RU2627602C2

RU2627602C2 - METHOD TO OBTAIN CHEMERIC RECOMBINANT PROTEIN fliC:pagN

Info

Publication number: RU2627602C2
Application number: RU2015156685A
Authority: RU
Inventors: Арина Владимировна Козырь; Александр Владимирович Колесников; Алена Константиновна Рябко; Лидия Александровна Лисицкая; Наталья Алексеевна Зенинская; Максим Александрович Марьин; Игорь Георгиевич Шемякин
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2017-08-09
Also published as: RU2015156685A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: to implement the method, a recombinant plasmid pETfliCpagN is constructed, then Escherichia coli BL21 (DE3) cells with the said plasmid and the resulting BL-fliCpagN strain is cultured at a temperature of 37°C. Next, a periplasmic fraction of producer bacteria is prepared by cells treatment with lysozyme in a 20% sucrose solution, followed by centrifugation, the chemeric fliC:pagN by metal chelate, anion exchange, and gel filtration chromatography to obtain a homogeneous final preparation of fliC:pagN protein. The recombinant pETfliCpagN plasmid contains the T7 bacteriophage promoter and carries sequences encoding fliC proteins, including the leader sequence of this protein, and pagN S. typhimurium, combined with a short linker sequence GSVDSSSGGN, and fused at the 3'-end with a synthetic sequence encoding six histidins.

EFFECT: method allows to synthesise this protein in soluble form with a native N-terminal amino acid sequence, yielding at least 0,3 g of protein from a litre of bacterial culture with 98 percent purity.

7 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биофармакологии, к областям получения и производства иммунобиологических препаратов, медицинской микробиологии, созданию фармакологических и вакцинных композиций, биотехнологиям продукции рекомбинантных белков, и касается разработки нового способа получения рекомбинантного химерного белка на основе белков fliC и pagN Salmonella typhimurium (fliC:pagN), обладающего высокой иммуногенностью и адъювантными свойствами, применимого для создания высокоэффективной конъюгированной вакцины в целях профилактики сальмонеллезной инфекции.The invention relates to biotechnology, specifically to biopharmacology, to the fields of production and production of immunobiological preparations, medical microbiology, the creation of pharmacological and vaccine compositions, biotechnologies for the production of recombinant proteins, and for the development of a new method for producing recombinant chimeric protein based on fliC and pagN Salmonella typhimurium proteins (fliC : pagN), which has high immunogenicity and adjuvant properties, is applicable to create a highly effective conjugate vaccine for the prevention of iki Salmonella infection.

Основной сферой применения предлагаемого способа получения рекомбинантного химерного fliC:pagN являются биомедицина, создание медицинских профилактических препаратов, лабораторные биологические и медицинские исследования, создание субъединичных и конъюгированных вакцин и вакцинных штаммов для профилактики кишечных инфекций, вызванных бактериями рода Salmonellae.The main scope of the proposed method for producing recombinant chimeric fliC: pagN are biomedicine, the creation of medical preventive drugs, laboratory biological and medical research, the creation of subunit and conjugate vaccines and vaccine strains for the prevention of intestinal infections caused by bacteria of the genus Salmonellae.

Белок fliC, наряду с fliB, является флагеллином (основным компонентом флагелл - органелл бактерии, обеспечивающих ее подвижность) Salmonella sp. (Bonifield H.R., Hughes K.T. // J. Bacteriol. - 2003. - V. 185. - P. 3567-3574). Вместе с этим, FliC, как и некоторые другие флагеллины, в силу его экспозиции на поверхности бактерий, является классическим «молекулярным паттерном, ассоциированным с повреждениями» (DAMP, damage-associated molecular pattern), и распознается одним из рецепторов «примитивной» системы врожденного иммунитета, а именно толл-подобным рецептором 5 (TLR5, Yoon S.I., Kurnasov О., Natarajan V., Hong М., Gudkov А.V., Osterman A.L., Wilson I.A. // Science. - 2012. - V. 335. - P. 859-64). Рецепторы этого типа, в свою очередь, обозначаются, как паттерн-распознающие рецепторы (PRR), которые узнают паттерны, ассоциированные с патогенами (PAMP, Kumar S. // Crit. Rev. Microbiol. - 2013. - V. 39. - P. 229-246). Необходимо отметить, что многие из PRR рассматриваются в качестве важнейших мишеней для молекулярных вакцинных адъювантов (Olive С. // Expert Rev. Vaccines. - 2012. - V. 11. - P. 237-256), в том числе, и система TLR5-флагеллин (Mizel S.B. // J. Immunol. - 2010. - V. 185. - Р. 5677-5682). Также существенно, что для индукции выработки антител флагеллин использует дополнительные механизмы, не связанные напрямую с активацией системы врожденного иммунитета (Sanders C.J. // Eur. J. Immunol. - 2009. - V. 39. - P. 359-371), что можно рассматривать как преимущество с точки зрения эффективности протективного гуморального иммунного ответа.The fliC protein, along with fliB, is flagellin (the main component of flagellas, the organelles of the bacterium that provide its mobility) Salmonella sp. (Bonifield H.R., Hughes K.T. // J. Bacteriol. - 2003. - V. 185. - P. 3567-3574). At the same time, FliC, like some other flagellins, due to its exposure on the surface of bacteria, is a classic “damage-associated molecular pattern” (DAMP), and is recognized by one of the receptors of the “primitive” system of the innate immunity, namely, toll-like receptor 5 (TLR5, Yoon SI, Kurnasov O., Natarajan V., Hong M., Gudkov A.V., Osterman AL, Wilson IA // Science. - 2012. - V. 335. - P. 859-64). Receptors of this type, in turn, are designated as pattern-recognizing receptors (PRR) that recognize patterns associated with pathogens (PAMP, Kumar S. // Crit. Rev. Microbiol. - 2013. - V. 39. - P . 229-246). It should be noted that many of the PRRs are considered as the most important targets for molecular vaccine adjuvants (Olive C. // Expert Rev. Vaccines. - 2012. - V. 11. - P. 237-256), including the TLR5 system -flagellin (Mizel SB // J. Immunol. - 2010. - V. 185. - R. 5677-5682). It is also significant that flagellin uses additional mechanisms to induce antibody production that are not directly related to the activation of the innate immunity system (Sanders CJ // Eur. J. Immunol. - 2009. - V. 39. - P. 359-371), which can seen as an advantage in terms of the effectiveness of a protective humoral immune response.

Белок pagN является мембранным белком сальмонелл с рядом доменов, экспонированных во внешнюю среду. Функцией этого белка является адгезия к клеткам организма-хозяина и участие в инвазии патогена в клетку (Lambert М.А., Smith S.G. // ВМС Microbiol. - 2008. - V. 8. - P. 142). Таким образом, pagN является важнейшим участником процесса инфекции сальмонелл, и его связывание, в частности, антителами, может блокировать процесс инвазии. Недавние исследования показали, что pagN является достаточно эффективным протективным антигеном для профилактики сальмонеллезной инфекции (Yang Y., Wan С., Xu Н., Aguilar Z.P., Tan Q., Xu F., Lai W., Xiong Y., Wei H. // Microbes Infect. - 2013. - V. 15. - P. 388-398). Вместе с тем, условия, при которых pagN обеспечивал бы полную защиту от инфекции, найдены пока не были. Уместно отметить, что наиболее эффективные с точки зрения протективного эффекта антигены сальмонелл не являются иммунодоминантными (Barat S., Wilier Y., Rizos K., Claudi В.,

A., Schemmer A.K., Kirchhoff D., Schmidt A., Burton N., Bumann D. // PLoS Pathog. - 2012. - V. 8. - P.e1002966), а, следовательно, иммунный ответ к ним может быть усилен за счет адъювантов, в том числе и молекулярных.The pagN protein is a Salmonella membrane protein with a number of domains exposed to the external environment. The function of this protein is adhesion to the cells of the host organism and participation in the invasion of the pathogen into the cell (Lambert MA, Smith SG // IUD Microbiol. - 2008. - V. 8. - P. 142). Thus, pagN is an important participant in the Salmonella infection process, and its binding, in particular, with antibodies, can block the invasion process. Recent studies have shown that pagN is a fairly effective protective antigen for the prevention of salmonella infection (Yang Y., Wan C., Xu N., Aguilar ZP, Tan Q., Xu F., Lai W., Xiong Y., Wei H. // Microbes Infect. - 2013. - V. 15. - P. 388-398). However, the conditions under which pagN would provide complete protection against infection have not yet been found. It is worth noting that the salmonella antigens that are most effective from the point of view of the protective effect are not immunodominant (Barat S., Wilier Y., Rizos K., Claudi B.,

A., Schemmer AK, Kirchhoff D., Schmidt A., Burton N., Bumann D. // PLoS Pathog. - 2012. - V. 8. - P.e1002966), and, therefore, the immune response to them can be enhanced by adjuvants, including molecular ones.

Конъюгированные сальмонеллезные вакцины используют в качестве активатора иммунного ответа экзополисахарид сальмонелл, в частности, экзополисахарид S. typhi, как наиболее изученный на данный момент антиген (Robbins J.D., Robbins J.B. // J. Infect. Dis. - 1984. - V. 150. - P. 436-449). Данный экзополисахарид известен под названием Vi-антигена и использовался как в качестве самостоятельного антигена, так и в качестве конъюгированной вакцины (Anwar Е., Goldberg Е., Fraser A., Acosta C.J., Paul М., Leibovici L. // Cochrane Database Syst. Rev. - 2014. - V. 1. - P.:CD001261), однако даже конъюгированные с известными антигенами-партнерами препараты Vi-антигена до сих пор не одобрены в качестве действующих вакцин и испытывают определенные проблемы с эффективностью (Pier G.B. // Hum. Vaccin. - 2007. - V. 3. - Р. 39-40). В связи с этим постоянно ведется поиск новых антигенов, которые можно было бы использовать в качестве партнеров для конъюгации. Немаловажной является и проблема иммунной интерференции (Borrow R., Dagan R., Zepp F., Hallander H., Poolman J. // Expert Rev. Vaccines. - 2011. - V. 10. - P. 1621-1631), поскольку брюшнотифозная вакцина не является календарной, а вакцины для профилактики вспышек кишечных инфекций, вызываемых Salmonella sp, могут применяться в разное время для разных групп населения. В силу этого вероятность интерференции иммунного ответа к сальмонеллезным вакцинам, конъюгированным с традиционными «календарными» антигенами, такими как дифтерийный и столбнячный токсоиды, возрастает (Dagan R., Poolman J., Siegrist C.A. // Vaccine. - 2010. - V. 28. - P. 5513-5523). Таким образом, идентификация альтернативных партнеров для конъюгации с полисахаридными антигенами сальмонелл, в первую очередь, с Vi-антигеном, представляется важной для создания эффективных вакцинных препаратов.Conjugated salmonella vaccines use salmonella exopolysaccharide, in particular S. typhi exopolysaccharide, as the most studied antigen at present (Robbins JD, Robbins JB // J. Infect. Dis. 1984. - V. 150. - as an activator of the immune response). P. 436-449). This exopolysaccharide is known as the Vi antigen and has been used both as an independent antigen and as a conjugate vaccine (Anwar E., Goldberg E., Fraser A., Acosta CJ, Paul M., Leibovici L. // Cochrane Database Syst Rev. - 2014. - V. 1. - P.:CD001261), however, even Vi-antigen preparations conjugated with well-known partner antigens are still not approved as active vaccines and have some problems with their effectiveness (Pier GB // Hum. Vaccin. - 2007. - V. 3. - P. 39-40). In this regard, a constant search is underway for new antigens that could be used as partners for conjugation. An important problem is the immune interference (Borrow R., Dagan R., Zepp F., Hallander H., Poolman J. // Expert Rev. Vaccines. - 2011. - V. 10. - P. 1621-1631), because typhoid vaccine is not a calendar vaccine, and vaccines for the prevention of outbreaks of intestinal infections caused by Salmonella sp can be used at different times for different population groups. Because of this, the likelihood of interference of the immune response to salmonella vaccines conjugated with traditional "calendar" antigens such as diphtheria and tetanus toxoids increases (Dagan R., Poolman J., Siegrist CA // Vaccine. - 2010. - V. 28. - P. 5513-5523). Thus, the identification of alternative partners for conjugation with salmonella polysaccharide antigens, primarily with the Vi antigen, seems to be important for creating effective vaccines.

Происходящий в настоящее время пересмотр парадигмы механизма участия белкового партнера в активации и модификации иммунного ответа к конъюгированному полисахаридному антигену диктует новые стратегии создания конъюгированных вакцин, которые учитывали бы новые данные о механизме активации Т-клеточного иммунитета к конъюгированным антигенам (Avci F.Y. // Curr. Top. Med. Chem. - 2013. - V. 13. - P. 2535-2540; Berti F., Adamo R. // ACS Chem. Biol. - 2013. - V. 8. - P. 1653-1663; Колесников A.B., Козырь A.B., Шемякин И.Г., Дятлов И.А. // Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. - 2015. - №3. - С. 97-106). В этой связи особое значение приобретают партнеры для конъюгации, способные повысить эффективность презентации фрагментов вакцинных конъюгатов антиген-презентирующими клетками (АПК) (Avci F.Y., Li X., Tsuji М., Kasper D.L. // Nat. Med. - 2011. - V. 17. - P. 1602-1609). Одним из возможных путей достижения данной цели является включение в состав белкового партнера для конъюгации антигенов, специфически распознаваемых и быстро процессируемых клетками иммунной системы, в частности, за счет рецептор-зависимого эндоцитоза в АПК (Bates J.T., Graff А.Н., Phipps J.P., Grayson J.M., Mizel S.B. // J. Immunol. - 2011. - V. 186. - P. 6255-6262).The ongoing paradigm review of the mechanism of the participation of the protein partner in the activation and modification of the immune response to the conjugated polysaccharide antigen dictates new strategies for creating conjugate vaccines that take into account new data on the activation mechanism of T-cell immunity to conjugated antigens (Avci FY // Curr. Top. Curr. Top .Med. Chem. - 2013. - V. 13. - P. 2535-2540; Berti F., Adamo R. // ACS Chem. Biol. - 2013. - V. 8. - P. 1653-1663; Kolesnikov AB, Trump AB, Shemyakin I.G., Dyatlov I.A. // Journal of Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. - 2015. - No. 3. - S. 97-106). In this regard, conjugation partners that are able to increase the efficiency of presentation of vaccine conjugate fragments by antigen-presenting cells (APCs) are of particular importance (Avci FY, Li X., Tsuji M., Kasper DL // Nat. Med. - 2011. - V. 17. - P. 1602-1609). One of the possible ways to achieve this goal is to include in the protein partner for conjugation of antigens that are specifically recognized and rapidly processed by cells of the immune system, in particular, due to receptor-dependent endocytosis in the AIC (Bates JT, Graff A.N., Phipps JP, Grayson JM, Mizel SB // J. Immunol. - 2011 .-- V. 186. - P. 6255-6262).

На объединении свойств специфического антигена и белка, способного усилить процессинг и презентацию АПК фрагментов конъюгированной вакцины, построена ранее не применявшаяся концепция использования слитого белка fliC:pagN в качестве антигена-партнера для конъюгированных сальмонеллезных вакцин, в первую очередь, вакцин, предназначенных для профилактики брюшнотифозной инфекции.By combining the properties of a specific antigen and a protein that can enhance the processing and presentation of APC fragments of a conjugated vaccine, the previously unused concept of using the fusion protein fliC: pagN as a partner antigen for conjugated salmonella vaccines, primarily vaccines intended for the prevention of typhoid infection, is built .

Известен рекомбинантный секретируемый антиген сальмонеллы SseB, который индуцирует сильный Т-клеточный иммунный ответ и может рассматриваться как гомологичный партнер для конъюгированной сальмонеллезной вакцины (Reynolds C.J., Jones С., Blohmke C.J., Darton Т.С., Goudet A., Sergeant R., Maillere В., Pollard A.J., Altmann D.M., Boyton R.J. // Immunology. - 2014. - V. 143. - P. 438-446). Однако SseB это белок, который секретируется уже эндоцитированной сальмонеллой, поэтому, несмотря на обнаружение сильного Т-клеточного ответа к очищенному белку нет гарантий отсутствия у сальмонелл механизма противодействия распознаванию данного антигена, поскольку указанный антиген активно секретируется патогеном и экспонируется в контексте МНС на поверхности клеток в процессе инфекции, не вызывая быстрого и эффективного иммунного ответа на патоген. Кроме того, поздняя секреция SseB не обеспечивает продукцию антител, способных к блокировке инвазии патогена в макрофаги хозяина как наиболее важного аспекта сальмонеллезной инфекции.Known recombinant secreted Salmonella antigen SseB, which induces a strong T-cell immune response and can be considered as a homologous partner for conjugated salmonella vaccine (Reynolds CJ, Jones C., Blohmke CJ, Darton T.C., Goudet A., Sergeant R., Maillere B., Pollard AJ, Altmann DM, Boyton RJ // Immunology. - 2014 .-- V. 143. - P. 438-446). However, SseB is a protein that is secreted by already endocytosed salmonella, therefore, despite the detection of a strong T-cell response to the purified protein, there is no guarantee that Salmonella does not have a mechanism to counteract recognition of this antigen, since this antigen is actively secreted by the pathogen and exposed in the context of MHC on the cell surface in infection process without causing a quick and effective immune response to the pathogen. In addition, late secretion of SseB does not produce antibodies capable of blocking pathogen invasion into host macrophages as the most important aspect of salmonella infection.

Известен способ получения рекомбинантных антигенов для создания конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе генетически детоксифицированного экзотоксина P. aeruginosa (Szu S.C., Taylor D.N., Trofa A.C., Clements J.D., Shiloach J., Sadoff J.C., Bryla D.A., Robbins J.B. // Infect. Immun. - 1994. - V. 62. - P. 4440-4444). Однако, несмотря на многолетние исследования, эффективность данного носителя в качестве модификатора протективного иммунного ответа к Vi-антигену вызывает сомнения (Pier G.B. // Hum. Vaccin. - 2007. - V. 3. - Р. 39-40).A known method of producing recombinant antigens for creating a conjugated typhoid vaccine based on a genetically detoxified exotoxin P. aeruginosa (Szu SC, Taylor DN, Trofa AC, Clements JD, Shiloach J., Sadoff JC, Bryla DA, Robbins JB // Infect. Immun. - 1994. - V. 62. - P. 4440-4444). However, despite many years of research, the effectiveness of this carrier as a modifier of the protective immune response to the Vi antigen is questionable (Pier G.B. // Hum. Vaccin. - 2007. - V. 3. - P. 39-40).

Известен способ получения рекомбинантных антигенов для создания конъюгированной брюшнотифозной вакцины на основе генетически детоксифицированного дифтерийного токсина CRM197 (Micoli F., Rondini S., Pisoni I., Proietti D., Berti F., Costantino P., Rappuoli R., Szu S., Saul A., Martin L.B. // Vaccine. - 2011. - V. 29. - P. 712-720). Несмотря на успех конъюгатов с использованием CRM197 в случае других конъюгированных вакцин и хорошо известные корреляты защиты для таких вакцин, вакцина на основе Vi-CRM до сих пор не прошла клинические испытания.A known method of producing recombinant antigens to create a conjugated typhoid vaccine based on the genetically detoxified diphtheria toxin CRM197 (Micoli F., Rondini S., Pisoni I., Proietti D., Berti F., Costantino P., Rappuoli R., Szu S., Saul A., Martin LB // Vaccine. - 2011 .-- V. 29. - P. 712-720). Despite the success of conjugates using CRM197 in the case of other conjugate vaccines and the well-known protection correlates for such vaccines, the Vi-CRM vaccine has not yet been clinically tested.

Известен способ получения рекомбинантного белка fliC продукцией в Е. coli (Патент US 8449891), однако, помимо того, что белок не содержит второй задействованный в настоящем изобретении белок - активатор иммунного ответа pagN, получаемый по данному способу fliC находится преимущественно в нерастворимой фракции клеточного лизата (тельцах включения), таким образом, получение растворимого белка fliC в данном случае требует процедуры рефолдинга.There is a method for producing recombinant fliC protein by products in E. coli (US Pat. No. 8,449,891), however, in addition to the protein not containing the second protein used in the present invention, the pagN immune response activator obtained by this method, fliC is predominantly in the insoluble fraction of the cell lysate (inclusion bodies), therefore, obtaining a soluble fliC protein in this case requires a refolding procedure.

Известен по существу наиболее близкий к заявленному изобретению способ получения рекомбинантного антигена fliC для последующего создания конъюгированной сальмонеллезной вакцины (Simon R., Wang J.Y., Boyd М.А., Tulapurkar M.E., Ramachandran G., Tennant S.M., Pasetti M., Galen J.E., Levine M.M. // PLoS One. - 2013. - V. 8. - P.e64680). Однако этот способ не использует в полной мере свойства fliC как молекулярного адъюванта с целью индукции антител, физически блокирующих инвазию сальмонелл в макрофаги организма-хозяина, поскольку не формируется слитый белок с другими потенциально нейтрализующими антигенами. Кроме того, антитела к самому fliC, которые могут формироваться в процессе иммунного ответа, не способны к блокировке инвазии патогена в макрофаги организма-хозяина.Known essentially closest to the claimed invention is a method of producing a recombinant fliC antigen for the subsequent creation of a conjugated salmonella vaccine (Simon R., Wang JY, Boyd M.A., Tulapurkar ME, Ramachandran G., Tennant SM, Pasetti M., Galen JE, Levine MM // PLoS One. - 2013. - V. 8. - P.e64680). However, this method does not fully utilize the properties of fliC as a molecular adjuvant to induce antibodies that physically block Salmonella invasion into macrophages of the host organism, since a fusion protein with other potentially neutralizing antigens is not formed. In addition, antibodies to fliC itself, which can be formed during the immune response, are not capable of blocking pathogen invasion into macrophages of the host organism.

Изобретение решает задачу создания способа получения растворимого рекомбинантного химерного белка fliC:pagN, который может быть использован в виде активатора иммунного ответа при разработке и производстве конъюгированных вакцин против брюшнотифозной инфекции и других вакцинных препаратов.The invention solves the problem of creating a method for producing a soluble recombinant chimeric protein fliC: pagN, which can be used as an activator of the immune response in the development and production of conjugated vaccines against typhoid infection and other vaccine preparations.

Поставленная задача решается путем создания способа получения рекомбинантного химерного белка fliC:pagN, включающего конструирование рекомбинантной плазмиды pETfliCpagN длиной 7532 п.н., несущей последовательности, кодирующие белки fliC (включая лидерную последовательность данного белка) и pagN S. typhimurium, разделенные линкерной последовательностью и слитые на 3'-конце с синтетической последовательностью, кодирующей шесть гистидинов, трансформацию клеток Е. coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pETfliCpagN, кодирующей рекомбинантный химерный белок fliC:pagN, культивирование полученного штамма BL-fliCpagN при температуре 37°С и продукцию химерного белка fliC:pagN в Е. coli в течение 10 часов при температуре 20°С, получение периплазматической фракции бактерий-продуцентов обработкой клеток лизоцимом в 20% растворе сахарозы с последующим центрифугированием, очистку химерного белка fliC:pagN из бактериальной периплазмы металл-хелатной, анионообменной и гель-фильтрационной хроматографией с получением гомогенного конечного препарата белка fliC:pagN с выходом не менее 0,3 г белка с литра бактериальной культуры, обладающего 98% чистоты по данным электрофореза и денситометрии и содержащего бактериальный эндотоксин в количестве не более 5 IU/мг.The problem is solved by creating a method for producing a recombinant chimeric protein fliC: pagN, including the construction of a recombinant plasmid pETfliCpagN 7532 bp in length, carrying sequences encoding fliC proteins (including the leader sequence of this protein) and pagN S. typhimurium separated by a linker sequence and fused at the 3'-end with a synthetic sequence encoding six histidines, transformation of E. coli BL21 (DE3) cell expression plasmid DNA pETfliCpagN encoding the recombinant chimeric protein fliC: pagN, cu lactivation of the obtained BL-fliCpagN strain at a temperature of 37 ° C and production of the chimeric fliC: pagN protein in E. coli for 10 hours at a temperature of 20 ° C, obtaining a periplasmic fraction of producer bacteria by treating the cells with lysozyme in a 20% sucrose solution, followed by centrifugation, purification of the chimeric fliC: pagN protein from bacterial periplasm of metal-chelate, anion-exchange, and gel filtration chromatography to obtain a homogeneous final preparation of fliC: pagN protein with a yield of at least 0.3 g of protein from a liter of bacterial culture having about 98% purity according to electrophoresis and densitometry and containing bacterial endotoxin in an amount of not more than 5 IU / mg.

Техническим результатом изобретения является способ продукции и очистки из периплазмы бактерий гомогенного рекомбинантного химерного белка fliC:pagN с чистотой 98%, содержанием бактериального эндотоксина не более 5 IU/мг и выходом 0,3 г с литра бактериальной культуры, применимый для получения больших количеств данного белка - активатора иммунного ответа, пригодного для использования в биотехнологии и фармакологии при разработке и производстве вакцинных препаратов.The technical result of the invention is a method for the production and purification from bacterial periplasm of a homogeneous recombinant chimeric fliC: pagN protein with a purity of 98%, a bacterial endotoxin content of not more than 5 IU / mg and a yield of 0.3 g per liter of bacterial culture, applicable to obtain large quantities of this protein - an activator of the immune response, suitable for use in biotechnology and pharmacology in the development and production of vaccines.

Технический результат изобретения достигается за счет получения последовательностей ДНК, определяющих синтез белков fliC и pagN, при помощи ПЦР с геномной ДНК S. typhimurium с использованием специфических праймеров, кодирующих сайты расщепления эндонуклеазами рестрикции NdeI, SalI, XhoI и линкерную последовательность, объединяющую данные белки в составе химерного белка.The technical result of the invention is achieved by obtaining DNA sequences that determine the synthesis of fliC and pagN proteins using PCR with S. typhimurium genomic DNA using specific primers encoding the restriction endonuclease cleavage sites NdeI, SalI, XhoI and the linker sequence combining these proteins in the composition chimeric protein.

Также технический результат изобретения достигается за счет конструирования векторной плазмиды pETfliCpagN, содержащей промоторную последовательность ДНК бактериофага Т7 и последовательности ДНК, кодирующие белки fliC и pagN S. typhimurium, линкерную последовательность, объединяющую данные белки в составе химерного белка, и синтетическую последовательность шесть гистидинов для очистки белка металл-хелатной хроматографией.The technical result of the invention is also achieved by constructing the vector plasmid pETfliCpagN containing the promoter DNA sequence of the bacteriophage T7 and DNA sequences encoding the fliC and pagN proteins of S. typhimurium, the linker sequence combining these proteins as part of the chimeric protein, and the synthetic sequence of six histidines for protein purification metal chelate chromatography.

Также технический результат изобретения достигается за счет получения штамма BL-fliCpagN на основе штамма E. coli BL21(DE3), трансформированного плазмидной ДНК pETfliCpagN, являющегося продуцентом химерного белка fliC:pagN.The technical result of the invention is also achieved by obtaining a strain of BL-fliCpagN based on E. coli strain BL21 (DE3) transformed with the plasmid DNA pETfliCpagN, which is a producer of the chimeric protein fliC: pagN.

Также технический результат изобретения достигается за счет продукции рекомбинантного химерного белка fliC:pagN в бактериях Е. coli штамма BL-fliCpagN в течение 10 часов при температуре 20°С, что обеспечивает накопление рекомбинантного белка в периплазме бактерий преимущественно в растворенном состоянии.The technical result of the invention is also achieved through the production of the recombinant chimeric protein fliC: pagN in the bacteria E. coli strain BL-fliCpagN for 10 hours at a temperature of 20 ° C, which ensures the accumulation of the recombinant protein in the periplasm of bacteria mainly in the dissolved state.

Также технический результат изобретения достигается получением периплазматической фракции бактериальных белков за счет процедуры обработки бактерий лизоцимом в присутствии 20% раствора сахарозы, что приводит к разрушению клеточной стенки и разделению периплазмы и сферопластов бактерий.The technical result of the invention is also achieved by obtaining the periplasmic fraction of bacterial proteins due to the treatment of bacteria with lysozyme in the presence of a 20% sucrose solution, which leads to the destruction of the cell wall and the separation of the periplasm and spheroplasts of bacteria.

Также технический результат изобретения достигается благодаря схеме хроматографической очистки химерного белка fliC:pagN, включающей этапы металл-хелатной хроматографии на колонке с иммобилизованным бивалентным металлом, анионообменной и гель-фильтрационной хроматографии, позволяющей получить гомогенный белок, характеризующийся 98% чистотой по данным электрофореза и денситометрии и содержанием бактериального эндотоксина не более 5 IU/мг белка.The technical result of the invention is also achieved due to the chromatographic purification scheme of the fliC: pagN chimeric protein, which includes the steps of metal chelate chromatography on a column with immobilized bivalent metal, anion exchange and gel filtration chromatography, which allows one to obtain a homogeneous protein characterized by 98% purity according to electrophoresis and densitometry and the content of bacterial endotoxin is not more than 5 IU / mg protein.

Отличием предлагаемого способа является высокий выход растворимого рекомбинантного белка fliC:pagN (0,3 г с литра бактериальной культуры), достигаемый за счет особенностей конструирования продуцента BL-fliCpagN и понижения температуры его культивации при синтезе химерного белка fliC:pagN. Необходимо отметить, что в большинстве случаев при продукции белка fliC в Е. coli происходит его накопление в цитоплазме бактерий в виде телец включения (Патенты WO 2007125535, US 8449891).The difference of the proposed method is the high yield of soluble recombinant protein fliC: pagN (0.3 g per liter of bacterial culture), achieved due to the design features of the producer BL-fliCpagN and lowering the temperature of its cultivation in the synthesis of the chimeric protein fliC: pagN. It should be noted that in most cases, during the production of fliC protein in E. coli, it accumulates in the bacterial cytoplasm in the form of inclusion bodies (Patents WO 2007125535, US 8449891).

В предлагаемом техническом решении химерный белок fliC:pagN синтезируется бактериями в растворимой форме с нативной N-концевой последовательностью флагеллина, что способствует корректному фолдингу данного домена химерного белка и оказывается возможным благодаря направленному накоплению fliC:pagN в периплазме бактерий, сопровождающемуся отщеплением лидерной последовательности fliC S. typhimurium.In the proposed technical solution, the chimeric fliC: pagN protein is synthesized by bacteria in soluble form with the native N-terminal flagellin sequence, which contributes to the correct folding of this chimeric protein domain and is possible due to the directed accumulation of fliC: pagN in bacterial periplasm, accompanied by cleavage of the fliC S. leader sequence typhimurium.

Предлагаемое техническое решение предусматривает проведение трех этапов хроматографической очистки, включая металл-хелатную хроматографию на смоле с иммобилизованными ионами кобальта, а также анионообменную и гель-фильтрационную хроматографии, обеспечивающих получение гомогенного химерного белка fliC:pagN с высокой степенью чистоты (до 98% по данным денситометрии).The proposed technical solution provides for three stages of chromatographic purification, including metal chelate chromatography on a resin with immobilized cobalt ions, as well as anion exchange and gel filtration chromatography, providing a homogeneous chimeric protein fliC: pagN with a high degree of purity (up to 98% according to densitometry )

Существенным достоинством предлагаемого способа получения рекомбинантного химерного белка fliC:pagN является низкий уровень содержания бактериального эндотоксина в конечном препарате (5 IU/мг белка), допустимый для применения в инъекциях как по российским, так и по международным стандартам (XII издание Государственной фармакопеи Российской Федерации; Международная фармакопея ВОЗ, документ QAS/11.452 FINAL, июль 2012 г.). Таким образом, полученный по данному способу рекомбинантный белок fliC:pagN пригоден для разработки и производства вакцин.A significant advantage of the proposed method for producing recombinant chimeric fliC: pagN protein is the low level of bacterial endotoxin in the final preparation (5 IU / mg protein), which is acceptable for injection both according to Russian and international standards (XII edition of the State Pharmacopoeia of the Russian Federation; WHO International Pharmacopoeia, document QAS / 11.452 FINAL, July 2012). Thus, the recombinant fliC: pagN protein obtained by this method is suitable for the development and production of vaccines.

Изобретение осуществляют следующим образом.The invention is as follows.

Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pETfliCpagN на основе коммерчески доступной плазмиды pET22b(+) (Novagen, США). Фрагменты ДНК, кодирующие флагеллин fliC и мембранный белок pagN, получают прямым ПЦР с генома S. typhimurium с использованием праймеров FliC_FNde/FliC_RSal и PagN_FSal/PagN_RXho, представленных на Фиг. 1. В составе последовательности ДНК, кодирующей флагеллин, амплифицируют лидерный пептид, определяющий транслокацию предшественника флагеллина в периплазму бактерий. В состав праймеров, примененных для амплификации, вводят кодоны, определяющие синтез линкерного пептида GSVDSSSGGN. Также в состав праймеров вводят сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI (5'-конец фрагмента ДНК, кодирующего ген fliC, праймер FliC_FNde), SalI (3'-конец фрагмента ДНК, кодирующего ген fliC - FliC_RSal, 5'-конец фрагмента ДНК, кодирующего ген pagN - PagN_FSal) и XhoI (3'-конец фрагмента ДНК, кодирующего ген pagN - PagN_RXho).Recombinant plasmid DNA pETfliCpagN was constructed based on the commercially available plasmid pET22b (+) (Novagen, USA). DNA fragments encoding flagellin fliC and pagN membrane protein were obtained by direct PCR from the S. typhimurium genome using the FliC_FNde / FliC_RSal and PagN_FSal / PagN_RXho primers shown in FIG. 1. As part of the DNA sequence encoding flagellin, the leader peptide is amplified, which determines the translocation of the flagellin precursor into bacterial periplasm. The primers used for amplification introduce codons that determine the synthesis of the GSVDSSSGGN linker peptide. NdeI restriction endonucleases sites (5'-end of the DNA fragment encoding the fliC gene, FliC_FNde primer), SalI (3'-end of the DNA fragment encoding the fliC gene - FliC_RSal, 5'-end of the DNA fragment encoding the pagN gene are also introduced into the primers - PagN_FSal) and XhoI (3'-end of the DNA fragment encoding the pagN gene - PagN_RXho).

Полученные фрагменты ДНК расщепляют соответствующими эндонуклеазами рестрикции (NdeI и SalI - фрагмент fliC; SalI и XhoI - фрагмент pagN) и затем последовательно клонируют в плазмиду pET22b(+). Единичные клоны, содержащие инсерты fliC (1500 п.н.) и pagN (700 п.н.), идентифицируют при помощи ПЦР с праймеров T7forward и T7reverse (Sigma-Aldrich, США). Выделяют плазмидную ДНК и верифицируют корректность встроенных последовательностей ДНК методом капиллярного секвенирования. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности экспрессионной конструкции, кодирующей продукцию химерного белка fliC:pagN, представлены на Фиг. 2. Структура экспрессионной конструкции для продукции химерного белка fliC:pagN представлены на Фиг. 3.The obtained DNA fragments were digested with the corresponding restriction endonucleases (NdeI and SalI - fliC fragment; SalI and XhoI - pagN fragment) and then sequentially cloned into the plasmid pET22b (+). Single clones containing fliC (1500 bp) and pagN (700 bp) insert were identified by PCR from T7forward and T7reverse primers (Sigma-Aldrich, USA). Plasmid DNA is isolated and the correctness of the inserted DNA sequences is verified by capillary sequencing. The nucleotide and amino acid sequences of the expression construct encoding the production of the chimeric fliC: pagN protein are shown in FIG. 2. The structure of the expression construct for the production of the chimeric fliC: pagN protein is shown in FIG. 3.

Плазмидой pETfliCpagN трансформируют клетки штамма Е. coli BL21(DE3) и получают единичные колонии продуцента белка fliC:pagN (BL-fliCpagN). На основании аналитической экспрессии и определения уровня содержания рекомбинантного белка в периплазматической фракции выделяют клоны-суперпродуценты белка. Проводят препаративную экспрессию белка клонов-суперпродуцентов. Для этого бактериальные клоны выращивают в течение ночи в среде 2xYT, содержащей ампициллин и 1% глюкозы, 10 мл ночной культуры помещают в 1 литр свежей среды, содержащей 0,1% глюкозы и ампициллин, и наращивают культуру до достижения 1 единицы оптической плотности. Культуру охлаждают до 20°С и индуцируют синтез белка добавлением 0,2 мМ ИПТГ. Экспрессию белка fliC:pagN проводят при 20°С в течение 10 часов. Бактериальную биомассу собирают центрифугированием, анализируют продукцию белка электрофоретически (Фиг. 4) и хранят при -70°С.Plasmid pETfliCpagN transform cells of E. coli strain BL21 (DE3) to obtain single colonies of the producer of the protein fliC: pagN (BL-fliCpagN). Based on analytical expression and determination of the level of recombinant protein in the periplasmic fraction, clones of superproducers of the protein are isolated. The preparative expression of the protein of super producer clones is carried out. To do this, bacterial clones are grown overnight in 2xYT medium containing ampicillin and 1% glucose, 10 ml of overnight culture is placed in 1 liter of fresh medium containing 0.1% glucose and ampicillin, and the culture is grown until 1 unit of optical density is reached. The culture is cooled to 20 ° C and protein synthesis is induced by the addition of 0.2 mM IPTG. The expression of fliC: pagN protein is carried out at 20 ° C for 10 hours. Bacterial biomass is collected by centrifugation, protein production is analyzed electrophoretically (Fig. 4) and stored at -70 ° C.

Выделение белка fliC:pagN проводят при температуре +4°С из периплазматической фракции бактерий. Для получения бактериальной периплазмы 50 г бактериальной биомассы суспендируют в 100 мл раствора, содержащего 20% сахарозы, 30 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ хлорида натрия, ингибитор протеаз Complete (Roche Life Sciences, США) и 100 мкг/мл лизоцима, и выдерживают 30 минут во льду с периодическим встряхиванием. Сферопласты отделяют от периплазматической фракции центрифугированием в течение 30 минут при 10000 g.Isolation of fliC: pagN protein is carried out at a temperature of + 4 ° C from the periplasmic fraction of bacteria. To obtain bacterial periplasm, 50 g of bacterial biomass is suspended in 100 ml of a solution containing 20% sucrose, 30 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM sodium chloride, Complete protease inhibitor (Roche Life Sciences, USA) and 100 μg / ml lysozyme, and incubated for 30 minutes in ice with occasional shaking. Spheroplasts are separated from the periplasmic fraction by centrifugation for 30 minutes at 10,000 g.

Белок fliC:pagN выделяют из периплазматической фракции металл-хелатной хроматографией на колонке Talon (Clontech, США) в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 8 и 100 мМ хлорида натрия. Элюцию белка с колонки проводят буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ хлорида натрия, 250 мМ имидазола.Protein fliC: pagN was isolated from the periplasmic fraction by metal-chelate chromatography on a Talon column (Clontech, USA) in a buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 8 and 100 mM sodium chloride. The elution of the protein from the column is carried out with a buffer containing 20 mm Tris-HCl pH 8, 100 mm sodium chloride, 250 mm imidazole.

Очистку белка проводят анионообменной хроматографией на колонке Q-Sepharose (GE Healthcare, США). Белок разводят в 10 раз на буфер, содержащий 20 мМ трис-HCl рН 8, 20 мМ хлорида натрия, наносят на колонку, уравновешенную тем же буфером, и элюируют градиентом хлорида натрия от 20 до 500 мМ в течение 60 минут. Фракции, содержащие белок fliC:pagN, идентифицируют электрофорезом в 10% ПААГ, концентрируют при помощи центрифужных концентраторов Amicon Ultra-15 (Millipore, США) и наносят на гель-фильтрационную колонку Superdex 200 10/300 GL, уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 150 мМ хлорида натрия. Фракции, содержащие целевой белок, определяют электрофоретически, объединяют и концентрируют. Препарат белка fliC:pagN хранят в аликвотах при температуре -70°С.Protein purification is carried out by anion exchange chromatography on a Q-Sepharose column (GE Healthcare, USA). Protein is diluted 10 times on a buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM sodium chloride, applied to a column equilibrated with the same buffer, and eluted with a sodium chloride gradient from 20 to 500 mM for 60 minutes. Fractions containing fliC: pagN protein were identified by electrophoresis in 10% PAG, concentrated using an Amicon Ultra-15 centrifuge concentrator (Millipore, USA) and applied to a Superdex 200 10/300 GL gel filtration column, equilibrated with a buffer containing 20 mM Tris -HCl pH 7.5, 150 mM sodium chloride. Fractions containing the target protein are determined electrophoretically, combined and concentrated. The protein preparation fliC: pagN is stored in aliquots at a temperature of -70 ° C.

Измерение концентрации белка в полученном препарате проводят по методу Брэдфорд. Выход рекомбинантного белка fliC:pagN составляет 0,3 г с литра бактериальной культуры. Чистоту полученного белкового препарата анализируют электрофорезом в 10% ПААГ с денситометрией, гомогенность препарата оценивают при помощи HPLC-SEC (Фиг. 5, 6). Чистота полученного препарата fliC:pagN по данным денситометрии составляет 98%, препарат гомогенен по данным HPLC-SEC. Иммунологическую идентичность подтверждают Вестерн-блотом с окрашиванием моноклональными антителами к флагеллину S. typhimurium (Фиг. 7). Содержание эндотоксина в конечном препарате белка fliC:pagN составляет менее 5 IU/мг. N-концевым секвенированием верифицируют отсутствие лидерного пептида на N-конце рекомбинантного белка.Measurement of protein concentration in the resulting preparation is carried out according to the Bradford method. The yield of the recombinant protein fliC: pagN is 0.3 g per liter of bacterial culture. The purity of the obtained protein preparation was analyzed by electrophoresis in 10% PAAG with densitometry, the homogeneity of the preparation was evaluated using HPLC-SEC (Fig. 5, 6). The purity of the obtained preparation fliC: pagN according to densitometry is 98%, the preparation is homogeneous according to HPLC-SEC. Immunological identity was confirmed by Western blot staining with monoclonal antibodies to S. typhimurium flagellin (Fig. 7). The endotoxin content in the final fliC: pagN protein preparation is less than 5 IU / mg. N-terminal sequencing verifies the absence of a leader peptide at the N-terminus of the recombinant protein.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы.The invention is illustrated by the following graphic materials.

Фиг. 1. Последовательности праймеров, использованных при получении экспрессионной конструкции химерного рекомбинантного белка fliC:pagN для продукции в клетках Е. coli.FIG. 1. The sequence of the primers used to obtain the expression constructs of the chimeric recombinant protein fliC: pagN for production in E. coli cells.

Фиг. 2. Нуклеотидная последовательность, кодирующая продукцию белка fliC:pagN и аминокислотная последовательность белка fliC:pagN. А - Нуклеотидная последовательность, кодирующая продукцию белка fliC:pagN; В - аминокислотная последовательность белка fliC:pagN; С - полная последовательность экспрессионной плазмиды pETfliCpagN.FIG. 2. The nucleotide sequence encoding the production of fliC: pagN protein and the amino acid sequence of fliC: pagN protein. A - The nucleotide sequence encoding the production of protein fliC: pagN; B is the amino acid sequence of fliC: pagN protein; C is the complete sequence of the expression plasmid pETfliCpagN.

Фиг. 3. Карта экспрессионной конструкции, использованной для получения химерного рекомбинантного белка fliC:pagN в клетках Е. coli.FIG. 3. Map of the expression construct used to produce the chimeric recombinant fliC: pagN protein in E. coli cells.

Фиг. 4. Продукция слитого химерного рекомбинантного белка fliC:pagN в клетках Е. coli. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder, Thermo Scientific, USA), дорожка 2 - периплазматическая фракция клеток BL-fliCpagNFIG. 4. Production of fused chimeric recombinant protein fliC: pagN in E. coli cells. Lane 1 — molecular weight marker (Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder, Thermo Scientific, USA), lane 2 — periplasmic fraction of BL-fliCpagN cells

Фиг. 5. Результаты выделения и очистки химерного рекомбинантного белка fliC:pagN. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы SM0671 (Thermo Scientific, США), дорожка 2 - белок fliC:pagN, очищенный из периплазматической фракции металл-хелатной хроматографией на колонке Talon (Clontech, США), дорожка 3 - белок fliC:pagN, очищенный анионообменной хроматографией на колонке Q-Sepharose (GE Healthcare, США), дорожка 4 - белок fliC:pagN, очищенный гель-фильтрационной хроматографией на колонке Superdex 200 (GE Healthcare, США).FIG. 5. Results of isolation and purification of the chimeric recombinant protein fliC: pagN. Lane 1 — molecular weight marker SM0671 (Thermo Scientific, USA), lane 2 — fliC: pagN protein purified from the periplasmic fraction by metal-chelate chromatography on a Talon column (Clontech, USA), lane 3 — fliC: pagN protein purified by anion exchange chromatography on a Q-Sepharose column (GE Healthcare, USA), lane 4 — fliC: pagN protein purified by gel filtration chromatography on a Superdex 200 column (GE Healthcare, USA).

Фиг. 6. Вестерн-блот по окрашиванию полученного рекомбинантного белка fliC:pagN моноклональными антителами к fliC. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы SM0671 (Thermo Scientific, США), дорожка 2 - белок fliC:pagN, окрашенный моноклональными антителами Anti-Flagellin FliC antibody (Invivogen, США).FIG. 6. Western blot for staining the resulting recombinant fliC protein: pagN with monoclonal antibodies to fliC. Lane 1 — molecular weight marker SM0671 (Thermo Scientific, USA), lane 2 — fliC: pagN protein stained with Anti-Flagellin FliC antibody monoclonal antibodies (Invivogen, USA).

Фиг. 7. Результаты HPLC-SEC очищенного препарата рекомбинантного белка fliC:pagN.FIG. 7. Results of HPLC-SEC purified fliC recombinant protein preparation: pagN.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.

Пример 1. Создание экспрессионной конструкции для продукции химерного рекомбинантного белка fliC:pagN.Example 1. The creation of an expression construct for the production of chimeric recombinant protein fliC: pagN.

Для получения геномной ДНК бактерии S. typhimurium культивируют в течение ночи в 10 мл среды 2xYT при 37°С и собирают центрифугированием. Бактериальную биомассу замораживают в жидком азоте, размораживают и суспендируют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, 50 мМ хлорида натрия, 70 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 20 мкг/мл лизоцима. Обработку лизоцимом проводят в течение 15 минут при +4°С, после чего к суспензии добавляют двухкратный объем раствора, содержащего 1% додецилсульфата натрия и 0,2 М NaOH и инкубируют при +4°С в течение 10 минут до появления вязкости. Полученный лизат троекратно экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1:1 v/v) с промежуточным центрифугированием при 20000 g и отбором водной фазы. К водной фазе после третьего раунда экстракции добавляют 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и 3 объема изопропанола, инкубируют смесь при +4°С в течение 30 минут и отделяют осадок центрифугированием при 20000 g. Полученный осадок промывают 80% этанолом, подсушивают и растворяют в 100 мкл бидистиллированной воды.To obtain genomic DNA, S. typhimurium bacteria were cultured overnight in 10 ml of 2xYT medium at 37 ° C and collected by centrifugation. Bacterial biomass is frozen in liquid nitrogen, thawed and suspended in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 50 mM sodium chloride, 70 mM glucose, 10 mM EDTA, 20 μg / ml lysozyme. Lysozyme treatment is carried out for 15 minutes at + 4 ° C, after which a twofold volume of a solution containing 1% sodium dodecyl sulfate and 0.2 M NaOH is added to the suspension and incubated at + 4 ° C for 10 minutes until a viscosity appears. The resulting lysate was extracted three times with a phenol / chloroform mixture (1: 1 v / v) with intermediate centrifugation at 20,000 g and selection of the aqueous phase. After the third round of extraction, 1/10 volume of sodium acetate pH 5.2 and 3 volumes of isopropanol are added to the aqueous phase, the mixture is incubated at + 4 ° C for 30 minutes, and the precipitate is separated by centrifugation at 20,000 g. The resulting precipitate was washed with 80% ethanol, dried and dissolved in 100 μl bidistilled water.

Фрагменты ДНК, кодирующие флагеллин fliC и мембранный белок pagN, получают ПЦР-амплификацией с геномной ДНК S. typhimurium с использованием пар праймеров FliC_FNde/FliC_RSal и PagN_FSal/PagN_RXho. ПЦР-амплификацию проводят с понижением температуры отжига праймеров с 65°С до 54°С (1°С на каждом цикле), после чего проводят дополнительно 20 циклов амплификации при температуре отжига праймеров 60°С. В состав праймеров введены сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI (5'-конец фрагмента ДНК, кодирующего ген fliC, праймер FliC_FNde), SalI (3'-конец фрагмента ДНК, кодирующего ген fliC - FliC_RSal, 5'-конец фрагмента ДНК, кодирующего ген pagN - PagN_FSal) и XhoI (3'-конец фрагмента ДНК, кодирующего ген pagN - PagN_RXho). В ПЦР-реакции содержится 20 рМ каждого праймера и 1 мкг геномной ДНК. Полученные продукты реакции анализируют электрофоретически в агарозном геле на наличие фрагментов ДНК длиной 1500 п.н. (fliC) и 700 п.н. (pagN).DNA fragments encoding flagellin fliC and pagN membrane protein are obtained by PCR amplification with S. typhimurium genomic DNA using the FliC_FNde / FliC_RSal and PagN_FSal / PagN_RXho primer pairs. PCR amplification is carried out with decreasing the annealing temperature of the primers from 65 ° C to 54 ° C (1 ° C in each cycle), after which an additional 20 cycles of amplification are carried out at annealing temperature of the primers of 60 ° C. The primers were introduced restriction endonuclease sites NdeI (5'-end of the DNA fragment encoding the fliC gene, primer FliC_FNde), SalI (3'-end of the DNA fragment encoding the fliC gene - FliC_RSal, 5'-end of the DNA fragment encoding the pagN gene - PagN_FSal) and XhoI (3'-end of the DNA fragment encoding the pagN gene - PagN_RXho). The PCR reaction contains 20 rM of each primer and 1 μg of genomic DNA. The resulting reaction products are analyzed electrophoretically in an agarose gel for the presence of DNA fragments with a length of 1500 bp. (fliC) and 700 bp (pagN).

Полученные с помощью ПЦР фрагменты ДНК обрабатывают эндонуклеазами рестрикции (NdeI и SalI - фрагмент fliC; SalI и XhoI - фрагмент pagN), разделяют в агарозном геле, вырезают из геля и очищают от контаминаций при помощи набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, UK). На первом этапе проводят клонирование фрагмента fliC в вектор pET22b(+), расщепленный по сайтам эндонуклеаз рестрикции NdeI и SalI. Единичные клоны, содержащие плазмиду pET22b(+) со встроенным фрагментом флагеллина S. typhimurium получают электротрансформацией клеток штамма Е. coli DH12S (Thermo Fisher Scientific, США). Клоны, содержащие инсерт длиной 1500 п.н., идентифицируют при помощи ПЦР с праймеров T7forward и T7reverse (Sigma-Aldrich, США). Выделяют плазмидную ДНК pETfliC и верифицируют корректность встроенной последовательности гена fliC методом капиллярного секвенирования.Obtained by PCR DNA fragments are treated with restriction endonucleases (NdeI and SalI - fliC fragment; SalI and XhoI - pagN fragment), separated on an agarose gel, excised from the gel and purified from contamination using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, UK). At the first stage, the fliC fragment is cloned into the pET22b (+) vector cleaved at the restriction endonuclease sites NdeI and SalI. Single clones containing the plasmid pET22b (+) with an integrated S. typhimurium flagellin fragment were obtained by electrotransformation of E. coli strain DH12S cells (Thermo Fisher Scientific, USA). Clones containing 1500 bp insert were identified by PCR from T7forward and T7reverse primers (Sigma-Aldrich, USA). PETfliC plasmid DNA was isolated and the correctness of the inserted fliC gene sequence was verified by capillary sequencing.

Полученную плазмиду pETfliC расщепляют по сайтам SalI и XhoI и лигируют с полученным ПЦР-фрагментом pagN, расщепленным по концевым сайтам соответствующих эндонуклеаз рестрикции. Электротрансформацией получают единичные клоны DH12S-pETfliCpagN и анализируют наличие встроенного фрагмента pagN с проверкой его корректной ориентации в конструкции по наличию инсерта 700 п.н. при помощи ПЦР с праймеров T7forward/PagN_RXho.The resulting plasmid pETfliC was cleaved at the SalI and XhoI sites and ligated with the obtained pagN PCR fragment cleaved at the terminal sites of the corresponding restriction endonucleases. Single clones of DH12S-pETfliCpagN are obtained by electrotransformation and the presence of an integrated pagN fragment is analyzed with verification of its correct orientation in the structure by the presence of an insert of 700 bp. using PCR with T7forward / PagN_RXho primers.

Праймеры, используемые для ПЦР-амплификации, содержат сайты эндонуклеаз рестрикции NdeI (N-конец гена, праймер MBP_FNde), NheI и XhoI (С-конец гена, праймер MBP_RNheXho). Выделяют плазмидную ДНК pETfliCpagN и верифицируют корректность встроенной последовательности гена pagN методом капиллярного секвенирования.The primers used for PCR amplification contain NdeI restriction endonuclease sites (N-terminus of the gene, MBP_FNde primer), NheI and XhoI (C-terminus of the gene, MBP_RNheXho primer). PETfliCpagN plasmid DNA was isolated and the correctness of the inserted pagN gene sequence was verified by capillary sequencing.

Пример 2. Получение продуцентов и продукция химерного рекомбинантного белка fliC:pagN в Е. coli.Example 2. Obtaining producers and production of the chimeric recombinant protein fliC: pagN in E. coli.

Штамм-продуцент Е. coli BL-fliCpagN получают электротрансформацией компетентных клеток Е. coli BL21(DE3) плазмидой pETfliCpagN. Проводят аналитическую экспрессию единичных клонов BL21(DE3), несущих плазмиду pETfliCpagN. Для этого едничные колонии Е. coli BL-fliCpagN выращивают в течение ночи при 37°С в 5 мл среды 2xYT с добавлением 1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, засевают 100 мкл ночной культуры в 10 мл среды 2xYT, содержащей 0.1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37°С в течение 3 часов. Выросшие культуры охлаждают до 20°С, добавляют ИПТГ до 0,2 мМ и проводят экспрессию 10 часов при температуре 20°С. Бактериальные клетки с 5 мл культуры продуцента собирают центрифугированием при 5000 об/мин 10 минут и выделяют периплазматическую фракцию. Для выделения периплазматической фракции бактериальную биомассу суспендируют в 1 мл раствора, содержащего 30 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ хлорида натрия, ингибитор протеаз Complete (Roche Life Sciences, США) и 100 мкг/мл лизоцима, и выдерживают 30 минут во льду с периодическим встряхиванием. Сферопласты отделяют от периплазматической фракции центрифугированием в течение 30 минут при 12000 об/мин, и отбирают равные аликвоты на электрофорез. Анализируют уровень содержания белка fliC:pagN в периплазматической фракции денатурирующим электрофорезом в 12% полиакриламидном геле. После окончания электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Typhoon FLA9500 (GE Healthcare, США). Клоны, обнаруживающие наибольший выход белка (образование на геле яркой полосы с молекулярной массой 75 кДа), являются суперпродуцентами, их выращивают на богатой среде (2xYT) в течение ночи, добавляют глицерин до 15% и замораживают при -70°С для хранения.The E. coli BL-fliCpagN producing strain is obtained by electro-transformation of competent E. coli BL21 (DE3) cells with the plasmid pETfliCpagN. Analytical expression of single BL21 clones (DE3) carrying the pETfliCpagN plasmid was performed. For this, single E. coli BL-fliCpagN colonies are grown overnight at 37 ° C in 5 ml of 2xYT medium with the addition of 1% glucose and 50 μg / ml ampicillin, 100 μl of overnight culture in 10 ml of 2xYT medium containing 0.1% glucose are inoculated and 50 μg / ml ampicillin, and grown at 37 ° C for 3 hours. The grown cultures are cooled to 20 ° C, IPTG is added to 0.2 mM and expression is carried out for 10 hours at a temperature of 20 ° C. Bacterial cells with 5 ml of producer culture are harvested by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes and the periplasmic fraction is isolated. To isolate the periplasmic fraction, the bacterial biomass is suspended in 1 ml of a solution containing 30 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM sodium chloride, Complete protease inhibitor (Roche Life Sciences, USA) and 100 μg / ml lysozyme, and incubated for 30 minutes in ice with periodic shaking. Spheroplasts are separated from the periplasmic fraction by centrifugation for 30 minutes at 12,000 rpm, and equal aliquots for electrophoresis are selected. The level of fliC: pagN protein in the periplasmic fraction was analyzed by denaturing electrophoresis in a 12% polyacrylamide gel. After electrophoresis, the gel was stained with Coomassie R-250 according to standard methods and scanned using a Typhoon FLA9500 densitometer (GE Healthcare, USA). Clones exhibiting the highest protein yield (gel formation of a bright band with a molecular weight of 75 kDa) are superproducers, they are grown in rich medium (2xYT) overnight, glycerol is added up to 15% and frozen at -70 ° C for storage.

Для препаративной экспрессии штаммы-суперпродуценты Е. coli BL-fliCpagN выращивают в течение ночи при 37°С с добавлением 1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина на среде 2xYT, помещают 10 мл ночной культуры в 1000 мл среды 2xYT, содержащей 0.1% глюкозы и 50 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37°С до достижения 1 единицы оптической плотности. Выросшую культуру охлаждают до 20°С, добавляют ИПТГ до 0,2 мМ и проводят экспрессию 10 часов при 20°С. Далее клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин 10 минут и хранят в виде замороженных осадков при температуре -70°С.For preparative expression, super-producer strains of E. coli BL-fliCpagN are grown overnight at 37 ° C with 1% glucose and 50 μg / ml ampicillin in 2xYT medium, 10 ml of overnight culture in 1000 ml of 2xYT medium containing 0.1% glucose are placed and 50 μg / ml ampicillin, and grown at 37 ° C to achieve 1 unit of optical density. The grown culture is cooled to 20 ° C. IPTG is added to 0.2 mM and expression is carried out for 10 hours at 20 ° C. Next, the cells are collected by centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes and stored in the form of frozen precipitates at a temperature of -70 ° C.

Пример 3. Выделение и очистка химерного рекомбинантного белка fliC:pagN из бактериальной биомассы.Example 3. Isolation and purification of the chimeric recombinant protein fliC: pagN from bacterial biomass.

Выделение белка fliC:pagN и хроматографические процедуры проводят при температуре +4°С. Выделение и очистку белка осуществляют из периплазматической фракции Е. coli. Для получения периплазматической фракции 50 г бактериальной биомассы суспендируют в 100 мл раствора, содержащего 20% сахарозы, 30 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ хлорида натрия, ингибитор протеаз Complete EDTA-free (Roche Life Sciences, США) и 100 мкг/мл лизоцима, и инкубируют 30 минут во льду с периодическим встряхиванием. Сферопласты отделяют от периплазматической фракции центрифугированием в течение 30 минут при 10000 g.Isolation of fliC: pagN protein and chromatographic procedures are carried out at a temperature of + 4 ° C. Isolation and purification of the protein is carried out from the periplasmic fraction of E. coli. To obtain the periplasmic fraction, 50 g of bacterial biomass are suspended in 100 ml of a solution containing 20% sucrose, 30 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM sodium chloride, Complete EDTA-free protease inhibitor (Roche Life Sciences, USA) and 100 μg / ml lysozyme, and incubated for 30 minutes in ice with periodic shaking. Spheroplasts are separated from the periplasmic fraction by centrifugation for 30 minutes at 10,000 g.

Раствор белков периплазмы наносят на металл-хелатную колонку Talon (Clontech, США) в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl рН 8 и 100 мМ хлорида натрия. Промывают колонку 10 объемами того же буфера. Элюцию белка с колонки проводят буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 8, 100 мМ хлорида натрия, 250 мМ имидазола, и с помощью электрофореза выявляют фракции, содержащие очищенный белок fliC:pagN.A solution of periplasm proteins is applied to a Talon metal-chelate column (Clontech, USA) in a buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 8 and 100 mM sodium chloride. Wash the column with 10 volumes of the same buffer. The protein was eluted from the column with a buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM sodium chloride, 250 mM imidazole, and fractions containing purified fliC: pagN protein were detected by electrophoresis.

Белок, элюированный с металл-хелатного сорбента, разводят в 10 раз на буфер, содержащий 20 мМ трис-HCl рН 8, 20 мМ хлорида натрия и наносят на анионообменную колонку Q-Sepharose (GE Healthcare, США), уравновешенную тем же буфером. Элюируют белок градиентом хлорида натрия от 20 до 500 мМ на том же буфере в течение 60 минут. Фракции, содержащие очищенный белок fliC:pagN, определяют электрофорезом в 10% ПААГ, собирают и концентрируют при помощи центрифужных концентраторов Amicon Ultra-15 (Millipore, США).The protein eluted from the metal chelate sorbent is diluted 10 times onto a buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM sodium chloride and applied to a Q-Sepharose anion exchange column (GE Healthcare, USA), equilibrated with the same buffer. Elute the protein with a gradient of sodium chloride from 20 to 500 mM in the same buffer for 60 minutes. Fractions containing purified fliC: pagN protein were determined by electrophoresis in 10% PAG, collected and concentrated using Amicon Ultra-15 centrifuge concentrators (Millipore, USA).

Сконцентрированный белок наносят на гель-фильтрационную колонку Superdex 200 10/300 GL, уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 150 мМ хлорида натрия. Фракции, содержащие целевой белок, определяют электрофоретически, объединяют и концентрируют. Препарат белка fliC:pagN хранят в аликвотах при температуре -70°С.The concentrated protein is applied to a Superdex 200 10/300 GL gel filtration column, equilibrated with a buffer containing 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM sodium chloride. Fractions containing the target protein are determined electrophoretically, combined and concentrated. The protein preparation fliC: pagN is stored in aliquots at a temperature of -70 ° C.

Пример 4. Валидация препарата химерного рекомбинантного белка fliC:pagN для применения при разработке вакцин.Example 4. Validation of the preparation of the chimeric recombinant protein fliC: pagN for use in the development of vaccines.

Измерение концентрации белка в полученном препарате проводят по методу Брэдфорд с использованием набора Quick Start™ Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США). Выход рекомбинантного белка fliC:pagN составляет 0,3 г с литра бактериальной культуры.Protein concentration in the obtained preparation was measured by the Bradford method using the Quick Start ™ Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad, USA). The yield of the recombinant protein fliC: pagN is 0.3 g per liter of bacterial culture.

Чистоту полученного белкового препарата анализируют электрофорезом в 10% денатурирующем ПААГ. После прохождения электрофореза гель окрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Typhoon FLA9500 (GE Healthcare, США). Чистота полученного препарата fliC:pagN по данным денситометрии составляет 98%.The purity of the obtained protein preparation was analyzed by electrophoresis in 10% denaturing PAAG. After electrophoresis, the gel was stained with Coomassie R-250 according to standard methods and scanned using a Typhoon FLA9500 densitometer (GE Healthcare, USA). The purity of the obtained preparation fliC: pagN according to densitometry is 98%.

Гомогенность препарата белка fliC:pagN тестируют при помощи хроматографии высокого давления HPLC-SEC. HPLC-SEC проводят с использованием колонки Waters BioSuite High Resolution. 100 мкг белка наносят на колонку в буфере, содержащем 100 мМ фосфата натрия, рН 6.5. Единственный пик на хроматограмме свидетельствует о гомогенности препарата белка fliC:pagN и отсутствии контаминаций.The homogeneity of the fliC: pagN protein preparation was tested by HPLC-SEC high pressure chromatography. HPLC-SEC is performed using a Waters BioSuite High Resolution column. 100 μg of protein is applied to the column in a buffer containing 100 mM sodium phosphate, pH 6.5. The only peak in the chromatogram indicates the homogeneity of the fliC: pagN protein preparation and the absence of contamination.

Иммунологическую идентичность подтверждают Вестерн-блотом с окрашиванием моноклональными антителами к флагеллину S. typhimurium. Белок после электрофореза в денатурирующем геле полусухим способом в буфере, содержащем 25 мМ трис-HCl, 190 мМ глицина, 20% метанола и 0,1% додецилсульфата натрия, переносят в течение 1 часа на мембрану Hybond-C Extra (GE Healthcare Life Sciences, США) при силе тока 1 мА/см. Мембрану в течение 30 минут блокируют фосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween-20 и 3% бычьего сывороточного альбумина. Проводят окрашивание мембраны моноклональными антителами Anti-Flagellin FliC antibody (Invivogen, США), трижды промывают фосфатным буфером, содержащим 0,01% Tween-20, и проявляют с использованием набора WesternBreeze Chromogenic Kit, anti-mouse (Thermo Fisher Scientific, США). Наличие на мембране полосы с молекулярной массой 75 кДа свидетельствует о иммунологической идентичности рекомбинантного флагеллина в составе фьюжн-белка fliC:pagN нативному флагеллину S. typhimurium.Immunological identity is confirmed by Western blot staining with monoclonal antibodies to S. typhimurium flagellin. The protein after electrophoresis in a denaturing gel semi-dry method in a buffer containing 25 mm Tris-HCl, 190 mm glycine, 20% methanol and 0.1% sodium dodecyl sulfate, transferred within 1 hour on a Hybond-C Extra membrane (GE Healthcare Life Sciences, USA) at a current strength of 1 mA / cm. The membrane is blocked for 30 minutes with phosphate buffer containing 0.05% Tween-20 and 3% bovine serum albumin. The membrane was stained with Anti-Flagellin FliC antibody monoclonal antibodies (Invivogen, USA), washed three times with phosphate buffer containing 0.01% Tween-20, and developed using the Western Breeze Chromogenic Kit, anti-mouse (Thermo Fisher Scientific, USA). The presence on the membrane of a band with a molecular weight of 75 kDa indicates the immunological identity of the recombinant flagellin in the composition of the fusion protein fliC: pagN to native flagellin S. typhimurium.

Содержание эндотоксина в конечном препарате белка fliC:pagN определяют при помощи ЛАЛ-теста (Charles River Endosafe, США), оно составляет менее 5 IU/мг.The endotoxin content in the final fliC: pagN protein preparation is determined using the LAL test (Charles River Endosafe, USA), it is less than 5 IU / mg.

Методом N-концевого секвенирования определяют первые 8 аминокислот очищенного рекомбинантного белка. Согласно результатам N-концевого секвенирования первые 8 аминокислот белка имеют последовательность LGTAIERL.The first 8 amino acids of the purified recombinant protein are determined by N-terminal sequencing. According to the results of N-terminal sequencing, the first 8 amino acids of the protein have the sequence LGTAIERL.

Claims

A method of obtaining a fusion chimeric recombinant protein fliC: pagN (SEQ ID NO: 2), comprising constructing a recombinant plasmid pETfliCpagN (SEQ ID NO: 3) of 7532 bp in length, containing a T7 bacteriophage promoter and a carrier sequence encoding fliC proteins, including leader the sequence of this protein, and S. typhimurium pagN, combined by the GSVDSSSGGN short linker sequence, and fused at the 3'-end with a synthetic sequence encoding six histidines, transformation of Escherichia coli BL21 (DE3) cell expression plasmid pETfliCpagN encoding pe the fliC: pagN recombinant chimeric protein, culturing the obtained BL-fliCpagN strain at 37 ° C and producing the fliC: pagN chimeric protein in Escherichia coli at 20 ° C for 10 hours, obtaining the periplasmic fraction of producer bacteria by treating the cells with lysozyme in 20% sucrose solution, followed by centrifugation, purification of the chimeric fliC: pagN protein from bacterial periplasm of metal-chelate, anion-exchange and gel filtration chromatography to obtain a homogeneous final preparation of fliC: pagN protein with a yield of at least 0.3 g of protein with MFI bacterial culture having 98% pure by electrophoresis and densitometry, and containing a bacterial endotoxin in an amount no greater than 5 IU / mg.