RU2626600C1

RU2626600C1 - Composition for application in photodynamic therapy of cancer

Info

Publication number: RU2626600C1
Application number: RU2016124200A
Authority: RU
Inventors: Елизавета Викторовна Беляева; Алина Александровна Маркова; Андрей Лейзорович Сиган; Лев Львович Гервиц; Сергей Сергеевич Букалов; Александр Альбертович Штиль; Николай Дмитриевич Чкаников
Priority date: 2016-06-20
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2017-07-28

Abstract

FIELD: pharmacology.

SUBSTANCE: composition includes a mixture of perfluorodecalin (PFD) and perfluoro-N-(4-methylcyclohexyl)piperidine (PMCP) as a fluorocarbon phase at PFD and PMC weight ratio of 2:1, in an amount of 5-30 wt %, meso-tetrakis(2,3,5,6-tetrafluoro-4-(1,1-H, H-perfluoroheptyloxy)phenyl)porphyrin or meso-tetrakis(6-H-perfluorohexyl-1)porphyrin in an amount of 0.01-0.04 wt % as a photosensitizer, proxanol-268 in an amount of 2-8 wt % as a stabiliser, NaCl in an amount of 0.7-0.9 wt % and water in an amount of up to 100 wt %.

EFFECT: increased phototoxicity of the photosensitizer with respect to the human colon adenocarcinoma cell line when administered as part of the claimed composition.

2 cl, 2 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к фотодинамической терапии (ФДТ) рака, конкретно к новой терапевтической композиции, представляющей собой фторуглеродную эмульсию, включающую фотосенсибилизатор, растворенный во фторуглеродной фазе.The invention relates to medicine, in particular to photodynamic therapy (PDT) of cancer, specifically to a new therapeutic composition, which is a fluorocarbon emulsion comprising a photosensitizer dissolved in a fluorocarbon phase.

Фотодинамическая терапия является высокоэффективным способом избирательного разрушения опухолей, который не уступает традиционным методам лечения. Фотодинамическая терапия известна с 1975 г. (Dougherty, T.G.; Grindey, G.B.; Fiel, R. Photoradiation therapy II. Culture of animal tumors with hematoporphyrin and light. J. Natl. Cancer Inst., 55, 155, 1975) и в последующие годы получила широкое распространение в США, Европе, Китае и Японии. В Российской Федерации ФДТ применяют с 1996 г.Photodynamic therapy is a highly effective method for the selective destruction of tumors, which is not inferior to traditional methods of treatment. Photodynamic therapy has been known since 1975 (Dougherty, TG; Grindey, GB; Fiel, R. Photoradiation therapy II. Culture of animal tumors with hematoporphyrin and light. J. Natl. Cancer Inst., 55, 155, 1975) and later The years became widespread in the USA, Europe, China and Japan. In the Russian Federation, PDT has been used since 1996.

Фотодинамическая терапия является разновидностью химиотерапии и заключается в локальной активации фотосенсибилизатора (ФС), введенного в опухоль, видимым красным светом, что в присутствии кислорода тканей приводит к развитию фотохимической реакции, разрушающей опухолевые клетки. ФДТ позволяет избежать системного (общего) воздействия на организм, характерного для обычной химиотерапии.Photodynamic therapy is a type of chemotherapy and consists in the local activation of a photosensitizer (PS), introduced into the tumor, visible in red light, which in the presence of tissue oxygen leads to the development of a photochemical reaction that destroys tumor cells. PDT avoids the systemic (general) effects on the body that are characteristic of conventional chemotherapy.

Механизм цитотоксического действия ФДТ описан в работах (Clifton, N.J., Methods in molecular biology, 2010, ISBN 978-1-60761-696-2, ISSN 1064-3745; J. Fuchs, J. Thiele, Free Radical Biology & Medicine, 1998, Vol. 24, No. 5, pp. 835-847). При облучении фотосенсибилизированной опухолевой ткани лазером в красном диапазоне происходит переход нетоксичного триплетного кислорода, содержащегося в опухолевой ткани, в синглетное состояние, обладающее выраженным цитотоксическим действием. Биомолекулы, входящие в состав мембран опухолевых клеток (ненасыщенные жирные кислоты, холестерин, боковые цепи альфа-аминокислот - триптофана, метионина, гистидина), активно реагируют с синглетным кислородом, что позволяет рассматривать их в качестве наиболее вероятных мишеней. Таким образом, ФДТ - трехкомпонентный метод лечения, составными частями которого являются фотосенсибилизатор, кислород, присутствующий в опухоли, и световое воздействие.The mechanism of the cytotoxic effect of PDT is described in (Clifton, NJ, Methods in molecular biology, 2010, ISBN 978-1-60761-696-2, ISSN 1064-3745; J. Fuchs, J. Thiele, Free Radical Biology & Medicine, 1998 Vol. 24, No. 5, pp. 835-847). When a photosensitized tumor tissue is irradiated with a laser in the red range, non-toxic triplet oxygen contained in the tumor tissue transitions to a singlet state with a pronounced cytotoxic effect. The biomolecules that make up the membranes of tumor cells (unsaturated fatty acids, cholesterol, side chains of alpha-amino acids - tryptophan, methionine, histidine) actively react with singlet oxygen, which allows us to consider them as the most likely targets. Thus, PDT is a three-component treatment method, the constituent parts of which are a photosensitizer, oxygen present in the tumor, and light exposure.

Известно, что в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ успешно используются соединения порфиринового ряда (хлорины, бактериохлорины, порфирины и др.) (М. Ethirajan, Y. Chen, P. Joshi, R.К. Pandey. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy, Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 340362). Фотосенсибилизаторы, представляющие собой соединения порфиринового ряда, способны селективно накапливаться в тканях злокачественных опухолей и практически не задерживаются в нормальных клетках; они обладают низкой темновой токсичностью, устойчивы при хранении и введении в организм, стабильны при световом воздействии, характеризуются высоким квантовым выходом триплетного состояния с энергией не меньше 94 кДж/моль, имеют интенсивный максимум поглощения в области 650-900 нм; являются коммерчески доступными соединениями или легко синтезируются.It is known that porphyrin compounds (chlorins, bacteriochlorins, porphyrins, etc.) (M. Ethirajan, Y. Chen, P. Joshi, R.K. Pandey. The role of porphyrin chemistry in tumor imaging are successfully used as photosensitizers for PDT. and photodynamic therapy, Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 340362). Photosensitizers, which are compounds of the porphyrin series, are able to selectively accumulate in the tissues of malignant tumors and practically do not linger in normal cells; they have low dark toxicity, are stable when stored and introduced into the body, are stable when exposed to light, are characterized by a high quantum yield of the triplet state with an energy of at least 94 kJ / mol, and have an intense absorption maximum in the region of 650-900 nm; are commercially available compounds or are easily synthesized.

Известно, что в настоящее время в клинике в качестве порфириновых ФС для ФДТ широко используются препараты, которые являются производными порфиринов и родственных соединений, такие как Amphinex, ADPM06, Chlorine еб, Fimaorfin (TPCS2a), Lemuteporfin, MPPa, Motexafin gadolinium, Motexafin lutetium, Padoporfin, Rostaporfin, Porfimer sodium, Stannsoporfin, Sonoflora 1, Talaporfin sodium, Temoporfin, WST11 (Stakel) и другие.It is known that currently in the clinic, drugs that are derivatives of porphyrins and related compounds, such as Amphinex, ADPM06, Chlorine eb, Fimaorfin (TPCS2a), Lemuteporfin, MPPa, Motexafin gadolinium, Motexafin l, are widely used in the clinic as porphyrin PS for PDT Padoporfin, Rostaporfin, Porfimer sodium, Stannsoporfin, Sonoflora 1, Talaporfin sodium, Temoporfin, WST11 (Stakel) and others.

Одним из основных требований к современным ФС является хорошая растворимость в воде или в жидкостях и плазмозаменителях, разрешенных для внутривенного введения. В частности, для введения и транспортировки ФС используют различные эмульсионные системы типа масло/вода или вода/масло, в которых ФС находится внутри микрокапсулы, липосомы или в адсорбционном слое наночастицы. Особый интерес вызывают наноэмульсии перфторуглеродов, которые не только доставляют ФС в опухоль, но и увеличивают содержание кислорода в ней (S. Khatri, Р. Lohani, S. Gandhi, Indo Global, Nanoemulsions in Cancer Therapy. Journal of Pharmaceutical Sciences, 3 (2), 124-133, 2013).One of the main requirements for modern PS is its good solubility in water or in liquids and plasma substitutes, which are allowed for intravenous administration. In particular, various emulsion systems of the oil / water or water / oil type are used for introducing and transporting the PS, in which the PS is located inside the microcapsule, liposome, or in the adsorption layer of the nanoparticle. Of particular interest are nanoemulsions of perfluorocarbons, which not only deliver PS to the tumor, but also increase the oxygen content in it (S. Khatri, P. Lohani, S. Gandhi, Indo Global, Nanoemulsions in Cancer Therapy. Journal of Pharmaceutical Sciences, 3 (2 ), 124-133, 2013).

Одним из факторов, способствующих повышению чувствительности опухолей к воздействию ФС, является повышение содержания в них кислорода. Большинство солидных опухолей находятся в состоянии гипоксии в результате нарушений микроциркуляции в клетках и повреждений в диффузионных каналах. С этой точки зрения использование перфторуглеродов, обладающих значительной кислородной емкостью (40-56 мл O₂ в 100 мл при атмосферном давлении), в качестве среды для ФС, которые одновременно доставляют ФС в опухоль и выполняют газотранспортную функцию, повышая содержание кислорода в опухоли, остается одним из наиболее перспективных направлений при разработке новых препаратов для ФДТ (Urgen Fuchs, Jens Thiele, The role of oxygen in cutaneous photodynamic therapy, Free Radical Biology and Medicine, v. 24, №5, 835-847, 1998).One of the factors contributing to an increase in the sensitivity of tumors to the effects of FS is an increase in their oxygen content. Most solid tumors are hypoxic as a result of disturbances in microcirculation in cells and damage in diffusion channels. From this point of view, the use of perfluorocarbons with significant oxygen capacity (40-56 ml O ₂ in 100 ml at atmospheric pressure) as a medium for PS, which simultaneously deliver PS to the tumor and perform a gas transport function, increasing the oxygen content in the tumor, remains one of the most promising areas in the development of new drugs for PDT (Urgen Fuchs, Jens Thiele, The role of oxygen in cutaneous photodynamic therapy, Free Radical Biology and Medicine, v. 24, No. 5, 835-847, 1998).

Существенными преимуществами применения перфторуглеродов в ФДТ является их инертность в биологических системах, увеличенное время жизни синглетного кислорода, которое во фторуглеродных средах на 3-4 порядка больше, чем в воде, и возможность визуализации фторуглеродных систем в организме методом МРТ ¹⁹F.Significant advantages of using perfluorocarbons in PDT are their inertness in biological systems, the increased lifetime of singlet oxygen, which is 3-4 orders of magnitude longer in fluorocarbon media than in water, and the ability to visualize fluorocarbon systems in the body by MRI ¹⁹ F.

Известны фармацевтически приемлемые перфторуглеродные эмульсии, насыщенные кислородом, при введении которых в гипоксическую зону опухоли повышается эффективность применяемой лучевой терапии за счет локальной оксигенации (US 4781676, 01.11.1988; US 5567765, 22.10.1996). Такое применение ограничивается необходимостью достижения опухолью размеров, позволяющих провести ее четкую локализацию, но при этом содержание кислорода повышается во всех тканях организма и цитотоксические лекарственные вещества поступают не только в опухоль, но и другие ткани организма, что вызывает усиление побочных эффектов.Known pharmaceutically acceptable perfluorocarbon emulsions saturated with oxygen, the introduction of which into the hypoxic zone of the tumor increases the effectiveness of the applied radiation therapy due to local oxygenation (US 4781676, 11/01/1988; US 5567765, 10/22/1996). Such use is limited by the need for the tumor to reach a size that allows it to be clearly localized, but the oxygen content increases in all body tissues and cytotoxic drugs enter not only the tumor, but also other body tissues, which causes an increase in side effects.

Уменьшение побочных эффектов химиотерапии и ФДТ при сохранении их эффективности в настоящее время является одним из наиболее актуальных направлений. Особое внимание уделяется развитию направленной фотодинамической терапии рака (НФДТ), основанной на таргетной доставке активной субстанции, проводятся исследования по применению фторуглеродных эмульсий, включающих противоопухолевые средства или фотосенсибилизаторы.Reducing the side effects of chemotherapy and PDT while maintaining their effectiveness is currently one of the most relevant areas. Particular attention is paid to the development of targeted photodynamic cancer therapy (NFDT), based on the targeted delivery of the active substance, studies are being conducted on the use of fluorocarbon emulsions, including antitumor agents or photosensitizers.

Известны композиции для лечения солидных опухолей, содержащие стволовые мезенхимальные клетки и вещества с противоопухолевым действием и включающие наночастицы перфторуглеродов. Приготовление таких композиций проводят путем инкубации в среде фармацевтически приемлемой водной наноэмульсии перфторуглеродов с диаметром частиц не более 300 нм (Патент РФ №2437692, 12.03.2010).Known compositions for the treatment of solid tumors containing mesenchymal stem cells and substances with an antitumor effect and including perfluorocarbon nanoparticles. The preparation of such compositions is carried out by incubation in a medium of a pharmaceutically acceptable aqueous nanoemulsion of perfluorocarbons with a particle diameter of not more than 300 nm (RF Patent No. 2437692, 03/12/2010).

Известна композиция для использования в ФДТ, полученная путем совместного культивирования эмульсии перфторуглеродов с Радохлорином в качестве ФС и стволовых клеток костного мозга (Патент РФ №2440158, 25.02.2010).A known composition for use in PDT obtained by co-culturing an emulsion of perfluorocarbons with Radochlorin as a PS and bone marrow stem cells (RF Patent No. 2440158, 02.25.2010).

Недостатками вышеуказанных композиций является необходимость использования генетически модифицированных клеток, процедура получения которых является трудоемкой и дорогостоящей.The disadvantages of the above compositions is the need to use genetically modified cells, the procedure for which is time-consuming and expensive.

Известна композиция для ФДТ, представляющая собой эмульсию перфторгексана и фотосенсибилизатора IR780, стабилизированную смесью лецитина и холестерина [Yuhao Cheng, Нао Cheng, Chenhiao Jiang. Xuefeng Qiu, Kaikai Wang, Wei Huan, Ahu Yuan, Jinhui Wu, Yiqiao Hu, Perfluorocarbon nanoparticles enhance reactive oxygen levels and tumor growth inhibition in photodynamic therapy, Nature communications, 2015). Указанная композиция является наиболее близкой к заявляемой по совокупности существенных признаков и была выбрана в качестве прототипа.A known composition for PDT is an emulsion of perfluorohexane and an IR780 photosensitizer stabilized with a mixture of lecithin and cholesterol [Yuhao Cheng, Nao Cheng, Chenhiao Jiang. Xuefeng Qiu, Kaikai Wang, Wei Huan, Ahu Yuan, Jinhui Wu, Yiqiao Hu, Perfluorocarbon nanoparticles enhance reactive oxygen levels and tumor growth inhibition in photodynamic therapy, Nature communications, 2015). The specified composition is the closest to the claimed combination of essential features and was selected as a prototype.

Наночастицы такой композиции со средним диаметром 200 нм состоят из фторуглеродного ядра и липидного монослоя, в котором содержится липофильный фотосенсибилизатор IR780.Nanoparticles of such a composition with an average diameter of 200 nm consist of a fluorocarbon core and a lipid monolayer, which contains the lipophilic photosensitizer IR780.

Недостатком композиции-прототипа является высокая темновая токсичность используемого ФС, что отчасти нивелируется нанесением его на частицы эмульсии. Однако в условиях кровотока в присутствии эндогенных ПАВ высока вероятность вымывания ФС с поверхности наночастиц эмульсии. В этом случае нарушается одновременная локализация в раковой клетке фотосенсибилизатора и фторуглерода, используемого в качестве депо кислорода, что требует использования высоких доз фотосенсибилизатора для подавления роста 50% клеток и в целом снижает эффективность таргетного применения ФДТ.The disadvantage of the composition of the prototype is the high dark toxicity of the used FS, which is partially offset by applying it to the particles of the emulsion. However, under conditions of blood flow in the presence of endogenous surfactants, there is a high probability of leaching of PS from the surface of emulsion nanoparticles. In this case, the simultaneous localization in the cancer cell of the photosensitizer and fluorocarbon used as an oxygen depot is disrupted, which requires the use of high doses of the photosensitizer to inhibit the growth of 50% of the cells and generally reduces the effectiveness of the targeted use of PDT.

Создание композиций в виде фторуглеродных эмульсий, содержащих фотосенсибилизатор, растворенный непосредственно во фторуглеродной фазе эмульсии, позволило бы обеспечить доставку ФС и одновременное насыщение опухоли кислородом за счет введения газопереносящей среды и повысить эффективность ФДТ.The creation of compositions in the form of fluorocarbon emulsions containing a photosensitizer dissolved directly in the fluorocarbon phase of the emulsion would allow the delivery of PS and simultaneous saturation of the tumor with oxygen due to the introduction of a gas-transporting medium and increase the efficiency of PDT.

Однако до сих пор не известны композиции для применения в ФДТ, представляющие собой фторуглеродные эмульсии, во фторуглеродной фазе которых растворен фотосенсибилизатор. Предлагаемое в настоящем изобретении техническое решение обеспечивает создание вышеуказанных композиций.However, compositions for use in PDT are still not known, which are fluorocarbon emulsions in which the photosensitizer is dissolved in the fluorocarbon phase. Proposed in the present invention, the technical solution provides the creation of the above compositions.

Задачей настоящего изобретения является создание композиции для применения в ФДТ, обладающей противоопухолевой активностью и представляющей собой эмульсию фторуглеродов в воде, включающую фотосенсибилизатор, способный растворяться во фторуглеродной фазе эмульсии.An object of the present invention is to provide a composition for use in PDT having antitumor activity and constituting an emulsion of fluorocarbons in water, including a photosensitizer capable of dissolving in the fluorocarbon phase of the emulsion.

Задача решается заявляемой композицией для применения в фотодинамической терапии рака, обладающей противоопухолевой активностью, которая представляет собой эмульсию фторуглеродов в воде, включающую фотосенсибилизатор и стабилизатор эмульсии, причем фотосенсибилизатор растворен во фторуглеродной фазе эмульсии; в качестве фотосенсибилизатора используют порфирин, способный растворяться во фторуглеродной фазе, имеющий в своей структуре полифторсодержащие заместители, в качестве фторуглеродной фазы используют смесь фторуглеродов перфтордекалина (ПФД) и перфтор-N-(4-метилциклогексил)пиперидина (ПМЦП), а в качестве стабилизатора эмульсии используют проксанол-268. При этом композиция имеет следующий состав (мас. %):The problem is solved by the claimed composition for use in photodynamic therapy of cancer having antitumor activity, which is an emulsion of fluorocarbons in water, including a photosensitizer and an emulsion stabilizer, the photosensitizer being dissolved in the fluorocarbon phase of the emulsion; porphyrin is used as a photosensitizer, it can dissolve in the fluorocarbon phase, which has polyfluorine-containing substituents in its structure, a mixture of perfluorodecalin fluorocarbons (PFD) and perfluoro-N- (4-methylcyclohexyl) piperidine (PMC) is used as the fluorocarbon phase. use proxanol-268. The composition has the following composition (wt.%):

Смесь фторуглеродов ПФД и ПМЦПA mixture of fluorocarbons PFD and PMTSP при массовом соотношении 2:1with a mass ratio of 2: 1 5-305-30 Проксанол-268Proxanol-268 2-82-8 ФотосенсибилизаторPhotosensitizer 0.01-0.040.01-0.04 NaClNaCl 0.7-0.90.7-0.9 ВодаWater остальноеrest

При разработке заявляемой композиции учтены требования, предъявляемые к эмульсии фармацевтического назначения, а также в отдельности к каждому ее компоненту. По современным представлениям необходимыми требованиями к эмульсионным композициям фармацевтического назначения для ФДТ являются размер частиц, не превышающий 200 нм, значительный срок хранения, отсутствие токсичности, приемлемый период полувыведения из организма.When developing the inventive composition, the requirements for pharmaceutical emulsions, as well as individually for each of its components, were taken into account. According to modern ideas, the necessary requirements for emulsion compositions for pharmaceutical purposes for PDT are a particle size of not more than 200 nm, a significant shelf life, no toxicity, an acceptable half-life from the body.

Указанным требованиям в полной мере удовлетворяет официально зарегистрированный препарат «Перфторан» (номер регистрационного удостоверения Р N001962/01-2002), используемый в качестве кровезаменителя с газотранспортной функцией (RU 2393849, Вестник Российской академии наук 1997, том 67, №11, с. 998-1013, Г.Р. Иваницкий, С.И. Воробьев «Кровезаменитель «Перфторан»). Препарат представляет собой эмульсию фторуглеродов (цис- и транс- изомеры перфтордекалина (ПФД), перфтор-N-(4-метилциклогексил)пиперидин (ПМЦП) в физиологическом растворе, стабилизированную проксанолом-268 (блок-сополимер окиси этилена и окиси пропилена Н-(-CH₂CH₂O-)_m-(-СН(CH₃)CH₂O-)_n-(-CH₂CH₂O-)_m-Н, где n~45, m~118). Состав препарата «Перфторан» взят за основу при разработке настоящего изобретения.The specified drug “Perftoran” (registration certificate number P N001962 / 01-2002), which is used as a blood substitute with gas transport function (RU 2393849, Bulletin of the Russian Academy of Sciences 1997, vol. 67, No. 11, p. 998), fully satisfies these requirements; -1013, G.R. Ivanitsky, S.I. Vorobyov “Blood substitute Perftoran”). The preparation is an emulsion of fluorocarbons (cis and trans isomers of perfluorodecalin (PFD), perfluoro-N- (4-methylcyclohexyl) piperidine (PMCP) in physiological saline, stabilized with proxanol-268 (block copolymer of ethylene oxide and propylene oxide N- ( -CH ₂ CH ₂ O-) _m - (- CH (CH ₃ ) CH ₂ O-) _n - (- CH ₂ CH ₂ O-) _m -Н, where n ~ 45, m ~ 118). Perftoran "is taken as a basis in the development of the present invention.

Известны фторуглеродные эмульсии «Oxygent» и «Fluosol-DA», разрабатываемые в качестве препаратов-кровезаменителей и отличающиеся от «Перфторана» характером фторуглеродных компонентов и их концентрацией. Состав этих препаратов также может быть основой при создании композиции для ФДТ, при условии соблюдения вышеуказанных требований.Oxygent and Fluosol-DA fluorocarbon emulsions are known that are developed as blood substitutes and differ from Perftoran in the nature of their fluorocarbon components and their concentration. The composition of these drugs can also be the basis when creating a composition for PDT, subject to the above requirements.

В качестве предлагаемой в изобретении фторуглеродной фазы могут использоваться любые другие фторуглероды, обладающие подходящими свойствами, такими как химическая инертность, кислородная емкость, отсутствие токсичности, способность образовывать устойчивые эмульсии с использованием нетоксичных эмульгаторов.As the fluorocarbon phase proposed in the invention, any other fluorocarbons having suitable properties, such as chemical inertness, oxygen capacity, lack of toxicity, and the ability to form stable emulsions using non-toxic emulsifiers, can be used.

Техническим результатом изобретения является новая композиция для ФДТ, которая представляет собой фторуглеродную эмульсию в воде, включающую полифторсодержащий фотосенсибилизатор, структура которого обеспечивает его растворение во фторуглеродной фазе эмульсии; повышение фототоксичности фотосенсибилизатора по отношению к клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека (НСТ116) при введении его в составе заявляемой композиции.The technical result of the invention is a new composition for PDT, which is a fluorocarbon emulsion in water, including a polyfluorine-containing photosensitizer, the structure of which ensures its dissolution in the fluorocarbon phase of the emulsion; an increase in the phototoxicity of the photosensitizer with respect to the cell line of the human colon adenocarcinoma (HCT116) when introduced as part of the claimed composition.

Технический результат достигается при использовании заявляемой композиции, которая обеспечивает доставку фотосенсибилизатора в опухоль и повышение содержания кислорода в опухоли за счет одновременного введения газопереносящей фторуглеродной среды, в которой растворен ФС.The technical result is achieved by using the inventive composition, which ensures the delivery of the photosensitizer to the tumor and an increase in the oxygen content in the tumor due to the simultaneous introduction of a gas-transporting fluorocarbon medium in which PS is dissolved.

Для достижения результата необходимо соблюдение ряда требований к индивидуальным компонентам эмульсии, а также к способу ее приготовления.To achieve the result, it is necessary to comply with a number of requirements for the individual components of the emulsion, as well as the method of its preparation.

К фторуглеродным компонентам предъявляются требования по контролируемому содержанию примеси фторид-иона, которое не должно превышать 10^-4 М. Таким образом достигается нетоксичность и апирогенность предлагаемых эмульсий [«Клеточный тест на токсичность эмульсий ПФОС и их компонентов: корреляция между химическим и биологическим тестированием», сборник научных трудов под ред. проф. Ф.Ф. Белоярцева. «Фторуглеродные газопереносящие среды», Пущино. 1984, с. 51].The fluorocarbon components are required to control the content of fluoride ion impurities, which should not exceed 10 ^-4 M. Thus, the non-toxicity and pyrogen-free nature of the proposed emulsions is achieved ["Cellular toxicity test of PFOS emulsions and their components: correlation between chemical and biological testing", collection of scientific papers under the editorship of prof. F.F. Beloyartseva. “Fluorocarbon gas transporting media”, Pushchino. 1984, p. 51].

Приготовление эмульсии для создания заявляемой композиции может осуществляться любым известным способом диспергирования, обеспечивающим получение коллоидной системы с размером частиц до 200 нм. В качестве компонентов используется 10%-ный раствор Проксанола-268 и раствор соответствующего фторсодержащего ФС во фторуглероде или в смеси фторуглеродов.The preparation of the emulsion to create the claimed composition can be carried out by any known dispersion method, providing a colloidal system with a particle size of up to 200 nm. As components, a 10% solution of Proxanol-268 and a solution of the corresponding fluorine-containing PS in fluorocarbon or in a mixture of fluorocarbons are used.

Хранение полученных образцов эмульсии следует осуществлять в замороженном состоянии при температуре не выше -18°C. Кристаллизация дисперсионной среды (водного раствора) незначительно влияет на морфологию частиц эмульсии. Более важным фактором является количество циклов заморозки/разморозки.Storage of the obtained emulsion samples should be carried out in a frozen state at a temperature not exceeding -18 ° C. Crystallization of a dispersion medium (aqueous solution) slightly affects the morphology of the particles of the emulsion. A more important factor is the number of freeze / thaw cycles.

В качестве ФС используют химические соединения, обладающие необходимым комплексом физико-химических свойств - способностью к поглощению света в диапазоне длин волн 650-780 нм, способностью к генерации активных форм кислорода, растворимостью во фторуглеродных компонентах эмульсии в количестве не менее 10^-4 М, отсутствием темновой токсичности по отношению к клеткам и тканям организма, фототоксичностью по отношению к клеткам и тканям раковой опухоли.Chemical compounds possessing the necessary complex of physicochemical properties — the ability to absorb light in the wavelength range of 650–780 nm, the ability to generate reactive oxygen species, the solubility in the fluorocarbon components of the emulsion in an amount of at least 10 ^–4 M, and the absence of PC ^{— are used} . dark toxicity to cells and tissues of the body, phototoxicity to cells and tissues of a cancerous tumor.

Известно, что для обеспечения достаточной растворимости во фторуглеродных жидкостях необходимо наличие в молекуле порфирина не менее четырех перфторалифатических фрагментов с длиной цепи C₄-C₈ [Pozzi, G.; Banfi, S.; Manfredi, A.; Montanari, R; Quid, S. Tetrahedron 1996, 52, 11879-11888].It is known that in order to ensure sufficient solubility in fluorocarbon fluids, the presence of at least four perfluoroaliphatic fragments with a C ₄ -C ₈ chain length [Pozzi, G .; Banfi, S .; Manfredi, A .; Montanari, R; Quid, S. Tetrahedron 1996, 52, 11879-11888].

Получен ряд порфиринов, имеющих в своей структуре фторалифатические фрагменты, например соединения общей формулы I и II. Показано, что полученные соединения поглощают свет при длине волны 650 нм, обладают способностью к генерации синглетного кислорода, не имеют темновой токсичности, обладают фототоксичностью по отношению к клеточной линии аденокарциномы толстой кишки человека (НСТ116) и клеточной линии миелоидного лейкоза человека (K562). Синтез порфиринов формулы I осуществляют из фторсодержащих 1-пирролил-карбинолов циклизацией в присутствии n-толуолсульфокислоты и последующим окислением дихлордицианохинолином или другими подходящими окислителями [Goll, J.G.; Moore, К.Т.; Ghosh, A.; Therien, М.J. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 8344-8354]. Синтез порфиринов формулы II осуществляли прямым замещением атома фтора в 4-м положении пентафторфенильного или 4-фторфенильного фрагмента в мезо-положении порфирина, а также путем конденсации 4- или 2,4,6-фторалкилзамещенных бензальдегидов с пирролом в присутствие эфирата трехфтористого бора [Belyaeva E.V., Sigan A.L., Druzhinina I.E., Ikonnikov N.S., Chkanikov N.D. Fluorine Notes, 2015, 5 (102).].A number of porphyrins having fluoroaliphatic fragments in their structure, for example, compounds of the general formula I and II, have been obtained. It was shown that the obtained compounds absorb light at a wavelength of 650 nm, have the ability to generate singlet oxygen, do not have dark toxicity, and have phototoxicity with respect to the human colon adenocarcinoma cell line (HCT116) and human myeloid leukemia cell line (K562). The synthesis of porphyrins of formula I is carried out from fluorine-containing 1-pyrrolyl-carbinols by cyclization in the presence of n-toluenesulfonic acid and subsequent oxidation with dichlorodicyanoquinoline or other suitable oxidizing agents [Goll, J.G .; Moore, K.T .; Ghosh, A .; Therien, M.J. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 8344-8354]. The synthesis of porphyrins of formula II was carried out by direct substitution of a fluorine atom at the 4-position of the pentafluorophenyl or 4-fluorophenyl fragment in the meso-position of porphyrin, as well as by condensation of 4- or 2,4,6-fluoroalkyl-substituted benzaldehydes with pyrrole in the presence of boron trifluoride etherate [Belyaeva EV, Sigan AL, Druzhinina IE, Ikonnikov NS, Chkanikov ND Fluorine Notes, 2015, 5 (102).].

Результаты клеточных тестов свидетельствуют о том, что указанные фотосенсибилизаторы, специально сконструированные для введения во фторуглеродную фазу эмульсии, обладают пренебрежительно малой темновой токсичностью по отношению к раковым клеткам как сами по себе, так и в составе заявляемой композиции. При световом лазерном воздействии на раковые клетки, предварительно инкубированные с растворами ФС и с эмульсиями, содержащими ФС, наблюдается выраженное цитотоксическое действие. Сравнение показателей гибели раковых клеток показало, что фототоксичность указанных фотосенсибилизаторов усиливается при использовании ФС в составе заявляемой композиции.The results of cell tests indicate that these photosensitizers, specially designed for the introduction of an emulsion into the fluorocarbon phase, have negligibly low dark toxicity to cancer cells both by themselves and in the composition of the claimed composition. When laser light is applied to cancer cells previously incubated with FS solutions and with emulsions containing PS, a pronounced cytotoxic effect is observed. Comparison of cancer cell death rates showed that the phototoxicity of these photosensitizers is enhanced when using PS as part of the claimed composition.

Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами. В примерах 1 и 2 описан синтез фотосенсибилизаторов (полифторалкилзамещенных порфиринов) и способ приготовления фторуглеродных эмульсий на их основе. Образцы заявляемой композиции в виде эмульсий с фотосенсибилизаторами 1 и 2 (ФС-1 и ФС-2) были протестированы на опухолевых клетках человека при облучении светом лазера с длиной волны 633 нм.The invention is illustrated by the following examples. Examples 1 and 2 describe the synthesis of photosensitizers (polyfluoroalkyl substituted porphyrins) and a method for preparing fluorocarbon emulsions based on them. Samples of the claimed composition in the form of emulsions with photosensitizers 1 and 2 (FS-1 and FS-2) were tested on human tumor cells when irradiated with laser light with a wavelength of 633 nm.

Пример 1Example 1

ФС-1 (мезо-тетракис(2,3,5,6-тетрафтор-4-(1,1-Н,Н-перфторгептилокси)фенил)порфирин) получают в одну стадию из коммерчески доступного мезо-тетракис(пентафторфенил)порфирина путем замещения атомов фтора в 4-м положении пентафторфенильных фрагментов на остаток 1,1-Н,Н-перфторгептанола-1 в присутствии сильного основания (гидрооксида калия) [Belyaeva E.V., Sigan A.L., Druzhinina I.E., Ikonnikov N.S., Chkanikov N.D. Fluorine Notes, 2015, J (102)].PS-1 (meso-tetrakis (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (1,1-H, H-perfluoroheptyloxy) phenyl) porphyrin) is obtained in a single step from commercially available meso-tetrakis (pentafluorophenyl) porphyrin by substitution of fluorine atoms in the 4-position of pentafluorophenyl fragments with the remainder of 1,1-H, H-perfluoroheptanol-1 in the presence of a strong base (potassium hydroxide) [Belyaeva EV, Sigan AL, Druzhinina IE, Ikonnikov NS, Chkanikov ND Fluorine Notes, 2015, J (102)].

К раствору мезо-тетракис(пентафторфенил)порфирина (0.5 г, 0.51 ммоль) и 1,1-Н,Н-перфторгептанола-1 (2.16 г, 6.2 ммоль) в ТГФ (200 мл) прибавляют KOH (2,86 г, 51 ммоль) и кипятят в инертной атмосфере 4 часа. Реакционную массу помещают в воду и экстрагируют диэтиловым эфиром. Органическую фазу промывают насыщенным водным раствором NaHCO₃ (2×40 мл) и сушат над CaCl₂. После удаления растворителя полученную массу очищают колоночной хроматографией (силикагель, хлороформ). Получено 0.55 г порошка фиолетового цвета (выход 47%).To a solution of meso-tetrakis (pentafluorophenyl) porphyrin (0.5 g, 0.51 mmol) and 1,1-H, N-perfluoroheptanol-1 (2.16 g, 6.2 mmol) in THF (200 ml) are added KOH (2.86 g, 51 mmol) and boil in an inert atmosphere for 4 hours. The reaction mass is placed in water and extracted with diethyl ether. The organic phase was washed with saturated aqueous NaHCO ₃ (2 × 40 ml) and dried over CaCl ₂ . After removing the solvent, the resulting mass was purified by column chromatography (silica gel, chloroform). Obtained 0.55 g of purple powder (yield 47%).

ЯМР ¹Н (300.13 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): -2.86 (с, 2Н, NH), 5.11 (т, 8Н, J₁=12.79 Гц, J₂=12.56 Гц, OCH ₂, 8.97 (с, 8Н, Pyr-H). ¹ H NMR (300.13 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm): -2.86 (s, 2H, N H ), 5.11 (t, 8H, J ₁ = 12.79 Hz, J ₂ = 12.56 Hz, OC H ₂ 8.97 (s, 8H, Pyr- H ).

ЯМР ¹⁹F (282.38 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): -78.48 (м, 8F, C_Ar-F^орто), -59.44 (дд, 8F, J₁=13.79 Гц, J₂=8.19 Гц, C_Ar-F^мета), -48.38 (м, 8F, CF ₂), -45.14 (м, 8F, CF ₂), -44.33 (м, 8F, CF ₂), -42.73 (м, 8F, CF ₂, -2.98 (т, 12F, J=9.05 Гц, CF ₂). УФ (перфтордекалин) (λ, нм (ε, 10³ М^-1*см^-1)): 406 (137,2), 501 (13,9), 583 (4,7), 654 (2,3). Относительная квантовая эффективность фосфоресценции ¹O₂ (ϕ(¹O₂)), 0.83 (в бензоле). ¹⁹ F NMR (282.38 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm): -78.48 (m, 8F, C _Ar -F ^ortho ), -59.44 (dd, 8F, J ₁ = 13.79 Hz, J ₂ = 8.19 Hz , C _Ar -F ^meta ), -48.38 (m, 8F, C F ₂ ), -45.14 (m, 8F, C F ₂ ), -44.33 (m, 8F, C F ₂ ), -42.73 (m, 8F , C F ₂ , -2.98 (t, 12F, J = 9.05 Hz, C F ₂ ). UV (perfluorodecalin) (λ, nm (ε, 10 ³ M ^-1 * cm ^-1 )): 406 (137.2 ), 501 (13.9), 583 (4.7), 654 (2.3), Relative quantum efficiency of phosphorescence ¹ O ₂ (ϕ ( ¹ O ₂ )), 0.83 (in benzene).

Вычислено для C₇₂H₁₈F₆₈N₄O₄ (%): С, 35.00; Н, 0.43; N, 2.00; F, 56.50. Найдено (%): С, 37.68; Н, 0.79; N, 2.44; F, 56.30.Calculated for C ₇₂ H ₁₈ F ₆₈ N ₄ O ₄ (%): C, 35.00; H, 0.43; N, 2.00; F, 56.50. Found (%): C, 37.68; H, 0.79; N, 2.44; F, 56.30.

Приготовление эмульсии с ФС-1 проводят следующим образом.The preparation of the emulsion with FS-1 is as follows.

В толстостенную стеклянную пробирку на 20 мл со сферическим дном помещают 1.3 г раствора ФС-1 в ПФД (с=3,65×10^-3 моль/л), 0.65 г ПМЦП, 4.0 г 10% раствора проксанола-286 и 10 мл раствора для инфузий. Приготовление эмульсии осуществляют методом ультразвукового диспергирования на диспергаторе фирмы Heat system-ultrasonics, модель Sonicator W-375. Полученная эмульсия представляет собой полупрозрачную опалесцирующую субстанцию, слабо окрашенную в желтый цвет.In a 20 ml thick-walled glass tube with a spherical bottom, 1.3 g of FS-1 solution in PFD (c = 3.65 × 10 ^-3 mol / L), 0.65 g of PMCP, 4.0 g of 10% proxanol-286 solution and 10 ml of solution are placed for infusion. The preparation of the emulsion is carried out by ultrasonic dispersion on a dispersant company Heat system-ultrasonics, model Sonicator W-375. The resulting emulsion is a translucent opalescent substance, slightly colored yellow.

Полученная эмульсия имеет следующее соотношение компонентов: ПФД - 8.46%, ПМЦП - 4.06%, проксанол-286 - 2.50%, ФС-1 - 0.037%, NaCl - 0.75%, остальное - вода.The resulting emulsion has the following ratio of components: PFD - 8.46%, PMCP - 4.06%, proxanol-286 - 2.50%, FS-1 - 0.037%, NaCl - 0.75%, the rest is water.

Пример 2Example 2

ФС-2 (мезо-тетракис(6-Н-перфторгексил-1)порфирин) получают в две стадии исходя из пиррола и 7-Н-перфторгептаналя. На первой стадии происходит присоединение альдегида к пирролу под действием гидрооксида натрия с образованием 1-(2-пирролил)-7-Н-перфторгептанола-1 [Sigan, Andrei L, Gusev, Dmitrii V, Chkanikov, Nikolai D, Shmidt, Elena Yu., Ivanov, Andrei V, Mihaleva, Al'bina I, Tetrahedron Letters 52 (2011) 5025-5028]. Затем полученный пирролил-карбинол вводят в реакцию циклизации в присутствии п-толуолсульфокислоты и окисляют дихлордицианохинолином (DDQ) с образованиемPS-2 (meso-tetrakis (6-H-perfluorohexyl-1) porphyrin) is prepared in two stages based on pyrrole and 7-H-perfluoroheptanal. At the first stage, the aldehyde is attached to pyrrole under the action of sodium hydroxide to form 1- (2-pyrrolyl) -7-H-perfluoroheptanol-1 [Sigan, Andrei L, Gusev, Dmitrii V, Chkanikov, Nikolai D, Shmidt, Elena Yu. , Ivanov, Andrei V, Mihaleva, Al'bina I, Tetrahedron Letters 52 (2011) 5025-5028]. Then, the resulting pyrrolyl-carbinol is introduced into the cyclization reaction in the presence of p-toluenesulfonic acid and oxidized with dichlorodicyanoquinoline (DDQ) to form

ФС-2.FS-2.

Стадия 1Stage 1

7-Н-перфторгептаналь (6.0 г, 20 ммоль) помещают в сосуд Шленка на 50 мл, дегазируют и заполняют аргоном. Прибавляют пиррол (2.68 г, 40 ммолей) и измельченный NaOH (2.08 г, 52 ммоль), полученную смесь интенсивно перемешивают в течение 2-х часов до прекращения разогрева, оставляют на ночь при комнатной температуре. Затем полученную пастообразную массу помещают в воду (30 мл) и экстрагируют продукт хлористым метиленом (2×20 мл). Органическую фазу сушат над сульфатом натрия. После удаления растворителя получен твердый продукт-сырец темно-красного цвета. После перекристаллизации из бензола получают 3.24 г белого кристаллического вещества, (выход 37%).7-H-perfluoroheptanal (6.0 g, 20 mmol) was placed in a 50 ml Schlenk vessel, degassed and filled with argon. Pyrrole (2.68 g, 40 mmol) and ground NaOH (2.08 g, 52 mmol) were added, the resulting mixture was stirred vigorously for 2 hours until the heating ceased, left overnight at room temperature. Then the resulting pasty mass is placed in water (30 ml) and the product is extracted with methylene chloride (2 × 20 ml). The organic phase is dried over sodium sulfate. After removal of the solvent, a solid dark red crude product was obtained. After recrystallization from benzene, 3.24 g of a white crystalline substance is obtained (yield 37%).

¹Н ЯМР (300.13 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): 2.51 (д, 1H, J₁=4.77 Гц, ОН); 5.31 (дм,1H, J=16.75 Гц, СН(ОН)); 6.07 (тт, 1H, J_HF=51.98 Гц, J_HF=5.25 Гц, CF₂ H); 6.24 (м, 1H, Pyr-H); 6.35 (м, 1H, Pyr-H)), 6.90 (м, 1Н, Pyr-H) ); 8.55 (с, 1H, NH). ¹ H NMR (300.13 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm): 2.51 (d, 1H, J ₁ = 4.77 Hz, O H ); 5.31 (dm, 1H, J = 16.75 Hz, C H (OH)); 6.07 (tt, 1H, J _HF = 51.98 Hz, J _HF = 5.25 Hz, CF ₂ H ); 6.24 (m, 1H, Pyr- H ); 6.35 (m, 1H, Pyr- H )); 6.90 (m, 1H, Pyr- H )); 8.55 (s, 1H, N H ).

¹⁹F ЯМР (282.38 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): -59.37 (д, 2F, J=30.52 Гц); -51.89 (с, 2F); -46.85 (д, 1F, J=280.43 Гц, А часть АВ-системы); -45.76 (д, 2F, J=70.19 Гц); -44.39 (д, 2F, J=42.72 Гц); -43.89 (с, 2F); -40.97 (дт, 1F, J=280.43 и 15.78 Гц, В часть АВ-системы). ¹⁹ F NMR (282.38 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm): -59.37 (d, 2F, J = 30.52 Hz); -51.89 (s, 2F); -46.85 (d, 1F, J = 280.43 Hz, A part of the AV system); -45.76 (d, 2F, J = 70.19 Hz); -44.39 (d, 2F, J = 42.72 Hz); -43.89 (s, 2F); -40.97 (dt, 1F, J = 280.43 and 15.78 Hz, part of the AV system).

Стадия 2Stage 2

Моногидрат толуолсульфокислоты (0.057 г, 0.3 ммоль) растворяют в сухом бензоле (650 мл) и кипятят с насадкой Дина-Старка, заполненной свежепрокаленными молекулярными ситами

и эффективным холодильником в течение 30 минут. Пропускают через реакционную смесь аргон в течение 20 минут. Прибавляют 7-Н-1-(1-Н-пиррол-2-ил)-перфторгептанол-1 (0.4 г, 1.0 ммоль) и кипятят 45 минут, прибавляют DDQ (0.59 г, 2.6 ммоль) и продолжают кипячение еще 30 минут. Прибавляют триэтиламин (0.04 мл, 0.3 ммоля) при перемешивании и удаляют растворитель. Растворяют остаток в хлороформе и пропускают через слой силикагеля. Полученный твердый остаток (0.2 г) промывают метанолом на фильтре до бесцветного раствора, нерастворенный остаток очищают хроматографически (силикагель, элюент гексан-хлороформ = 2-1). Получают 80 мг фиолетово-коричневого порошка (выход 21%).Toluenesulfonic acid monohydrate (0.057 g, 0.3 mmol) is dissolved in dry benzene (650 ml) and boiled with a Dean-Stark nozzle filled with freshly calcined molecular sieves

and an efficient refrigerator for 30 minutes. Argon was passed through the reaction mixture for 20 minutes. 7-H-1- (1-H-pyrrol-2-yl) -perfluoroheptanol-1 (0.4 g, 1.0 mmol) was added and boiled for 45 minutes, DDQ (0.59 g, 2.6 mmol) was added and boiling was continued for another 30 minutes. Triethylamine (0.04 ml, 0.3 mmol) was added with stirring and the solvent was removed. Dissolve the residue in chloroform and pass through a layer of silica gel. The obtained solid residue (0.2 g) was washed with methanol on a filter to a colorless solution, the insoluble residue was purified by chromatography (silica gel, eluent hexane-chloroform = 2-1). Obtain 80 mg of violet-brown powder (yield 21%).

¹Н ЯМР (300.13 МГц, CDCl₃, δ, м.д.): -2.28 (с, 2Н, NH); 6.28 (т, 4Н, J_HF=52.30 Гц, CF₂ H); 9.55 (с, 8Н, Pyr-H). ¹⁹F ЯМР (CDCl₃, δ, м.д.): -61.10 (с, 2F); -53.37 (с, 2F); -47.15 (с, 2F); -45.27 (с, 2F); -37.96 (с, 2F). УФ (в перфтордекалине) (λ, нм): 410, 514, 547, 598, 654. ¹ H NMR (300.13 MHz, CDCl ₃ , δ, ppm): -2.28 (s, 2H, N H ); 6.28 (t, 4H, J _HF = 52.30 Hz, CF ₂ H ); 9.55 (s, 8H, Pyr- H ). ¹⁹ F NMR (CDCl ₃ , δ, ppm): -61.10 (s, 2F); -53.37 (s, 2F); -47.15 (s, 2F); -45.27 (s, 2F); -37.96 (s, 2F). UV (in perfluorodecalin) (λ, nm): 410, 514, 547, 598, 654.

Относительная квантовая эффективность фосфоресценции ¹O₂ (ϕ(¹О₂)), 0.72 (в бензоле).The relative quantum efficiency of phosphorescence is ¹ O ₂ (ϕ ( ¹ O ₂ )), 0.72 (in benzene).

Приготовление эмульсии с ФС-2 осуществляют так же, как описано в Примере 1 для эмульсии с ФС-1.The preparation of the emulsion with FS-2 is carried out as described in Example 1 for an emulsion with FS-1.

В толстостенную стеклянную пробирку на 20 мл со сферическим дном помещают 1.3 г раствора ФС-2 в ПФД (с=1,81×10^-3 моль/л), 0.65 г ПМЦП, 4.0 г 10% раствора проксанола-286 и 10 мл раствора для инфузий. Приготовление эмульсии осуществляют методом ультразвукового диспергирования. Полученная эмульсия представляет из себя полупрозрачную опалесцирующую субстанцию, слабо окрашенную в желтый цвет.1.3 g of FS-2 solution in PFD (c = 1.81 × 10 ^-3 mol / L), 0.65 g of PMCP, 4.0 g of 10% proxanol-286 solution and 10 ml of solution are placed in a 20 ml thick-walled glass tube with a spherical bottom for infusion. The preparation of the emulsion is carried out by ultrasonic dispersion. The resulting emulsion is a translucent opalescent substance, slightly colored yellow.

Полученная эмульсия имеет следующее соотношение компонентов: ПФД - 8.15%, ПМЦП - 4.08%, проксанол-286 - 2.51%, ФС-2 - 0.012%, NaCl - 0.77%, остальное - вода.The resulting emulsion has the following ratio of components: PFD - 8.15%, PMCP - 4.08%, proxanol-286 - 2.51%, FS-2 - 0.012%, NaCl - 0.77%, the rest is water.

Образцы заявляемой композиции в виде эмульсий, полученных в примерах 1 и 2, а именно эмульсии ФС-1 и ФС-2, были протестированы на фототоксичность.Samples of the claimed composition in the form of emulsions obtained in examples 1 and 2, namely emulsions FS-1 and FS-2, were tested for phototoxicity.

Для экспериментов использовали клеточную линию НСТ116 - аденокарцинома толстой кишки человека. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением следующих компонентов до конечных концентраций: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Условия культивирования: 37°C, 5% CO₂ в увлажненной атмосфере. В экспериментах использовали культуру в логарифмической фазе роста.For the experiments, the HCT116 cell line, a human colon adenocarcinoma, was used. Cells were cultured in DMEM supplemented with the following components to final concentrations: 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. Cultivation conditions: 37 ° C, 5% CO ₂ in a humidified atmosphere. The experiments used culture in the logarithmic phase of growth.

Клетки рассевали в 96-луночные планшеты (Costar, США) в концентрации 5-10×10³ клеток в 190 мкл культуральной среды. В лунки с клетками вносили образцы эмульсии из примеров 1 и 2, а также ФС-1 и ФС-2 из 10 мМ растворов ДМФ до конечных концентраций ФС-1 и ФС-2 в культуральной среде 5,10, 20 мкМ. В контролях - клетки с эмульсией, не содержащей ФС (соотношение эмульсия: клеточная среда 1:2 по объему) и интактные клетки. Планшеты с данными пробами готовили для исследования темновой и фототоксичности - по 1 планшету на измерение в соответствующем режиме. Каждую концентрацию исследовали при 3 повторах. Культуры инкубировали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO₂ в течение 24 часов. После окончания инкубации планшеты для исследования темновой токсичности оставляли в темноте, остальные - освещали 10 минут красным лазером (633 нм), после чего инкубировали еще 1 час при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO₂.Cells were scattered in 96-well plates (Costar, USA) at a concentration of 5-10 × 10 ³ cells in 190 μl of culture medium. The emulsion samples from Examples 1 and 2, as well as PS-1 and PS-2 from 10 mM DMF solutions to final concentrations of PS-1 and PS-2 in a culture medium of 5.10, 20 μM were added to the cell wells. In the controls, cells with an emulsion that does not contain PS (emulsion: cell medium ratio 1: 2 by volume) and intact cells. Tablets with these samples were prepared for the study of dark and phototoxicity - 1 tablet per measurement in the corresponding mode. Each concentration was investigated in 3 repetitions. The cultures were incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO ₂ for 24 hours. After incubation, the dark toxicity test plates were left in the dark, the rest were illuminated for 10 minutes with a red laser (633 nm), after which they were incubated for 1 hour at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO ₂ .

Жизнеспособность клеток определяли методом МТТ-теста (цветная реакция, развивающаяся при восстановлении МТТ в формазан митохондриями живых клеток). В лунки вносили по 20 мкл водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия), инкубировали 1,5 часа при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO₂. После окончания инкубации культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Multiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны 591 нм. Процент клеток, выживших в экспериментальных лунках, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности в этих лунках к средней оптической плотности контрольных интактных лунок (значения последних приняты за 100%). Результаты представлены в таблицах 1 и 2.Cell viability was determined by the MTT test (a color reaction that develops when MTT is restored to formazan by mitochondria of living cells). 20 μl of MTT aqueous solution (5 mg / ml, PanEco, Russia) was added to the wells, incubated for 1.5 hours at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO ₂ content. After incubation, the culture medium was taken, the cells were resuspended in 100 μl DMSO, and the optical density of the solution was measured on a Multiscan FC plate spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) at a wavelength of 591 nm. The percentage of cells that survived in the experimental wells was calculated as the quotient of the division of the average optical density in these wells to the average optical density of the control intact wells (the values of the latter are taken as 100%). The results are presented in tables 1 and 2.

Результаты определения темновой токсичности показали, что ФС-1 и ФС-2 как в ДМФ растворах, так и в составе композиций в виде эмульсии являются нетоксичными для клеток (выживаемость больше 90%). Кроме того, эмульсия, не содержащая фотосенсибилизаторов, благотворно влияет на жизнеспособность клеток, под ее действием в условиях эксперимента прирост клеток составил 30% относительно контрольной интактной пробы (% выживаемости - 130).The results of the determination of dark toxicity showed that PS-1 and PS-2 both in DMF solutions and in the composition of the compositions in the form of an emulsion are non-toxic to cells (survival rate of more than 90%). In addition, an emulsion that does not contain photosensitizers has a beneficial effect on cell viability; under its action, under the conditions of the experiment, the cell growth was 30% relative to the control intact sample (% survival rate - 130).

Результаты определения фототоксичности образцов фотосенсибилизаторов (ФС-1 и ФС-2) показывают, что цитотоксическое действие ФС усиливается, когда ФС вводят в составе заявляемых композиций в виде эмульсий. Доказано, что эффект гибели клеток обусловлен именно действием фотосенсибилизатора, поскольку эмульсия, не содержащая ФС не обладает фототоксичностью (% выживаемости - 97 относительно интактной пробы). Дополнительным доказательством служит различие в процентах выживаемости клеток под действием разных фотосенсибилизаторов, вводимых как в составе эмульсии, так и в ДМФ растворе. Например, ФС-2 обладает большим фототоксическим эффектом, чем ФС-1, он в большей степени вызывает гибель опухолевых клеток при введении в составе эмульсии, чем ФС-1. При введении всех исследуемых ФС в составе заявляемой композиции в виде эмульсии их цитотоксическое действие выше, чем при введении в растворе.The results of determination of the phototoxicity of photosensitizer samples (FS-1 and FS-2) show that the cytotoxic effect of PS is enhanced when PS is introduced into the composition of the claimed compositions in the form of emulsions. It was proved that the effect of cell death is caused precisely by the action of the photosensitizer, since an emulsion that does not contain PS does not have phototoxicity (survival rate is 97 relative to the intact sample). Additional evidence is the difference in the percentage of cell survival under the influence of different photosensitizers introduced both in the composition of the emulsion and in the DMF solution. For example, FS-2 has a greater phototoxic effect than FS-1, it causes more death of tumor cells when introduced into the emulsion than FS-1. With the introduction of all the studied FS in the composition of the claimed composition in the form of an emulsion, their cytotoxic effect is higher than when introduced in solution.

Claims

1. Composition for use in the photodynamic therapy of cancer, which is an emulsion of fluorocarbons in water, comprising a photosensitizer and an emulsion stabilizer, characterized in that meso-tetrakis (2,3,5,6-tetrafluoro-4- (1, 5, 1) is used as a photosensitizer 1-H, H-perfluoroheptyloxy) phenyl) porphyrin or meso-tetrakis (6-H-perfluorohexyl-1) porphyrin, soluble in the fluorocarbon phase, in the following ratio, wt. %:

A mixture of perfluorodecalin fluorocarbons (PFD) and perfluoro-N- (4-methylcyclohexyl) piperidine (PMCP) with a mass ratio of 2: 1 5-30 Proxanol-268 2-8 Photosensitizer 0.01-0.04 NaCl 0.7-0.9 Water rest

2. The composition according to p. 1, characterized in that it has antitumor activity.