RU2626269C2 - Method and device for excitating fluorescence by long-range surface waves on single-photon crystal - Google Patents

Method and device for excitating fluorescence by long-range surface waves on single-photon crystal Download PDF

Info

Publication number
RU2626269C2
RU2626269C2 RU2015150238A RU2015150238A RU2626269C2 RU 2626269 C2 RU2626269 C2 RU 2626269C2 RU 2015150238 A RU2015150238 A RU 2015150238A RU 2015150238 A RU2015150238 A RU 2015150238A RU 2626269 C2 RU2626269 C2 RU 2626269C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
fluorescence
sample
range
long
excitation
Prior art date
Application number
RU2015150238A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2015150238A (en
Inventor
Дмитрий Владимирович Клинов
Кирилл Александрович Прусаков
Дмитрий Викторович Басманов
Original Assignee
Дмитрий Владимирович Клинов
Кирилл Александрович Прусаков
Дмитрий Викторович Басманов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дмитрий Владимирович Клинов, Кирилл Александрович Прусаков, Дмитрий Викторович Басманов filed Critical Дмитрий Владимирович Клинов
Priority to RU2015150238A priority Critical patent/RU2626269C2/en
Publication of RU2015150238A publication Critical patent/RU2015150238A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2626269C2 publication Critical patent/RU2626269C2/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens

Abstract

FIELD: physics.
SUBSTANCE: fluorescence is excited by an electromagnetic field localized near the interface between the sample-containing liquid and the solid phase. As the solid phase, a multilayer structure is used with periodically varying refractive indices of layers, wherein the number, thickness and refractive indices of the layers are selected such that long-range surface waves of, at least, one mode, the wavelength of wich is within the wavelength range providing effective excitation of sample fluorescence.
EFFECT: increasing the contrast of the images obtained and enabling the study of near-surface processes and adsorption.
3 cl, 8 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к оптической промышленности, к области систем засветки образца на флуоресцентных микроскопах и может быть использовано для проведения лабораторных исследований и медико-биологических анализов.The invention relates to the optical industry, to the field of sample illumination systems using fluorescence microscopes and can be used for laboratory research and biomedical analyzes.

Уровень техникиState of the art

На протяжении последних лет во всем мире отмечается значительный рост количества коммерчески доступных устройств для реализации различных методик в флуоресцентной микроскопии [1]. Одной из проблем широкопольной флуоресцентной микроскопии, на решение которой нацелены данные устройства, является наличие паразитного фонового сигнала от объектов, находящихся вне плоскости фокуса объектива, ухудшающего контраст получаемых микроскопических изображений.Over the past few years, there has been a significant increase in the number of commercially available devices for implementing various techniques in fluorescence microscopy [1]. One of the problems of wide-field fluorescence microscopy, which these devices are aimed at solving, is the presence of a spurious background signal from objects outside the plane of the focus of the lens, which worsens the contrast of the obtained microscopic images.

В связи с этим ставится вопрос о создании систем засветки, позволяющих возбуждать флуоресценцию только в тонком слое объема образца. Кроме увеличения контраста получаемых изображений, несомненным преимуществом таких систем перед классическими системами объемной засветки является возможность изучать приповерхностные процессы и адсорбцию [2].In this regard, the question arises of creating exposure systems that allow excitation of fluorescence only in a thin layer of the sample volume. In addition to increasing the contrast of the obtained images, the undoubted advantage of such systems over classical systems of volumetric illumination is the ability to study surface processes and adsorption [2].

Ближайшим аналогом изобретения является метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (ФМПВО) [3]. В этом методе для возбуждения флуоресценции образца используют затухающую электромагнитную волну, которая локализована на границе раздела двух сред, имеющих различные показатели преломления. Для возбуждения флуоресценции по методике ФМПВО свет на образец заводят под углом, большим или равным критическому, из среды, показатель преломления которой больше показателя преломления образца. Глубина проникновения поля в образец зависит от длины волны света, угла засветки и показателей преломления сред. На практике в качестве описанной выше границы раздела наиболее часто используют границу между образцом и стеклом. Существуют две основные схемы реализации метода ФМПВО: призменный метод и метод с высокоапертурным иммерсионным объективом.The closest analogue of the invention is the method of fluorescence microscopy of total internal reflection (FMPVO) [3]. In this method, a damped electromagnetic wave, which is localized at the interface between two media with different refractive indices, is used to excite fluorescence of the sample. To excite fluorescence according to the FMPVO method, light is injected onto a sample at an angle greater than or equal to a critical angle from a medium whose refractive index is greater than the refractive index of the sample. The depth of field penetration into the sample depends on the wavelength of light, the angle of illumination, and the refractive indices of the media. In practice, the interface between the sample and glass is most often used as the interface described above. There are two main schemes for the implementation of the FMFVO method: the prism method and the method with a high aperture immersion lens.

Основными недостатками метода ФМПВО являются необходимость постоянной юстировки оптической системы для достижения оптимального угла засветки и необходимость использовать дорогостоящий высокоапертурный иммерсионный объектив при реализации соответствующей схемы.The main disadvantages of the FMPVO method are the need for constant alignment of the optical system to achieve the optimal illumination angle and the need to use an expensive high-aperture immersion lens when implementing the corresponding scheme.

Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Целью настоящего изобретения является разработка способа и устройства засветки образца, которое не требует постоянной юстировки (перед каждым использованием прибора), не содержит дорогостоящих компонент и позволяет возбуждать флуоресценцию только в тонком слое объема образца за счет локализации там электромагнитного излучения источника засветки.The aim of the present invention is to develop a method and device for illuminating the sample, which does not require constant adjustment (before each use of the device), does not contain expensive components and allows excitation of fluorescence only in a thin layer of the volume of the sample due to the localization of electromagnetic radiation from the illuminating source there.

Технический результат, сформулированный в цели изобретения, достигается за счет использования для возбуждения флуоресценции образца длиннопробежных поверхностных волн оптического диапазона, распространяющихся вдоль границы раздела между средой, в которой находится образец (жидкостью или воздухом), и твердой поверхностью одномерного фотонного кристалла. При этом структуру фотонного кристалла выбирают таким образом, чтобы поверхностные волны, которые могут возбуждаться на данной границе раздела, имели длину волны, подходящую для эффективного возбуждения флуоресценции образца.The technical result formulated for the purpose of the invention is achieved through the use of long-range surface waves of the optical range propagating along the interface between the medium in which the sample (liquid or air) and the solid surface of a one-dimensional photonic crystal are used to excite fluorescence. The structure of the photonic crystal is chosen so that surface waves that can be excited at a given interface have a wavelength suitable for efficient excitation of fluorescence of the sample.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Основным элементом, который позволяет предложенному способу и устройству достигать требуемого технического результата, является одномерный фотонный кристалл (далее ОФК) - многослойная структура с периодически меняющимися показателями преломления слоев. Как показано в работе [4], варьируя количество, толщину и показатели преломления слоев, а также показатель преломления внешней среды, можно создать необходимые условия для существования на поверхности ОФК одной или нескольких мод длиннопробежных поверхностных электромагнитных волн оптического диапазона. Длина пробега таких волн вдоль границы раздела между твердой поверхностью ОФК и жидкой или газообразной внешней средой может достигать нескольких сот микрометров. Кроме того, изменяя указанные выше параметры ОФК, можно также варьировать глубину проникновения электромагнитного поля поверхностной волны в объем внешней среды.The main element that allows the proposed method and device to achieve the desired technical result is a one-dimensional photonic crystal (hereafter OFC) - a multilayer structure with periodically varying refractive indices of the layers. As shown in [4], by varying the number, thickness, and refractive indices of the layers, as well as the refractive index of the external medium, it is possible to create the necessary conditions for the existence of one or several modes of long-range surface electromagnetic waves of the optical range on the surface of the optical complex. The mean free path of such waves along the interface between the solid surface of the OFC and the liquid or gaseous external medium can reach several hundred micrometers. In addition, by changing the above parameters of the OFC, one can also vary the depth of penetration of the electromagnetic field of the surface wave into the volume of the external medium.

Данные уникальные свойства ОФК позволяют использовать длиннопробежные поверхностные волны для возбуждения флуоресценции образцов только в тонком приповерхностном слое на одной или нескольких длинах волн. За счет большой длины пробега такие волны равномерно возбуждают флуоресценцию на площадях, сопоставимых с размерами полей микроскопных объективов среднего и высокого увеличения. При этом, как уже отмечалось ранее, параметры ОФК выбирают таким образом, чтобы данные длины волн попадали в спектр поглощения флуорофора, находящегося в образце, и эффективно возбуждали его флуоресценцию. Кроме того, возможность изменять глубину проникновения поверхностной волны во внешнюю среду позволяет возбуждать флуоресценцию объектов различного размера, а также локализованных на различных расстояниях от поверхности ОФК.These unique properties of OPC allow the use of long-range surface waves to excite fluorescence of samples only in a thin surface layer at one or more wavelengths. Due to the long path length, such waves uniformly excite fluorescence in areas comparable to the size of the fields of medium and high magnification microscopic lenses. In this case, as already noted above, the OFC parameters are chosen in such a way that these wavelengths fall into the absorption spectrum of the fluorophore in the sample and effectively excite its fluorescence. In addition, the ability to change the depth of penetration of a surface wave into the external medium allows one to excite fluorescence of objects of various sizes, as well as localized at different distances from the surface of the OFC.

Преимущества такого способа заключаются в том, что он позволяет получать микроскопические изображения, обладающие более высоким контрастом и разрешением, по сравнению с изображениями, полученными при использовании стандартных методик засветки параллельным пучком через объектив, реализованными в большинстве коммерчески доступных эпифлуоресцентных микроскопов.The advantages of this method are that it allows you to obtain microscopic images with a higher contrast and resolution, compared with images obtained using standard methods of exposure to a parallel beam through the lens, implemented in most commercially available epifluorescence microscopes.

Пример реализации изобретенияAn example implementation of the invention

Для демонстрации возможностей заявленного способа, а также для иллюстрации других признаков, заявленных в техническом результате изобретения, мы собрали прототип устройства для возбуждения флуоресценции при помощи длиннопробежных поверхностных волн и провели несколько модельных экспериментов. Следует отметить, что конкретная конструкция данного устройства может принимать различные модификации в зависимости от требуемых длин волн, метода создания ОФК, производителя оптических компонент и конструкции флуоресцентного микроскопа, на который предполагается устанавливать данную систему засветки образца. Однако данные вариации не меняют сущность изобретения и не выходят за пределы объема изобретения, определенного в формуле изобретения.To demonstrate the capabilities of the claimed method, as well as to illustrate other features claimed in the technical result of the invention, we assembled a prototype device for exciting fluorescence using long-range surface waves and conducted several model experiments. It should be noted that the specific design of this device can take various modifications depending on the required wavelengths, the method of creating an OFC, the manufacturer of the optical components, and the design of the fluorescence microscope on which this sample exposure system is to be installed. However, these variations do not change the essence of the invention and do not go beyond the scope of the invention defined in the claims.

На фигуре 1 приведена схема заявленного устройства. На фигуре 1 присутствуют следующие условные обозначения: 1 - лазер, 2 - поляризатор, 3 - расширитель пучка с регулировкой схождения, 4 - призма, 5 - цилиндрическая линза, 6 - иммерсионное масло, 7 - проточная микрофлюидная ячейка, 8 - объектив микроскопа, 9 - объекты, адсорбированные на стенку микрофлюидной ячейки, противоположенную поверхности ОФК, 10 - объекты, адсорбированные на поверхность ОФК, 11 - ОФК, 12 - ПЗС камера, кроме того, толстыми стрелками показан ход оптических лучей. Данная установка была собрана на предметном столике инвертированного микроскопа, при реализации на микроскопах прямого типа схема принципиально не изменяется.The figure 1 shows a diagram of the claimed device. The figure 1 contains the following conventions: 1 - laser, 2 - polarizer, 3 - beam expander with convergence adjustment, 4 - prism, 5 - cylindrical lens, 6 - immersion oil, 7 - flow microfluidic cell, 8 - microscope objective, 9 - objects adsorbed on the wall of the microfluidic cell opposite the surface of the OFC, 10 - objects adsorbed on the surface of the OFC, 11 - OFC, 12 - CCD camera, in addition, the thick arrows show the course of optical rays. This setup was assembled on a stage of an inverted microscope; when implemented on direct-type microscopes, the circuit does not fundamentally change.

Центральным элементом данной системы засветки, как уже отмечалось выше, является ОФК. Основной конструктивной особенностью и отличительным признаком ОФК, необходимым для реализации заявленного способа, является то, что поверхностные моды, возбуждаемые на границе раздела между его поверхностью и внешней средой, должны иметь длину волны, подходящую для возбуждения флуоресценции образца. Таким образом, количество и толщину слоев ОФК рассчитывают, опираясь на спектральные характеристики флуорофора образца, и на значения показателя преломления среды, в которой находится образец. При этом применяют численные методы на основе описанного в литературе метода импедансов [4], либо на основе матричного метода [5]. Из данных работ следует, что структура ОФК может быть рассчитана для возбуждения на ней одной или нескольких поверхностных мод, с любой требуемой длинной волны из диапазона от ближнего ультрафиолета до ближнего инфракрасного. В нашей демонстрации в качестве модельных объектов для микроскопических исследований (фигура 1, обозначение 9, 10) мы использовали флуоресцентно меченные полимерные микрочастицы диаметром ~6 мкм, имеющие широкий спектр поглощения с максимумом в районе 640 нм и максимумом эмиссии в районе 710 нм. Для возбуждения флуоресценции этих объектов был изготовлен подходящий ОФК при помощи метода магнетронного напыления диэлектрических покрытий. Данный ОФК состоял из полированной основы из стекла марки БК-7 толщиной 1,5 мм, 3 слоев SiO2 толщиной 183,5 нм и Ta2O5 толщиной 111,5 нм и завершающего слоя SiO2 толщиной 346,2 нм. На поверхности данной многослойной структуры могут распространяться моды с длинами волн в окрестности 659 нм при условии, что показатель преломления внешней среды близок к 1,33 - т.е. в том случае, если внешняя среда является водой при комнатной температуре. Видно, что данная длина волны не совпадает с максимумом поглощения флуоресцентного красителя в используемых нами полимерных микрочастицах, однако она находится внутри спектральной области, обеспечивающей эффективное возбуждение данного флуоресцентного красителя.The central element of this illumination system, as noted above, is OFC. The main design feature and hallmark of the OFC necessary for the implementation of the claimed method is that the surface modes excited at the interface between its surface and the external environment must have a wavelength suitable for excitation of fluorescence of the sample. Thus, the number and thickness of the OPC layers are calculated based on the spectral characteristics of the fluorophore of the sample and the values of the refractive index of the medium in which the sample is located. In this case, numerical methods are used based on the impedance method described in the literature [4], or on the basis of the matrix method [5]. From these works it follows that the OFC structure can be calculated to excite one or several surface modes on it, with any desired wavelength from the range from near ultraviolet to near infrared. In our demonstration, as model objects for microscopic studies (Figure 1, designation 9, 10), we used fluorescently labeled polymer microparticles with a diameter of ~ 6 μm, which have a wide absorption spectrum with a maximum at 640 nm and an emission maximum at 710 nm. To excite the fluorescence of these objects, a suitable OFC was fabricated using the method of magnetron sputtering of dielectric coatings. This OFC consisted of a polished base made of glass grade BK-7 with a thickness of 1.5 mm, 3 layers of SiO 2 with a thickness of 183.5 nm and Ta 2 O 5 with a thickness of 111.5 nm and a final layer of SiO 2 with a thickness of 346.2 nm. Modes with wavelengths in the vicinity of 659 nm can propagate on the surface of this multilayer structure, provided that the refractive index of the external medium is close to 1.33 - i.e. in the event that the external environment is water at room temperature. It can be seen that this wavelength does not coincide with the maximum absorption of the fluorescent dye in the polymer microparticles used by us, however, it is located inside the spectral region that ensures the effective excitation of this fluorescent dye.

Для выполнения условий дисперсии и ввода излучения с волновым вектором, необходимым для возбуждения поверхностной волны, ОФК присоединили к одной из граней призмы (фигура 1, обозначение 4) с подходящим показателем преломления при помощи иммерсионного масла (фигура 1, обозначение 6), показатель преломления которого также согласован с материалом основы ОФК. Вместо иммерсионного масла для присоединения ОФК к призме могут также использоваться различные оптически клеи или гели, при этом основным отличительным признаком таких соединений является согласование показателей преломления. Система возбуждения поверхностной волны состоит из источника лазерного излучения, расширителя пучка с регулировкой схождения и цилиндрической линзы (фигура 1, обозначения 1, 3, 5 соответственно). В качестве источника нами использовался полупроводниковый лазер с длиной волны 660,7 нм, которая подходит как для возбуждения поверхностных волн на используемом нами ОФК, так и для возбуждения флуоресценции красителя в полимерных микрочастицах. Отличительной особенностью такой системы засветки, необходимой для реализации заявленного изобретения, является фокусировка излучения источника в линию на поверхности одномерного фотонного кристалла при помощи расширителя пучка с регулировкой схождения и цилиндрической линзы. Такая один раз сфокусированная и настроенная под нужный диапазон углов схема позволяет избавиться от постоянной юстировки, необходимой при засветке параллельным пучком, которая реализуется в системе ФМПВО. Так происходит, потому что цилиндрическая линза собирает на поверхности ОФК сразу целый набор углов засветки, при этом, если диапазон углов выбран верно, в данном наборе всегда найдется угол, под которым возбуждается поверхностная волна, несмотря на то, что точное значение угла возбуждения постоянно меняется во времени. Такие изменения неизбежно происходят в течение эксперимента за счет флуктуаций показателя преломления и изменений свойств поверхности ОФК за счет адсорбции частиц. При этом остальные углы отражаются от границы раздела и выходят из призмы, не создавая паразитной засветки. Для уменьшения ширины фокусной перетяжки цилиндрическую линзу также закрепили на призме при помощи иммерсионного масла. Следует пояснить, что возбуждение флуоресценции в тонком слое при помощи длиннопробежной поверхностной волны следует наблюдать в стороне от описанной выше перетяжки фокуса цилиндрической линзы.To fulfill the conditions of dispersion and input radiation with a wave vector necessary for exciting a surface wave, OFC was attached to one of the faces of the prism (figure 1, designation 4) with a suitable refractive index using immersion oil (figure 1, designation 6), the refractive index of which also aligned with OFC base material. Instead of immersion oil, various optical adhesives or gels can also be used to attach the OFC to the prism, and the main distinguishing feature of such compounds is the coordination of refractive indices. The surface wave excitation system consists of a laser source, a beam expander with adjustable convergence and a cylindrical lens (figure 1, designations 1, 3, 5, respectively). As a source, we used a semiconductor laser with a wavelength of 660.7 nm, which is suitable both for excitation of surface waves on the OFC used by us, and for excitation of fluorescence of a dye in polymer microparticles. A distinctive feature of such an illumination system necessary for the implementation of the claimed invention is the focusing of the radiation of the source in a line on the surface of a one-dimensional photonic crystal using a beam expander with adjustable convergence and a cylindrical lens. Such a once focused and tuned to the desired range of angles scheme allows you to get rid of the constant alignment necessary when exposed to a parallel beam, which is implemented in the FMPVO system. This happens because a cylindrical lens immediately collects a whole set of illumination angles on the surface of the optical photographic interface, and if the range of angles is chosen correctly, this set always contains the angle at which the surface wave is excited, despite the fact that the exact value of the excitation angle is constantly changing in time. Such changes inevitably occur during the experiment due to fluctuations in the refractive index and changes in the properties of the RPA surface due to particle adsorption. In this case, the remaining angles are reflected from the interface and exit the prism without creating spurious illumination. To reduce the width of the focal waist, a cylindrical lens was also fixed to the prism using immersion oil. It should be clarified that fluorescence excitation in a thin layer by means of a long-range surface wave should be observed away from the focus constriction of the cylindrical lens described above.

Для дополнительной детекции поверхностной длиннопробежной волны в нашем демонстрационном эксперименте мы добавили к заявленной системе поляризатор (фигура 1, обозначение 2) и ПЗС камеру для детектирования излучения, отраженного от границы раздела и вышедшего из призмы (фигура 1, обозначение 12). Эти компоненты не являются необходимыми для реализации заявленного изобретения и служат только для иллюстрации принципов работы данного устройства. Кроме того, используемый нами ОФК обладает тем свойством, что на нем возбуждаются поверхностные волны только при условии, что инициирующее излучение имеет ТЕ поляризацию. Таким образом, вращая поляризацию засветки, можно «включать» и «выключать» поверхностную волну, не отключая лазерного источника. Поляризационная селективность ОФК также не является необходимым условием реализации данного изобретения.For additional detection of a surface long-range wave in our demonstration experiment, we added to the claimed system a polarizer (figure 1, designation 2) and a CCD camera for detecting radiation reflected from the interface and emerging from the prism (figure 1, designation 12). These components are not necessary for the implementation of the claimed invention and serve only to illustrate the principles of operation of this device. In addition, the OFC used by us has the property that surface waves are excited on it only under the condition that the initiating radiation has TE polarization. Thus, by rotating the polarization of the illumination, one can “turn on” and “turn off” the surface wave without switching off the laser source. The polarization selectivity of OFC is also not a necessary condition for the implementation of this invention.

На поверхности ОФК была собрана проточная микрофлюидная ячейка (фигура 1, обозначение 7). Высота ячейки составила 50 мкм. Нижней стенкой ячейки, противоположенной ОФК, являлось покровное стекло толщиной 0,17 мм, сквозь которое и происходила съемка процессов в ячейке. Отметим, что конкретная конструкция микрофлюидной ячейки не важна для реализации заявленного изобретения, кроме того, с данным устройством засветки возможно проводить эксперименты в открытом объеме образца, если используется объектив с водной иммерсией.A flowing microfluidic cell was collected on the surface of the OFC (Figure 1, designation 7). The cell height was 50 μm. The bottom wall of the cell, opposite to the OFC, was a 0.17 mm thick coverslip through which the processes in the cell were shot. Note that the specific design of the microfluidic cell is not important for the implementation of the claimed invention, in addition, with this illumination device, it is possible to conduct experiments in the open volume of the sample if a lens with water immersion is used.

На фигуре 2А представлено микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности ОФК, наблюдаемые через объектив с десятикратным увеличением и стандартную для эпифлуоресцентного микроскопа систему оптических фильтров, записанное на ПЗС камеру микроскопа. Фокус микроскопа настроен на объекты с условным обозначением 10 на фигуре 1, при этом засветка обладает поляризацией ТМ, то есть поверхностная волна отсутствует. При этом фактически реализован метод ФМПВО и наблюдается сильная неоднородность засветки вокруг фокусной перетяжки цилиндрической линзы. На фигуре 2Б представлено угловое распределение отраженного излучения такой засветки, вышедшего из призмы, которое представляет собой гауссов профиль. Теперь поляризатор повернули на 90°, и засветка стала обладать ТЕ поляризацией. На фигуре 3А приведено флуоресцентное изображение с того же поля зрения и с той же плоскости фокуса, что и на фигуре 2А, однако, теперь видно, что поверхностная волна распространяется влево от линии фокусировки, возбуждая на своем пути флуоресценцию микрочастиц. На фигуре ЗБ представлено угловое распределение отраженного излучения при засветке с поляризацией ТЕ, на котором хорошо видно падение интенсивности при углах, на которых происходит возбуждение поверхностной волны. Кроме того, в отраженном свете также наблюдается интерференционный эффект, характерный для длиннопробежных волн (см. соответствующие обозначения на фигуре 3Б).Figure 2A shows a microscopic fluorescence image of the surface of the OFC, observed through a lens with a tenfold magnification and a standard optical filter system for an epifluorescence microscope recorded on a CCD microscope camera. The focus of the microscope is tuned to objects with a symbol 10 in figure 1, while the illumination has polarization TM, that is, the surface wave is absent. In this case, the FMFVO method is actually implemented and a strong inhomogeneity of illumination is observed around the focal constriction of the cylindrical lens. Figure 2B shows the angular distribution of the reflected radiation of such a flare emerging from a prism, which is a Gaussian profile. Now the polarizer was rotated 90 °, and the flare began to possess TE polarization. Figure 3A shows a fluorescence image from the same field of view and the same focus plane as in Figure 2A, however, it is now seen that the surface wave propagates to the left of the focus line, exciting microparticle fluorescence in its path. The ST figure shows the angular distribution of the reflected radiation upon exposure to TE polarization, at which the intensity drop is clearly visible at the angles at which the surface wave is excited. In addition, in the reflected light there is also an interference effect characteristic of long-range waves (see the corresponding notation in figure 3B).

Далее мы провели сравнение заявленного способа со стандартным методом засветки образца параллельным пучком через объектив, реализованным в большинстве эпифлуоресцентных микроскопов. Для этого мы сместили плоскость фокуса микроскопа на поверхность нижней стенки микрофлюидной ячейки, то есть на объекты с условным обозначением 9 на фигуре 1. На фигуре 4А представлено флуоресцентное изображение, полученное при таком положении фокуса и при возбуждении флуоресценции по стандартной методике. На данном изображении четко видны объекты, адсорбированные на нижней стенке ячейки, и размыто объекты, адсорбированные на ОФК (обозначены стрелками на фигуре 4А). На фигуре 4Б плоскость фокуса и поле зрения сохранены относительно фигуры 4А, однако, данное флуоресцентное изображение получено при возбуждении флуоресценции с помощью поверхностной волны. Объекты, адсорбированные на нижней стенке ячейки, теперь не видны, что свидетельствует о том, что поверхностная волна не возбудила их флуоресценцию. Данное наблюдение является следствием малой глубины проникновения поля поверхностной волны во внешнюю среду. Вернув теперь плоскость фокуса на поверхность ОФК (т.е. на объекты с условным обозначением 10 на фигуре 1), мы записали флуоресцентное изображение с возбуждением по стандартной методике с того же поля зрения, что и изображение на рисунке 3А (см. фигуру 5). При сравнении изображений на фигурах 3А и 5 видно, что при возбуждении поверхностной волной интенсивность паразитного сигнала от частиц, адсорбированных на нижней стенке микрофлюидной ячейки (т.е. от объектов с условным обозначением 9 на фигуре 1), намного слабее, чем при возбуждении по стандартной методике (объекты обозначены стрелками на рисунке 5).Next, we compared the claimed method with the standard method of exposing a sample to a parallel beam through a lens, implemented in most epifluorescence microscopes. To do this, we shifted the focus plane of the microscope to the surface of the bottom wall of the microfluidic cell, that is, to objects with the symbol 9 in figure 1. Figure 4A shows the fluorescence image obtained at this focus position and when fluorescence was excited by a standard method. In this image, objects adsorbed on the lower wall of the cell are clearly visible, and objects adsorbed on the OFC are blurry (indicated by arrows in Figure 4A). In FIG. 4B, the focus plane and field of view are maintained relative to FIG. 4A, however, this fluorescence image was obtained by excitation of fluorescence using a surface wave. Objects adsorbed on the lower wall of the cell are now invisible, indicating that the surface wave did not excite their fluorescence. This observation is a consequence of the shallow depth of penetration of the surface wave field into the external environment. Having now returned the focus plane to the OFC surface (i.e., to objects with the symbol 10 in Figure 1), we recorded a fluorescent image with excitation according to the standard method from the same field of view as the image in Figure 3A (see figure 5) . When comparing the images in figures 3A and 5, it is seen that when a surface wave is excited, the intensity of the spurious signal from particles adsorbed on the bottom wall of the microfluidic cell (i.e., from objects with the symbol 9 in figure 1) is much weaker than when excited by standard technique (objects are indicated by arrows in Figure 5).

Таким образом, проиллюстрированы все пункты заявленного технического результата данного изобретения.Thus, all points of the claimed technical result of the present invention are illustrated.

Перечень поясняющих рисунков и схем.The list of explanatory drawings and diagrams.

Фигура 1. Схема установки для возбуждения флуоресценции при помощи длиннопробежных поверхностных волн на ОФК.Figure 1. The setup diagram for the excitation of fluorescence using long-range surface waves at the OFC.

Фигура 2. А: Микроскопические флуоресцентные изображение поверхности ОФК при засветке через призму с поляризацией ТМ. Поверхностная волна отсутствует.Figure 2. A: Microscopic fluorescence image of the OFC surface when exposed through a prism with polarization TM. The surface wave is absent.

Б: Картина углового распределения отраженного света при засветке через призму с поляризацией ТМ. Поверхностная волна отсутствует.B: A picture of the angular distribution of reflected light when exposed through a prism with polarization TM. The surface wave is absent.

Фигура 3. А: Микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности ОФК при засветке через призму с поляризацией ТЕ. Наблюдается поверхностная длиннопробежная волна.Figure 3. A: Microscopic fluorescence image of the OFC surface when exposed through a prism with polarization TE. A superficial long-range wave is observed.

Б: Картина углового распределения отраженного света при засветке через призму с поляризацией ТЕ. Наличие провала интенсивности в отраженном свете и наличие характерного эффекта интерференции подтверждает наличие поверхностной длиннопробежной волны.B: A picture of the angular distribution of reflected light when exposed through a prism with polarization TE. The presence of an intensity dip in reflected light and the presence of a characteristic interference effect confirms the presence of a surface long-range wave.

Фигура 4. А: Микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности стенки микрофлюидной ячейки, противоположной ОФК при засветке по стандартной методике эпифлуоресцентной микроскопии.Figure 4. A: Microscopic fluorescence image of the surface of the wall of the microfluidic cell opposite to the OFC during exposure according to standard epifluorescence microscopy.

Б: Микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности стенки микрофлюидной ячейки, противоположной ОФК при засветке через призму с поляризацией ТЕ.B: Microscopic fluorescence image of the surface of the wall of the microfluidic cell opposite to the OFC when exposed through a prism with polarization TE.

Фигура 5. Микроскопическое флуоресцентное изображение поверхности ОФК при засветке по стандартной методике эпифлуоресцентной микроскопии.Figure 5. Microscopic fluorescence image of the surface of the OFC during exposure according to the standard method of epifluorescence microscopy.

ЛитератураLiterature

[1] J.W. Lichtman, J.A. Conchello, Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2005, 2, 910-919.[1] J.W. Lichtman, J.A. Conchello, Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2005, 2, 910-919.

[2] A.N. Asanov, W.W. Wilson, P.B. Oldham. Regenerable Biosensor Platform: A Total Internal Reflection Fluorescence Cell with Electrochemical Control. Anal. Chem. 1998, 70,1156-1163.[2] A.N. Asanov, W.W. Wilson, P.B. Oldham. Regenerable Biosensor Platform: A Total Internal Reflection Fluorescence Cell with Electrochemical Control. Anal. Chem. 1998, 70.1156-1163.

[3] G. Kennedy, D.M. Warshaw. An adjustable total internal reflectance microscopy (tirfm) illuminator apparatus, WO 2012051383 A2, PCT/US2011/056089.[3] G. Kennedy, D.M. Warshaw. An adjustable total internal reflectance microscopy (tirfm) illuminator apparatus, WO 2012051383 A2, PCT / US2011 / 056089.

[4] V.N. Konopsky. Plasmon-polariton waves in nanofilms on one-dimensional photonic crystal surfaces. New Journal of Physics, 2010, 12 (9), 093006.[4] V.N. Konopsky. Plasmon-polariton waves in nanofilms on one-dimensional photonic crystal surfaces. New Journal of Physics, 2010, 12 (9), 093006.

[5] P. Yeh, A. Yariv, C.S. Hong, Electromagnetic propagation in periodic stratified media. J. Opt. Soc. Am. 1977, 67, 423-38.[5] P. Yeh, A. Yariv, C.S. Hong, Electromagnetic propagation in periodic stratified media. J. Opt. Soc. Am. 1977, 67, 423-38.

Claims (3)

1. Способ возбуждения флуоресценции только в тонком слое образца при помощи электромагнитного поля, локализованного вблизи границы раздела между жидкостью, в которой находится образец, и твердой фазы, отличающийся тем, что в качестве твердой фазы используют многослойную структуру с периодически меняющимися показателями преломления слоев, причем количество, толщину и показатели преломления слоев выбирают таким образом, чтобы на данной границе раздела могли возбуждаться длиннопробежные поверхностные волны хотя бы одной моды, длина волны которой находится внутри диапазона длин волн, обеспечивающих эффективное возбуждение флуоресценции образца.1. The method of excitation of fluorescence only in a thin layer of a sample using an electromagnetic field localized near the interface between the liquid in which the sample is located and a solid phase, characterized in that a multilayer structure with periodically varying refractive indices of the layers is used as a solid phase, the number, thickness and refractive indices of the layers are chosen so that long-range surface waves of at least one mode can be excited at a given interface, wavelength which lies within the wavelength range that provides effective excitation of the fluorescence of the sample. 2. Устройство засветки образца на флуоресцентном микроскопе для возбуждения флуоресценции только в тонком слое образца при помощи электромагнитного поля, локализованного вблизи границы раздела между жидкостью, в которой находится образец, и твердой фазой, отличающееся тем, что в качестве твердой фазы используют многослойную структуру с периодически меняющимися показателями преломления слоев, причем количество, толщину и показатели преломления слоев выбирают таким образом, чтобы на данной границе раздела могли возбуждаться длиннопробежные поверхностные волны хотя бы одной моды, длина волны которой находится внутри диапазона длин волн, обеспечивающих эффективное возбуждение флуоресценции образца.2. A device for illuminating a sample with a fluorescence microscope to excite fluorescence only in a thin layer of the sample using an electromagnetic field localized near the interface between the liquid in which the sample is located and the solid phase, characterized in that a multilayer structure with periodic varying refractive indices of the layers, and the number, thickness and refractive indices of the layers are chosen so that long-range ezhnye surface waves at least one mode whose wavelength is within the range of wavelengths that provide efficient excitation of the sample fluorescence. 3. Устройство по п. 2, отличающееся тем, что оптическая система для возбуждения на данной границе раздела длиннопробежных поверхностных волн содержит источник лазерного излучения, расширитель пучка с регулировкой схождения, цилиндрическую линзу и призму, с закрепленной на ней многослойной структурой, при этом лазерное излучение фокусируют в линию на поверхности многослойной структуры.3. The device according to p. 2, characterized in that the optical system for excitation at a given long-range surface wave interface contains a laser source, a beam expander with convergence adjustment, a cylindrical lens and a prism with a multilayer structure attached to it, while the laser radiation focus in a line on the surface of the multilayer structure.
RU2015150238A 2015-11-24 2015-11-24 Method and device for excitating fluorescence by long-range surface waves on single-photon crystal RU2626269C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015150238A RU2626269C2 (en) 2015-11-24 2015-11-24 Method and device for excitating fluorescence by long-range surface waves on single-photon crystal

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015150238A RU2626269C2 (en) 2015-11-24 2015-11-24 Method and device for excitating fluorescence by long-range surface waves on single-photon crystal

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015150238A RU2015150238A (en) 2017-05-29
RU2626269C2 true RU2626269C2 (en) 2017-07-25

Family

ID=59031426

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015150238A RU2626269C2 (en) 2015-11-24 2015-11-24 Method and device for excitating fluorescence by long-range surface waves on single-photon crystal

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2626269C2 (en)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7154598B2 (en) * 2002-07-12 2006-12-26 Decision Biomarkers, Inc. Excitation and imaging of fluorescent arrays
US7362440B2 (en) * 2004-02-20 2008-04-22 The University Of Maryland Far-field optical microscope with a nanometer-scale resolution based on the in-plane image magnification by surface plasmon polaritions
WO2012018364A1 (en) * 2010-07-08 2012-02-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Multi-color fluorescence enhancement from a photonic crystal surface
RU2552386C1 (en) * 2014-02-19 2015-06-10 Валерий Николаевич Конопский Semiconductor radiation source built around long-range surface plasmon

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7154598B2 (en) * 2002-07-12 2006-12-26 Decision Biomarkers, Inc. Excitation and imaging of fluorescent arrays
US7362440B2 (en) * 2004-02-20 2008-04-22 The University Of Maryland Far-field optical microscope with a nanometer-scale resolution based on the in-plane image magnification by surface plasmon polaritions
WO2012018364A1 (en) * 2010-07-08 2012-02-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Multi-color fluorescence enhancement from a photonic crystal surface
RU2552386C1 (en) * 2014-02-19 2015-06-10 Валерий Николаевич Конопский Semiconductor radiation source built around long-range surface plasmon

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015150238A (en) 2017-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yang et al. Super-resolution imaging of a dielectric microsphere is governed by the waist of its photonic nanojet
Wesemann et al. Selective near-perfect absorbing mirror as a spatial frequency filter for optical image processing
Axelrod [1] Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology
JP6552606B2 (en) An optical fiber having a hollow tube for accommodating a sample along the center of the fiber core
Jacobsen et al. Refractive‐index‐induced aberrations in two‐photon confocal fluorescence microscopy
Reihani et al. Significant improvement of optical traps by tuning standard water immersion objectives
Singh et al. Comparison of objective lenses for multiphoton microscopy in turbid samples
Goto et al. Three-dimensional motion detection of a 20-nm gold nanoparticle using twilight-field digital holography with coherence regulation
Guo et al. Experimental far-field imaging properties of high refractive index microsphere lens
Shi et al. Multiplane illumination enabled by Fourier-transform metasurfaces for high-speed light-sheet microscopy
Lin et al. Super-resolution imaging by microsphere-assisted optical microscopy
Sun et al. Pulse duration dependent nonlinear propagation of a focused femtosecond laser pulse in fused silica
Rodrigo et al. Illumination coherence engineering and quantitative phase imaging
Kong et al. Surface imaging microscopy with tunable penetration depth as short as 20 nm by employing hyperbolic metamaterials
RU2626269C2 (en) Method and device for excitating fluorescence by long-range surface waves on single-photon crystal
US11474283B2 (en) Super resolution for magneto-optical microscopy
Ogura Raman scattering enhancement of dielectric microspheres on silicon nitride film
US20170336612A1 (en) Inhomogeneous Surface Wave Microscope
Kim et al. Gradient field microscopy for label-free diagnosis of human biopsies
US20220003604A1 (en) Multicolor Optical Resonator For Imaging Methods
Ling et al. RETRACTED ARTICLE: Modelling and verification of white light oil immersion microsphere optical nanoscope
Malureanu et al. Microspherical nanoscopy: is it a reliable technique?
Guo et al. Imaging of sub-surface nanostructures by dielectric planer cavity coupled microsphere lens
CN113892042B (en) Apparatus, system and method for solid immersion meniscus lenses
Lei et al. Multifunctional darkfield microscopy using an axicon

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20171125