DSB, which contains peaks corresponding to particles of different sizes that are present in the specified sample;

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;(c) Bringing said sample into contact with at least one substance that specifically binds to the immunoglobulins of one or more isotypes contained in the sample;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество, с получением обработанного образца;(d) Removing from the specified sample complexes containing the specified substance, to obtain a processed sample;

(д) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (г), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;(e) Obtaining a DSR spectrum of the treated sample obtained in step (d), which contains peaks corresponding to particles of different sizes that are present in said treated sample;

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.(e) Comparison of the spectrum of DSB obtained in stage (b) with the spectrum obtained in stage (e), based on differences in the spectrum of the treated sample and the spectrum obtained for the original sample, determine the characteristics of the isotypic composition of the immune complexes present in the specified sample biological fluid.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ диагностики заболевания или состояния у субъекта, включающий определение характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости субъекта, причем иммунные комплексы с указанной характеристикой изотипического состава присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании или состоянии, при этом указанную характеристику изотипического состава в образце биологической жидкости определяют с помощью способа по любому из соответствующих вариантов реализации настоящего изобретения.According to one embodiment of the present invention, there is provided a method for diagnosing a disease or condition in a subject, comprising characterizing the isotypic composition of the immune complexes in a sample of a biological fluid of a subject, wherein immune complexes with the indicated isotypic composition are present in the biological fluid of the subject in the indicated disease or condition, wherein the specified characteristic of the isotypic composition in the sample of biological fluid is determined using benefits according to any of the respective embodiments of the present invention.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения под характеристикой изотипического состава иммунных комплексов, с использованием которой осуществляют диагностику некоторого состояния или заболевания субъекта и которая является характерной для указанного заболевания или состояния, понимают, например, определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, входящих в состав иммунных комплексов, или, например, отклонения от соотношения изотипов иммуноглобулинов, входящих в состав иммунных комплексов, наблюдаемого при норме, или, например, изменения относительных количеств иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов.In some embodiments of the present invention, the characteristic of the isotypic composition of the immune complexes, which is used to diagnose a certain condition or disease of the subject and which is characteristic of the specified disease or condition, is understood, for example, as a specific combination of immunoglobulin isotypes that are part of the immune complexes, or, for example, deviations from the ratio of immunoglobulin isotypes that are part of the immune complexes observed at normal rates, or, for example, changes in relative amounts of immune complexes containing a particular combination of immunoglobulin isotypes.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ диагностики заболевания или состояния у субъекта, включающий определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании или состоянии (характерны для указанного заболевания или состояния), при этом присутствие указанных иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:According to one embodiment of the present invention, there is provided a method for diagnosing a disease or condition in a subject, comprising determining the presence of immune complexes containing a specific combination of immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid obtained from the specified subject, wherein immune complexes with the specified combination of isotypes are present in the biological fluid of the subject with the specified disease or condition (characteristic of the specified disease or condition), while the effect of these immune complexes containing a combination of certain immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid is determined using the method for determining the characteristics of the isotypic composition of immune complexes in a sample of biological fluid obtained from a subject, including:

(в) Приведение указанного образца в контакт с по меньшей мере одним веществом, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, содержащихся в образце;(c) Bringing said sample into contact with at least one substance that specifically binds to immunoglobulins of one or more isotypes contained in the sample;

(г) Удаление из указанного образца комплексов, содержащих указанное вещество с получением обработанного образца;(d) Removing from the specified sample complexes containing the specified substance to obtain a processed sample;

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава представляет собой присутствие в указанном образце биологической жидкости иммунных комплексов, содержащих определенный изотип иммуноглобулинов или определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов.According to one embodiment of the present invention, said isotypic characterization is the presence in the specified sample of biological fluid of immune complexes containing a specific immunoglobulin isotype or a specific combination of immunoglobulin isotypes.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава, определяемая с помощью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой размер иммунного комплекса, содержащего иммуноглобулины одного или нескольких изотипов согласно, который присутствует в указанном исходном образце.According to some embodiments of the present invention, said isotypic characterization determined by the method of the present invention is the size of an immune complex containing the immunoglobulins of one or more isotypes according to that is present in said parent sample.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава, определяемая с помощью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой вклад в светорассеяние иммунного комплекса, который присутствует в указанном исходном образце.According to some embodiments of the present invention, said isotypic characterization determined by the method of the present invention is a contribution to the light scattering of the immune complex that is present in said parent sample.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава, определяемая с помощью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в иммунных комплексах в указанном исходном образце.According to some variants of implementation of the present invention, the specified characteristic of the isotypic composition, determined using the method according to the present invention, is the presence of immunoglobulin of a certain isotype in the immune complexes in the specified source sample.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанная характеристика изотипического состава, определяемая с помощью способа согласно настоящему изобретению, представляет собой присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в иммунных комплексах в указанном исходном образце в определенном соотношении по сравнению с другими изотипами антител, входящими в состав указанного иммунного комплекса.According to some embodiments of the present invention, said isotypic characteristic determined by the method of the present invention is the presence of an immunoglobulin of a specific isotype in the immune complexes in the specified source sample in a certain ratio compared to other antibody isotypes included in the specified immune complex.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ оценки эффективности лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании (характерны для указанного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:According to one embodiment of the present invention, there is provided a method for evaluating the effectiveness of treating a disease or condition in a subject, comprising determining the presence of immune complexes containing a particular combination of immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid obtained from said subject, wherein immune complexes with the specified combination of isotypes are present in the biological fluid of the subject in the specified disease (characteristic of the specified disease), while the presence of complexes containing a combination of certain isotypes of immunoglobulins in a sample of biological fluid is determined using a method for determining characteristics of the composition isotypic immune complexes in a body fluid sample obtained from a subject, comprising:

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ оценки риска развития патологического состояния у субъекта, включающий определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном патологическом состоянии (характерны для указанного патологического состояния), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:According to one embodiment of the present invention, there is provided a method for assessing the risk of developing a pathological condition in a subject, comprising determining the presence of immune complexes containing a specific combination of immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid obtained from the specified subject, the immune complexes with the specified combination of isotypes being present in the biological fluid subject with the specified pathological condition (characteristic of the specified pathological condition), with e The presence of immune complexes containing a combination of certain immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid is determined using a method for determining the characteristics of the isotypic composition of immune complexes in a sample of biological fluid obtained from a subject, including:

(б) Получение спектра ДСР указанного образца, который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном образце;(b) Obtaining a DSL spectrum of the specified sample, which contains peaks corresponding to particles of different sizes that are present in the specified sample;

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения обеспечение исходного образца биологической жидкости включает отбор некоторого объема указанной биологической жидкости у субъекта.According to one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes taking a certain volume of said biological fluid from a subject.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения обеспечение исходного образца биологической жидкости включает удаление из указанного образца по меньшей мере части ИК, присутствующих в указанной биологической жидкости у субъекта с применением любого подходящего способа.According to one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes removing from said sample at least a portion of the IR present in said biological fluid in a subject using any suitable method.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения обеспечение исходного образца биологической жидкости включает удаление из указанного образца по меньшей мере части ИК, присутствующих в указанной биологической жидкости у субъекта, с помощью фильтрации и/или центрифугирования.According to one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes removing from the sample at least a portion of the IR present in said biological fluid in a subject by filtration and / or centrifugation.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный субъект представляет собой млекопитающее.In one embodiment of the invention, said subject is a mammal.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения млекопитающее представляет собой человека.In one embodiment, the mammal is a human.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное вещество, которое специфически связывает иммуноглобулин, выбрано из: антитела против иммуноглобулина конкретного изотипа, бактериального белка, специфически связывающего иммуноглобулин, антигенного материала.According to one embodiment of the present invention, said substance that specifically binds immunoglobulin is selected from: an antibody against an immunoglobulin of a particular isotype, a bacterial protein specifically binding immunoglobulin, an antigenic material.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанные иммунные комплексы образовались в образце биологической жидкости спонтанным образом, т.е. присутствовали в образце биологической жидкости до его отбора у указанного субъекта.According to one embodiment of the present invention, said immune complexes are formed in a sample of a biological fluid spontaneously, i.e. were present in the sample of biological fluid prior to its selection from the specified subject.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанные иммунные комплексы образовались в образце биологической жидкости в результате добавления антигенного материала.According to one embodiment of the present invention, said immune complexes are formed in a sample of biological fluid as a result of the addition of antigenic material.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения определяют размер иммунного комплекса, который присутствует в указанном исходном образце.According to one embodiment of the present invention, the size of the immune complex that is present in said parent sample is determined.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения определяют вклад в светорассеяние иммунного комплекса, который присутствует в указанном исходном образце.According to one embodiment of the present invention, the contribution to light scattering of the immune complex that is present in said parent sample is determined.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, определяют присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в указанном исходном образце.According to one embodiment of the present invention, the presence of an immunoglobulin of a particular isotype in the specified source sample is determined.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения определяют присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в составе иммунного комплекса в указанном образце.According to one embodiment of the present invention, the presence of an immunoglobulin of a particular isotype in the composition of the immune complex in the specified sample is determined.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения определяют комбинацию иммуноглобулинов определенного изотипа в составе иммунного комплекса в указанном образце.According to one embodiment of the present invention, a combination of immunoglobulins of a particular isotype is determined as part of an immune complex in said sample.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения для получения спектра ДСР указанного образца применяют гетеродинную схему детекции динамического светорассеяния.According to one embodiment of the present invention, a heterodyne dynamic light scattering detection circuit is used to obtain the DLS spectrum of the indicated sample.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения обработанный образец получают посредством удаления комплекса вещества, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином на стадии с помощью одного или более из: иммуно-аффинной хроматографии, фильтрации, центрифугирования, например ультрацентрифугирования.According to one embodiment of the present invention, a treated sample is obtained by removing a complex of a substance that specifically interacts with an immunoglobulin in a step using one or more of: immuno-affinity chromatography, filtration, centrifugation, for example ultracentrifugation.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения вещество, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, представляет собой антитело животного, принадлежащего к виду, отличному от того, от которого получен исходный образец биологической жидкости.According to one embodiment of the present invention, the substance that specifically interacts with the immunoglobulin is an antibody of an animal belonging to a species different from that from which the original sample of biological fluid was obtained.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения исходный образец биологической жидкости представляет собой любую биологическую жидкость, содержащую иммуноглобулины. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения исходный образец биологической жидкости представляет собой любую биологическую жидкость, содержащую ИК.According to one embodiment of the present invention, the initial sample of the biological fluid is any biological fluid containing immunoglobulins. According to one embodiment of the present invention, the initial sample of the biological fluid is any biological fluid containing IR.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения исходный образец биологической жидкости представляет собой любую биологическую жидкость, например цельную кровь, плазму крови, сыворотку крови, лимфу, слюну, сперму, спинномозговую жидкость, молоко, молозиво, мокроту, амниотическую жидкость, мочу, гной, слизь, выпот, асцитическую жидкость или плевральную жидкость.According to one embodiment of the present invention, the initial sample of biological fluid is any biological fluid, for example, whole blood, blood plasma, blood serum, lymph, saliva, semen, cerebrospinal fluid, milk, colostrum, sputum, amniotic fluid, urine, pus, mucus , effusion, ascitic fluid or pleural fluid.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при обработке исходного образца добавляют несколько веществ, каждое из которых специфично к иммуноглобулину определенного изотипа.According to one embodiment of the present invention, several substances are added during processing of the initial sample, each of which is specific for an immunoglobulin of a particular isotype.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, соответствующий частицам большего размера, чем размеры частиц, присутствующих в исходном образце.According to one embodiment of the present invention, when comparing the DLS spectra of the initial and processed samples, it is found that a peak corresponding to particles of a larger size than the sizes of particles present in the original sample is present in the processed sample.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце отсутствует пик, соответствующий частицам определенного размера, присутствующим в исходном образце.According to one embodiment of the present invention, when comparing the DLS spectra of the initial and processed samples, it is found that there is no peak in the processed sample corresponding to particles of a certain size present in the initial sample.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения у субъекта, от которого получен образец биологической жидкости, диагностируют присутствие или определяют степень тяжести заболевания или состояния.According to one embodiment of the present invention, the presence of a disease or condition is diagnosed in the subject from which the biological fluid sample is obtained.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние представляет собой одно или более из: ревматологического заболевания, аутоиммунного заболевания, реакции гиперчувствительности, аллергического заболевания, аллергической реакции, иммунной реакции на экзогенные материалы, используемые в трансплантологии и стоматологии, реакции отторжения трансплантата, вирусной инфекции, бактериальной инфекции, паразитарной инфекции, инфекционного заболевания, новообразования, злокачественного новообразования, опухоли, рака.According to one embodiment of the present invention, said disease or condition is one or more of: rheumatologic disease, autoimmune disease, hypersensitivity reaction, allergic disease, allergic reaction, immune reaction to exogenous materials used in transplantology and dentistry, transplant rejection reaction, viral infection, bacterial infection, parasitic infection, infectious disease, neoplasm, malignant neoplasms, tumors, cancer.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние выбрано из: реакции гиперчувствительности, аллергического заболевания, аутоиммунного заболевания, иммунной реакции на экзогенный материал, например иммунной реакции на экзогенный материал, используемые в трансплантологии и стоматологии, инфекционного заболевания, воспаления, рака.According to one embodiment of the present invention, said disease or condition is selected from: a hypersensitivity reaction, an allergic disease, an autoimmune disease, an immune response to an exogenous material, for example, an immune response to an exogenous material used in transplantology and dentistry, an infectious disease, inflammation, cancer.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние представляет собой туберкулез.According to one embodiment of the present invention, said disease or condition is tuberculosis.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние представляет аллергию.In one embodiment of the invention, said disease or condition is an allergy.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние связано со злокачественным перерождением клеток иммунной системы, например представляет собой лимфому.According to one embodiment of the present invention, said disease or condition is associated with a malignant degeneration of cells of the immune system, for example, a lymphoma.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное заболевание или состояние связано с присутствием в образце биологической жидкости указанного субъекта иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов.According to one embodiment of the present invention, said disease or condition is associated with the presence in the sample of biological fluid of said subject of immune complexes containing a particular combination of immunoglobulin isotypes.

Также в соответствии с настоящим изобретением предложен набор для осуществления способа, описанного в настоящей заявке, включающий по меньшей мере одно вещество, которое специфически связывает иммуноглобулин определенного изотипа; инструкцию по осуществлению способа и, возможно, один или несколько реагентов для осуществления способа согласно настоящему изобретению.Also in accordance with the present invention, there is provided a kit for implementing the method described herein, comprising at least one substance that specifically binds an immunoglobulin of a particular isotype; instructions for implementing the method, and possibly one or more reagents for implementing the method according to the present invention.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложен набор для осуществления способа, описанного в настоящей заявке, включающий по меньшей мере одно вещество, которое специфически связывает иммуноглобулин определенного изотипа; инструкцию.According to one embodiment of the present invention, there is provided a kit for implementing the method described herein, comprising at least one substance that specifically binds an immunoglobulin of a particular isotype; instructions.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное по меньшей мере одно вещество в наборе представляет собой антитело, специфичное к иммуноглобулину определенного изотипа.According to one embodiment of the present invention, said at least one substance in the kit is an antibody specific for an immunoglobulin of a particular isotype.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанное по меньшей мере одно антитело представляет собой моноклональное антитело.In one embodiment, the at least one antibody is a monoclonal antibody.

Другие аспекты настоящего изобретения будут ясны из нижеследующего подробного описания.Other aspects of the present invention will be apparent from the following detailed description.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Фигура 1. Гистограммы субфракционного состава частиц в аликвотах исходной плазмы (А), аликвоты после обработки белком А (Б), после добавления антигена (В), после добавления антигена и антисыворотки к IgE (Г).Figure 1. Histograms of the subfraction composition of particles in aliquots of the original plasma (A), aliquots after treatment with protein A (B), after addition of antigen (C), after addition of antigen and antiserum to IgE (D).

Фигура 2. Гистограммы субфракционного состава частиц: обнаружение свободноциркулирующих иммунных комплексов (А) и индуцированных стандартным аллергеном смеси пыльцы деревьев иммунных комплексов (В) и определение изотипического состава (G1 - М и G1 Е) иммунных комплексов в плазме крови пациентки с аллергическим риноконъюнктивитом.Figure 2. Histograms of the subfraction composition of particles: detection of free-circulating immune complexes (A) and a mixture of tree pollen-induced immune complexes (B) induced by a standard allergen and determination of the isotypic composition (G1 - M and G1 E) of immune complexes in the blood plasma of a patient with allergic rhinoconjunctivitis.

Фигура 3. Гистограммы субфракционного состава частиц в аликвотах исходной плазмы (А) и аликвоты после обработки белком А (Б) у пациентки с сезонным аллергическим риноконъюнктивитом.Figure 3. Histograms of the subfraction composition of particles in aliquots of the original plasma (A) and aliquots after treatment with protein A (B) in a patient with seasonal allergic rhinoconjunctivitis.

Фигура 4. Гистограммы субфракционного состава частиц в аликвотах исходной плазмы (А), аликвоты после фильтрования через мембрану с диаметром пор 100 нм (Б) и аликвоты после добавления антигена домашней пыли (В) пациента с аллергическим риноконъюнктивитом.Figure 4. Histograms of the subfraction composition of particles in aliquots of the original plasma (A), aliquots after filtering through a membrane with a pore diameter of 100 nm (B) and aliquots after adding house dust antigen (C) to a patient with allergic rhinoconjunctivitis.

Фигура 5. Гистограммы субфракционного состава частиц в аликвотах фильтрованной плазмы (А), ГСС той же плазмы с циклоцитрулином (Б), ГСС плазмы с циклоцитрулином и антителами к IgG3 (В), ГСС плазмы с циклоцитрулином и смесью антител a IgG1 и IgG3 (Г) и ГСС плазмы с циклоцитрулином и смесью антител a IgG3 и IgE (Д) пациента с ревматоидным артритом.Figure 5. Histograms of the subfraction composition of particles in aliquots of filtered plasma (A), GSS of the same plasma with cyclocytrulin (B), GSS of plasma with cyclocytrulin and antibodies to IgG3 (C), GSS of plasma with cyclocytrulin and a mixture of antibodies a IgG1 and IgG3 (G ) and GSS plasma with cyclocytrulin and a mixture of antibodies a IgG3 and IgE (D) of a patient with rheumatoid arthritis.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

В одном аспекте настоящее изобретения относится к способу определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающему:In one aspect, the present invention relates to a method for determining the characteristics of the isotypic composition of immune complexes in a sample of biological fluid obtained from a subject, including:

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики заболевания у субъекта, включающем определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании (характерны для указанного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающем:In one aspect, the present invention also relates to a method for diagnosing a disease in a subject, comprising determining the presence of immune complexes containing a particular combination of immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid obtained from said subject, wherein immune complexes with said combination of isotypes are present in the biological fluid of the subject with said disease (characteristic of the specified disease), while the presence of immune complexes containing a combination is determined of isotopic immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid is determined using a method for determining the characteristics of the isotypic composition of immune complexes in a sample of biological fluid obtained from a subject, including:

(е) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (д), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, посредством чего определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.(e) Comparison of the spectrum of DSB obtained in stage (b) with the spectrum obtained in stage (e), based on the differences in the spectrum of the treated sample and the spectrum obtained for the original sample, whereby the characteristics of the isotypic composition of the immune complexes present in the specified sample of biological fluid.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению способа динамического светорассеяния для определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов.In one aspect, the present invention relates to the use of a dynamic light scattering method for characterizing the isotypic composition of immune complexes.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к применению способа динамического светорассеяния для определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов, при этом указанный способ включает:In one aspect, the present invention relates to the use of a dynamic light scattering method for characterizing the isotypic composition of immune complexes, said method comprising:

В одном из вариантов реализации настоящее изобретение относится к способу определения характеристики изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающему:In one embodiment, the present invention relates to a method for characterizing the isotypic composition of immune complexes in a biological fluid sample obtained from a subject, comprising:

(г) Получение спектра ДСР обработанного образца, полученного на стадии (в), который содержит пики, соответствующие частицам разного размера, которые присутствуют в указанном обработанном образце;(d) Obtaining a DSB spectrum of a treated sample obtained in step (c), which contains peaks corresponding to particles of different sizes that are present in said processed sample;

(д) Сопоставление спектра ДСР, полученного на стадии (б), со спектром, полученным на стадии (г), на основании отличий спектра указанного обработанного образца и спектра, полученного для исходного образца, определяют характеристики изотипического состава иммунных комплексов, присутствующих в указанном образце биологической жидкости.(e) Comparison of the spectrum of DSB obtained in stage (b) with the spectrum obtained in stage (d), based on differences in the spectrum of the treated sample and the spectrum obtained for the original sample, determine the characteristics of the isotypic composition of the immune complexes present in the specified sample biological fluid.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения стадии в)-д) описанного выше способа согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере два раза.In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the method described above according to the present invention are carried out at least two times.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава.In one aspect, the present invention also relates to the use of a dynamic light scattering method for diagnosing a disease or condition in a subject, which is characterized by the presence of immune complexes of a particular isotypic composition.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава, при этом указанный способ включает определение присутствия иммунных комплексов, содержащих определенную комбинацию изотипов иммуноглобулинов, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при указанном заболевании (характерны для указанного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости определяют с помощью способа определения изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:In one aspect, the present invention also relates to the use of a dynamic light scattering method for diagnosing a disease or condition in a subject that is characterized by the presence of immune complexes of a particular isotypic composition, said method comprising determining the presence of immune complexes containing a particular combination of immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid, obtained from the specified subject, and immune complexes with the specified combination of isotypes are present in the biological fluid of a subject with a specified disease (characteristic of the indicated disease), wherein the presence of immune complexes containing a combination of certain immunoglobulin isotypes in a biological fluid sample is determined using a method for determining the isotypic composition of immune complexes in a biological fluid sample obtained from a subject, including:

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики заболевания, выбранного из: ревматологического заболевания, аутоиммунного заболевания, реакции гиперчувствительности, аллергического заболевания, аллергической реакции, иммунной реакции на экзогенные материалы, используемые в трансплантологии и стоматологии, реакции отторжения трансплантата, вирусной инфекции, бактериальной инфекции, паразитарной инфекции, инфекционного заболевания, новообразования, злокачественного новообразования, опухоли, рака.In one aspect, the present invention also relates to a method for diagnosing a disease selected from: rheumatological disease, autoimmune disease, hypersensitivity reaction, allergic disease, allergic reaction, immune response to exogenous materials used in transplantology and dentistry, transplant rejection reaction, viral infection, bacterial infection, parasitic infection, infectious disease, neoplasm, malignant neoplasm, tumor, cancer.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения указанное инфекционное заболевание представляет собой заболевание, вызванное бактерией или вирусом.In one embodiment of the invention, said infectious disease is a disease caused by a bacterium or virus.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики инфекционного заболевания, выбранного из группы, состоящей из, но не ограничиваясь перечисленными: ангины, аскаридоза, аспергиллеза, бактериальной пневмонии, бактериального вагиноза, бешенства, бластоцитоза, болезни Лайма, болезни Шагаса, ботулизма, ветрянки, вирусной пневмонии, ВИЧ-инфекции, газовой гангрены, гепатита А, гепатита В, гепатита С, гепатита D, гепатита Е, гонореи, гриппа, дифтерии, иерсиниоза, кандидоза, кератита, клещевого энцефалита, клонорхоза, коклюша, кори, краснухи, лепры (проказы), лептоспироза, лямблиоза, малярии, мелиоидоза, менингита, нематодоза, ОРЗ, орнитоза, оспы, папилломавируса человека, парагонимоза, парагриппа, педикулеза тела, пищевого отравления, пневмонии, полиомиелита, простого герпеса, простуды, риккетсий, риновирусной инфекции, ротавирусной инфекции, сальмонеллеза, свинки, сепсиса, сибирско язвы, сифилиса, стафилококковой инфекции, столбняка, сыпного тифа, токсоплазмоза, ТОРС (тяжелого острого респираторного синдрома), туберкулеза, уреаплазмоза, хеликобактериоза, хламидиоза, холеры, цитомегаловируса, чесотки, чумы, шистосомоза, шигеллеза, дизентерии, энтеробиоза, энтеровирусной инфекции.In one aspect, the present invention also relates to a method for diagnosing an infectious disease selected from the group consisting of, but not limited to: tonsillitis, ascariasis, aspergillosis, bacterial pneumonia, bacterial vaginosis, rabies, blastocytosis, Lyme disease, Chagas disease, botulism, chickenpox , viral pneumonia, HIV infection, gas gangrene, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, gonorrhea, influenza, diphtheria, yersiniosis, candidiasis, keratitis, tick-borne encephalitis, clonorchosis, kokl Sha, measles, rubella, leprosy, leptospirosis, giardiasis, malaria, melioidosis, meningitis, nematodosis, acute respiratory infections, ornithosis, smallpox, human papillomavirus, paragonimiasis, parainfluenza, pediculosis of the body, food poisoning, pneumonia, poliomyelitis, poliomyelitis, , rickettsia, rhinovirus infection, rotavirus infection, salmonellosis, mumps, sepsis, anthrax, syphilis, staphylococcal infection, tetanus, typhus, typhoid, toxoplasmosis, SARS (severe acute respiratory syndrome), tuberculosis, ureaplasmosis, Helicoblosis, Helicoblosis midioza, cholera, cytomegalovirus, scabies, plague, schistosomiasis, shigellosis, dysentery, Enterobiasis, enterovirus infection.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики аутоиммунного заболевания, выбранного из группы, состоящей из, но не ограничиваясь перечисленными: ревматоидного артрита, рассеянного склероза, сахарного диабета первого типа, аутоиммунного панкреатита, васкулита, волчанки, пузырчатки, гемолитической анемии, болезни Грейвса, миастении, склеродермии, болезни Бехчета, полиомиозита, синдрома Шегрена, антифосфолипидного синдрома, спондилоартропатии, синдрома Гиена-Баре, язвенного колита, болезни Крона, целиакии, витилиго, псориаза, аутоиммунной крапивницы, алопеции, саркоидоза, миокардита, дерматомиозита, фибромиалгии, миозита.In one aspect, the present invention also relates to a method for diagnosing an autoimmune disease selected from the group consisting of, but not limited to: rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, type 1 diabetes, autoimmune pancreatitis, vasculitis, lupus, pemphigus, hemolytic anemia, Graves disease , myasthenia gravis, scleroderma, Behcet’s disease, poliomyositis, Sjögren’s syndrome, antiphospholipid syndrome, spondyloarthropathy, Hyena-Bare syndrome, ulcerative colitis, Crohn’s disease, celiac disease, itiligo, psoriasis, autoimmune urticaria, alopecia, sarcoidosis, myocarditis, dermatomyositis, fibromyalgia, myositis.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу диагностики гемобластоза, в частности лимфомы или лейкоза.In one aspect, the present invention also relates to a method for the diagnosis of hemoblastosis, in particular lymphoma or leukemia.

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава, при этом указанный способ включает определение присутствия иммунных комплексов, в которых преобладает IgG3, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при аутоиммунном заболевании (характерны для аутоиммунного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:In one aspect, the present invention also relates to the use of a dynamic light scattering method for diagnosing a disease or condition in a subject that is characterized by the presence of immune complexes of a particular isotypic composition, said method comprising determining the presence of immune complexes in which IgG3 predominates in a sample of biological fluid obtained from the specified subject, and immune complexes with the specified combination of isotypes are present in the biological fluid of the subject when an autoimmune disease (characteristic of an autoimmune disease), wherein the presence of immune complexes containing a combination of certain immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid is determined using a method for determining the characteristics of the isotypic composition of immune complexes in a sample of biological fluid obtained from a subject, including:

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава, при этом указанный способ включает определение присутствия иммунных комплексов, в которых преобладает IgE, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при аллергической реакции (характерны для аллергической реакции), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения характеристик изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:In one aspect, the present invention also relates to the use of a dynamic light scattering method for diagnosing a disease or condition in a subject that is characterized by the presence of immune complexes of a particular isotypic composition, said method comprising determining the presence of immune complexes in which IgE predominates in a biological fluid sample obtained from the specified subject, and immune complexes with the specified combination of isotypes are present in the biological fluid of the subject when an allergic reaction (characteristic of an allergic reaction), wherein the presence of immune complexes containing a combination of certain immunoglobulin isotypes in a sample of biological fluid is determined using a method for determining the characteristics of the isotypic composition of immune complexes in a sample of biological fluid obtained from a subject, including:

В одном аспекте настоящее изобретение также относится к применению способа динамического светорассеяния для диагностики заболевания или состояния у субъекта, которое характеризуется наличием иммунных комплексов определенного изотипического состава, при этом указанный способ включает определение присутствия иммунных комплексов, в составе которых присутствует комбинация иммуноглобулинов изотипов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, в образце биологической жидкости, полученном от указанного субъекта, причем иммунные комплексы с указанной комбинацией изотипов присутствуют в биологической жидкости субъекта при инфекционном заболевании (характерны для инфекционного заболевания), при этом присутствие иммунных комплексов, содержащих комбинацию определенных изотипов иммуноглобулинов в образце биологической жидкости, определяют с помощью способа определения изотипического состава иммунных комплексов в образце биологической жидкости, полученном от субъекта, включающего:In one aspect, the present invention also relates to the use of a dynamic light scattering method for diagnosing a disease or condition in a subject that is characterized by the presence of immune complexes of a particular isotypic composition, said method comprising determining the presence of immune complexes comprising a combination of immunoglobulins of IgG1, IgG3 isotypes, IgG4, IgE, in a sample of biological fluid obtained from the specified subject, and the immune complexes with the specified combination of IPs are present in the biological fluid of a subject in an infectious disease (characteristic of an infectious disease), wherein the presence of immune complexes containing a combination of certain immunoglobulin isotypes in a biological fluid sample is determined using a method for determining the isotypic composition of immune complexes in a biological fluid sample obtained from a subject, including:

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения подходящим способом согласно настоящему изобретению определяют, что в образце биологической жидкости субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой туберкулез.According to one embodiment of the present invention, it is determined by a suitable method according to the present invention that immune complexes containing a combination of immunoglobulin isotypes IgG1, IgG3, IgG4, IgE are present in a sample of the biological fluid of the subject, and the disease is tuberculosis.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения подходящим способом согласно настоящему изобретению определяют, что в образце биологической жидкости субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой реакцию на возбудителя, резистентного к антибиотику.According to one embodiment of the present invention, it is determined by a suitable method according to the present invention that immune complexes containing a combination of immunoglobulin isotypes IgG1, IgG3, IgG4, IgE are present in a sample of the biological fluid of the subject, and the disease is a response to an antibiotic-resistant pathogen.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения подходящим способом согласно настоящему изобретению определяют, что в образце биологической жидкости субъекта присутствуют иммунные комплексы, содержащие комбинацию изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG3, IgG4, IgE, а заболевание представляет собой реакцию на инфекционного агента.According to one embodiment of the present invention, it is determined by a suitable method according to the present invention that immune complexes containing a combination of immunoglobulin isotypes IgG1, IgG3, IgG4, IgE are present in a sample of a body fluid, and the disease is a response to an infectious agent.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, способом, описанным в настоящей заявке, определяют присутствие иммунного комплекса, в составе которого антитела изотипа IgE составляют по меньшей мере приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% от суммарного содержания всех изотипов антител в указанном комплексе.In one embodiment of the present invention, the presence of an immune complex in which IgE isotype antibodies comprise at least about 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56 is determined by the method described in this application. %, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% of the total content of all antibody isotypes in this complex.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, способом, описанным в настоящей заявке, определяют присутствие иммунного комплекса, в составе которого процент содержания антител изотипа IgE больше, чем процент содержания каждого из других изотипов антител по отдельности.In one embodiment of the present invention, the presence of an immune complex is determined by the method described in this application, in which the percentage of IgE isotype antibodies is greater than the percentage of each of the other antibody isotypes individually.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, способом, описанным в настоящей заявке, определяют присутствие иммунного комплекса, в составе которого антитела изотипа IgG3 составляют по меньшей мере приблизительно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% от содержания всех изотипов антител в указанном комплексе.In one embodiment of the present invention, the presence of an immune complex in which IgG3 isotype antibodies comprise at least about 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56 is determined by the method described in this application. %, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% of the content of all antibody isotypes in this complex.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, способом, описанным в настоящей заявке, определяют присутствие иммунного комплекса, в составе которого процент содержания антител изотипа IgG3 больше, чем процент содержания каждого из других изотипов антител по отдельности.In one embodiment of the present invention, the presence of an immune complex is determined by the method described in this application, in which the percentage of antibodies of the IgG3 isotype is greater than the percentage of each of the other antibody isotypes individually.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанное вещество, которое специфически связывается с иммуноглобулинами одного или нескольких изотипов, специфически связывается с константными частями указанных иммуноглобулинов.In one embodiment of the present invention, said substance that specifically binds to immunoglobulins of one or more isotypes specifically binds to constant portions of said immunoglobulins.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере два раза. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере три раза. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) перечисленных способов осуществляют по меньшей мере четыре раза. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере пять раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере шесть раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере семь раз. В одном из вариантов реализации стадии настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере восемь раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере девять раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, стадии в)-е) способов согласно настоящему изобретению осуществляют по меньшей мере десять раз.In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the methods of the present invention are carried out at least twice. In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the methods of the present invention are carried out at least three times. In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the above methods are carried out at least four times. In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the methods of the present invention are carried out at least five times. In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the methods of the present invention are carried out at least six times. In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the methods of the present invention are carried out at least seven times. In one embodiment, the implementation of the stage of the present invention, stage c) -e) of the methods according to the present invention is carried out at least eight times. In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the methods of the present invention are carried out at least nine times. In one embodiment of the present invention, steps c) -e) of the methods of the present invention are carried out at least ten times.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, проба биологической жидкости представляет собой пробу любой биологической жидкости, полученной от субъекта. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения биологическая жидкость представляет собой любую жидкость, производимую субъектом. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения биологическая жидкость представляет собой любую жидкость, производимую субъектом, при этом указанная биологическая жидкость содержит иммунные комплексы. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения биологическая жидкость выбрана из цельной крови, плазмы крови, сыворотки крови, лимфы, слюны, спермы, спинномозговой жидкости, молока, молозива, мокроты, амниотической жидкости, мочи, гноя, слизи, выпота, асцитической жидкости или плевральной жидкости.In one embodiment of the present invention, a biological fluid sample is a sample of any biological fluid received from a subject. In one embodiment, the biological fluid is any fluid produced by a subject. In one embodiment of the present invention, the biological fluid is any fluid produced by a subject, said biological fluid containing immune complexes. In one embodiment, the biological fluid is selected from whole blood, blood plasma, blood serum, lymph, saliva, sperm, cerebrospinal fluid, milk, colostrum, sputum, amniotic fluid, urine, pus, mucus, effusion, ascitic fluid, or pleural liquids.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, субъект представляет собой млекопитающие. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения млекопитающее представляет собой человека.In one embodiment of the present invention, the subject is a mammal. In one embodiment of the present invention, the mammal is a human.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение пробы биологической жидкости включает в себя получение пробы указанной жидкости от субъекта стандартными способами получения пробы указанного типа биологической жидкости.In one embodiment of the present invention, providing a sample of a biological fluid includes obtaining a sample of said fluid from a subject using standard methods for producing a sample of said type of biological fluid.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор, достаточным для удаления нежелательных частиц из указанной пробы биологической жидкости. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор от 10 нм до 100 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 10-50 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 50-100 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 100-200 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 200-300 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 300-400 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 400-500 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 500 нм - 1 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 1-10 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 10-50 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 50-100 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 100 нм.In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter sufficient to remove unwanted particles from said sample of the biological fluid. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of 10 nm to 100 μm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 10-50 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 50-100 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 100-200 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 200-300 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 300-400 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 400-500 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of approximately 500 nm to 1 μm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 1-10 microns. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 10-50 microns. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 50-100 microns. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of approximately 100 nm.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем центрифугирования, например ультрацентрифугирования. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем центрифугирования с ускорением, достаточным для удаления нежелательного осадка из указанной пробы биологической жидкости. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100 до приблизительно 15000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100 до приблизительно 1000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 5000 до приблизительно 10000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 50G до приблизительно 15000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 50G до приблизительно 100G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100G до приблизительно 1000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 1000G до приблизительно 5000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 5000G до приблизительно 10000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 10000G до приблизительно 15000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет приблизительно 1500G.In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by centrifugation, such as ultracentrifugation. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes treating the sample by centrifugation at an acceleration sufficient to remove unwanted sediment from said sample of the biological fluid. In one embodiment of the present invention, said centrifugation speed in a standard laboratory centrifuge is from about 100 to about 15,000 rpm. In one embodiment of the present invention, said centrifugation rate in a standard laboratory centrifuge is from about 100 to about 1000 rpm. In one embodiment of the present invention, said centrifugation rate in a standard laboratory centrifuge is from about 1000 to about 5000 rpm. In one embodiment of the present invention, said centrifugation speed in a standard laboratory centrifuge is from about 5,000 to about 10,000 rpm. In one embodiment of the present invention, said centrifugation speed in a standard laboratory centrifuge is from about 10,000 to about 15,000 rpm. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 50G to about 15000G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 50G to about 100G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 100G to about 1000G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 1000G to about 5000G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 5000G to about 10000G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 10,000 G to about 15,000 G. In one embodiment of the present invention, the acceleration of said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is approximately 1500 G.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца буфером. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 6 до приблизительно 8. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 6 до приблизительно 6,5. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 6,5 до приблизительно 7. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7 до приблизительно 7,5. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 8. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7 до приблизительно 7,1. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,2. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,2 до приблизительно 7,3. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,3 до приблизительно 7,4. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН от приблизительно 7,4 до приблизительно 7,5. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, буфер представляет собой буфер с рН приблизительно 7,2.In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes diluting said sample. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample with a buffer. In one embodiment of the present invention, the buffer is a buffer with a pH of from about 6 to about 8. In one embodiment, the buffer is a buffer with a pH of from about 6 to about 6.5. In one embodiment of the present invention, the buffer is a buffer with a pH of from about 6.5 to about 7. In one embodiment, the buffer is a buffer with a pH of from about 7 to about 7.5. In one embodiment of the present invention, the buffer is a buffer with a pH of from about 7.5 to about 8. In one embodiment, the buffer is a buffer with a pH of from about 7 to about 7.1. In one embodiment of the present invention, the buffer is a buffer with a pH of from about 7.1 to about 7.2. In one embodiment of the present invention, the buffer is a buffer with a pH of from about 7.2 to about 7.3. In one embodiment of the present invention, the buffer is a buffer with a pH of from about 7.3 to about 7.4. In one embodiment of the present invention, the buffer is a buffer with a pH of from about 7.4 to about 7.5. In one embodiment of the present invention, the buffer is a buffer with a pH of approximately 7.2.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца физиологическим раствором.In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample with physiological saline.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца изотоническим раствором.In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample with isotonic solution.

Еще одним вариантом буфера согласно настоящему изобретению является буфер с добавлением натриевой соли ЭДТА. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 5 мМ до приблизительно 10 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 30 мМ до приблизительно 40 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ЭДТА добавляют в концентрации приблизительно 10 мМ.Another buffer option according to the present invention is an EDTA sodium salt buffer. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 1 mM to about 500 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 1 mM to about 5 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 5 mM to about 10 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 10 mM to about 20 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 20 mM to about 30 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 30 mM to about 40 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 40 mM to about 50 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 50 mM to about 100 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of from about 100 mM to about 500 mM. In one embodiment of the present invention, EDTA is added at a concentration of about 10 mM.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца в степени, достаточной для проведения последующего анализа указанного образца. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 1-1000 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 1-5 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 5-10 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 10-20 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 30-40 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 40-50 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 50-100 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 100-500 раз. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разведение указанного образца приблизительно в 500-1000 раз.In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes diluting said sample to a degree sufficient to conduct subsequent analysis of said sample. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample approximately 1-1000 times. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample approximately 1-5 times. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample approximately 5-10 times. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes diluting said sample approximately 10-20 times. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes diluting said sample approximately 30-40 times. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample approximately 40-50 times. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes diluting said sample approximately 50-100 times. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample approximately 100-500 times. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes diluting said sample approximately 500-1000 times.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на аликвоты одинакового или разного объема.In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes dividing the sample received from the subject into aliquots of the same or different volume.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 2 аликвоты. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 3 аликвоты. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 4 аликвоты. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 5 аликвот. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 6-10 аликвот. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 10-20 аликвот. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы на 20-30 аликвот. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя разделение полученной от субъекта пробы по меньшей мере на 30 аликвот.In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes dividing the sample received from the subject into 2 aliquots. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes dividing the sample received from the subject into 3 aliquots. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes dividing the sample received from the subject into 4 aliquots. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes dividing the sample received from the subject into 5 aliquots. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes dividing the sample received from the subject into 6-10 aliquots. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes dividing the sample received from the subject into 10-20 aliquots. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes dividing the sample received from the subject into 20-30 aliquots. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes dividing the sample obtained from the subject into at least 30 aliquots.

Способ динамического светорассеяния (ДСР) основан на взаимодействии монохроматического когерентного излучения со светорассеивающими частицами исследуемой жидкости. Информация обо всех динамических процессах в изучаемой системе содержится в спектре флуктуаций света, рассеянного на частицах в растворе. Спектр флуктуаций фототока на выходе фотоприемника (или корреляционная функция) совпадает со спектром рассеянного света и описывается лоренцианом (или в случае корреляционной функции указанный спектр описывается экспонентой). Полуширина кривой прямо пропорциональна среднему коэффициенту диффузии - D. Зная величину среднего коэффициента диффузии, по формуле Эйнштейна-Стокса можно определить средний гидродинамический радиус частиц - R_h. Спектр флуктуаций фототока рассеивающих частиц разных размеров, содержащихся в полидисперсных биологических жидкостях, представляет собой сумму лоренцианов, полуширина которых характеризует гидродинамический радиус частиц, а амплитуда - вклад частиц данного размера в суммарное рассеяние образца. Решение обратной задачи методом регуляризации позволяет восстановить из спектра флуктуаций фототока гистограмму распределения по размерам частиц, вносящих вклад в светорассеяние. Такая гистограмма состоит из столбцов, высота которых отражает процентное соотношение вклада в светорассеяние компонентов анализируемой биологической жидкости. Методология предполагает, что вклад в светорассеяние остальных макромолекул и частиц считается пренебрежимо малым. Современная измерительная техника позволяет достаточно точно измерить спектр флуктуаций интенсивности фототока в полосе частот от приблизительно единиц Гц до приблизительно 20-50 кГц, что в свою очередь позволяет оценить размеры частиц в диапазоне от приблизительно единиц нанометров (например, приблизительно 2-5 нм) до приблизительно десятков микрометров.The method of dynamic light scattering (DLS) is based on the interaction of monochromatic coherent radiation with light scattering particles of the test fluid. Information on all dynamic processes in the system under study is contained in the spectrum of fluctuations of light scattered by particles in solution. The spectrum of fluctuations of the photocurrent at the output of the photodetector (or the correlation function) coincides with the spectrum of the scattered light and is described by the Lorentzian (or in the case of the correlation function, this spectrum is described by the exponential). The half-width of the curve is directly proportional to the average diffusion coefficient - D. Knowing the value of the average diffusion coefficient, using the Einstein-Stokes formula, we can determine the average hydrodynamic radius of particles - R _h . The fluctuation spectrum of the photocurrent of scattering particles of different sizes contained in polydispersed biological fluids is the sum of Lorentzians, the half-width of which characterizes the hydrodynamic radius of the particles, and the amplitude is the contribution of particles of this size to the total scattering of the sample. Solving the inverse problem by the regularization method makes it possible to reconstruct from the spectrum of photocurrent fluctuations a histogram of the size distribution of particles that contribute to light scattering. Such a histogram consists of columns whose height reflects the percentage of the contribution to the light scattering of the components of the analyzed biological fluid. The methodology assumes that the contribution to the light scattering of the remaining macromolecules and particles is considered negligible. Modern measuring technology allows you to accurately measure the range of fluctuations in the intensity of the photocurrent in the frequency band from approximately units of Hz to approximately 20-50 kHz, which in turn allows us to estimate particle sizes in the range from approximately units of nanometers (for example, approximately 2-5 nm) to approximately tens of micrometers.

Непосредственно измеряемой в данном подходе величиной является спектр (либо корреляционная функция) флуктуации фототока на выходе фоторегистрирующего прибора. Этот спектр представляет собой результат биений гармоник электромагнитных полей друг с другом и сосредоточен в низкочастотной области, т.е. там, где его очень удобно анализировать современными мощными радиотехническими методами. Уже на этом уровне, а именно на уровне классификации регистрируемых фотодетектором гармоник электромагнитных полей, существует два варианта измерения:The quantity directly measured in this approach is the spectrum (or the correlation function) of the photocurrent fluctuations at the output of the photo-recording device. This spectrum is the result of beats of harmonics of electromagnetic fields with each other and is concentrated in the low-frequency region, i.e. where it is very convenient to analyze it with modern powerful radio engineering methods. Already at this level, namely at the classification level of the harmonics of electromagnetic fields recorded by the photo detector, there are two measurement options:

- на фотодетектор попадает лишь свет, рассеянный изучаемой системой, в этом варианте реализуется гомодинный метод измерения;- only light scattered by the studied system gets onto the photodetector; in this version, a homodyne measurement method is implemented;

- вместе с рассеянным на фотодетектор попадает и часть нерассеянного (опорного) излучения, этот вариант получил название гетеродинирования.- along with the scattered radiation, a part of the non-scattered (reference) radiation enters the photodetector, this option is called heterodyning.

В первом случае регистрируется лишь один, рассеянный, луч. Во второй схеме предполагается совмещение фронтов двух лучей на фотоприемнике (рассеянного и нерассеянного). Именно по первой, более упрощенной, схеме работают почти все коммерческие спектрометры ДСР. Согласно настоящему изобретению схема гетеродинирования имеет ряд преимуществ, связанных с большей, чем в гомодинной схеме, концентрационной чувствительностью и устойчивостью к присутствию посторонних сильных рассеивателей в исследуемом образце. Это позволяет избегать искажений измерений, связанных с присутствием посторонних рассеивателей.In the first case, only one scattered ray is detected. In the second scheme, it is assumed that the fronts of two beams are combined at the photodetector (scattered and unscattered). Almost all commercial DSR spectrometers work according to the first, more simplified, scheme. According to the present invention, the heterodyning scheme has several advantages associated with a higher concentration sensitivity and resistance to the presence of extraneous strong scatterers in the sample than in the homodyne scheme. This avoids measurement distortions associated with the presence of extraneous diffusers.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при выборе режимов измерений (полоса спектра и количество циклов накопления) руководствуются соображениями о максимально достоверном восстановлении размера частиц в интересующем диапазоне. Измерения проводят в полосе 2048 Гц или 8096 Гц. Наиболее точно восстанавливают размеры частиц, когда полоса измерений составляет не менее чем 10 полуширин лоренциана, с другой. Для частиц, размеры которых колеблются в диапазоне 0,1-1,5 мкм, полуширина лоренцианов лежит в пределах от 20 до 500 Гц, оптимальной будет полоса 8096 Гц при разрешении 4 Гц на канал (2048 точек спектра). Приведенные выше условия требуют, чтобы «негладкость» спектра составляла не более 0,03. Так как флуктуации экспериментальных точек в спектре практически всегда носят случайный характер, то можно допустить, что величина «негладкости» обратно пропорциональна квадратному корню из количества копий суммарного спектра. Таким образом, количество копий накопления должно быть не менее 1000. Для исключения неизвестных факторов выбрали эту величину равной 2000. При таких параметрах измерений время, затраченное на исследование одного образца, составляет приблизительно 15 минутAccording to one embodiment of the present invention, when choosing measurement modes (spectrum band and number of accumulation cycles), they are guided by considerations about the most reliable restoration of particle size in the range of interest. Measurements are taken in the band of 2048 Hz or 8096 Hz. The particle sizes are most accurately restored when the measurement band is not less than 10 half-widths of Lorentzian, on the other. For particles whose sizes fluctuate in the range of 0.1-1.5 μm, the half-width of Lorentzians lies in the range from 20 to 500 Hz; the optimum band will be 8096 Hz at a resolution of 4 Hz per channel (2048 points in the spectrum). The above conditions require that the "nonsmoothness" of the spectrum is not more than 0.03. Since the fluctuations of the experimental points in the spectrum are almost always random, it can be assumed that the “nonsmoothness” is inversely proportional to the square root of the number of copies of the total spectrum. Thus, the number of copies of the accumulation should be at least 1000. To exclude unknown factors, this value was chosen equal to 2000. With these measurement parameters, the time taken to study one sample is approximately 15 minutes

В одном из вариантов реализации согласно настоящему изобретению для получения спектра ДСР используют гетеродинную схему детекции.In one embodiment, according to the present invention, a heterodyne detection scheme is used to obtain a DSL spectrum.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, измеренный способом динамического светорассеяния спектр флуктуаций света, рассеянного на частицах биологической жидкости в пробе, математически преобразуют в гистограммы субфракционного состава частиц (ГСС), где по оси X - размер частиц в нм, по оси Y - доля вклада в рассеяние света частицами данного размера от совокупного рассеяния измеряемого образца.In one embodiment of the present invention, the spectrum of fluctuations of light scattered by particles of biological fluid in a sample, measured by dynamic light scattering, is mathematically converted into histograms of subfraction composition of particles (GSS), where along the X axis is the particle size in nm, along the Y axis is the fraction contribution to light scattering by particles of a given size from the total scattering of the measured sample.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, путем сравнения ГСС исходной пробы и с ГСС обработанной пробы идентифицируют пик, соответствующий продукту реакции антиген-антитело, то есть иммунному комплексу. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанный пик соответствует частицам большего размера, чем индивидуальные иммуноглобулины на исходной гистограмме, и обязан отсутствовать на ГСС пробы, из которой удалены иммунные комплексы одним из подходящих способов в соответствии с настоящим изобретением.In one embodiment of the present invention, by comparing the GHS of the original sample and the GSS of the processed sample, a peak corresponding to the antigen-antibody reaction product, i.e., the immune complex, is identified. In one embodiment of the present invention, said peak corresponds to particles of a larger size than the individual immunoglobulins in the initial histogram, and must be absent from the GSS sample, from which the immune complexes were removed using one of the suitable methods in accordance with the present invention.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, иммобилизовано на носителе, в частности на твердофазном носителе. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, иммобилизовано на микросферах.In one embodiment of the present invention, a substance specifically binding the immunoglobulins of the present invention is immobilized on a carrier, in particular on a solid phase carrier. In one embodiment of the present invention, a substance specifically binding the immunoglobulins of the present invention is immobilized on microspheres.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, представляет собой бактериальный белок. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, представляет собой белок А Staphilococcus aureus, антитела, против указанных глобулинов или другие известные в данной области техники связывающие иммуноглобулины агенты. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанные антитела против иммуноглобулинов согласно настоящему изобретению представляют собой антитела, специфически связывающие иммуноглобулины конкретного изотипа.In one embodiment of the present invention, the immunoglobulin specific binding substance of the present invention is a bacterial protein. In one embodiment of the present invention, the immunoglobulin-specific binding agent of the present invention is Staphilococcus aureus protein A, antibodies against said globulins, or other immunoglobulin binding agents known in the art. In one embodiment of the present invention, said anti-immunoglobulin antibodies of the present invention are antibodies that specifically bind a particular isotype of immunoglobulins.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, вещество, специфически связывающее иммуноглобулины согласно настоящему изобретению, выбрано из: антигенного агента, антитела против иммуноглобулина конкретного изотипа, бактериального белка, специфически связывающего иммуноглобулины, например бактериального белка, специфически связывающего константные области иммуноглобулинов.According to one embodiment of the present invention, the immunoglobulin-specific binding agent of the present invention is selected from: an antigenic agent, an anti-immunoglobulin antibody of a particular isotype, a bacterial protein, specifically immunoglobulin binding, such as a bacterial protein that specifically binds immunoglobulin constant regions.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения вещество, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, представляет собой антитело животного, принадлежащего к виду, отличному от того, от которого получен исходный образец биологической жидкости. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения вещество, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, представляет собой антитело животного, принадлежащего к виду, выбранному из: мыши, кролика, козы, крысы, свиньи, лошади, овцы, обезьяны, осла.According to one embodiment of the present invention, the substance that specifically interacts with the immunoglobulin is an antibody of an animal belonging to a species different from that from which the original sample of biological fluid was obtained. According to one embodiment of the present invention, a substance that specifically interacts with immunoglobulin is an animal antibody of a species selected from: mouse, rabbit, goat, rat, pig, horse, sheep, monkey, donkey.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, для детекции используют поликлональные антитела. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, для детекции используют моноклональные антитела.In one embodiment of the present invention, polyclonal antibodies are used for detection. In one embodiment of the present invention, monoclonal antibodies are used for detection.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обработанный образец согласно настоящему изобретению получают путем удаления из образца биологической жидкости комплекса вещества, специфически связывающего иммуноглобулины согласно настоящему изобретению и представляющего интерес иммуноглобулина. Согласно одному из вариантов реализации, указанный комплекс удаляют путем фильтрации через мембрану с диаметром пор, достаточным для элиминации (удаления) указанного комплекса из раствора. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор от 10 нм до 100 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 10-50 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 50-100 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 100-200 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 200-300 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 300-400 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 400-500 нм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 500 нм - 1 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 1-10 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 10-50 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 50-100 мкм. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение исходной пробы биологической жидкости включает в себя обработку образца путем фильтрации через мембрану с диаметром пор приблизительно 100 нм.In one embodiment of the present invention, a treated sample of the present invention is obtained by removing from a sample of a biological fluid a complex of a substance that specifically binds the immunoglobulins of the present invention and of interest of immunoglobulin. According to one embodiment, the complex is removed by filtration through a membrane with a pore diameter sufficient to eliminate (remove) the complex from the solution. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of 10 nm to 100 μm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of a biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 10-50 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 50-100 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 100-200 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 200-300 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 300-400 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 400-500 nm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of approximately 500 nm to 1 μm. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 1-10 microns. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 10-50 microns. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of about 50-100 microns. In one embodiment of the present invention, providing an initial sample of the biological fluid includes processing the sample by filtration through a membrane with a pore diameter of approximately 100 nm.

Согласно одному из вариантов реализации указанный комплекс удаляют путем центрифугирования с ускорением, достаточным для удаления указанного комплекса из пробы биологической жидкости. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100 до приблизительно 15000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100 до приблизительно 1000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 5000 до приблизительно 10000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, скорость указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 10000 до приблизительно 15000 оборотов в минуту. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 50G до приблизительно 15000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 50G до приблизительно 100G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 100G до приблизительно 1000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 1000G до приблизительно 5000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 5000G до приблизительно 10000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет от приблизительно 10000G до приблизительно 15000G. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, ускорение указанного центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге составляет приблизительно 1500G.In one embodiment, said complex is removed by centrifugation at an acceleration sufficient to remove said complex from a sample of biological fluid. In one embodiment of the present invention, said centrifugation speed in a standard laboratory centrifuge is from about 100 to about 15,000 rpm. In one embodiment of the present invention, said centrifugation rate in a standard laboratory centrifuge is from about 100 to about 1000 rpm. In one embodiment of the present invention, said centrifugation rate in a standard laboratory centrifuge is from about 1000 to about 5000 rpm. In one embodiment of the present invention, said centrifugation speed in a standard laboratory centrifuge is from about 5,000 to about 10,000 rpm. In one embodiment of the present invention, said centrifugation speed in a standard laboratory centrifuge is from about 10,000 to about 15,000 rpm. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 50G to about 15000G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 50G to about 100G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 100G to about 1000G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 1000G to about 5000G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 5000G to about 10000G. In one embodiment of the present invention, accelerating said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is from about 10,000 G to about 15,000 G. In one embodiment of the present invention, the acceleration of said centrifugation in a standard laboratory centrifuge is approximately 1500 G.

Согласно одному из вариантов реализации указанный комплекс удаляют путем иммуноаффинной хроматографии. Антитела, специфичные к определенному изотипу или изотипам антител, иммобилизуют на подходящем носителе для получения иммуносорбента, после чего с иммуносорбентом приводят в контакт образец, содержащий комплексы антиген-антитело, за счет чего представляющие интерес комплексы связываются с иммуносорбентом и тем самым указанные комплексы удаляют из образца. Для реализации данного аспекта настоящего изобретения могут быть использованы стандартные методики проведения иммуноаффинной хроматографии, известные в данной области техники.In one embodiment, the complex is removed by immunoaffinity chromatography. Antibodies specific to a particular isotype or isotypes of antibodies are immobilized on a suitable carrier to produce an immunosorbent, after which a sample containing antigen-antibody complexes is contacted with the immunosorbent, whereby the complexes of interest bind to the immunosorbent and thereby remove these complexes from the sample . To implement this aspect of the present invention, standard immunoaffinity chromatography techniques known in the art can be used.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, используют и/или детектируют антитела класса IgG, IgA, IgM, IgE или IgD или комбинации указанных классов. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, используют и/или детектируют антитела изотипов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM или IgD или комбинации указанных изотипов.In one embodiment of the present invention, antibodies of the IgG, IgA, IgM, IgM, IgE or IgD class or combinations of these classes are used and / or detected. In one embodiment of the invention, antibodies of the IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM or IgD isotypes are used and / or detected, or combinations of these isotypes.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения вещество, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, представляет собой антигенный материал. Антигенный материал согласно настоящему изобретению представляет собой любой материал, который способен специфически связываться с антителом биологической жидкости субъекта. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, антигенный материал представляет собой материал, который вызывает реакцию гиперчувствительности у субъекта. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, указанная реакция гиперчувствительности представляет собой аллергическую реакцию. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, обеспечение антигенного материала включает его выделение или получение известными в данной области техники способами. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, антигенный материал представляет собой материал, полученный от субъекта. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, антигенный материал представляет собой материал, выбранный из экзогенного, эндогенного или аутоантигенного материала. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, антигенный материал представляет собой циклоцитруллин.According to one embodiment of the present invention, a substance that specifically interacts with an immunoglobulin is an antigenic material. An antigenic material according to the present invention is any material that is capable of specifically binding to an antibody of a biological fluid of a subject. In one embodiment of the present invention, the antigenic material is a material that causes a hypersensitivity reaction in a subject. In one embodiment of the present invention, said hypersensitivity reaction is an allergic reaction. In one embodiment of the present invention, providing an antigenic material comprises isolating or preparing methods known in the art. In one embodiment of the present invention, the antigenic material is material obtained from a subject. In one embodiment of the present invention, the antigenic material is a material selected from exogenous, endogenous, or autoantigenic material. In one embodiment of the present invention, the antigenic material is cyclocytrulline.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, добавление к указанной пробе антигенного материала приводит к образованию в указанной пробе иммунных комплексов, которые детектируют и исследуют способами согласно настоящему изобретению.In one embodiment, the addition of antigenic material to said sample results in the formation of immune complexes in said sample that are detected and examined by the methods of the present invention.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, добавление к указанной пробе вещества, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, приводит к образованию в указанной пробе агрегатов большего размера, чем размер отдельного иммунного комплекса.In one embodiment, the addition of a substance that specifically interacts with an immunoglobulin to said sample results in the formation of larger aggregates in said sample than the size of a single immune complex.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, добавление к указанной пробе вещества, которое специфично взаимодействует с иммуноглобулином, приводит к образованию в указанной мегаагрегатов большего размера, чем размер отдельного иммунного комплекса или агрегата.In one embodiment, the addition of a substance that specifically interacts with an immunoglobulin to said sample results in the formation of larger mega-aggregates in said mega-aggregate than the size of a single immune complex or aggregate.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, соответствующий частицам приблизительно такого же размера, чем размеры частиц, присутствующих в исходном образце.According to one embodiment of the present invention, when comparing the DLS spectra of the initial and processed samples, it is found that a peak corresponding to particles of approximately the same size as the sizes of particles present in the original sample is present in the processed sample.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, отсутствующий в исходном образце.According to one embodiment of the present invention, when comparing the DLS spectra of the initial and processed samples, it is found that a peak is absent in the processed sample that is absent in the initial sample.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, отсутствующий в исходном образце, при этом размер указанного пика соответствует предполагаемому размеру иммунных комплексов в указанной пробе.According to one embodiment of the present invention, when comparing the DLS spectra of the initial and processed samples, it is found that a peak is absent in the processed sample that is not in the original sample, while the size of the peak corresponds to the estimated size of the immune complexes in the specified sample.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения при сопоставлении спектров ДСР исходного и обработанного образцов обнаруживают, что в обработанном образце присутствует пик, отсутствующий в исходном образце, при этом размер указанного пика соответствует предполагаемому размеру иммунных комплексов, агрегатов или мегаагрегатов в указанной пробе.According to one embodiment of the present invention, when comparing the DLS spectra of the initial and processed samples, it is found that a peak is absent in the processed sample that is not in the original sample, while the size of the specified peak corresponds to the estimated size of the immune complexes, aggregates or megaaggregates in the specified sample.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙDEFINITIONS OF TERMS AND CONCEPTS

При использовании в настоящем описании термина «белок А» (protein А) указанный термин обозначает белок с молекулярной массой приблизительно 40-60 кДа, выделенный с поверхности клеточной стенки золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus). Белок А связывает многие иммуноглобулины млекопитающих, предпочтительно иммуноглобулины класса G. Белок А связывает Fc-участок антител, взаимодействуя при этом с тяжелыми цепями. При этом сайт связывания антитела не изменяется. Белок А с высокой аффинностью связывает IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, а также IgG2a, IgG2b и IgG3 мыши; с умеренной аффинностью - IgM, IgA и IgE человека.When used in the present description, the term "protein A" (protein A), this term refers to a protein with a molecular weight of approximately 40-60 kDa, isolated from the surface of the cell wall of Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus). Protein A binds many mammalian immunoglobulins, preferably class G immunoglobulins. Protein A binds to the Fc region of antibodies, while interacting with heavy chains. However, the binding site of the antibody does not change. Protein A binds with high affinity human IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, as well as mouse IgG2a, IgG2b and IgG3; with moderate affinity - human IgM, IgA and IgE.

При использовании в настоящем описании термина «пациент» указанный термин обозначает любое животное, включая, но не ограничиваясь этим, людей, приматов, собак, кошек, грызунов и тому подобных, которые получают определенное лечение.When used in the present description, the term "patient", this term refers to any animal, including, but not limited to, humans, primates, dogs, cats, rodents and the like, which receive certain treatment.

При использовании в настоящем описании термина «эффективное количество» указанный термин обозначает количество средства, достаточное для достижения желаемого результата.When used in the present description, the term "effective amount", this term refers to the amount of funds sufficient to achieve the desired result.

При использовании в настоящем описании термина «специфическое связывание» указанный термин означает, что одно средство, вещество или агент, например полипептид, реагирует или соединяется с другим средством, веществом или агентом, например полипептидом, более часто, более быстро, с большей длительностью или с большей аффинностью или с определенными комбинациями перечисленного, чем альтернативные средства, вещества или агенты. Специфическое связывание не во всех случаях предполагает эксклюзивное связывание. Термин «связывание» обычно, но не обязательно, обозначает специфическое связывание.When used in the present description, the term "specific binding", this term means that one agent, substance or agent, for example a polypeptide, reacts or combines with another agent, substance or agent, for example a polypeptide, more often, more quickly, with a longer duration or with greater affinity or with certain combinations of the above than alternative agents, substances or agents. Specific binding does not in all cases involve exclusive binding. The term "binding" usually, but not necessarily, refers to specific binding.

В настоящем описании под «иммуноглобулином определенного изотипа» понимают иммуноглобулин типа IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, иммуноглобулин с типом каппа или лямбда легкой цепи или их варианты. При этом под веществом, которое специфически связывает иммуноглобулин определенного изотипа, понимают любое вещество, например антитело, такое как моноклональное антитело, которое селективно связывает иммуноглобулин любого определенного изотипа или ограниченную комбинацию иммуноглобулинов некоторых определенных изотипов.As used herein, “defined isotype immunoglobulin” means an immunoglobulin of the type IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, immunoglobulin of the Kappa type or lambda type light chain, or variants thereof. Moreover, a substance that specifically binds an immunoglobulin of a certain isotype is understood to mean any substance, for example an antibody, such as a monoclonal antibody that selectively binds an immunoglobulin of any particular isotype or a limited combination of immunoglobulins of certain certain isotypes.

В настоящем описании термин «антитело» относится к иммуноглобулину, специфически связывающемуся с конкретным антигеном. Термин охватывает иммуноглобулины естественного происхождения, то есть выработанные организмом в результате контакта с антигеном, а также те, что были искусственно синтезированы или сконструированы. В некоторых вариантах реализации термин охватывает любые полипептиды со структурными элементами иммуноглобулинов, достаточными для обеспечения специфического связывания. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антитело может быть членом любого класса иммуноглобулинов, включая любой из классов иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA и IgD. Подходящие под определение антитела включают антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, биспецифичные антитела, гуманизированные антитела (включающие участки антител человека), конъюгированные антитела (т.е. антитела, конъюгированные или слитые с другими белками, радиоактивными метками, цитотоксинами), малые модульные иммунофармацевтические (Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPsTM")) белки, одноцепочечные антитела, камелоидные антитела (антитела верблюдовых) или любые фрагменты антител. В настоящем документе термин "антитело" также включает в себя интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, однодоменные антитела (например, однодоменные антитела акулы (например, IgNAR или их фрагменты), мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител при условии, что они проявляют требуемую биологическую активность.As used herein, the term “antibody” refers to an immunoglobulin that specifically binds to a particular antigen. The term encompasses immunoglobulins of natural origin, that is, produced by the body as a result of contact with an antigen, as well as those that have been artificially synthesized or constructed. In some embodiments, the term encompasses any polypeptides with structural elements of immunoglobulins sufficient to provide specific binding. The antibody may be monoclonal or polyclonal. An antibody can be a member of any class of immunoglobulins, including any of the classes of human immunoglobulins: IgG, IgM, IgA and IgD. Antibodies suitable for definition include human antibodies, primatized antibodies, chimeric antibodies, bispecific antibodies, humanized antibodies (including portions of human antibodies), conjugated antibodies (i.e. antibodies conjugated or fused to other proteins, radioactive tags, cytotoxins), small modular immunopharmaceutical (Small Modular ImmunoPharmaceuticals ("SMIPsTM")) proteins, single chain antibodies, cameloid antibodies (camelid antibodies), or any antibody fragments. As used herein, the term “antibody” also includes intact monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, single domain antibodies (eg, single domain shark antibodies (eg, IgNAR or fragments thereof), multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies) formed from at least two intact antibodies, and antibody fragments, provided that they exhibit the desired biological activity.

В настоящем документе термин «фрагмент антитела» подразумевает часть интактного антитела, такую как, например, антиген-связывающий или вариабельный домен антитела. Примеры фрагментов антитела включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; триатела; тетратела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Термин "фрагмент антитела" также включает в себя любые синтетические или сконструированные белки, действующие как антитела, связываясь со специфическим антигеном с образованием комплекса. Например, фрагменты антител, содержащие изолированные фрагменты, фрагменты "Fv", состоящие из вариабельных областей тяжелых и легких цепей, рекомбинантных одноцепочечных белковых молекул, в которых вариабельные области тяжелых и легких цепей соединены белковым линкером ("белки ScFv"), и минимальные распознаваемые единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельную область.As used herein, the term “antibody fragment” refers to a portion of an intact antibody, such as, for example, an antigen binding or variable domain of an antibody. Examples of antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2, and Fv fragments; triates; tetra bodies; linear antibodies; single chain antibody molecules and multispecific antibodies formed from antibody fragments. The term "antibody fragment" also includes any synthetic or engineered proteins that act as antibodies, binding to a specific antigen to form a complex. For example, antibody fragments containing isolated fragments, “Fv” fragments consisting of variable regions of the heavy and light chains, recombinant single chain protein molecules in which the variable regions of the heavy and light chains are connected by a protein linker (“ScFv proteins”), and the minimum recognized units consisting of amino acid residues that mimic the hypervariable region.

Термин «моноклональное антитело» в данной заявке относится к гомогенной популяции антител, участвующих в высокоспецифичном распознавании и связывании отдельной антигенной детерминанты или эпигона. Напротив, поликлональные антитела обычно содержат смесь различных антител, направленных против множества различных антигенных детерминант. В объем термина «моноклональное антитело» входят как интактные и полноразмерные моноклональные антитела, так и фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (scFv) антитела, слитые белки, содержащие часть антитела, и любая другая модифицированная молекула иммуноглобулина, содержащая сайт распознавания антигена (сайт связывания антигена). Более того, «моноклональное антитело» относится к таким антителам, которые получены с помощью любого количества способов, включая, но не ограничиваясь перечисленными, продуцирование гибридомой, селекцию фагов, рекомбинантную экспрессию и трансгенных животных.The term "monoclonal antibody" in this application refers to a homogeneous population of antibodies involved in the highly specific recognition and binding of a single antigenic determinant or epigon. In contrast, polyclonal antibodies typically contain a mixture of different antibodies directed against many different antigenic determinants. The term “monoclonal antibody” includes both intact and full-sized monoclonal antibodies, as well as antibody fragments (for example, Fab, Fab ', F (ab') 2, Fv), single-chain (scFv) antibodies, fusion proteins containing part of the antibody, and any other modified immunoglobulin molecule containing an antigen recognition site (antigen binding site). Moreover, "monoclonal antibody" refers to those antibodies that are obtained using any number of methods, including, but not limited to, hybridoma production, phage selection, recombinant expression and transgenic animals.

В настоящем описании термином «иммунный комплекс» обозначена макромолекулярная структура, образующаяся в результате специфического взаимодействия антигенов с бивалентными или мультивалентными антителами в биологических жидкостях организма.In the present description, the term "immune complex" refers to a macromolecular structure resulting from the specific interaction of antigens with bivalent or multivalent antibodies in body fluids.

В настоящем описании «антиген» или «антигенный материал» представляет собой молекулу или объект, с которым связывается антитело. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой полипептид или его часть. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой часть инфекционного агента, распознаваемую антителами.As used herein, an “antigen” or “antigenic material” is a molecule or object to which an antibody binds. In some embodiments, the antigen is a polypeptide or part thereof. In some embodiments, the antigen is a portion of an infectious agent recognized by antibodies.

В рамках настоящего описания под характеристикой изотипического состава иммунного комплекса понимают одно или более из следующего: размер иммунного комплекса, содержащего иммуноглобулины одного или нескольких конкретных изотипов; присутствие иммуноглобулина определенного изотипа в определенном соотношении по сравнению с другими изотипами антител, входящих в состав указанного иммунного комплекса; вклад в светорассеяние иммунного комплекса(комплексов), содержащего иммуноглобулин определенного изотипа или комбинацию иммуноглобулинов определенных изотипов, который(которые) присутствует в образце биологической жидкости, или любую другую особенность иммунного комплекса, который содержится в исследуемом образце, которую определяют одновременно с получением информации об изотипе по меньшей мере одного иммуноглобулина, входящего в состав указанного иммунного комплекса. В частности, характеристика может представлять собой характеристику изотипического состава, т.е. информацию о совокупности иммуноглобулинов, которые присутствуют в иммунном комплексе.In the framework of the present description, under the characteristic of the isotypic composition of the immune complex, one or more of the following is understood: the size of the immune complex containing the immunoglobulins of one or more specific isotypes; the presence of immunoglobulin of a certain isotype in a certain ratio compared to other isotypes of antibodies that make up the specified immune complex; contribution to light scattering of an immune complex (s) containing a certain isotype immunoglobulin or a combination of certain isotype immunoglobulins that (which) is present in a sample of biological fluid, or any other feature of the immune complex that is contained in the test sample, which is determined simultaneously with obtaining information about the isotype at least one immunoglobulin that is part of the specified immune complex. In particular, the characteristic may be a characteristic of isotypic composition, i.e. information about the totality of immunoglobulins that are present in the immune complex.

В рамках настоящего описания под понятием «диагностика» понимают определение степени тяжести или выраженности заболевания или состояния, в том числе при отслеживании результатов терапевтического воздействия. В частности, под диагностикой понимают процесс установления диагноза, то есть заключения о наличии и/или сущности болезни и состоянии пациента.In the framework of the present description, the term "diagnosis" is understood as determining the severity or severity of a disease or condition, including when tracking the results of a therapeutic effect. In particular, under the diagnosis understand the process of establishing a diagnosis, that is, conclusions about the presence and / or nature of the disease and the condition of the patient.

В рамках настоящего описания под понятием «преобладающий изотип» и/или «изотип преобладает» понимают, что процент содержания антител (иммуноглобулинов) указанного преобладающего изотипа больше, чем процент содержания каждого из других изотипов антител по отдельности. В частности, антитела указанного преобладающего изотипа могут составлять по меньшей мере приблизительно 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% от суммарного содержания всех изотипов антител в указанном комплексе. В частности, иммунный комплекс может содержать только антитела (иммуноглобулины) указанного преобладающего изотипа.In the framework of the present description, the term "predominant isotype" and / or "isotype predominates" means that the percentage of antibodies (immunoglobulins) of the specified predominant isotype is greater than the percentage of each of the other antibody isotypes individually. In particular, antibodies of the indicated predominant isotype can be at least about 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63 %, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99%, 100% of the total content of all antibody isotypes in this complex. In particular, the immune complex may contain only antibodies (immunoglobulins) of the indicated predominant isotype.

В настоящем документе термин «приблизительно» или «примерно», применяемый к одной или более рассматриваемым величинам, относится к величине, значение которой сходно со значением указанной величины. В некоторых вариантах реализации термин "приблизительно" или "примерно" относится к диапазону значений, которые входят в 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее с отклонением в любую сторону (больше или меньше) от указанной величины, если не указано иное, или если иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, когда такое значение превышает 100% от возможной величины).As used herein, the term “approximately” or “approximately”, as applied to one or more of the quantities considered, refers to a value whose value is similar to the value of the specified value. In some embodiments, the term “approximately” or “approximately” refers to a range of values that fall within 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% or less with a deviation in any direction (more or less) from the specified value, if not otherwise indicated, or unless otherwise apparent from the context (unless the value exceeds 100% of the possible value).

При использовании в настоящем описании и формуле форма единственного числа включает множественное число, если в контексте явно не указано другое.When used in the present description and formula, the singular includes the plural, unless the context clearly indicates otherwise.

Следует понимать, что, если одни варианты воплощения изобретения описываются в настоящем описании термином «включает», допустимо также, что другие аналогичные варианты реализации изобретения описываются термином "содержит" и/или "обязательно содержит".It should be understood that if some embodiments of the invention are described in the present description by the term "includes", it is also acceptable that other similar embodiments of the invention are described by the term "contains" and / or "necessarily contains".

Термин «и/или» при использовании в настоящем описании в такой фразе, как «А и/или В», подразумевает включение как А, так и В; А или В; А (единственно) и В (единственно).The term “and / or” when used in the present description in such a phrase as “A and / or B”, means the inclusion of both A and B; A or B; A (single) and B (single).

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, предложенный способ осуществляют следующим образом. Готовят пробу биологической жидкости обследуемого пациента. Клеточные элементы и крупные белковые агрегаты удаляют с помощью центрифугирования на стандартной лабораторной центрифуге при скорости 10-15 тыс. оборотов в минуту. Надосадочную жидкость разбавляют физиологически приемлемым буфером, таким как фосфатный, ацетатный или фосфатно-ацетатный буфер со значением рН от приблизительно 6.0 до приблизительно 8.0, например изотоническим фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением натриевой соли ЭДТА (10 тМ) до концентраций, удобных для измерения на исследуемом приборе, в случае плазмы или сыворотки крови производят разведение в 5-10 раз.According to one aspect of the present invention, the proposed method is as follows. Prepare a sample of biological fluid of the examined patient. Cell elements and large protein aggregates are removed by centrifugation in a standard laboratory centrifuge at a speed of 10-15 thousand revolutions per minute. The supernatant is diluted with a physiologically acceptable buffer, such as phosphate, acetate or phosphate-acetate buffer with a pH value of from about 6.0 to about 8.0, for example, isotonic phosphate buffer pH 7.2 with the addition of sodium salt of EDTA (10 tM) to concentrations convenient for measurement on the test device, in the case of plasma or blood serum, a dilution of 5-10 times is performed.

Если интерес представляют иммунные комплексы, изначально присутствующие в исследуемой жидкости, то пробу делят на две части. Производят измерение спектров флуктуаций света, рассеянного на частицах биологической жидкости в аликвоте 1, способом динамического светорассеяния и математическое преобразование полученных спектров в гистограммы субфракционного состава частиц (ГСС_исх) по оси X - размер частиц в нм, по оси Y - доля вклада в рассеяние света частицами данного размера от совокупного рассеяния измеряемого образца. Из аликвоты 2 с помощью иммуноаффинного связывания белком А Staphylococcus aureus или антителами против иммуноглобулинов человека, иммобилизованными на частицах-носителях, удаляют иммуноглобулины и образуемые ими иммунные комплексы. Удаление осуществляется осаждением путем центрифугирования этих иммуноаффинных сорбентов, предварительно добавленных в пробу. Затем производят измерение спектра флуктуаций света, рассеянного на частицах биологической жидкости в супернатанте аликвоты 2, и получают гистограмму субфракционного состава частиц (ГСС_прА). Путем сравнения ГСС_исх с ГСС_прА идентифицируют пик, соответствующий продукту реакции антиген-антитело (иммунные комплексы). Пик должен соответствовать частицам большего размера, чем индивидуальные иммуноглобулины на исходной гистограмме (Фиг. 1А), и обязан отсутствовать на ГСС_прА. (Фиг. 1Б). Обычно гидродинамический радиус иммунных комплексов составляет приблизительно 50 нм или более. При определении изотипического состава иммуноглобулинов, входящих в иммунные комплексы, к исходной пробе добавляют моноклональные антитела, специфичные к определенным типам антител или их комбинации, после чего производят измерения. Добавленные антиизотипические антитела приводят к дополнительной агрегации и, соответственно, к избирательному увеличению размера комплексов, содержащих антитела данного изотипа. По увеличению размеров иммунных комплексов на ГСС можно судить о присутствии данной разновидности иммуноглобулинов в составе иммунных комплексов, а по отношению вклада в рассеяние более крупных иммунных комплексов к суммарному вкладу всех иммунных комплексов - о доле иммунных комплексов, содержащих иммуноглобулины данного изотипа (Фиг. 1Г). Добавление к биологической жидкости моноклональных антител к иммуноглобулинам различных изотипов приводит к специфическому связыванию между собой иммунных комплексов, содержащих иммуноглобулины данного изотипа, и образованию еще более крупных, чем изначальные иммунные комплексы, агрегатов. Появление таких крупных агрегатов свидетельствует о наличии в составе иммунных комплексов иммуноглобулинов соответствующего изотипа, а величина вклада в рассеяние позволяет примерно оценить количество (долю) данного изотипа. В случае добавления к биологической жидкости смеси моноклональных антител против нескольких различных изотипов появление более крупных агрегатов, чем при добавлении антител к отдельным изотипам, свидетельствует о гетерогенном составе иммунных комплексов и содержании в них одновременно нескольких разных изотипов антител. По приведенным данным увеличение иммуноглобулинов после добавления антигена составляет 28.5% (Фиг. 1В). Вклад IgE в суммарное рассеяние иммунных комплексов составляет 42.1%. Вклад IgG3 составляет 43.8%.If immune complexes originally present in the test fluid are of interest, then the sample is divided into two parts. The spectra of fluctuations of light scattered by the particles of biological fluid in aliquot 1 are measured using dynamic light scattering and the mathematical conversion of the obtained spectra into histograms of the subfractional composition of particles (GSS_ex) on the X axis is the particle size in nm, along the Y axis is the fraction of the contribution to light scattering by particles given size from the total scattering of the measured sample. From an aliquot 2 by immunoaffinity binding of protein A to Staphylococcus aureus or antibodies against human immunoglobulins immobilized on carrier particles, the immunoglobulins and the immune complexes formed by them are removed. Removal is carried out by precipitation by centrifugation of these immunoaffinity sorbents previously added to the sample. Then, a measurement is made of the spectrum of fluctuations of light scattered on the particles of the biological fluid in the supernatant of aliquot 2, and a histogram of the subfraction composition of the particles (GSS_prA) is obtained. By comparing GCC_exc with GCC_prA, the peak corresponding to the antigen-antibody reaction product (immune complexes) is identified. The peak should correspond to particles of a larger size than individual immunoglobulins in the initial histogram (Fig. 1A), and must be absent in GSS_prA. (Fig. 1B). Typically, the hydrodynamic radius of the immune complexes is approximately 50 nm or more. When determining the isotypic composition of immunoglobulins that are part of immune complexes, monoclonal antibodies specific for certain types of antibodies or their combination are added to the initial sample, after which measurements are made. Added anti-isotypic antibodies lead to additional aggregation and, accordingly, to selective increase in the size of complexes containing antibodies of this isotype. By increasing the size of the immune complexes on the GSS, one can judge the presence of this variety of immunoglobulins in the composition of the immune complexes, and by the ratio of the contribution to the scattering of larger immune complexes to the total contribution of all immune complexes - the share of the immune complexes containing immunoglobulins of this isotype (Fig. 1G) . Adding monoclonal antibodies to immunoglobulins of various isotypes to biological fluid leads to specific binding of immune complexes containing immunoglobulins of this isotype to each other and the formation of aggregates larger than the original immune complexes. The appearance of such large aggregates indicates the presence of the corresponding isotype of the immunoglobulins in the immune complexes, and the magnitude of the contribution to scattering allows one to approximately estimate the amount (fraction) of this isotype. If a mixture of monoclonal antibodies against several different isotypes is added to the biological fluid, the appearance of larger aggregates than when antibodies are added to individual isotypes indicates a heterogeneous composition of the immune complexes and the presence of several different antibody isotypes in them at the same time. According to the data, the increase in immunoglobulins after adding antigen is 28.5% (Fig. 1B). The contribution of IgE to the total scattering of immune complexes is 42.1%. The contribution of IgG3 is 43.8%.

Если интерес представляют иммунные комплексы, образуемые при взаимодействии предсуществующих в биологической жидкости антител с экзогенным антигеном, то при приготовлении образца для измерений все предсуществующие иммунные комплексы и другие макромолекулярные агрегаты удаляют путем фильтрования через фильтр с диаметром пор 100 нм. Таким образом, при анализе таких образцов не регистрируют частицы большего чем 100 нм размера. При добавлении к образцу исследуемого антигена или аллергена могут образовываться иммунные комплексы большего размера, которые с высокой чувствительностью могут быть зарегистрированы с помощью динамического рассеяния. Образование их возможно лишь в случае наличия в исследуемой жидкости антител, специфически связывающих добавляемый антиген. Анализ распределения этих иммунных комплексов по изотипическому составу входящих в них антител осуществляется тем же способом, что описан выше.If immune complexes formed by the interaction of antibodies pre-existing in a biological fluid with an exogenous antigen are of interest, then when preparing a sample for measurements, all pre-existing immune complexes and other macromolecular aggregates are removed by filtration through a filter with a pore diameter of 100 nm. Thus, in the analysis of such samples, particles larger than 100 nm in size are not recorded. When a test antigen or allergen is added to the sample, larger immune complexes can form, which can be detected with high sensitivity by dynamic scattering. Their formation is possible only if there are antibodies in the test fluid that specifically bind the added antigen. An analysis of the distribution of these immune complexes according to the isotypic composition of their constituent antibodies is carried out in the same manner as described above.

Пример 1Example 1

Пациентка КАА. Диагноз - сезонный аллергический риноконъюнктивит средней тяжести. Симптомы: заложенность носа, кашель, нарушения сна. Ингаляционный провокационный тест со стандартным аллергеном смеси пыльцы деревьев положительный. Общий IgE - 740 кЕ/л.KAA patient. The diagnosis is seasonal allergic rhinoconjunctivitis of moderate severity. Symptoms: nasal congestion, cough, sleep disturbances. Positive inhalation provocation test with a standard allergen mixture of tree pollen. Total IgE - 740 kE / L.

Исследование предложенным способом показало наличие в плазме крови пациентки свободно циркулирующих иммунных комплексов (Фиг. 2, Табл. 1). Данное заключение сделано на основании отсутствия пика на ГСС плазмы крови, обработанной белком А (Фиг. 2Б), и наличия соответствующего пика на ГСС исходной плазмы (Фиг 4А черный цвет). Добавление стандартного аллергена смеси пыльцы деревьев приводит к увеличению количества иммунных комплексов по вкладу в рассеяние в среднем в 2.2 раза (с 13.47% до 29.74% (Табл. 1)).The study of the proposed method showed the presence of freely circulating immune complexes in the patient's plasma (Fig. 2, Table 1). This conclusion was made on the basis of the absence of a peak on the GSS of blood plasma treated with protein A (Fig. 2B) and the presence of a corresponding peak on the GSS of the original plasma (Fig. 4A black). Adding a standard allergen to a mixture of tree pollen leads to an increase in the number of immune complexes by the contribution to scattering by an average of 2.2 times (from 13.47% to 29.74% (Table 1)).

В иммунных комплексах, связавших стандартный аллерген, присутствуют иммуноглобулины только двух изотипов: IgG1 (Фиг. 2 G1) и IgE (Фиг. 2 Е). Остальные изотипы иммуноглобулинов в составе иммунных комплексов отсутствуют (Фиг. 2, Табл.1).In the immune complexes that bind the standard allergen, only two isotypes of immunoglobulins are present: IgG1 (Fig. 2 G1) and IgE (Fig. 2 E). The remaining immunoglobulin isotypes in the composition of the immune complexes are absent (Fig. 2, Table 1).

Добавление смеси антител к иммуноглобулинам классов G1 и Е приводит к образованию незначительного количества (менее 2.5%, см. Табл. 1) очень крупных агрегатов (размером порядка микрона). Эти макроагрегаты образуют иммунные комплексы со смешанным составом изотипов IgG1 и IgE. Остальные иммунные комплексы однородны по своему составу и в подавляющем большинстве (более 27%, см. Табл. 1) содержат иммуноглобулины изотипа IgE. Таким образом можно с уверенностью утверждать, что сезонный аллергический риноконъюнктивит у данной пациентки имеет аллергическую природу.Adding a mixture of antibodies to immunoglobulins of classes G1 and E leads to the formation of an insignificant amount (less than 2.5%, see Table 1) of very large aggregates (about micron in size). These macroaggregates form immune complexes with a mixed composition of IgG1 and IgE isotypes. The remaining immune complexes are homogeneous in composition and in the vast majority (more than 27%, see Table 1) contain immunoglobulins of the IgE isotype. Thus, it can be confidently stated that seasonal allergic rhinoconjunctivitis in this patient is allergic in nature.

Пример 2Example 2

Пациентка К, 44 года. Диагноз - сезонный аллергический риноконъюнктивит средней тяжести. Симптомы: заложенность носа, кашель, нарушения сна. Ингаляционный провокационный тест со стандартным аллергеном смеси пыльцы деревьев положительный. Общий IgE - 740 кЕ/л.Patient K, 44 years old. The diagnosis is seasonal allergic rhinoconjunctivitis of moderate severity. Symptoms: nasal congestion, cough, sleep disturbances. Positive inhalation provocation test with a standard allergen mixture of tree pollen. Total IgE - 740 kE / L.

Образец плазмы крови пациентки разводили в 5 раз изотоническим фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением натриевой соли ЭДТА (10 мМ) и проводили измерения по стандартной процедуре, описанной выше.The patient’s blood plasma sample was diluted 5 times with isotonic phosphate buffer pH 7.2 with the addition of EDTA sodium salt (10 mM) and measurements were performed according to the standard procedure described above.

Исследование предложенным способом показало наличие в плазме крови пациентки значительного количества свободно циркулирующих иммунных комплексов (Фиг. 3А). При сравнении гистограмм отмечают отсутствие пика на ГСС плазмы крови, обработанной белком А (Фиг. 3Б), и наличие соответствующего пика на ГСС исходной плазмы (Фиг. 3А, темный цвет). На основании этого делают вывод о присутствии в плазме крови пациентки циркулирующих иммунных комплексов.The study by the proposed method showed the presence in the patient's plasma of a significant amount of freely circulating immune complexes (Fig. 3A). When comparing the histograms, the absence of a peak on the GSS of blood plasma treated with protein A (Fig. 3B) and the presence of a corresponding peak on the GSS of the original plasma (Fig. 3A, dark color) are noted. Based on this, a conclusion is drawn about the presence of circulating immune complexes in the patient’s blood plasma.

Пример 3Example 3

Пациент Б., 52 года. Диагноз - аллергический риноконъюнктивит средней тяжести. Симптомы: отек слизистой носа, кашель, зуд. Скарификационный тест со стандартным аллергеном домашней пыли положительный. Общий IgE - 560 кЕ/л.Patient B., 52 years old. The diagnosis is moderate allergic rhinoconjunctivitis. Symptoms: swelling of the nasal mucosa, cough, itching. A screening test with a standard house dust allergen is positive. Total IgE - 560 ke / l.

Перед исследованием плазму крови пациента разводили в 5 раз изотоническим фосфатным буфером рН 7,2 с добавлением натриевой соли ЭДТА (10 мМ) и фильтровали через фильтр Millipor™ PWDF с диаметром пор 100 нм. Данная процедура позволяла убрать все частицы с R_h более 50 нм, в том числе и крупные иммунные комплексы. Измерения проводили по стандартной процедуре. Как видно из приведенного на фигуре 4, число таких частиц падает с 30% в исходном образце плазмы (Фиг. 4А) до нуля (Фиг. 4Б). Добавление к 0.2 мл образца 200 единиц PNU стандартного аллергена домашней пыли вызывает образование крупных иммунных комплексов с R_h более 100 нм, вклад в рассеяние которых составляет более 20%. (Фиг. 4В). На данном основании может быть подтверждено наличие у пациента аллергии на домашнюю пыль.Before the study, the patient's blood plasma was diluted 5 times with isotonic phosphate buffer pH 7.2 with the addition of sodium EDTA (10 mM) and filtered through a Millipor ™ PWDF filter with a pore diameter of 100 nm. This procedure made it possible to remove all particles with R _h greater than 50 nm, including large immune complexes. The measurements were carried out according to the standard procedure. As can be seen from the figure 4, the number of such particles decreases from 30% in the original plasma sample (Fig. 4A) to zero (Fig. 4B). The addition of 200 units of PNU of a standard house dust allergen to 0.2 ml of a sample causes the formation of large immune complexes with R _h more than 100 nm, the contribution to the scattering of which is more than 20%. (Fig. 4B). On this basis, the patient may be allergic to house dust.

Пример 4Example 4

Пациентка Ш., 50 лет. Отек десен. Жалобы на дискомфорт при приеме пищи. Предположительный диагноз - аллергическая реакция на один или несколько компонентов пломбировочного материала.Patient Sh., 50 years old. Swelling of the gums. Complaints of discomfort while eating. A presumptive diagnosis is an allergic reaction to one or more components of the filling material.

Приготовление растворов тестируемых веществPreparation of test substance solutions

Так как большинство используемых в стоматологии веществ не растворимы или плохо растворимы в воде, необходимо экстрагировать водорастворимые компоненты, поскольку только они могут быть иммуногенны. С этой целью исследуемые материалы в течение суток вымачивали в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО) при 45°С, который широко используют как универсальный растворитель в биологических исследованиях. Объем используемого ДМСО должен в 10 раз превышать объем исследуемого вещества. Вслед за этим к исследуемому образцу добавляли 10-кратный объем щелочного физиологического раствора с рН 11,5 и выдерживали образцы еще сутки. Затем рН снижали до 6,0 добавлением концентрированного буфера (обычно используют органический буфер HEPES 1М). Полученный экстракт центрифугировали при 13000 оборотов в минуту в течение 20 мин для удаления возможных микрочастиц, которые могли бы мешать проведению измерений способом динамического светорассеяния. Полученный экстракт хранят и используют в качестве концентрированного раствора для тестирования иммуногенности.Since most substances used in dentistry are insoluble or poorly soluble in water, it is necessary to extract water-soluble components, since only they can be immunogenic. For this purpose, the studied materials were soaked for one day in 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) at 45 ° С, which is widely used as a universal solvent in biological studies. The volume of DMSO used should be 10 times the volume of the test substance. Following this, a 10-fold volume of alkaline physiological saline with a pH of 11.5 was added to the test sample and the samples were kept for another day. Then, the pH was reduced to 6.0 by the addition of concentrated buffer (HEPES 1M organic buffer is usually used). The extract obtained was centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes to remove possible microparticles that could interfere with the measurements using dynamic light scattering. The resulting extract is stored and used as a concentrated solution for testing immunogenicity.

0,2 мл плазмы крови тестируемого пациента разбавляли в 5 раз 10 мМ раствором этилен-диамин-тетрауксусной к-ты (ЭДТА) в физиологическом растворе рН 7,2. Полученный раствор фильтровали через фильтр Millipor™ PWDF с диаметром пор 100 нм. Затем к 0,2 мл фильтрата добавляли 20 мкл (10% от объема) экстракта тестируемого вещества. Измерения проводили по стандартной процедуре.0.2 ml of blood plasma of the test patient was diluted 5 times with 10 mm solution of ethylene diamine-tetraacetic to-you (EDTA) in physiological saline pH 7.2. The resulting solution was filtered through a Millipor ™ PWDF filter with a pore diameter of 100 nm. Then, 20 μl (10% by volume) of the test substance extract was added to 0.2 ml of the filtrate. The measurements were carried out according to the standard procedure.

Как и в предыдущем примере, о степени аллергической реакции на пломбировочный материал судили по появлению иммунных комплексов (частиц с Rh крупнее 100 нм) в ответ на действие экстракта пломбировочного материала. Было протестировано 10 образцов широко используемых пломбировочных материалов. Результаты приведены в таблице 2. Как видно из приведенных в таблице данных, наиболее пригодным пломбировочным материалом для данной пациентки является Нейлон, вообще не вызывающий образование ИК.As in the previous example, the degree of an allergic reaction to the filling material was judged by the appearance of immune complexes (particles with Rh larger than 100 nm) in response to the action of the filling material extract. 10 samples of commonly used filling materials were tested. The results are shown in table 2. As can be seen from the data in the table, the most suitable filling material for this patient is Nylon, which does not cause the formation of IR at all.

Пример 5Example 5

Пациент К, диагноз - ревматоидный артрит. Целью исследования было зафиксировать изменения в изотипическом составе ИК в ходе проведения терапевтического лечения. В качестве стандартного антигена использовали раствор циклоцитрулина. Образцы плазмы готовили, как описано в примере 3, с тем отличием, что, кроме циклоцитрулина, к образцам добавляли по 20 мкл моноклональных антител к иммуноглобулинам человека различных изотипов как в чистом виде, так и в различных сочетаниях. В данном случае в образцы фильтрованной плазмы с циклоцитрулином добавляли антитела к иммуноглобулинам IgG1, IgG3, IgG4, IgE и смеси антител к IgG1 и антител к IgG3, антител к IgG1 и антител к IgE, антител к IgG3 и антител к IgE. Общее количество образцов было равно 10.Patient K, diagnosed with rheumatoid arthritis. The aim of the study was to record changes in the isotypic composition of IC during the course of therapeutic treatment. A cyclocytrulin solution was used as a standard antigen. Plasma samples were prepared as described in example 3, with the difference that, in addition to cyclocytrulin, 20 μl of monoclonal antibodies to human immunoglobulins of various isotypes were added to the samples, either in pure form or in various combinations. In this case, antibodies to immunoglobulins IgG1, IgG3, IgG4, IgE and a mixture of antibodies to IgG1 and antibodies to IgG3, antibodies to IgG1 and antibodies to IgE, antibodies to IgG3 and antibodies to IgE were added to samples of filtered plasma with cyclocytrulin. The total number of samples was 10.

На фигуре 5 выборочно представлены только наиболее характерные ГСС: ГСС фильтрованной плазмы (А), ГСС той же плазмы с циклоцитрулином (Б), ГСС плазмы с циклоцитрулином и антителами к IgG3 (В), ГСС плазмы с циклоцитрулином и смесью антител a IgG1 и IgG3 (Г) и ГСС плазмы с циклоцитрулином и смесью антител a IgG3 и IgE (Д). Как видно из приведенных гистограмм, после добавления в фильтрованную плазму пациента циклоцитрулина происходит образование иммунных комплексов, о чем свидетельствует появление пика на ГСС с R_h порядка 100 нм (Фиг. 5Б). Если образовавшиеся иммунные комплексы содержат иммуноглобулины интересующего изотипа (в данном конкретном случае IgG3 - Фиг. 5В), на ГСС появляется еще один пик с большим R_h порядка 200 нм. Вклад данных частиц в рассеяние позволяет примерно оценить долю иммуноглобулинов данного изотипа в общем пуле иммуноглобулинов. Однако эта оценка не может быть строго количественной в силу сильной нелинейности вклада в рассеяние частиц от их размера. В случае использования смесей антител к различным иммуноглобулинам картина носит еще более сложный характер. Если иммунные комплексы гомогенны по своему составу, при добавлении смеси антител картина будет похожа на описанную выше (Фиг. 5Д). Отличия от ГСС на Фиг. 5В заключаются в заметно большем вкладе в рассеяние крупных агрегатов, так как они образуются из иммунных комплексов, содержащих иммуноглобулины обоих изотипов. Если иммунные комплексы гетерогенны и содержат иммуноглобулины обоих изотипов, происходит образование еще более крупных мегаагрегатов с R_h порядка 400 нм (Фиг. 5Г). В силу упомянутой выше нелинейности зависимости вклада в рассеяние от размера частиц в данном случае можно только зафиксировать гетерогенность комплексов, но нет возможности сделать вывод о доле таких гетерогенных ИК в общем пуле. Пик с R_h порядка 100 нм в этом случае характеризует иммунные комплексы, не содержащие иммуноглобулины, антитела к которым добавлены в образец.The figure 5 selectively presents only the most characteristic GSS: GSS filtered plasma (A), GSS of the same plasma with cyclocytrulin (B), GSS plasma with cyclocytrulin and antibodies to IgG3 (C), GSS plasma with cyclocytrulin and a mixture of antibodies a IgG1 and IgG3 (D) and GSS plasma with cyclocytrulin and a mixture of antibodies a IgG3 and IgE (D). As can be seen from the histograms, after the addition of cyclocytrulin to the patient’s filtered plasma, the formation of immune complexes occurs, as evidenced by the appearance of a peak on the GSS with R _{h of the} order of 100 nm (Fig. 5B). If the resulting immune complexes contain immunoglobulins of the isotype of interest (in this particular case, IgG3 - Fig. 5B), another peak with a large R _{h of} about 200 nm appears on the GSS. The contribution of these particles to scattering allows one to approximately estimate the fraction of immunoglobulins of a given isotype in the total pool of immunoglobulins. However, this estimate cannot be strictly quantitative due to the strong nonlinearity of the contribution of particle size to scattering. In the case of using mixtures of antibodies to various immunoglobulins, the picture is even more complex. If the immune complexes are homogeneous in composition, when a mixture of antibodies is added, the picture will be similar to that described above (Fig. 5E). Differences from the GSS in FIG. 5B consist of a significantly larger contribution to the scattering of large aggregates, since they are formed from immune complexes containing immunoglobulins of both isotypes. If the immune complexes are heterogeneous and contain immunoglobulins of both isotypes, the formation of even larger mega-aggregates with R _{h of the} order of 400 nm (Fig. 5G). Due to the nonlinearity mentioned above, the dependence of the contribution to scattering on the particle size in this case can only fix the heterogeneity of the complexes, but there is no way to draw a conclusion about the share of such heterogeneous IR in the total pool. A peak with R _{h of the} order of 100 nm in this case characterizes immune complexes that do not contain immunoglobulins, the antibodies to which are added to the sample.

После анализа данных по всем 10 вариантам можно сделать заключение, что в данном конкретном случае иммуноглобулины изотипов IgG1 и IgG3 образуют гетерогенные иммунные комплексы, а иммунные комплексы, содержащие иммуноглобулин изотипа IgE, - гомогенны. Содержание иммуноглобулинов остальных изотипов находится на уровне ошибки определения (вклад в рассеяние таких ИК менее 1%).After analyzing the data for all 10 variants, we can conclude that in this particular case, the immunoglobulins of the IgG1 and IgG3 isotypes form heterogeneous immune complexes, and the immune complexes containing the immunoglobulin of the IgE isotype are homogeneous. The content of immunoglobulins of the remaining isotypes is at the level of determination error (contribution to the scattering of such IRs is less than 1%).

Изменение изотипического состава иммунных комплексов у данного пациента в процессе лечения представлено в Табл. 3. Из данных таблицы видно, что изотипический состав ИК в процессе лечения претерпевает существенные изменения: если вначале (1 срок) картина не отличается от исходной и в плазме пациента содержатся иммунные комплексы, образованные исключительно иммуноглобулинами типа IgG3, то начиная со 2 срока, в составе иммунных комплексов появляются иммуноглобулины типа IgE. Начиная с 3 срока, в составе иммунных комплексов появляются иммуноглобулины типа IgG1, при этом он образует гетерогенные комплексы с иммуноглобулином IgG3. Комплексы, содержащие иммуноглобулин IgE, остаются однородными. На последнем сроке иммуноглобулин IgG1 становится основным в составе иммунных комплексов.The change in the isotypic composition of the immune complexes in this patient during treatment is presented in Table. 3. It can be seen from the table that the isotypic composition of IR undergoes significant changes during treatment: if at the beginning (1 term) the picture does not differ from the initial one and the patient’s plasma contains immune complexes formed exclusively by IgG3-type immunoglobulins, then starting from the 2nd term, IgG type immunoglobulins appear in the composition of immune complexes. Starting from the 3rd term, IgG1 type immunoglobulins appear in the composition of immune complexes, while it forms heterogeneous complexes with IgG3 immunoglobulin. Complexes containing IgE immunoglobulin remain homogeneous. In the last term, IgG1 immunoglobulin becomes the main one in the composition of immune complexes.

Пример 6Example 6

Оценка чувствительности способа. Для оценки чувствительности предлагаемого подхода к образцам культуральной среды RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 5 мкг/мл мышиных моноклональных антител к человеческому церулоплазмину добавляли церулоплазмин в различных концентрациях. Или же к такой же среде, содержащей 5 мкг на мл церулоплазмина, добавляли различные количества моноклональных антител мыши, специфически связывающих церулоплазмин. Появление иммунных комплексов измеряли с помощью динамического светорассеяния. Вклад таких комплексов в общее светорассеяние образцов, выраженный в процентах, приведен в таблицах 4 и 5.Assessment of the sensitivity of the method. To assess the sensitivity of the proposed approach to samples of RPMI1640 culture medium supplemented with 10% fetal calf serum and 5 μg / ml mouse monoclonal antibodies to human ceruloplasmin, ceruloplasmin was added in various concentrations. Or, to the same medium containing 5 μg per ml of ceruloplasmin, various amounts of mouse monoclonal antibodies specifically binding ceruloplasmin were added. The appearance of immune complexes was measured using dynamic light scattering. The contribution of such complexes to the total light scattering of the samples, expressed as a percentage, is shown in tables 4 and 5.

В исходных образцах сыворотки иммунные комплексы отсутствуют. При добавлении к тестируемым образцам церулоплазмина в конечной концентрации 1000 нг/мл резко увеличивается вклад частиц с гидродинамическим радиусом приблизительно 100 нм (Табл. 4). Поскольку такие комплексы не образуются в образцах, которые не содержат антител, связывающих церулоплазмин, то резонно полагать, что они представляют собой иммунные комплексы, составленные множественными молекулами церулоплазмина, связанными между собой специфичными к нему молекулами антител. Уменьшение концентрации церулоплазмина приводит к снижению доли вклада в рассеяние иммунных комплексов и при концентрациях менее 80 пг/мл они вообще перестают регистрироваться. Аналогичная картина наблюдается при титровании сыворотки с церулоплазмином моноклональными антителами к церулоплазмину (Таблица 5).In the original samples of serum, immune complexes are absent. When ceruloplasmin is added to the test samples at a final concentration of 1000 ng / ml, the contribution of particles with a hydrodynamic radius of approximately 100 nm sharply increases (Table 4). Since such complexes do not form in samples that do not contain antibodies that bind ceruloplasmin, it is reasonable to assume that they are immune complexes made up of multiple ceruloplasmin molecules bound together by specific antibody molecules. A decrease in the concentration of ceruloplasmin leads to a decrease in the share of the contribution to the scattering of immune complexes and at concentrations less than 80 pg / ml they generally cease to be recorded. A similar pattern is observed when titrating serum with ceruloplasmin with monoclonal antibodies to ceruloplasmin (table 5).

Полученные результаты показывают, что способ согласно настоящему изобретению позволяет регистрировать антиген вплоть до концентрации указанного антигена в несколько нанограмм на мл и определять наличие специфических антител вплоть до концентрации менее 100 пг/мл.The results show that the method according to the present invention allows you to register the antigen up to a concentration of the specified antigen in a few nanograms per ml and to determine the presence of specific antibodies up to a concentration of less than 100 pg / ml.

Должно быть очевидно, что примеры и варианты реализации, описанные в данной заявке, приведены исключительно с целью пояснения и что специалистам в данной области техники будут предложены их различные модификации или изменения, которые должны быть включены в сущность и область настоящей заявки.It should be obvious that the examples and implementations described in this application are provided solely for the purpose of explanation and that various modifications or changes will be offered to those skilled in the art that should be included in the spirit and scope of this application.

Claims

1. A method for determining the characteristics of the isotypic composition of immune complexes in a sample of biological fluid obtained from a subject, including:

(a) Providing an initial sample of biological fluid from a subject;

(b) Obtaining for the specified sample dynamic light scattering spectrum (DLS), which contains peaks corresponding to particles of different sizes that are present in the specified sample;

(c) Bringing said sample into contact with at least one substance that specifically binds to immunoglobulins of one or more isotypes contained in the sample;

(d) Removing from the specified sample complexes containing the specified substance, to obtain a processed sample;

(e) Obtaining a DSR spectrum of the treated sample obtained in step (d), which contains peaks corresponding to particles of different sizes that are present in said treated sample;

(e) Comparison of the spectrum of DSB obtained in stage (b) with the spectrum obtained in stage (e), based on the differences in the spectrum of the treated sample and the spectrum obtained for the original sample, determine the isotypic composition of the immune complexes present in the specified sample biological fluid.

2. The method according to p. 1, characterized in that stage c) -e) is carried out at least twice.

3. The method according to p. 1, characterized in that the said subject is a mammal.

4. The method according to p. 3, characterized in that the mammal is a human.

5. The method according to p. 1, characterized in that said immunoglobulin of a particular isotype is an IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM immunoglobulin, Kappa or lambda type light chain immunoglobulin.

6. The method according to p. 1, characterized in that the substance used in stage (C) is selected from: an antigenic agent, antibodies against an immunoglobulin of a particular isotype, a bacterial protein that specifically binds immunoglobulins, for example, a bacterial protein that specifically binds constant regions immunoglobulins.

7. The method according to p. 1, characterized in that said substance used in step (c) is immobilized on a carrier.

8. The method according to p. 1, characterized in that said immune complexes are formed in a sample of biological fluid in a spontaneous manner.

9. The method according to p. 1, characterized in that these immune complexes were formed in a sample of biological fluid as a result of the addition of antigenic material.

10. The method according to p. 1, characterized in that the specified isotypic composition, determined in stage (e), is the size of the immune complex containing the immunoglobulins of one or more isotypes according to (c), which is present in the specified source sample.

11. The method according to p. 1, characterized in that the specified characteristic of the isotypic composition, determined at stage (e), is a contribution to the light scattering of the immune complex, which is present in the specified source sample.

12. The method according to p. 1, characterized in that the specified characteristic of the isotypic composition, determined at stage (e), is the presence of an immunoglobulin of a certain isotype in the immune complexes in the specified source sample.

13. The method according to p. 1, characterized in that the specified characteristic of the isotypic composition, determined in stage (e), is the presence of an immunoglobulin of a particular isotype in the immune complexes in the specified source sample in a certain ratio compared to other antibody isotypes included in the specified immune complex.

14. The method according to p. 1, characterized in that to obtain the spectrum of the DSL, a heterodyne scheme for detecting dynamic light scattering is used.

15. The method according to p. 1, characterized in that the complex of the specified substance with the specified immunoglobulin in stage (g) is removed using one or more of: immuno-affinity chromatography, filtration, centrifugation.

16. The method according to p. 1, characterized in that the substance used in stage (C), is an antibody of an animal belonging to a species different from that from which the original sample of biological fluid.

17. The method according to p. 1, characterized in that the substance used in stage (C) is a monoclonal antibody.

18. The method according to p. 1, characterized in that the specified initial sample of biological fluid is: whole blood, blood plasma, blood serum, lymph, saliva, semen, cerebrospinal fluid, milk, colostrum, sputum, amniotic fluid, urine, pus , mucus, effusion, ascitic fluid or pleural fluid.

19. The method according to p. 1 or 12, characterized in that at the stage (c) add several substances (antibodies), each of which is specific to a specific type of immunoglobulin.

20. The method according to p. 19, characterized in that when comparing the spectrum of the DSB obtained in stage (b) with the spectrum obtained in stage (e), it is found that a peak corresponding to particles of a larger size than the sizes is present in the processed sample particles present in the original sample.

21. A method for diagnosing a disease or condition in a subject, comprising determining the characteristics of the isotypic composition of the immune complexes in the sample of the biological fluid of the subject, and immune complexes with the specified characteristic of the isotypic composition are present in the biological fluid of the subject in the specified disease or condition, while the specified isotypic composition in the sample biological fluid is determined using the method according to any one of paragraphs. 1-20.

22. The method according to p. 21, characterized in that the specified characteristic of the isotypic composition is the presence in the specified sample of the biological fluid of immune complexes containing a specific combination of immunoglobulin isotypes.

23. The method according to p. 21, characterized in that said subject is a mammal.

24. The method according to p. 22 or 23, characterized in that the mammal is a human.

25. The method according to p. 21 or 23, characterized in that said disease or condition is selected from: a hypersensitivity reaction, an allergic disease, an autoimmune disease, an immune response to an exogenous material, for example, an immune response to an exogenous material used in transplantology and dentistry, infectious disease, inflammation.

26. The method according to p. 25, characterized in that in the sample of biological fluid of the specified subject there are immune complexes in which IgE predominates, and the disease is an allergy.

27. The method according to p. 25, characterized in that in the sample of biological fluid of the specified subject there are immune complexes in which IgG3 predominates, and the disease is an autoimmune disease.

28. The method according to p. 25, characterized in that the sample of biological fluid of the specified subject contains immune complexes containing a combination of immunoglobulin isotypes IgG1, IgG3, IgG4, IgE, and the disease is an infectious disease.

29. The method according to p. 25, characterized in that the sample of biological fluid of the specified subject contains immune complexes containing a combination of immunoglobulin isotypes IgG1, IgG3, IgG4, IgE, and the disease is tuberculosis.

30. The method according to p. 25, characterized in that in the sample of biological fluid of the specified subject there are immune complexes containing a combination of immunoglobulin isotypes IgG1, IgG3, IgG4, IgE, and the disease is a reaction to an antibiotic-resistant pathogen.

31. The method according to p. 25, characterized in that the sample of biological fluid of the specified subject contains immune complexes containing a combination of isotype immunoglobulins IgG1, IgG3, IgG4, IgE, and the disease is a reaction to an infectious agent.

32. The method of claim 25, wherein said infectious disease is a disease caused by a bacterium or virus.

33. A kit for implementing the method according to p. 21, including:

at least one substance that specifically binds to immunoglobulins of one or more isotypes contained in a biological sample, and instructions for using said substance in the method of claim 21.

34. The kit of claim 33, wherein said at least one substance is an antibody specific for a particular isotype immunoglobulin.

35. The kit of claim 34, wherein said antibody is a monoclonal antibody.