RU2622085C2

RU2622085C2 - Dna-structure encoding modified version of protective antigene bacillus anthracis

Info

Publication number: RU2622085C2
Application number: RU2015146604A
Authority: RU
Inventors: Андрей Викторович Летаров; Екатерина Юрьевна Эпова; Евгений Евгеньевич Куликов; Алла Константиновна Голомидова; Павел Александрович Иванов; Валерий Никандрович Трифан; Николай Васильевич Мельник; Борис Казиевич Лайпанов; Алла Владимировна Белякова; Оксана Александровна Леонович; Юлия Константиновна Бирюкова; Марина Валерьевна Зылькова; Анатолий Яковлевич Самуйленко
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2015-10-29
Publication date: 2017-06-09
Also published as: RU2015146604A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to an artificial gene, allowing to express in bacteria cells an isolated domain 1 of PAG protective antigen from Bacillus anthracis 55 VNIIVVIM. This gene is intended for intriduction into the chromosome of bacillus in composition of specific DNA-structure.

EFFECT: invention allows to improve method of obtaining protective antigen of the anthrax pathogen Bacillus anthracis.

2 dwg, 3 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области биоинженерии, в частности к усовершенствованию метода получения протективного антигена Bacillus anthracis – основного антигена, необходимого для создания средств вакцинопрофилактики и диагностики сибиреязвенной инфекции у человека и животных.The invention relates to the field of bioengineering, in particular to the improvement of the method for producing the protective antigen Bacillus anthracis - the main antigen necessary for the creation of vaccine prophylaxis and diagnosis of anthrax infection in humans and animals.

Предметом изобретения является фрагмент последовательности гена PAG из B. anthracis 55-ВНИИВВиМ в составе интегративной генетической конструкции pWP-SW (находится под контролем промотора гена WprA, кодирующего субтилизин клеточной стенки Bacillus subtilis; содержит также терминатор транскрипции гена WprA и маркер лекарственной устойчивости к спектиномицину). Особенностью гена PAG в составе конструкции pWPag201-SW по сравнению с аналогичными конструкциями, содержащими ген PAG дикого типа, является наличие у закодированного продукта, соответствующего изолированному первому домену полноразмерного белка PAG, собственного секреторного лидера. Наличие этого элемента, а также удачный выбор точки искусственной терминации трансляции PAG позволили добиться эффективной секреции продукта во внеклеточное пространство с образованием устойчивого к протеолизу, растворимого и высокоиммуногенного продукта.The subject of the invention is a fragment of the PAG gene sequence from B. anthracis 55-VNIIIVViM as part of the pWP-SW integrative genetic construct (controlled by the promoter of the WprA gene encoding the subtilisin of the Bacillus subtilis cell wall; also contains the transcription terminator of the WprA gene and the drug resistance marker for spectinomycin) . A feature of the PAG gene in the pWPag201-SW construct compared to similar constructs containing the wild-type PAG gene is the presence of an intrinsic secretory leader in the encoded product corresponding to the isolated first domain of the full-length PAG protein. The presence of this element, as well as a good choice of the point of artificial termination of PAG translation, allowed achieving effective secretion of the product into the extracellular space with the formation of a proteolysis-resistant, soluble and highly immunogenic product.

Штамм, несущий конструкцию pWPag201-SW, пригоден в качестве продуцента искусственного производного проективного антигена, соответствующего его первому домену, с целью его очистки in vitro. Такой белок может быть использован при изготовлении тест-систем серологической детекции антител к PAG и прототипов вакцин. Живая споровая культура, несущая конструкцию pWPag201-SW, может быть непосредственно использована в качестве вакцинной субстанции по аналогии со споровой культурой аттенуированного штамма B. anthracis 55-ВНИИВВиМ, как это описано в патенте РФ №2191599 [1]. В отличие от технического решения, описанного в патенте РФ №2321628 [2], заявляемое решение основано на использовании генетически стабильной интегративной конструкции вместо автономно реплицирующейся плазмиды на основе нестабильного репликона pUB110. Конструкция pWPag201-SW (Фиг.1) введена в геном полностью непатогенного штамма B. subtilis AJ73, что позволяет использовать штамм для введения in vivo без риска потери конструкции или ее неконтролируемого распространения во внешней среде.The strain carrying the construction of pWPag201-SW is suitable as a producer of an artificial derivative of the projective antigen corresponding to its first domain for the purpose of its purification in vitro. Such a protein can be used in the manufacture of test systems for serological detection of antibodies to PAG and prototype vaccines. The live spore culture bearing the pWPag201-SW construct can be directly used as a vaccine substance by analogy with the spore culture of the attenuated B. anthracis strain 55-VNIIVViM, as described in RF patent No. 2191599 [1]. In contrast to the technical solution described in the patent of the Russian Federation No. 2321628 [2], the claimed solution is based on the use of a genetically stable integrative construct instead of an autonomously replicating plasmid based on the unstable replicon pUB110. The pWPag201-SW construct (FIG. 1) was introduced into the genome of a completely non-pathogenic B. subtilis AJ73 strain, which allows the strain to be used for in vivo administration without the risk of losing the construct or its uncontrolled distribution in the external environment.

Уровень техникиState of the art

Известен Патент РФ №2181294 [3], описание изобретения содержит информацию об использовании для приготовления сухой формы комбинированной сибиреязвенной вакцины протективного антигена, получаемого из микробной культуры B. anthracis штамма-продуцента 55/5, выборе эффективной среды высушивания и лиофилизации препарата. Изобретение позволяет увеличить срок хранения вакцины (до 4 лет) и расширить температурный режим хранения (до+25°С в течение месяца) при доставке вакцины потребителю. Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления жидкой комбинированной сибиреязвенной вакцины (патент РФ 2115433 [4]), содержащей сорбированный на носителе протективный антиген (ПА) и споры B. anthracis вакцинного штамма СТИ-1. Содержание компонентов в одной прививочной человеко-дозе (0,5 см³) вакцины следующее: спор – 40-60 млн, ПА – 30-40 среднеэффективных иммунизирующих доз (ИД₅₀) для белых мышей [5], гидроокиси алюминия - не более 2,5 мг. Общим существенным признаком с заявляемым способом является использование в жидкой комбинированной вакцине спор B. anthracis штамма СТИ-1. Недостатком прототипа изобретения, указанным авторами, является относительно непродолжительный срок хранения (до 2-х лет) и необходимость в течение всего времени хранения, в том числе и при ее транспортировании, использовать температуры от 0 до плюс 4°С. Увеличение сроков хранения жидкой комбинированной вакцины, а также изменение температурного режима при хранении или транспортировании сопровождается ослаблением защитных свойств вакцины за счет снижения иммуногенности ПА и жизнеспособности спор (споры и ПА находятся в препарате в физиологическом растворе без стабилизатора и в большей степени подвержены отрицательному воздействию факторов внешней среды, в том числе и температурным колебаниям).Known RF Patent No. 2181294 [3], the description of the invention contains information about the use of a protective antigen obtained from the microbial culture of B. anthracis producer strain 55/5 for the preparation of the dry form of the combined anthrax vaccine, the choice of an effective medium for drying and lyophilization of the drug. The invention allows to increase the shelf life of the vaccine (up to 4 years) and expand the temperature regime of storage (up to + 25 ° C for a month) upon delivery of the vaccine to the consumer. Closest to the claimed is a method of preparing a liquid combined anthrax vaccine (RF patent 2115433 [4]) containing a protective antigen (PA) adsorbed on a carrier and spores of B. anthracis vaccine strain STI-1. The content of the components in one vaccination human dose (0.5 cm ³ ) of the vaccine is as follows: spore - 40-60 million, PA - 30-40 average effective immunizing doses (ID ₅₀ ) for white mice [5], aluminum hydroxide - not more than 2 5 mg. A common essential feature with the claimed method is the use of B. anthracis strain STI-1 spores in a liquid combination vaccine. The disadvantage of the prototype of the invention indicated by the authors is the relatively short shelf life (up to 2 years) and the need to use temperatures from 0 to + 4 ° C during the entire storage time, including during its transportation. An increase in the shelf life of the liquid combined vaccine, as well as a change in the temperature regime during storage or transportation, is accompanied by a weakening of the protective properties of the vaccine due to a decrease in the immunogenicity of PA and the viability of spores (spores and PA are in the preparation in physiological saline without a stabilizer and are more susceptible to negative effects of external environment, including temperature fluctuations).

Известен Патент РФ №2115433 [4], использует в качестве прототипа известный способ получения адсорбированной сибиреязвенной вакцины (anthrax vaccine adsorbed - далее адсорбированная вакцина), производимую Michigan Departament of Public Health (Lansing, Michigan 48909) по лицензии №99 (руководство по применению "Anthrax vaccine adsorbed"). В отличие от прототипа, описанная вакцина представляет собой жидкий препарат, содержащий следующие компоненты: протективный антиген Bacillus anthracis (РА), получаемый при культивировании бескапсульного штамма сибиреязвенного микроба в синтетической среде. Вакцина используется следующим образом. Выполняется первичная иммунизация, включающая три подкожные инъекции по 0,5 мл вакцины с интервалом в две недели и затем три дополнительных подкожных инъекции по 0,5 мл вакцины через 6, 12 и 18 мес.При формировании иммунитета рекомендуется выполнять ежегодно по одной бустерной подкожной инъекции по 0,5 мл. Недостатком адсорбированной вакцины является сложная схема ее применения и низкая защитная эффективность. Последнее обусловлено тем, что действие адсорбированной вакцины направлено лишь на предотвращение заключительного этапа инфекционного процесса - поражения макроорганизма токсичными продуктами сибиреязвенного микроба. Создание антитоксического иммунитета защищает от клинических проявлений заболевания, однако не исключает развития начальных стадий инфекционного процесса - колонизации B. anthracis в области входных ворот и инвазии во внутреннюю среду организма. Низкая защитная эффективность адсорбированной вакцины обусловливает необходимость многократной вакцинации - отсюда и сложная схема применения такой вакцины.Known RF Patent No. 2154143 [4], uses as a prototype the known method for producing an adsorbed anthrax vaccine (anthrax vaccine adsorbed - hereinafter adsorbed vaccine), manufactured by Michigan Departament of Public Health (Lansing, Michigan 48909) under license No. 99 (application guide " Anthrax vaccine adsorbed "). Unlike the prototype, the described vaccine is a liquid preparation containing the following components: the protective antigen Bacillus anthracis (RA), obtained by culturing a capsule-free strain of anthrax microbe in a synthetic medium. The vaccine is used as follows. Primary immunization is performed, including three subcutaneous injections of 0.5 ml of the vaccine with an interval of two weeks and then three additional subcutaneous injections of 0.5 ml of the vaccine after 6, 12 and 18 months. When forming immunity, it is recommended to perform one booster subcutaneous injection every year. 0.5 ml each. A disadvantage of an adsorbed vaccine is its complex application and low protective efficacy. The latter is due to the fact that the effect of the adsorbed vaccine is aimed only at preventing the final stage of the infectious process - the defeat of the macroorganism by the toxic products of the anthrax microbe. The creation of antitoxic immunity protects against the clinical manifestations of the disease, but does not exclude the development of the initial stages of the infectious process - colonization of B. anthracis in the area of the entrance gate and invasion of the internal environment of the body. The low protective efficacy of the adsorbed vaccine necessitates multiple vaccinations - hence the complex use of such a vaccine.

Общим существенным признаком с заявляемой вакциной является использование в качестве одного из иммуногенов протективного антигена B. anthracis. Адсорбированная вакцина, производимая Michigan Department of Public Health, является коммерческим препаратом, разрешенным для использования в США и ряде других стран.A common essential feature with the claimed vaccine is the use of the protective antigen B. anthracis as one of the immunogens. The adsorbed vaccine manufactured by the Michigan Department of Public Health is a commercial drug approved for use in the United States and several other countries.

Наиболее близкой к заявляемой является вакцина сибиреязвенная СТИ живая сухая (далее - живая вакцина). Вакцина представляет собой взвесь живых спор бескапсульного сибиреязвенного штамма СТИ в 30% глицерине (Инструкция по применению вакцины сибиреязвенной СТИ живой сухой). Первоначально она выпускалась Предприятием по производству бактерийных препаратов Тбилисского НИИ вакцин и сывороток (380042, Тбилиси, ул. Готца 3) в виде лиофилизированного препарата, содержащего 4×10⁹ - 5×10⁹ живых спор на ампулу. Непосредственно перед использованием препарат подлежал разведению в 30% растворе глицерина. Вакцинация проводилась двумя способами: накожным (плановая вакцинация) и подкожным безыгольным (по эпидемическим показаниям). Первичная иммунизация проводилась двукратно с интервалом в 21 день, ревакцинация - через год однократно. Одна накожная прививочная доза требовала введения от 4×10⁸ до 5×10⁸, одна подкожная от 4×10⁷ до 5×10⁷ живых спор. Доза для ревакцинации та же, что и при первичном применении. Недостатком живой вакцины является длительный латентный период и период нарастания (до 3 - 4 недель) и относительно короткий период высокой специфической резистентности, что проявляется "пробоем" иммунитета в первые 5-14 суток и через 3 месяца после иммунизации (среди всех заболевших сибирской язвой от 6,4 до 27,7% составляли люди, ранее привитые живой вакциной [6]). Указанные недостатки обусловлены тем, что формирование поствакцинального иммунитета после применения живой вакцины связано с колонизацией, размножением и последующей диссеминацией по лимфатическим путям микробов вакцинного штамма. Наряду с этим, живая вакцина обеспечивает формирование специфического иммунитета, воздействующего в первую очередь на начальные этапы инфекции (антибактериальный иммунитет), и в случае генерализации процесса недостаточно эффективно предотвращает токсические эффекты, наблюдаемые на заключительной стадии заболевания. Общим существенным признаком с заявляемой вакциной является использование в качестве одного из иммуногенов живых спор B. anthracis штамма СТИ. Вакцина сибиреязвенная СТИ живая сухая - коммерческий препарат, разрешенный для использования в СССР. Задачей изобретения является создание в короткие сроки высокой и длительно сохраняющейся специфической невосприимчивости к возбудителю сибирской язвы. Поставленная задача решается благодаря тому, что вакцина сибиреязвенная, содержащая споры бескапсульного вакцинного штамма B. anthracis СТИ, дополнительно содержит ПА сибиреязвенного микроба. ПА сибиреязвенного микроба может быть сорбирован на носителе и/или находиться в простой смеси со спорами вакцинного штамма B. anthracis. Соотношение компонентов в одной прививочной дозе коммерческого варианта вакцины следующее:Closest to the claimed is the vaccine anthrax STI live dry (hereinafter - the live vaccine). The vaccine is a suspension of live spores of the capsule-free anthrax strain STI in 30% glycerol (Instructions for use of the vaccine anthrax STI live dry). Initially, it was produced by the Enterprise for the Production of Bacterial Preparations of the Tbilisi Research Institute of Vaccines and Serums (380042, Tbilisi, 3 Gottsa St.) in the form of a lyophilized preparation containing 4 × 10 ⁹ - 5 × 10 ⁹ live spores per ampoule. Immediately before use, the drug was diluted in a 30% glycerol solution. Vaccination was carried out in two ways: subcutaneous (routine vaccination) and subcutaneous needleless (according to epidemic indications). Primary immunization was carried out twice with an interval of 21 days, revaccination - once a year. One subcutaneous inoculation dose required the administration of 4 × 10 ⁸ to 5 × 10 ⁸ , one subcutaneous inoculation of 4 × 10 ⁷ to 5 × 10 ⁷ live spores. The dose for revaccination is the same as with the initial use. The disadvantage of a live vaccine is a long latent period and a rise period (up to 3-4 weeks) and a relatively short period of high specific resistance, which is manifested by a “breakdown” of immunity in the first 5-14 days and 3 months after immunization (among all patients with anthrax from 6.4 to 27.7% were people previously vaccinated with a live vaccine [6]). These disadvantages are due to the fact that the formation of post-vaccination immunity after the use of a live vaccine is associated with the colonization, reproduction and subsequent dissemination of the microbes of the vaccine strain along the lymphatic pathways. Along with this, a live vaccine provides the formation of specific immunity, which primarily affects the initial stages of infection (antibacterial immunity), and if the process is generalized, it does not effectively prevent the toxic effects observed at the final stage of the disease. A common essential feature with the claimed vaccine is the use of a living strain of STI as one of the immunogens of live spores. The anthrax STI live dry vaccine is a commercial preparation approved for use in the USSR. The objective of the invention is the creation in a short time of high and long-lasting specific immunity to the causative agent of anthrax. The problem is solved due to the fact that the anthrax vaccine, containing spores of the capsule-free vaccine strain B. anthracis STI, additionally contains the anthrax microbe PA. The anthrax microbe PA can be adsorbed on a carrier and / or in a simple mixture with spores of the vaccine strain B. anthracis. The ratio of components in one vaccination dose of a commercial variant of the vaccine is as follows:

1. живых спор Bacillus anthracis СТИ - 40 - 60 млн,1. live spores of Bacillus anthracis STI - 40 - 60 million,

2. ПА сибиреязвенного микроба - 30 - 40 ИД₅₀,2. PA anthrax microbe - 30 - 40 ID ₅₀ ,

3. геля гидроокиси алюминия не более - 2,5 мг,3. aluminum hydroxide gel no more than 2.5 mg,

где ИД₅₀ - среднеэффективная иммунизирующая единица для белых мышей (ИД₅₀ см. [5]).where ID ₅₀ is a medium-efficient immunizing unit for white mice (ID ₅₀ see [5]).

Доза для иммунизации людей содержится в 0,5 мл предложенной вакцины. Первичная иммунизация проводится один раз в год подкожно. Сопоставляя значения показателей косвенных тестов и уровни защищенности против подкожного и аэрогенного заражения вирулентными культурами сибиреязвенного микроба, определенные на экспериментальных животных, с динамикой клеточных и гуморальных показателей специфической резистентности у людей, можно предположить, что напряженный иммунитет после однократного применения заявляемой сибиреязвенной вакцины обеспечивает защиту от развития инфекции не менее, чем у 80-90% привитых. Прочный иммунитет формируется к 7-10 суток и сохраняется в течение 6 месяцев, а через 9-12 месяцев определяется примерно у 50-70% вакцинированных. Наряду с этим, высокий уровень специфической резистентности после однократного применения живой вакцины (прототип) развивается к 21 суткам у 55-65%, сохраняется до 4 месяцев у 30-40%, до 6 месяцев - у 15-20% и до 9-12 месяцев - лишь у 5-10% привитых. После введения адсорбированной вакцины-аналога иммунитет формируется к 7-10 суток у 70-80% и сохраняется до 4 месяцев только у 10-15% вакцинированных.The dose for immunizing people is contained in 0.5 ml of the proposed vaccine. Primary immunization is carried out once a year subcutaneously. Comparing the values of the indices of indirect tests and the levels of protection against subcutaneous and aerogenic infection with virulent cultures of anthrax microbe determined in experimental animals with the dynamics of cellular and humoral indicators of specific resistance in humans, it can be assumed that intense immunity after a single application of the claimed anthrax vaccine provides protection against development infections in no less than 80-90% vaccinated. Strong immunity is formed by 7-10 days and lasts for 6 months, and after 9-12 months it is determined in about 50-70% of vaccinees. Along with this, a high level of specific resistance after a single use of a live vaccine (prototype) develops by 21 days at 55-65%, persists for up to 4 months at 30-40%, up to 6 months - at 15-20% and up to 9-12 months - only 5-10% of vaccinated. After the administration of an adsorbed analogue vaccine, immunity is formed by 7–10 days in 70–80% and lasts up to 4 months only in 10–15% of vaccinees.

Между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно:Between the set of essential features of the claimed object and the achieved technical result there is a causal relationship, namely:

1. Полноценный иммунитет против сибирской язвы предполагает наличие специфической защищенности против агрессивного воздействия спор, вегетативных клеток (антибактериальный иммунитет) и экзотоксина (антитоксический иммунитет) - что достигается в заявленном изобретении сочетанием обоих антигенных компонентов в одном вакцинном препарате и проявляется высокой и длительно сохраняющейся специфической невосприимчивостью к заражению возбудителем сибирской язвы.1. Full immunity against anthrax suggests the presence of specific protection against the aggressive effects of spores, vegetative cells (antibacterial immunity) and exotoxin (antitoxic immunity) - which is achieved in the claimed invention by a combination of both antigenic components in one vaccine preparation and is manifested by high and long-lasting specific immunity to infection by the causative agent of anthrax.

2. Короткие сроки формирования специфической невосприимчивости обусловлены действием на иммунную систему макроорганизма ПА, тогда как использование только живых спор вакцинного штамма B. anthracis предполагает длительный латентный период в иммунном ответе на их введение.2. The short periods of formation of specific immunity are due to the action of the PA macroorganism on the immune system, while the use of only live spores of the vaccine strain B. anthracis suggests a long latent period in the immune response to their introduction.

По утверждениям авторов, изобретение позволяет:According to the authors, the invention allows:

- повысить безопасность персонала, работающего в эпидемических очагах сибирской язвы и в лабораторных условиях.- increase the safety of personnel working in the epidemic foci of anthrax and in the laboratory.

- сократить расходы на иммунизацию людей и животных.- reduce the cost of immunization of people and animals.

- проводить иммунизацию на фоне антибактериальной терапии сибирской язвы.- to carry out immunization against the background of antibiotic therapy for anthrax.

Известен патент РФ №2191599 [1]. Изобретение основано на использовании в качестве прототипа способа получения вакцины для профилактики некробактериоза рогатого скота, содержащая в равных объемных соотношениях инактивированные формалином эндотоксин и экзотоксин, полученные из местных эпизоотических культур возбудителя некробактериоза, и адъювант на основе минерального масла и ланолина (Патент RU 1816348 [7]). Ассоциированная вакцина содержит адсорбированный на гидроокиси алюминия инактивированный формалином экзотоксин лейкоцидин, суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией 5,0-5,5×10⁹ спор/мл в физиологическом растворе, 1 М раствор метабисульфита натрия и масляный адъювант.Компоненты вакцины содержатся в сбалансированном соотношении. Экзотоксин лейкоцидин представляет собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа. Он получен из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ. Ассоциированную вакцину вводят однократно крупному рогатому скоту, овцам, козам, свиньям и северным оленям внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в объеме 0,2-0,4 см³. Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза является высокоэффективным препаратом, способным защитить животных одновременно от сибирской язвы и некробактериоза, и по иммуногенности превосходит составляющие ее моновакцины.Known RF patent No. 2191599 [1]. The invention is based on the use as a prototype of a method for producing a vaccine for the prevention of cattle necrobacteriosis, containing in equal volume proportions formalin inactivated endotoxin and exotoxin obtained from local epizootic cultures of the pathogen necrobacteriosis, and an adjuvant based on mineral oil and lanolin (Patent RU 1816348 [7] ) The associated vaccine contains formalin inactivated exotoxin leukocidin adsorbed on aluminum hydroxide, a suspension of live spores of the anthrax vaccine strain 55-VNIIVViM with an initial concentration of 5.0-5.5 × 10 ⁹ spores / ml in physiological solution, 1 M sodium metabisulfite solution and an oil adjuvant. The components of the vaccine are contained in a balanced ratio. Exotoxin leukocidin is a highly purified protein with a molecular weight of 18-20 kDa. It is obtained from the production strain Fusobacterium necrophorum "0-1" VIEV. The associated vaccine is administered once to cattle, sheep, goats, pigs and reindeer intradermally using a needleless injector in a volume of 0.2-0.4 cm ³ . The associated vaccine against anthrax and necrobacteriosis is a highly effective drug that can protect animals from anthrax and necrobacteriosis at the same time, and is superior in immunogenicity to its mono-vaccines.

Известен Патент РФ №2340356 [8], содержит описание методики получения очистки протективного антигена B. antracis, в частности, культивирование вакцинного штамма на стерильной питательной среде с бикарбонатом натрия. При этом бикарбонат натрия вводят в питательную среду на протяжении экспоненциальной фазы роста на 6-8 ч культивирования вакцинного штамма. После окончания процесса культивирования выделение, концентрирование и стерилизацию протективного антигена осуществляют на одной установке ультра- и микрофильтрации. Способ обеспечивает стабильное получение нативного сибиреязвенного протективного антигена с активностью в РДП более 100 ЕА·мл^-1, а также сокращение времени и стадий получения стерильного концентрированного протективного антигена с активностью в РДП не менее 200 ЕА·мл^-1. Изобретение позволяет воспроизводимо получать нативный ПА с активностью в реакции диффузионной преципитации (РДП) в геле более 100 ЕА·мл^-1, сократить время и количество технологических стадий получения стерильного концентрированного ПА.Known RF Patent No. 2340356 [8], contains a description of the methods for purification of the protective antigen B. antracis, in particular, the cultivation of the vaccine strain on a sterile nutrient medium with sodium bicarbonate. In this case, sodium bicarbonate is introduced into the nutrient medium during the exponential growth phase for 6-8 hours of cultivation of the vaccine strain. After the cultivation process is completed, the isolation, concentration and sterilization of the protective antigen is carried out in one ultrafiltration and microfiltration unit. The method provides stable production of a native anthrax protective antigen with an activity in an RPD of more than 100 EA · ml ^-1 , as well as a reduction in the time and stages of obtaining a sterile concentrated protective antigen with an activity in an RDP of at least 200 EA · ml ^-1 . EFFECT: invention allows reproducibly producing native PA with activity in the diffusion precipitation (RDP) reaction in a gel of more than 100 EA · ml ^-1 , reducing the time and number of technological steps for obtaining sterile concentrated PA.

Патент РФ №2480237 [9] описывает методику изготовления комбинированной вакцины из известных компонентов (суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5-5,2)×10-⁷ в 1 см³ физиологического раствора - 1,0-1,2 и инактивированного формалином лейкоцидина (экзотоксин F. necrophorum) массой 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum «0-1» ВИЭВ с содержанием белка 5,5-6 мг %, адсорбированный 12-15% гидроокисью алюминия, взятой в конечной концентрации 1,8-2,0%, предварительно суспендированной в гликолевом буфере с рН 8,4-8,6) с добавлением в качестве адъюванта геля сапонина, необходимого для продления срока защитного действия вакцины до одного года.Russian Patent №2480237 [9] describes a method of manufacturing the combined vaccine of known components (suspension of living spores of the anthrax vaccine strain 55 VNIIVViM initial concentration (5-5,2) × 10- ⁷ cm ³ in 1 saline - 1.0- 1,2 and formalin inactivated leukocidin (exotoxin F. necrophorum) weighing 18-20 kDa from the strain Fusobacterium necrophorum "0-1" VIEV with a protein content of 5.5-6 mg%, adsorbed 12-15% aluminum hydroxide taken in the final concentration of 1.8-2.0%, previously suspended in glycol buffer with a pH of 8.4-8.6) with the addition of as an adjuvant for saponin gel, necessary to extend the protective effect of the vaccine to one year.

Известен действующий отечественный патент РФ №2444570 [10]. В нем описан способ получения рекомбинантной вакцины, предусматривающий создание химерных белков или ДНК, экспрессирующих гены этих химерных белков, состоящих из трех или более функциональных частей. Эти части являются действующим веществом вакцины и представлены антигеном патогенного микроорганизма, лигандом для TLR-рецепторов и лигандами для рецепторов, проводящих сигнал через ITAM-мотив. Химерные белки напрямую используют в качестве вакцины для иммунизации человека и животных. Для вакцин, представляющих собой ДНК, кодирующую химерный белок, в качестве носителя используют рекомбинантные аденовирусные частицы и/или плазмидную ДНК.Known current domestic patent of the Russian Federation No. 2444570 [10]. It describes a method for producing a recombinant vaccine, comprising the creation of chimeric proteins or DNA expressing the genes of these chimeric proteins, consisting of three or more functional parts. These parts are the active substance of the vaccine and are represented by the antigen of a pathogenic microorganism, a ligand for TLR receptors and ligands for receptors that conduct a signal through an ITAM motif. Chimeric proteins are directly used as a vaccine to immunize humans and animals. For vaccines representing DNA encoding a chimeric protein, recombinant adenoviral particles and / or plasmid DNA are used as a carrier.

Известен патент РФ №2321628 [2] описан рекомбинантный штамм В. anthracis СТИ тпа-1 (pub110pa-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба. Штамм получен путем трансформации штамма В. anthracis СТИ тпа-1 (pub110pa-1) плазмидой pUB110PA-1. Он депонирован в ГК патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ-96. По утверждениям авторов, штамм характеризуется стабильностью гибридного репликона и высоким уровнем продукции протективного антигена - основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.Known RF patent No. 2321628 [2] describes a recombinant strain of B. anthracis STI TPA-1 (pub110pa-1) - a producer of the protective antigen of anthrax microbe. The strain was obtained by transformation of strain B. anthracis STI TPA-1 (pub110pa-1) with plasmid pUB110PA-1. It is deposited in the microorganisms GK of pathogenic bacteria “Microbe” under the number KM-96. According to the authors, the strain is characterized by the stability of a hybrid replicon and a high level of production of protective antigen, the main component of chemical anthrax vaccines.

Известны также действующие на территории РФ и в других странах мира иностранные патенты на создание вакцин против сибирской язвы, например патент US 8409590 [11]. Основной частью формулы является описание метода изготовления субстанции в виде сухого порошка, содержащего протективный антиген B. anthracis, хитозан и поликлональные сывороточные антитела к ПА. Субстанция предназначена для введения через слизистые оболочки и предназначена преимущественно для индукции «секреторного» иммунитета.Foreign patents for the development of anthrax vaccines are also valid in the Russian Federation and other countries of the world, for example, US patent 8409590 [11]. The main part of the formula is a description of the method of manufacturing a substance in the form of a dry powder containing the protective antigen B. anthracis, chitosan and polyclonal serum antibodies to PA. The substance is intended for administration through the mucous membranes and is intended primarily for the induction of "secretory" immunity.

Известен Патент US 8383359 [12] описывается метод количественной оценки Т-лимфоцитов, специфичных к летальному антигену B. anthracis. Изобретение направлено на создание метода точной количественной оценки эффективности новых вакцин против сибирской язвы, что свидетельствует об актуальности работ в этом направлении с точки зрения правительственных экспертов США.Known US Pat. No. 8,383,359 [12] describes a method for quantifying T lymphocytes specific for the lethal antigen B. anthracis. The invention is aimed at creating a method for accurate quantitative assessment of the effectiveness of new vaccines against anthrax, which indicates the relevance of work in this direction from the point of view of US government experts.

В патенте US 8394387 [13] описан дефектный по споруляции рекомбинантный штамм B. anthracis, накапливающий большие количества протективного антигена (PA) с повышенной протеолитической устойчивостью, предназначенный для иммунизации человека и животных. Наличие этой разработки свидетельствует о том, что правительственные эксперты США считают допустимым по соображениям безопасности использование живых рекомбинантных штаммов B. anthracis для создания вакцин для защиты как человека, так и животных. Основную проблему на этом пути они усматривают в необходимости повышения иммуногенности РА, для чего они предлагают его мутантный вариант. Предлагаемое в рамках ПНИ решение по созданию ВПЧ, несущих РА, представляется равно безопасным по сравнению с описанным в патенте US 8394387, однако, позволяющим добиться существенно большего повышения иммуногенности.US 8394387 [13] describes a sporulation-defective recombinant strain of B. anthracis, which accumulates large amounts of protective antigen (PA) with increased proteolytic resistance, intended for immunization of humans and animals. The presence of this development indicates that US government experts consider it acceptable for safety reasons to use live recombinant B. anthracis strains to create vaccines to protect both humans and animals. The main problem on this path they see in the need to increase the immunogenicity of RA, for which they offer its mutant version. The proposed PNI solution for the creation of HPVs bearing RA seems equally safe compared to that described in US Pat. No. 8,393,487, however, allowing a significantly greater increase in immunogenicity.

Имеется патент US 8404820 [14], описывающий полную структуру антитела человека, обладающего способностью к нейтрализации РА B. anthracis.There is a patent US 8404820 [14], describing the complete structure of a human antibody with the ability to neutralize RA B. anthracis.

Характеризуя активность зарубежных компаний-разработчиков вакцин против сибирской язвы на территории РФ, целесообразно обратить внимание на действующий патент РФ №2270865 [15]. Разработан способ получения иммуногенного полипептида, вызывающего иммунный ответ, обеспечивающий защиту от инфекции B. anthracis. Предложенный иммуногенный полипептид содержит от одного до трех доменов полноразмерного протективного антигена (РА) из В. anthracis или их варианты, и, по меньшей мере, один из указанных доменов является доменом 1 или доменом 4 из РА или его вариантом. Данные варианты иммуногенного полипептида, а также полноразмерный РА продуцируются в результате экспрессии в E.coli. Также предложен вектор для экспрессии в бактериальных клетках, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую упомянутый выше иммуногенный полипептид. Разработан способ предупреждения инфекции, вызванной В. anthracis за счет введения достаточного количества иммуногенного полипептида. Предложена также вакцина для предупреждения инфекции, вызываемой В. anthracis, содержащая эффективное количество иммуногенного полипептида и подходящий носитель.Describing the activity of foreign companies developing vaccines against anthrax in the territory of the Russian Federation, it is advisable to pay attention to the current patent of the Russian Federation No. 2270865 [15]. A method has been developed for the production of an immunogenic polypeptide that elicits an immune response that provides protection against B. anthracis infection. The proposed immunogenic polypeptide contains from one to three domains of a full-sized protective antigen (RA) from B. anthracis or their variants, and at least one of these domains is domain 1 or domain 4 of RA or its variant. These variants of the immunogenic polypeptide, as well as full-sized RA, are produced as a result of expression in E. coli. Also provided is a vector for expression in bacterial cells, comprising a nucleic acid encoding the aforementioned immunogenic polypeptide. A method has been developed to prevent infection caused by B. anthracis by introducing a sufficient amount of an immunogenic polypeptide. A vaccine is also provided to prevent infection by B. anthracis, comprising an effective amount of an immunogenic polypeptide and a suitable carrier.

К этому же числу можно отнести патент РФ №2288272 [16]. В патенте описан метод получения протективного антигена В. anthracis опытно-промышленного уровня. Разработана технология культивирования рекомбинантного штамма E.coli в лабораторных ферментерах с подпиткой (фидингом). Штамм получен на базе плазмиды pQE30. Денатурированный мочевиной рекомбинантный РА, имеющий на N-конце 6His-таг, очищают с помощью металлоаффинной хроматографии.The patent of the Russian Federation No. 2288272 [16] can be attributed to the same number. The patent describes a method for producing a protective antigen of B. anthracis pilot level. A technology was developed for culturing a recombinant E. coli strain in laboratory fed-fed fermenters. The strain obtained on the basis of the plasmid pQE30. Urea-denatured recombinant RA having a 6His tag at the N-terminus is purified by metal affinity chromatography.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

1) Фрагмент ДНК, содержащий промотор гена WprA получают с помощью ПЦР с праймерами Wpr141 и WPR201, используя в качестве матрицы геномную ДНК B. subtilis AJ73, размер продукта 935 п.н. Продукт обрабатывают с помощью двойной рестрикции XhoI и SphI и лигируют с ДНК векторной плазмиды pQE30 (Invitrogen), предварительно расщепленной XhoI и SphI. Проводят трансформацию E.coli TG1, отбирают колонии, содержащие в плазмиде вставку ожидаемого размера 930 п.н. при контрольной рестрикции по XhoI и SphI.1) A DNA fragment containing the WprA gene promoter is obtained by PCR with primers Wpr141 and WPR201, using B. subtilis AJ73 genomic DNA as a template, product size 935 bp The product is digested with double restriction XhoI and SphI and ligated with the DNA of the vector plasmid pQE30 (Invitrogen), previously digested with XhoI and SphI. Transformation of E. coli TG1 is carried out, colonies containing an insert of the expected size of 930 bp are selected in the plasmid with control restriction by XhoI and SphI.

2) Фрагмент ДНК, соответствующий гену PAG получают с помощью ПЦР с праймерами PAG201 и PAG3, используя в качестве матрицы геномную ДНК B. anthracis 55-ВНИИВВиМ, размер продукта 525 п.н. Продукт обрабатывают с помощью двойной рестрикции Eco32.I и KpnI и лигируют с ДНК плазмиды pQE30-WprA, полученной на предыдущей стадии конструирования, предварительно расщепленной Eco32.I и KpnI. Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, отбирают ампициллин-устойчивые колонии, содержащие в плазмиде вставку ожидаемого размера 520 п.н. при контрольной рестрикции Eco32.I и KpnI.2) The DNA fragment corresponding to the PAG gene was obtained by PCR with primers PAG201 and PAG3, using B. anthracis 55-VNIIIVViM genomic DNA as a template, product size 525 bp The product is digested with Eco32.I and KpnI double restriction and ligated with the DNA of plasmid pQE30-WprA obtained in the previous construction step, previously digested with Eco32.I and KpnI. Transformation of E. coli TG1 with a ligase mixture is carried out, ampicillin-resistant colonies containing an insert of the expected size of 520 bp are selected in the plasmid with control restriction of Eco32.I and KpnI.

3) Фрагмент ДНК, содержащий терминатор гена WprA получают с помощью ПЦР с праймерами WPR1.1 и Wpr2, используя в качестве матрицы геномную ДНК B. subtilis AJ73, размер продукта 150 п.н. Продукт обрабатывают с помощью двойной рестрикции PstI и SacI и лигируют с ДНК плазмиды pBlueScript-KS+(Stratagene). Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, отбирают ампициллин-устойчивые колонии, содержащие в плазмиде вставку ожидаемого размера 1020 п.н. при контрольной рестрикции PstI и SacI.3) A DNA fragment containing the WprA gene terminator is obtained by PCR with primers WPR1.1 and Wpr2, using B. subtilis AJ73 genomic DNA as a template, the product size is 150 bp. The product is double digested with PstI and SacI and ligated with plasmid DNA pBlueScript-KS + (Stratagene). Transformation of E. coli TG1 with a ligase mixture is carried out, ampicillin-resistant colonies containing an insert of the expected size of 1020 bp are selected in the plasmid with control restriction PstI and SacI.

4) Фрагмент размером 770 п.н., соответствующий маркеру устойчивости к спектиномицину с собственным промотором и терминатором транскрипции, получают путем обработки рестриктазой PstI плазмидной ДНК конструкции pSG1154 (Lewis P.J., Marston A.L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 1999 Feb 4; 227(1): 101-110). Его и лигируют с ДНК плазмиды pBS-WprA, полученной на предыдущей стадии конструирования, предварительно расщепленной PstI. Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, отбирают колонии с двойной устойчивостью к ампициллину в концентрации 100 мкг/мл и спектиномицину в концентрации 75 мкг/мл. Проверяют наличие в плазмиде вставки ожидаемого размера 770 п.н. при контрольной рестрикции PstI. Предпочтительно использовать клоны, содержащие вставку маркера устойчивости к спектиномицину в ориентации, соответствующей ходу транскрипции гена LacZ (отличительный признак – образование единственного фрагмента 4420 п.н. при контрольной рестрикции EcoRI).4) A fragment of 770 bp corresponding to a spectinomycin resistance marker with its own promoter and transcription terminator is obtained by treatment with the PstI restriction enzyme of plasmid DNA of the pSG1154 construct (Lewis PJ, Marston AL GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 1999 Feb 4; 227 (1): 101-110). It is ligated with the DNA of the plasmid pBS-WprA obtained in the previous construction step, previously cleaved with PstI. Transformation of E. coli TG1 with a ligase mixture is carried out, colonies with double resistance to ampicillin at a concentration of 100 μg / ml and spectinomycin at a concentration of 75 μg / ml are selected. Check for plasmid insertion of the expected size of 770 bp with control restriction PstI. It is preferable to use clones containing an insertion of the spectinomycin resistance marker in the orientation corresponding to the transcription of the LacZ gene (a distinctive feature is the formation of a single 4420 bp fragment during control EcoRI restriction).

5) Фрагмент длиной 2060 п.н., содержащий терминатор транскрипции гена WprA и маркерный ген Spc, экстрагируют из конструкции pBS-Spc-WprA, подвергая ее двойной рестрикции EcoR32.1 и Ecl136.II. Очищенный путем элюции из агарозного геля продукт лигируют с ДНК конструкции pQE30-WprA-PAG, расщепленной рестриктазой PvuII. Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, отбирают колонии с двойной устойчивостью к ампициллину в концентрации 100 мкг/мл и спектиномицину в концентрации 75 мкг/мл. Проверяют наличие в плазмиде вставки ожидаемого размера 480 п.н. при контрольной рестрикции EcoRI. Отбирают клоны, содержащие вставку маркера устойчивости к спектиномицину в ориентации, обратной ходу транскрипции гибридного гена WprA-PAG.5) A 2060 bp fragment containing the transcriptional terminator of the WprA gene and the Spc marker gene is extracted from the pBS-Spc-WprA construct by double restriction with EcoR32.1 and Ecl136.II. Purified by elution from the agarose gel, the product is ligated with the pQE30-WprA-PAG DNA digested with PvuII restriction enzyme. Transformation of E. coli TG1 with a ligase mixture is carried out, colonies with double resistance to ampicillin at a concentration of 100 μg / ml and spectinomycin at a concentration of 75 μg / ml are selected. Check for plasmid insertion of the expected size of 480 bp. with control restriction EcoRI. Clones were selected containing the insertion of the spectinomycin resistance marker in the reverse direction of the transcription of the WprA-PAG hybrid gene.

6) Полученная конструкция получает обозначение pWPag201-SW (Фиг.1), SEQ ID NO 1.6) The resulting design is designated pWPag201-SW (Figure 1), SEQ ID NO 1.

ДНК конструкцию pWPag201-SW используют для введения в штамм B. subtilis AJ73 методом химической трансформации по Спицайзену, как описано ранее (Anagnostopoulos C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis / Anagnostopoulos C., Spizizen J. // J. Bacteriol. - 1961. - V. 81. - P. 741-746.). Отбор трансформантов проводят на агаризованной среде LB (пептон 1%, дрожжевой экстракт 0,5%, NaCl 0,5%, 2% бактоагара), содержащей 75 мкг/мл спектиномицина.The pWPag201-SW DNA construct is used for introduction into the B. subtilis AJ73 strain by the method of chemical transformation according to Spitsaisen, as described previously (Anagnostopoulos C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis / Anagnostopoulos C., Spizizen J. // J. Bacteriol. - 1961. - V. 81. - P. 741-746.). Transformants were selected on LB agar medium (peptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, 2% bactoagar) containing 75 μg / ml spectinomycin.

Краткое описание графических изображенийShort description of graphic images

Фиг.1. Схема функциональных элементов конструкций pWPag201-SW (SEQ ID NO 1), предназначенной для введения в клетки B. subtilis гена PAG, кодирующего изолированный домен 1 полноразмерного белка из B. anthracis с секреторным лидером. Конструкция содержат промотор WprA, терминатор WprA, ген PAG из B. anthracis 55-ВНИИВВиМ (SEQ ID NO 2), маркер устойчивости к спектиномицину из конструкции pSG1154. Поддержание конструкции в E.coli осуществляется за счет элементов из состава стандартного вектора pQE30 (Invitrogen): репликона плазмиды pMC16 и гена β-лактамазы (детерминанта устойчивости к ампициллину).Figure 1. Scheme of functional elements of pWPag201-SW constructs (SEQ ID NO 1), intended for introducing into the B. subtilis cells the PAG gene encoding the isolated domain 1 of a full-sized protein from B. anthracis with a secretory leader. The construct contains the WprA promoter, the WprA terminator, the PAG gene from B. anthracis 55-VNIIIVViM (SEQ ID NO 2), the spectinomycin resistance marker from the pSG1154 construct. Maintenance of the construct in E. coli is carried out due to elements from the standard vector pQE30 (Invitrogen): replicon of plasmid pMC16 and β-lactamase gene (determinant of resistance to ampicillin).

Фиг.2. Идентификация продукта модифицированного гена PAG в культуральной жидкости B. subtilis AJ73, несущей конструкцию pWPag201-SW, методом иммуноблоттинга с антителами против протективного антигена B. anthracis 55-ВНИИВВиМ (производства ФКП «Орловская биофабрика»). На дорожки геля нанесены: молекулярно-массовый стандарт PageRuler (MBI Fermentas (Литва)), дорожки 1 и 2 - суммарные белки культуральной жидкости нерекомбинантного штамма B. subtilis AJ73, дорожка 3 - культуральная жидкость нерекомбинантного штамма B. subtilis AJ73 pWPag201-SW.Figure 2. Product identification of the modified PAG gene in B. subtilis AJ73 culture fluid carrying the pWPag201-SW construct by immunoblotting with antibodies against the protective antigen B. anthracis 55-VNIIVViM (manufactured by Oryol Biofactory FKP). The gel tracks were coated with the PageRuler molecular weight standard (MBI Fermentas (Lithuania)), lanes 1 and 2 — total proteins of the culture fluid of the non-recombinant B. subtilis AJ73 strain, lane 3 — the culture fluid of the non-recombinant B. subtilis AJ73 pWPag201-SW strain.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

1. Генноинженерное конструирование1. Genetic engineering

Штамм B. subtilis AJ73 получают из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, где он депонирован под номером ВКПМ B-5036. Для выделения ДНК из биомассы штамма используют 1,5 мл культуры, полученной выращиванием на жидкой среде LB (пептон 1%, дрожжевой экстракт 0,5%, NaCl 0,5%) при интенсивной аэрации при 37°С.выделяют ДНК с помощью набора Проба-ГС (ДНК-технология, Москва) согласно инструкции производителя, растворяя полученный препарат в 50 мкл деионизованной воды. В качестве матрицы для проведения ПЦР используют 1 мкл препарата геномной ДНК. Реакцию проводят в 30 мкл, используя по 10 пмоль каждого из двух праймеров Wpr141

и WPR201

. Продукт размером 935 п.н. очищают путем нанесения-десорбции на стеклянное молоко с применением набора GenJet (MBI Fermentas, Литва) и растворяют в 30 мкл деионизованной воды. 10 мкл препарата отбирают для двойной рестрикции XhoI/SphI и лигируют с ДНК вектора pQE30 (Invitrogen) в стандартных условиях. Лигазной смесью проводят трансформацию E.coli TG1, трансформанты высевают на среду с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Отбирают ампициллин-резистентные колонии. Полученная конструкция получает обозначение pQE30-WprA.The strain B. subtilis AJ73 is obtained from the All-Russian collection of industrial microorganisms, where it is deposited under the number VKPM B-5036. To isolate DNA from the biomass of the strain, 1.5 ml of the culture obtained by growing on liquid LB medium (peptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%) with intensive aeration at 37 ° C is used. DNA is isolated using a kit Sample-GS (DNA technology, Moscow) according to the manufacturer's instructions, dissolving the resulting preparation in 50 μl of deionized water. As a matrix for PCR use 1 μl of the preparation of genomic DNA. The reaction is carried out in 30 μl using 10 pmol of each of the two primers Wpr141

and WPR201

. Product size 935 bp purified by glass desorption on glass milk using a GenJet kit (MBI Fermentas, Lithuania) and dissolved in 30 μl of deionized water. 10 μl of the drug was selected for double restriction XhoI / SphI and ligated with DNA vector pQE30 (Invitrogen) under standard conditions. The transformation of E. coli TG1 is carried out with a ligase mixture, transformants are plated on medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin. Ampicillin-resistant colonies were selected. The resulting design is designated pQE30-WprA.

Для выделения ДНК из биомассы штамма B. anthracis 55-ВНИИВВиМ используют вакцину сухую сибиреязвенную производства Федерального казенного предприятия «Орловская биофабрика». К лиофилизированному препарату из вскрытой ампулы добавляют 1 мл деионизованной воды, тщательно суспендируют пипетированием, отбирают 100 мкл и выделяют ДНК с помощью набора Проба-ГС (ДНК-технология, Москва) согласно инструкции производителя, растворяя полученный препарат в 50 мкл деионизованной воды. В качестве матрицы для проведения ПЦР используют 1 мкл препарата геномной ДНК. Реакцию проводят в 30 мкл, используя по 10 пмоль каждого из двух праймеров PAG201 (GGGATATCatatgaaaaaacgaaaagtgtt) и PAG3 (GGGGTAccagcacttgtacttcgcttt).To isolate DNA from the biomass of strain B. anthracis 55-VNIIVViM, the dry anthrax vaccine produced by the Orel Biofactory Federal State Enterprise is used. 1 ml of deionized water is added to the lyophilized preparation from the opened ampoule, carefully suspended by pipetting, 100 μl are taken and DNA is isolated using the Proba-GS kit (DNA technology, Moscow) according to the manufacturer's instructions, dissolving the obtained preparation in 50 μl of deionized water. As a matrix for PCR use 1 μl of the preparation of genomic DNA. The reaction is carried out in 30 μl using 10 pmol of each of the two primers PAG201 (GGGATATCatatgaaaaaacgaaaagtgtt) and PAG3 (GGGGTAccagcacttgtacttcgcttt).

Продукт размером 525 пн очищают путем нанесения-десорбции на стеклянное молоко с применением набора GenJet (MBI Fermentas, Литва) и растворяют в 30 мкл деионизованной воды. 10 мкл препарата отбирают для двойной рестрикции Eco32.I/KpnI и лигируют с ДНК вектора pQE30-WprA (Invitrogen) в стандартных условиях. Лигазной смесью проводят трансформацию E.coli TG1, трансформанты высевают на среду с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Отбирают ампициллин-резистентные колонии. Полученная конструкция получает обозначение pQE-WprA-PAG.A 525 bp product is purified by desorption on glass milk using a GenJet kit (MBI Fermentas, Lithuania) and dissolved in 30 μl of deionized water. 10 μl of the drug was taken for double restriction Eco32.I / KpnI and ligated with DNA vector pQE30-WprA (Invitrogen) under standard conditions. The transformation of E. coli TG1 is carried out with a ligase mixture, transformants are plated on medium supplemented with 100 μg / ml ampicillin. Ampicillin-resistant colonies were selected. The resulting design is designated pQE-WprA-PAG.

Вспомогательную конструкцию, содержащую терминатор гена WprA и маркер устойчивости к спектиномицину Spc с собственным промотором и терминатором, получают на основе вектора pBlueScript-KS+(Stratagene) (pBSks+), после чего переносят оба элемента на репликон вектора pQE30, несущего промотор гена WprA и модифицированный вариант гена PAG.An auxiliary construct containing the WprA gene terminator and Spc spectinomycin resistance marker with its own promoter and terminator is obtained based on the pBlueScript-KS + (Stratagene) vector (pBSks +), after which both elements are transferred to the replicon of the pQE30 vector carrying the WprA gene promoter and a modified variant PAG gene.

Для этого фрагмент ДНК, содержащий терминатор гена WprA, получают с помощью ПЦР с праймерами WPR1.1 и Wpr2, используя в качестве матрицы геномную ДНК B. subtilis AJ73 (ВКПМ B-5036), размер продукта 1600 п.н. Продукт обрабатывают рестриктазами PstI (расщепляет природный сайт внутри кодирующей области гена WprA) и SacI (вводится в составе праймера Wpr2). Рестрикционную смесь, не разделяя на фрагменты, лигируют с ДНК плазмиды pBlueScript-KS+(Stratagene). Проводят трансформацию E.coli TG1 лигазной смесью, высевая трансформанты на среду с ампициллином в концентрации 100 мкг/мл и X-gal в концентрации 20 мкг/мл. После инкубации чашки Петри с агаризованной средой в течение 20 часов при 37°С, отбирают ампициллин-устойчивые колонии белого цвета, содержащие в плазмиде вставку ожидаемого размера 1020 п.н. при контрольной рестрикции PstI и SacI.For this, a DNA fragment containing the WprA gene terminator is obtained by PCR with primers WPR1.1 and Wpr2, using B. subtilis AJ73 genomic DNA (VKPM B-5036) as a template, the product size is 1600 bp. The product is treated with restriction enzymes PstI (cleaves the natural site within the coding region of the WprA gene) and SacI (introduced as part of the Wpr2 primer). The restriction mixture, without dividing into fragments, is ligated with the DNA of plasmid pBlueScript-KS + (Stratagene). Transformation of E. coli TG1 with a ligase mixture is carried out, seeding transformants on medium with ampicillin at a concentration of 100 μg / ml and X-gal at a concentration of 20 μg / ml. After incubation of the Petri dish with agar medium for 20 hours at 37 ° C, ampicillin-resistant white colonies containing the expected size of 1020 bp insert in the plasmid were selected. with control restriction PstI and SacI.

С целью введения в конструкцию pBSks-WprA маркера устойчивости к спектиномицину, ген лекарственной устойчивости получают в виде фрагмента размером 770 п.н. путем обработки рестриктазой PstI плазмидной ДНК конструкции pSG1154 (Lewis P.J., Marston A.L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 1999 Feb 4; 227(1): 101-110). Его лигируют с ДНК плазмиды pBS-WprA, полученной на предыдущей стадии конструирования, предварительно расщепленной PstI.In order to introduce the spectinomycin resistance marker into the pBSks-WprA construct, the drug resistance gene is obtained in the form of a fragment of 770 bp in size. by treatment with PstI restriction enzyme for plasmid DNA of construct pSG1154 (Lewis P.J., Marston A.L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 1999 Feb 4; 227 (1): 101-110). It is ligated with the DNA of the plasmid pBS-WprA obtained in the previous construction step, previously digested with PstI.

Поскольку маркер Spc содержит собственный промотор и терминатор транскрипции, и вводится в лигирование в виде фрагмента с одноименными (симметричными) концами, образованными рестриктазой PstI, возможно его встраивание в вектор в обеих ориентациях. Кроме того, большая часть вектора при лигировании замыкается в кольцо, не захватывая вставку. Однако, для дальнейшего применения пригоден вариант конструкции только с одной ориентацией вставки, в которой кодирующие области гена WprA и Spc расположены конвергентно. С учетом этого, лигазную смесь используют для трансформации E.coli TG1, после чего высевают трансформанты на агаризованную полноценную среду LB, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл и спектиномицин в концентрации 75 мкг/мл. Проверяют наличие в плазмиде вставки ожидаемого размера 770 п.н. при контрольной рестрикции PstI и отсутствие фрагмента при рестрикции EcoRI.Since the Spc marker contains its own promoter and transcription terminator, and is introduced into the ligation as a fragment with the same (symmetrical) ends formed by the restriction enzyme PstI, it can be inserted into the vector in both orientations. In addition, most of the vector, when ligated, closes into a ring without capturing the insert. However, for further use, a design variant with only one insertion orientation is suitable, in which the coding regions of the WprA and Spc gene are located convergent. With this in mind, the ligase mixture is used to transform E. coli TG1, after which the transformants are seeded on complete agarized LB medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / ml and spectinomycin at a concentration of 75 μg / ml. Check for plasmid insertion of the expected size of 770 bp with control restriction PstI and the absence of a fragment with restriction EcoRI.

На заключительном этапе конструирования из плазмиды pBSks-Spc-WprA извлекают полноразмерную вставку, содержащую как маркер Spc, так и транскрипционный терминатор гена WprA. Для этого ее подвергают двойной рестрикции эндонуклеазами EcoR32.I и Ecl136.II, дающими тупые концы. Вставку размером 2060 п.н. экстрагируют элюцией из агарозного геля и лигируют с плазмидной ДНК конструкции pQE-WprA-PAG, расщепленной PvuII, также образующей тупой конец. Сайт рестриктазы PvuII в составе конструкции pQE-WprA-PAG расположен за пределами полилинкера ниже терминатора фага Т5, происходящего из базового коммерческого вектора pQE30. Таким образом, в случае вcтройки фрагмента Spc-WprA на базе pQE30 в прямой ориентации терминатора WprA относительно его промотора образуется интегративная конструкция, обладающая двумя плечами для гомологичной рекомбинации с хромосомой B. subtilis. Эти плечи фланкируют маркер лекарственной устойчивости к спектиномицину, что дает возможность селектировать на антибиотикосодержащей среде клоны, содержащие конструкцию в хромосоме (репликон pQE30 (pMC16) не поддерживается в B. subtilis и других видах бацилл).At the final stage of construction, a full-sized insert containing both the Spc marker and the transcriptional terminator of the WprA gene is recovered from the pBSks-Spc-WprA plasmid. To do this, it is subjected to double restriction with endonucleases EcoR32.I and Ecl136.II, giving blunt ends. 2060 bp insert extracted by elution from the agarose gel and ligated with plasmid DNA of the pQE-WprA-PAG construct cleaved with PvuII, also forming a blunt end. The PvuII restriction enzyme site in the pQE-WprA-PAG construct is located outside the polylinker below the T5 phage terminator derived from the base commercial vector pQE30. Thus, in the case of insertion of the Spc-WprA fragment based on pQE30 in the direct orientation of the WprA terminator relative to its promoter, an integrative construct is formed with two arms for homologous recombination with the B. subtilis chromosome. These shoulders flank the marker of drug resistance to spectinomycin, which makes it possible to select clones containing the chromosome construct on an antibiotic-containing medium (pQE30 replicon (pMC16) is not supported in B. subtilis and other types of bacilli).

С учетом этого на последней стадии конструирования отбирают клоны E.coli, обладающие способностью расти на плотной полноценной среде с содержанием спектиномицина 75 мкг/мл (уровень спонтанной устойчивости E.coli к этому антибиотику 30-40 мкг/мл). Отбор необходимой ориентации вставки проводят за счет контрольной рестрикции плазмидной ДНК клонов рестриктазой EcoRI: целевые клоны дают фрагменты размером 480 п.н. и 6680 п.н.With this in mind, at the last stage of construction, E. coli clones are selected that can grow on a dense, complete medium with spectinomycin 75 μg / ml (the level of E. coli spontaneous resistance to this antibiotic is 30-40 μg / ml). The selection of the desired orientation of the insert is carried out by means of a control restriction of plasmid DNA of clones with EcoRI restrictase enzyme: target clones give fragments of 480 bp in size. and 6680 bp

2. Получение рекомбинантных штаммов B. subtilis2. Obtaining recombinant strains of B. subtilis

Введение ДНК конструкции pWPag201-SW в клетки B. subtilis AJ73 проводится методом химической трансформации по Спицайзену с отбором трансформантов на полноценной среде, содержащей 75 мкг/мл спектиномицина. Для проведения трансформации ДНК конструкции pWPag201-SW препаративно выделяют из клеток E.coli TG1. В трансформации она используется в кольцевой форме в количестве 2-5 мкг на одну реакцию. Полученные штаммы-трансформанты учитывают через 48 часов после инкубации на полной среде при 37°С. Их однократно пассируют на полноценной среде со спектиномицином для удаления клеток штамма дикого типа, не несущего конструкции. После этого по 10 клонов, несущих каждую конструкцию, тестируют на способность к продукции целевого белка PAG путем высева на среду LB, не содержащую антибиотика. Учет результатов проводят после культивирования штамма при +37°С в течение 20 часов.The DNA of the pWPag201-SW construct was introduced into B. subtilis AJ73 cells by the Spitsaisen method of chemical transformation with selection of transformants on a complete medium containing 75 μg / ml spectinomycin. To carry out DNA transformation, pWPag201-SW constructs are preparatively isolated from E. coli TG1 cells. In transformation, it is used in a ring form in an amount of 2-5 μg per reaction. The obtained transforming strains are taken into account 48 hours after incubation in complete medium at 37 ° C. They are passaged once on a complete medium with spectinomycin to remove cells of a wild-type strain that does not carry a construct. After that, 10 clones carrying each construct were tested for their ability to produce the desired PAG protein by plating on LB medium that did not contain an antibiotic. Analysis is carried out after cultivation of the strain at + 37 ° C for 20 hours.

3. Исследование уровня накопления целевого продукта – белка PAG в среде культивирования рекомбинантных штаммов, несущих конструкцию pWPag201-SW3. The study of the level of accumulation of the target product - PAG protein in the culture medium of recombinant strains bearing the construction of pWPag201-SW

3.1 Получение посевной культуры.3.1 Obtaining a seed crop.

В микробиологическую пробирку объемом 20 мл, содержащую 3 мл жидкой среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% NaCl) микробиологической петлей засевают материал отдельной колонии B. subtilis AJ73 (pWPag201-SW), полученной на плотной среде LB без добавления антибиотика. Культивирование ведут при+37°С в течение 16 часов.In a microbiological test tube with a volume of 20 ml containing 3 ml of liquid LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl), the material of a separate colony of B. subtilis AJ73 (pWPag201-SW) obtained on solid LB medium without antibiotic addition. Cultivation is carried out at + 37 ° C for 16 hours.

3.2 Получение рабочей культуры.3.2 Obtaining a working culture.

30 мкл посевной культуры вносят в 3 мл среды LB. Культивирование ведут при +37°С в течение 20 часов.30 μl of inoculum is added to 3 ml of LB medium. Cultivation is carried out at + 37 ° C for 20 hours.

3.3 Сбор биомассы.3.3 Collection of biomass.

Биомассу рабочих культур собирают центрифугированием в при 9 тыс. G в течение 3 мин. 1 мл супернатанта каждой культуры осаждают, добавляя 100 мкл насыщенного раствора трихлоруксусной кислоты с последующей инкубацией при +4°С в течение 30 мин и центрифугированием при 9 тыс. G в течение 5 мин. Супернатант тщательно удаляют с помощью водоструйного насоса. Осадок промывают 50% водным раствором ацетона (200 мкл на полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл), центрифугируют при 9 тыс. G в течение 2 мин., супернатант тщательно удаляют с помощью водоструйного насоса. Осадок подсушивают на воздухе при 37°С в течение 5 мин.The biomass of working crops is collected by centrifugation at at 9 thousand G for 3 minutes. 1 ml of the supernatant of each culture is precipitated by adding 100 μl of a saturated solution of trichloroacetic acid, followed by incubation at + 4 ° С for 30 min and centrifugation at 9 thousand G for 5 min. The supernatant is carefully removed using a water jet pump. The precipitate was washed with a 50% aqueous acetone solution (200 μl per 1.5 ml polypropylene tube), centrifuged at 9 thousand G for 2 minutes, the supernatant was carefully removed using a water-jet pump. The precipitate was dried in air at 37 ° C for 5 minutes.

В качестве отрицательного контроля используют нерекомбинантный штамм B. subtilis AJ73, с культуральной жидкостью которого проводят операции, идентичные культуральной жидкости рекомбинантных штаммов.As a negative control, a non-recombinant B. subtilis AJ73 strain is used, with the culture fluid of which operations are carried out that are identical to the culture fluid of the recombinant strains.

3.4 Выявление рекомбинантного продукта конструкции pWPag201-SW методом иммуноблоттинга.3.4 Identification of the recombinant construct product pWPag201-SW by immunoblotting.

Осажденные ТХУ препараты секреторной фракции культуральной жидкости B. subtilis AJ73 (pWPag201-SW) растворяют в 20 мкл буфера Лэммли (трис, 3 г; глицин 14,2, 1% SDS), содержащего 1% свежевнесенного β-меркаптоэтанола, денатурируют образцы прогреванием при 98°С в течение 5 мин и осветляют центрифугированием при 9 тыс. G в течение 2 мин. По 10 мкл каждого образца тестируют, нанося на дорожки 12,5% денатурирующего ПААГ, с последующим диск-электрофорезом и полусухим переносом на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C. Визуализацию иммуноблоттинга проводят с помощью лошадиных поликлональных антител, полученных при трехкратной иммунизации сухой сибиреязвенной вакциной производства ФКП «Орловская биофабрика» в разведении 1:5000 раз в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2). Связанные на мембране антитела визуализируют с помощью конъюгата белка А с пероксидазой (Имтек (Москва). В качестве хромогенного субстрата используют 0,02% 3,3’-диаминобензидин (Sigma) в присутствии 0,01% H₂O₂. Для определения молекулярной массы белков используют стандарт PageRuler (MBI Fermentas (Литва)). Результаты типичного определения представлены на Фиг.2. Масса иммуноположительного продукта (дорожка 3) соответствует ожидаемой и равна 35 кДа. Аналогичный иммуноположительный продукт в культуральной жидкости нерекомбинантного штамма B. subtilis AJ73 (дорожки 1 и 2) не выявляется.The TCA-precipitated preparations of the secretory fraction of the B. subtilis AJ73 culture fluid (pWPag201-SW) were dissolved in 20 μl of Laemmli buffer (Tris, 3 g; glycine 14.2, 1% SDS) containing 1% freshly added β-mercaptoethanol, the samples were denatured by heating with 98 ° C for 5 minutes and clarified by centrifugation at 9 thousand G for 2 minutes. 10 μl of each sample was tested by applying 12.5% denaturing PAAG to the tracks, followed by disk electrophoresis and semi-dry transfer to the Hybond-C nitrocellulose membrane. Immunoblotting is visualized using equine polyclonal antibodies obtained by triple immunization with the dry anthrax vaccine produced by the Oryol Biofactory PCP at a dilution of 1: 5000 times in phosphate-buffered saline (pH 7.2). Bound on the membrane antibodies are visualized using a conjugate of protein A with peroxidase (Imtek (Moscow). As a chromogenic substrate, 0.02% 3,3'-diaminobenzidine (Sigma) is used in the presence of 0.01% H ₂ O _2. To determine the molecular protein masses use PageRuler standard (MBI Fermentas (Lithuania)). Typical determination results are shown in Figure 2. The mass of the immunopositive product (lane 3) is as expected and 35 kDa. A similar immunopositive product in the culture fluid of the non-recombinant B. subtilis AJ73 strain (lanes) 1 and 2) not detected.

Источники информацииInformation sources

1. Караваев Ю.Д., Селиверстов В.В., Мельник Н.В. и др. Ассоциированная вакцина для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных // Патент РФ №2191599. Опубл. 27.10.2002.1. Karavaev Yu.D., Seliverstov VV, Melnik N.V. and other Associated vaccine for the prevention of anthrax and animal necrobacillosis // RF Patent No. 2191599. Publ. 10/27/2002.

2. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Кудрявцева О.М. Рекомбинантный штамм Bacillus anthracis СТИ ТПА-1 (pUB110pa-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Патент РФ №2321628. Опубл. 10.04.2008.2. Mikshis N.I., Popov Yu.A., Kudryavtseva O.M. Recombinant strain of Bacillus anthracis STI TPA-1 (pUB110pa-1) - producer of the protective antigen of anthrax microbe // RF Patent No. 2321628. Publ. 04/10/2008.

3. Кожухова В.В., Пименова Е.В., Сероглазова В.В. и др. Способ получения сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины // Патент РФ №2181294. Опубл. 20.04.2002.3. Kozhukhova VV, Pimenova EV, Seroglazova VV and others. A method of obtaining a dry combined anthrax vaccine // RF Patent No. 2181294. Publ. 04/20/2002.

4. Садовой Н.В., Кравец И.Д., Селиваненко Г.М. и др. Вакцина сибиреязвенная комбинированная // Патент РФ №2115433. Опубл. 20.07.1998.4. Sadovoy N.V., Kravets I.D., Selivanenko G.M. and other vaccine anthrax combined // Patent of the Russian Federation No. 21115433. Publ. 07/20/1998.

5. Дербин М.И., Садовой Н.В., Тарумов B.C., Гарин Н.С. Сравнительное изучение гуморального противосибиреязвенного иммунитета у привитых живой и химической вакцинами // Иммунология. 1982. №3. С.49–52.5. Derbin M.I., Sadovoy N.V., Tarumov B.C., Garin N.S. Comparative study of humoral anti-anthrax immunity in vaccinated with live and chemical vaccines // Immunology. 1982. No. 3. S.49-52.

6. Бургасов П.Н., редактор. Патоморфогенез сибирской язвы. М.: Медицина; 2002. 240 с.6. Burgasov PN, editor. Pathomorphogenesis of anthrax. M .: Medicine; 2002.240 s.

7. Караваев Ю.Д., Семенова И.Н., Мусаев А.Р., Панюков Н.А. Вакцина для профилактики некробактериоза рогатого скота // Патент РФ №1816348. Опубл. 20.08.1995.7. Karavaev Yu.D., Semenova I.N., Musaev A.R., Panyukov N.A. A vaccine for the prevention of cattle necrobacillosis // Patent of the Russian Federation No. 1816348. Publ. 08/20/1995.

8. Шевцов А.Н., Лобастов В.С., Боровской Д.В. и др. Способ получения сибиреязвенного протективного антигена // Патент РФ №2340356. Опубл. 10.12.2008.8. Shevtsov A.N., Lobastov V.S., Borovskoy D.V. and other Method for producing anthrax protective antigen // RF Patent No. 2340356. Publ. 12/10/2008.

9. Мельник Н.В., Соболев В.В., Захарченко О.С.и др. Ассоциированная вакцина для профилактики сибирской язвы и некробактериоза животных // Патент РФ №2480237. Опубл. 27.04.2013.9. Melnik N.V., Sobolev V.V., Zakharchenko O.S. et al. Associated vaccine for the prevention of anthrax and necrobacteriosis of animals // RF Patent No. 2480237. Publ. 04/27/2013.

10. Щербинин Д.Н., Тутыхина И.Л., Верховская Л.В. и др. Способ получения рекомбинантной вакцины // Патент РФ №2444570. Опубл. 10.03.2012.10. Scherbinin D.N., Tutykhina I.L., Verkhovskaya L.V. and others. A method of obtaining a recombinant vaccine // RF Patent No. 2444570. Publ. 03/10/2012.

11. Susan Wimer-Mackin. Anthrax antigens and methods of use // Патент США 8409590. Опубл. 02.04.2013.11. Susan Wimer-Mackin. Anthrax antigens and methods of use // US Patent 8409590. Publ. 04/02/2013.

12. Frucht D.M., Fang H. Use of lymphocytes to measure anthrax lethal toxin activity // Патент США 8383359. Опубл. 26.02.2013.12. Frucht D.M., Fang H. Use of lymphocytes to measure anthrax lethal toxin activity // US Patent 8383359. Publ. 02/26/2013.

13. Leppla S.H., Rosovitz M.J., Robbins J.B. et al. Recombinant modified Bacillus anthracis protective antigen for use in vaccines // Патенте США 8394387. Опубл. 12.03.2013.13. Leppla S.H., Rosovitz M.J., Robbins J.B. et al. Recombinant modified Bacillus anthracis protective antigen for use in vaccines // US Patent 8394387. Publ. 03/12/2013.

14. Keler T., Lowy I., Vitale L.A. et al. Human monoclonal antibodies against Bacillus anthracis protective antigen // Патент США 8404820. Опубл. 26.03.2013.14. Keler T., Lowy I., Vitale L.A. et al. Human monoclonal antibodies against Bacillus anthracis protective antigen // US Patent 8404820. Publ. 03/26/2013.

15. Уильямсон Э.Д., Миллер Д., Уолкер Н.Дж. и др. Иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против Bacillus anthracis (варианты), способ его получения, нуклеиновая кислота, кодирующая его, вектор для экспрессии (варианты), способ и вакцина для предупреждения инфекции, вызванной Bacillus anthracis // Патент РФ №2270865. Опубл. 27.02.2006.15. Williamson E.D., Miller D., Walker N.J. and other Immunogenic polypeptide that elicits a protective immune response against Bacillus anthracis (options), method for its preparation, nucleic acid encoding it, expression vector (options), method and vaccine for preventing infection caused by Bacillus anthracis // RF Patent No. 2270865 . Publ. 02/27/2006.

16. Бхатнагар Р., Вахид С.М., Чаухан В. Высокие уровни конститутивного продуцирования защитного антигена сибирской язвы // Патент РФ №2288272. Опубл. 27.11.2006.16. Bhatnagar R., Vahid S.M., Chauhan V. High levels of constitutive production of anthrax protective antigen // RF Patent No. 2288272. Publ. 11/27/2006.

Claims

An artificial gene that allows expression of isolated domain 1 of the protective PAG antigen from Bacillus anthracis 55-VNIIIVViM in bacterial cells, characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, designed to introduce bacilli into the chromosome as part of a DNA construct characterized by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 .