RU2618409C1 - Method for prostate cancer differential diagnosis based on plasma micrornas analysis - Google Patents

Method for prostate cancer differential diagnosis based on plasma micrornas analysis Download PDF

Info

Publication number
RU2618409C1
RU2618409C1 RU2016100243A RU2016100243A RU2618409C1 RU 2618409 C1 RU2618409 C1 RU 2618409C1 RU 2016100243 A RU2016100243 A RU 2016100243A RU 2016100243 A RU2016100243 A RU 2016100243A RU 2618409 C1 RU2618409 C1 RU 2618409C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
mir
prostate cancer
hsa
micrornas
expression
Prior art date
Application number
RU2016100243A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Максим Юрьевич Шкурников
Тимур Рустэмович Саматов
Евгений Николаевич Князев
Борис Яковлевич Алексеев
Александр Григорьевич Тоневицкий
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум"
Priority to RU2016100243A priority Critical patent/RU2618409C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2618409C1 publication Critical patent/RU2618409C1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: hsa-miR-619-5p and hsa-miR-1184 microRNAs expression in the patient's blood plasma is measured by microarray analysis. At hsa-miR-619-5p microRNAs expression log2-scale more than 1.25 and hsa-miR-1184 microRNAs expression more than 3.5, prostate cancer is diagnosed. At hsa-miR-619-5p microRNAs expression log2-scale less than 1.25 and hsa-miR-1184 microRNAs expression less than 3.5, benign prostatic hyperplasia is diagnosed.
EFFECT: obtaining of new diagnostic marker for prostate cancer and benign prostatic hyperplasia, allowing to perform a differential diagnosis of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia at comparable accuracy and specificity.
3 tbl, 6 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики рака предстательной железы. В плазме крови пациентов методом микрочипового анализа определяется представленность микроРНК hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184. При величинах экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p в log2-шкале более 1,25 и микроРНК hsa-miR-1184 в log2-шкале более 3,5 диагностируют рак предстательной железы. При величинах экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p в log2-шкале менее 1,25 и микроРНК hsa-miR-1184 в log2-шкале менее 3,5 диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы. Изобретение позволяет эффективно осуществлять дифференциальную диагностику рака предстательной железы от доброкачественной гиперплазии предстательной железы, что дает возможность начать своевременную и адекватную терапию.The present invention relates to medicine, in particular to oncology and molecular biology, and can be used for the differential diagnosis of prostate cancer. In the blood plasma of patients by the method of microarray analysis, the representation of hsa-miR-619-5p and hsa-miR-1184 microRNAs is determined. With hsa-miR-619-5p miRNA expression values in the log2 scale of more than 1.25 and hsa-miR-1184 microRNA in the log2 scale of over 3.5, prostate cancer is diagnosed. With hsa-miR-619-5p miRNA expression values on the log2 scale less than 1.25 and hsa-miR-1184 miRNAs on the log2 scale less than 3.5, benign prostatic hyperplasia is diagnosed. The invention allows to effectively carry out differential diagnosis of prostate cancer from benign prostatic hyperplasia, which makes it possible to start timely and adequate therapy.

Уровень техникиState of the art

Ранняя диагностика рака предстательной железы (РПЖ) и дифференциальная диагностика данного состояния с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) позволяет улучшить клинические исходы и повысить выживаемость среди больных РПЖ. ДГПЖ является распространенным заболеванием, проявляющимся в увеличении размера предстательной железы, что может оказывать значительное влияние на здоровье больного и требовать хирургического лечения. ДГПЖ может развиваться в молодом возрасте, однако заболевание чаще всего диагностируется в возрасте примерно 50 лет, когда частота развития ДГПЖ достигает 50% [М Т Lokant and R К Naz, "Presence of PSA Auto-Antibodies in Men with Prostate Abnormalities (prostate Cancer/benign Prostatic Hyperplasia/prostatitis)," Andrologia, March 2014].Early diagnosis of prostate cancer (PCa) and differential diagnosis of this condition with benign prostatic hyperplasia (BPH) can improve clinical outcomes and increase survival among patients with prostate cancer. BPH is a common disease, manifested in an increase in the size of the prostate gland, which can have a significant impact on the patient’s health and require surgical treatment. BPH can develop at a young age, but the disease is most often diagnosed at the age of about 50 years, when the frequency of BPH reaches 50% [MT Lokant and R K Naz, "Presence of PSA Auto-Antibodies in Men with Prostate Abnormalities (prostate Cancer / benign Prostatic Hyperplasia / prostatitis), "Andrologia, March 2014].

Скрининг для раннего выявления РПЖ включает в себя ректальное пальцевое исследование (РПИ) и/или определение уровня простатического специфического антигена (ПСА). Однако РПИ у пациентов с уровнем ПСА менее 2 нг/мл имеет положительную прогностическую ценность всего около 5-30% [G F Carvalhal et al., "Digital Rectal Examination for Detecting Prostate Cancer at Prostate Specific Antigen Levels of 4 Ng./ml. or Less.," The Journal of Urology 161, no. 3 (1999): 835-39]. В свою очередь, ПСА является маркером, специфичным для органа, но не для конкретного заболевания, поэтому данный маркер может быть повышен как при РПЖ, так и при ДГПЖ, простатите и других состояниях. Кроме того, РПЖ у многих мужчин обнаруживается при низких значениях ПСА [Ian М Thompson et al., "Prevalence of Prostate Cancer among Men with a Prostate-Specific Antigen Level < or =4.0 Ng per Milliliter.," The New England Journal of Medicine 350, no. 22 (2004): 2239-46, doi: 10.1056/NEJMoa031918]. Таким образом, малоинвазивная диагностика РПЖ в настоящее время не является достаточно эффективной, что делает актуальным поиск новых клинико-лабораторных показателей для диагностики РПЖ и дифференциальной диагностики с ДГПЖ.Screening for early detection of prostate cancer includes rectal digital examination (EPI) and / or determination of the level of prostate specific antigen (PSA). However, EPI in patients with a PSA level of less than 2 ng / ml has a positive predictive value of only about 5-30% [GF Carvalhal et al., "Digital Rectal Examination for Detecting Prostate Cancer at Prostate Specific Antigen Levels of 4 Ng./ml. Or Less., "The Journal of Urology 161, no. 3 (1999): 835-39]. In turn, PSA is a marker specific for the organ, but not for a specific disease, so this marker can be increased in both prostate cancer and BPH, prostatitis and other conditions. In addition, PCa is found in many men with low PSA values [Ian M Thompson et al., "Prevalence of Prostate Cancer among Men with a Prostate-Specific Antigen Level <or = 4.0 Ng per Milliliter.," The New England Journal of Medicine 350, no. 22 (2004): 2239-46, doi: 10.1056 / NEJMoa031918]. Thus, minimally invasive diagnosis of prostate cancer is currently not sufficiently effective, which makes it relevant to search for new clinical and laboratory parameters for the diagnosis of prostate cancer and differential diagnosis with BPH.

Было обнаружено, что в качестве биологических показателей наличия РПЖ могут выступать циркулирующие молекулы микроРНК. МикроРНК - это короткие некодирующие одноцепочечные молекулы РНК длиной около 22 нуклеотидов, играющие роль посттранскрипционных регуляторов экспрессии определенных генов-мишеней [David Р Bartel, "MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function.," Cell 116, no. 2 (January 2004): 281-97]. Молекулы микроРНК вовлечены во многие процессы, включая развитие, пролиферацию и апоптоз, кроме того, микроРНК связаны со многими патологическими процессами, например злокачественными опухолями [Francesco Russo et al., "A Knowledge Base for the Discovery of Function, Diagnostic Potential and Drug Effects on Cellular and Extracellular miRNAs.," BMC Genomics 15 Suppl 3 (January 2014): S4]. При различных видах рака определение экспрессионных профилей микроРНК может выступать в роли метода для классификации, диагностирования и прогнозирования течения заболевания [Tanja Kunej et al., "Epigenetic Regulation of microRNAs in Cancer: An Integrated Review of Literature.," Mutation Research 717, no. 1-2 (December 2011): 77-84]. МикроРНК обнаруживаются в различных биологических жидкостях и обладают заметной стабильностью, что подчеркивает их возможную роль в качестве перспективных малоинвазивных маркеров рака [Jessica A Weber et al., "The microRNA Spectrum in 12 Body Fluids." Clinical Chemistry 56, no. 11 (November 2010): 1733-41, doi: 10.1373/clinchem. 2010. 147405]. Потенциальная польза микроРНК была показана также в диагностике рака предстательной железы [Qinfeng Yang, Yushan Zheng, and Dequan Zhu, "Diagnostic Performance of microRNAs Expression in Prostate Cancer.," Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, July 2014].It was found that circulating miRNA molecules can act as biological indicators of the presence of prostate cancer. MicroRNAs are short non-coding single-stranded RNA molecules with a length of about 22 nucleotides, which play the role of post-transcriptional regulators of the expression of certain target genes [David P Bartel, "MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function.," Cell 116, no. 2 (January 2004): 281-97]. MicroRNA molecules are involved in many processes, including development, proliferation, and apoptosis; in addition, microRNAs are associated with many pathological processes, such as malignant tumors [Francesco Russo et al., "A Knowledge Base for the Discovery of Function, Diagnostic Potential and Drug Effects on Cellular and Extracellular miRNAs., "BMC Genomics 15 Suppl 3 (January 2014): S4]. For various types of cancer, determining the expression profiles of microRNAs can act as a method for classifying, diagnosing and predicting the course of the disease [Tanja Kunej et al., "Epigenetic Regulation of microRNAs in Cancer: An Integrated Review of Literature.," Mutation Research 717, no. 1-2 (December 2011): 77-84]. MicroRNAs are found in various body fluids and have marked stability, highlighting their potential role as promising minimally invasive cancer markers [Jessica A Weber et al., "The microRNA Spectrum in 12 Body Fluids." Clinical Chemistry 56, no. 11 (November 2010): 1733-41, doi: 10.1373 / clinchem. 2010. 147405]. The potential benefits of miRNAs have also been shown in the diagnosis of prostate cancer [Qinfeng Yang, Yushan Zheng, and Dequan Zhu, "Diagnostic Performance of microRNAs Expression in Prostate Cancer.," Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, July 2014].

Одним из наиболее вероятных механизмов появления РПЖ-специфических циркулирующих микроРНК в периферической крови представляется их поступление непосредственно из раковых клеток или клеточного окружения опухоли, включая эндотелий, иммунные клетки и другие источники. Было обнаружено, что повышение уровня экспрессии микроРНК может быть связано с гиперэкспрессией гена-хозяина, в интроне которого закодирована соответствующая микроРНК [S. Ambs et al., "Genomic Profiling of MicroRNA and Messenger RNA Reveals Deregulated MicroRNA Expression in Prostate Cancer," Cancer Research 68, no. 15 (August 2008): 6162-70, doi: 10.1158/0008-5472. CAN-08-0144]. Таким образом, можно предположить, что анализ циркулирующих микроРНК в периферической крови помимо ранней дифференциальной диагностики позволяет оценивать генетические изменения в клетках РПЖ.One of the most likely mechanisms for the appearance of PCa-specific circulating microRNAs in the peripheral blood seems to be their entry directly from cancer cells or the tumor cell environment, including endothelium, immune cells, and other sources. It was found that an increase in the level of miRNA expression can be associated with overexpression of the host gene, in the intron of which the corresponding miRNA is encoded [S. Ambs et al., "Genomic Profiling of MicroRNA and Messenger RNA Reveals Deregulated MicroRNA Expression in Prostate Cancer," Cancer Research 68, no. 15 (August 2008): 6162-70, doi: 10.1158 / 0008-5472. CAN-08-0144]. Thus, it can be assumed that the analysis of circulating miRNAs in peripheral blood, in addition to early differential diagnosis, allows us to evaluate genetic changes in prostate cancer cells.

Первично было обнаружено, что miR-141 может определять наличие распространенного, метастатического РПЖ при сравнении со здоровым контролем с чувствительностью 60% и специфичностью 100% [Patrick S Mitchell et al., "Circulating microRNAs as Stable Blood-Based Markers for Cancer Detection.," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, no. 30 (July 29, 2008): 10513-18, doi: 10.1073/pnas. 0804549105]. При сравнении локализованного РПЖ с метастатической формой специфичность определения miR-141 оказалась ниже 100%, параллельно были выявлены две микроРНК, отличавшие раннюю стадию болезни от здорового контроля [Fulya Yaman Agaoglu et al., "Investigation of miR-21, miR-141, and miR-221 in Blood Circulation of Patients with Prostate Cancer.," Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine 32, no. 3 (June 2011): 583-88]. Еще одно исследование обнаружило в результате микрочипового анализа 15 микроРНК, повышенных при РПЖ, но данные молекулы не позволяли достоверно отличить РПЖ от других типов рака [Michael J Lodes et al., "Detection of Cancer with Serum miRNAs on an Oligonucleotide Microarray.," PloS One 4, no. 7 (January 2009): e6229, doi: 10.1371/journal. pone. 0006229]. Было показано, что в крови мужчин при РПЖ изменена концентрация 12 определенных микроРНК, 11 из которых значительно повышены при наличии метастазов в сравнении с локализованной формой РПЖ, особенно микроРНК miR-141 и miR-375 [R J Bryant et al., "Changes in Circulating microRNA Levels Associated with Prostate Cancer.," British Journal of Cancer 106, no. 4 (February 14, 2012): 768-74, doi: 10.1038/bjc. 2011. 595].It was initially found that miR-141 can detect the presence of advanced, metastatic prostate cancer when compared with a healthy control with 60% sensitivity and 100% specificity [Patrick S Mitchell et al., "Circulating microRNAs as Stable Blood-Based Markers for Cancer Detection., "Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, no. 30 (July 29, 2008): 10513-18, doi: 10.1073 / pnas. 0804549105]. When comparing localized prostate cancer with a metastatic form, the specificity of miR-141 determination was below 100%, two microRNAs were distinguished in parallel that distinguished the early stage of the disease from healthy control [Fulya Yaman Agaoglu et al., "Investigation of miR-21, miR-141, and miR-221 in Blood Circulation of Patients with Prostate Cancer., "Tumour Biology: The Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine 32, no. 3 (June 2011): 583-88]. Another study found by microarray analysis of 15 miRNAs elevated in prostate cancer, but these molecules did not significantly distinguish prostate cancer from other types of cancer [Michael J Lodes et al., "Detection of Cancer with Serum miRNAs on an Oligonucleotide Microarray.," PloS One 4, no. 7 (January 2009): e6229, doi: 10.1371 / journal. pone. 0006229]. It was shown that in the blood of men with prostate cancer, the concentration of 12 certain miRNAs was altered, 11 of which were significantly increased in the presence of metastases in comparison with the localized form of prostate cancer, especially miR-141 and miR-375 miRNAs [RJ Bryant et al., "Changes in Circulating microRNA Levels Associated with Prostate Cancer., "British Journal of Cancer 106, no. 4 (February 14, 2012): 768-74, doi: 10.1038 / bjc. 2011.595].

Исследование циркулирующих микроРНК при РПЖ подтвердило изменение уровней miR-141 и miR-375 в крови больных РПЖ, а также выявило панель из пяти микроРНК (miR-562/miR-210/miR-501-3p/miR-375/miR-551b), способных определить 84% больных РПЖ, панель из 4 микроРНК (let-7a*/miR-210/miR-562/miR-616), достоверно отличающих РПЖ от ДГПЖ в 80% случаев, а также панель из 4 микроРНК (miR-375/miR-708/miR-1203/miR-200a), отличающих диссеминированную форму РПЖ от локализованной [Christa Haldrup et al, "Profiling of Circulating microRNAs for Prostate Cancer Biomarker Discovery.," Drug Delivery and Translational Research 4, no. 1 (February 2014): 19-30]. Уровень miR-21 оказался повышен в сыворотке при сравнении кастрационно-резистентного РПЖ и ДГПЖ, однако с локализованным и андрогензависимым РПЖ достоверной разницы не наблюдалось [Hai-Liang Zhang et al., "Serum miRNA-21: Elevated Levels in Patients with Metastatic Hormone-Refractory Prostate Cancer and Potential Predictive Factor for the Efficacy of Docetaxel-Based Chemotherapy.," The Prostate 71, no. 3 (February 2011): 326-31]. Еще одно исследование показало, что микроРНК let-7e, let-7с, miR-25 и miR-30с понижены в плазме при РПЖ в сравнении с ДГПЖ, a miR-346, miR-622, miR-940 и miR-1285 повышены. При этом авторы выявили, что панель из пяти микроРНК с наибольшей точностью отличает РПЖ от ДГПЖ, при этом три микроРНК данной панели понижены при РПЖ (let-7e, let-7c и miR-30с), а две - повышены (miR-622 и miR-1285) [Zhang-Hui Chen et al., "A Panel of Five Circulating microRNAs as Potential Biomarkers for Prostate Cancer.," The Prostate 72, no. 13 (September 2012): 1443-52]. Набор из 4 микроРНК (miR-26a, miR-32, miR-195, miR-let7i) позволял отличать РПЖ от ДГПЖ с чувствительностью 78,4% и специфичностью 66,7%, при этом уровень miR-16, miR-195 и miR-26a был связан с повышенной частотой положительными хирургическими краями, а уровень miR-195 и miR-let7i - с оценкой по шкале Глисона [Robert Mahn et al., "Circulating microRNAs (miRNA) in Serum of Patients with Prostate Cancer.," Urology 77, no. 5 (May 2011): 1265.е9-16]. Комбинация микроРНК let-7c, miR-30с, miR-141 и miR-375 позволяла провести дифференциальную диагностику ДГПЖ и РПЖ с чувствительностью 86,8% и специфичностью 81,8% и площадью под ROC-кривой (AUC) 0,877 [Darina Kachakova et al., "Combinations of Serum Prostate-Specific Antigen and Plasma Expression Levels of Let-7c, miR-30с, miR-141, and miR-375 as Potential Better Diagnostic Biomarkers for Prostate Cancer.," DNA and Cell Biology 34, no. 3 (March 2015): 189-200, doi: 10.1089/dna. 2014. 2663].A study of circulating miRNAs in prostate cancer confirmed a change in the levels of miR-141 and miR-375 in the blood of patients with prostate cancer, and also revealed a panel of five miRNAs (miR-562 / miR-210 / miR-501-3p / miR-375 / miR-551b) able to identify 84% of patients with prostate cancer, a panel of 4 microRNAs (let-7a * / miR-210 / miR-562 / miR-616) that reliably distinguish prostate cancer from BPH in 80% of cases, as well as a panel of 4 microRNAs (miR- 375 / miR-708 / miR-1203 / miR-200a), distinguishing the disseminated form of prostate cancer from the localized one [Christa Haldrup et al, "Profiling of Circulating microRNAs for Prostate Cancer Biomarker Discovery.," Drug Delivery and Translational Research 4, no. 1 (February 2014): 19-30]. MiR-21 was found to be elevated in serum when comparing castration-resistant prostate cancer and BPH, but there was no significant difference with localized and androgen-dependent prostate cancer [Hai-Liang Zhang et al., "Serum miRNA-21: Elevated Levels in Patients with Metastatic Hormone- Refractory Prostate Cancer and Potential Predictive Factor for the Efficacy of Docetaxel-Based Chemotherapy., "The Prostate 71, no. 3 (February 2011): 326-31]. Another study showed that let-7e, let-7c, miR-25, and miR-30c miRNAs were reduced in plasma with prostate cancer compared with BPH, while miR-346, miR-622, miR-940, and miR-1285 were elevated. At the same time, the authors found that a panel of five microRNAs most accurately distinguishes prostate cancer from BPH, while three microRNAs of this panel are lowered with prostate cancer (let-7e, let-7c and miR-30c), and two are increased (miR-622 and miR-1285) [Zhang-Hui Chen et al., "A Panel of Five Circulating microRNAs as Potential Biomarkers for Prostate Cancer.," The Prostate 72, no. 13 (September 2012): 1443-52]. A set of 4 microRNAs (miR-26a, miR-32, miR-195, miR-let7i) made it possible to distinguish prostate cancer from BPH with a sensitivity of 78.4% and a specificity of 66.7%, with miR-16, miR-195 and miR-26a was associated with an increased frequency of positive surgical margins, and miR-195 and miR-let7i were associated with a Gleason score [Robert Mahn et al., "Circulating microRNAs (miRNA) in Serum of Patients with Prostate Cancer.," Urology 77, no. 5 (May 2011): 1265.e9-16]. The combination of let-7c, miR-30c, miR-141 and miR-375 miRNAs allowed differential diagnosis of BPH and prostate cancer with a sensitivity of 86.8% and a specificity of 81.8% and an area under the ROC curve (AUC) of 0.877 [Darina Kachakova et al., "Combinations of Serum Prostate-Specific Antigen and Plasma Expression Levels of Let-7c, miR-30c, miR-141, and miR-375 as Potential Better Diagnostic Biomarkers for Prostate Cancer.," DNA and Cell Biology 34, no . 3 (March 2015): 189-200, doi: 10.1089 / dna. 2014.2663].

В ходе патентного поиска запатентованных способов определения риска развития, диагностики, стадирования, прогнозирования течения и результатов лечения РПЖ было обнаружено ограниченное количество патентов, часть из которых не обладает специфичностью по отношению только к РПЖ, кроме того, определение биологических маркеров происходит чаще всего в ткани опухоли, что ассоциировано с большой инвазивностью процедуры и снижает ценность метода в аспекте скрининга опухоли. Все вышесказанное определяет целесообразность разработки и патентования такого метода. Общая тенденция развития изобретений в данной области предполагает использование малоинвазивных способов получения образца, в частности определение биомаркеров в крови и ее производных.During the patent search for patented methods for determining the risk of development, diagnosis, staging, predicting the course and results of treatment for prostate cancer, a limited number of patents were discovered, some of which are not specific for prostate cancer, in addition, the determination of biological markers occurs most often in tumor tissue , which is associated with a large invasiveness of the procedure and reduces the value of the method in the aspect of tumor screening. All of the above determines the feasibility of developing and patenting such a method. The general development trend of inventions in this field involves the use of minimally invasive methods for producing a sample, in particular the determination of biomarkers in the blood and its derivatives.

Один из аспектов создания тест-систем для диагностики и дифференциальной диагностики РПЖ - это анализ и выбор конкретных генов и молекул для последующего включения в тест-систему. В данном случае наблюдается тенденция к изучению транскриптома различных биологических объектов с помощью полногеномного транскриптомного анализа с использованием микрочиповых технологий для установления закономерностей и определения целевых генов, наиболее соответствующих поставленным целям (AU 2014202735).One of the aspects of creating test systems for the diagnosis and differential diagnosis of prostate cancer is the analysis and selection of specific genes and molecules for subsequent inclusion in the test system. In this case, there is a tendency to study the transcriptome of various biological objects using a genome-wide transcriptome analysis using microarray technologies to establish patterns and determine the target genes that are most relevant to the goals (AU 2014202735).

Изобретение ЕР 2505669 (А2) относится к методам диагностики солидных опухолей путем определения измененного уровня экспрессии определенных микроРНК. Диагностируется наличие или повышенный риск развития солидных опухолей, среди которых рак толстой кишки, поджелудочной железы, желудка и РПЖ. Определение уровня микроРНК производится путем проведения обратной транскрипции выделенной из образца РНК и гибридизации на микрочипе. Кроме того, используются другие методы определения микроРНК, включая нозерн-блоттинг, ПЦР-РВ, гибридизацию in situ. В качестве образца могут выступать свежая ткань предстательной железы или клетки крови, выделенные из цельной крови, например лейкоциты. Как видно из описания, изобретение не обладает специфичностью для РПЖ и использует менее эффективную методику определения микроРНК.The invention EP 2505669 (A2) relates to methods for the diagnosis of solid tumors by determining the altered expression level of certain miRNAs. Diagnosed with the presence or increased risk of developing solid tumors, including cancer of the colon, pancreas, stomach and prostate cancer. The microRNA level is determined by reverse transcription of the RNA extracted from the sample and hybridization on a microchip. In addition, other methods for determining miRNAs are used, including Northern blotting, PCR-PB, in situ hybridization. The sample may be fresh prostate tissue or blood cells isolated from whole blood, such as white blood cells. As can be seen from the description, the invention does not have specificity for prostate cancer and uses a less effective method for determining miRNAs.

В заявке на патент WO 2014057279 (А1) описаны маркерные микроРНК, применяемые в диагностике и/или прогнозировании РПЖ, а также для мониторинга и/или лечения РПЖ. Составлен список из 35 микроРНК, в различных комбинациях предсказывающих наличие или прогрессирование РПЖ, а также позволяющих отличать вялотекущий РПЖ от агрессивного. Таким образом, определение наличия или отсутствия данных микроРНК и/или изменения их уровня с течением времени может быть использовано для обнаружения у человека РПЖ или потенциала развития его агрессивной формы, а также для дифференциальной диагностики РПЖ и простатита или ДГПЖ. В типичном случае в качестве образца используется свежая ткань предстательной железы, сыворотка, плазма или моча, однако определение возможно в таких биологических образцах, как заключенная в парафин ткань предстательной железы, цельная кровь, слюна, жидкость вокруг предстательной железы, секрет предстательной железы, лимфатическая жидкость, раневой секрет, фекалии, слизь, пот, слезы и ликвор. Предпочтительным методом определения микроРНК является ПЦР-РВ, однако приемлемыми в изобретении указываются методы на основе микрочипов, других вариантов ПЦР, гибридизации in situ, нозерн-блоттинга, секвенирования и методов, основанных на флуоресценции.The patent application WO 2014057279 (A1) describes marker microRNAs used in the diagnosis and / or prognosis of prostate cancer, as well as for monitoring and / or treatment of prostate cancer. A list of 35 miRNAs has been compiled, in various combinations predicting the presence or progression of prostate cancer, and also allowing to distinguish sluggish prostate cancer from aggressive one. Thus, the determination of the presence or absence of these microRNAs and / or changes in their level over time can be used to detect prostate cancer in a person or the development potential of its aggressive form, as well as for differential diagnosis of prostate cancer and prostatitis or BPH. Typically, fresh prostate tissue, serum, plasma, or urine is used as a sample, however, biological samples such as paraffin-embedded prostate tissue, whole blood, saliva, fluid around the prostate gland, prostate secretion, lymphatic fluid can be detected. , wound secret, feces, mucus, sweat, tears and cerebrospinal fluid. PCR-PB is the preferred method for detecting miRNAs, however, microarray based methods, other PCR variants, in situ hybridization, Northern blotting, sequencing and fluorescence based methods are acceptable in the invention.

Другая наиболее близкая тест-система описана в патенте AU 2014202735 (А1), который относится к области молекулярной биологии, конкретно к средствам и методам диагностики, прогнозирования и лечения РПЖ. Сущность способа заключается в определении ряда микроРНК в свежей ткани предстательной железы и сравнение с уровнем в контроле. Первичный поиск маркеров производился с помощью микрочиповых технологий для анализа как мРНК в целом, так и отдельно микроРНК. Подтвержденные микроРНК определялись методом ПЦР-РВ. Среди методов оценки уровня микроРНК в патентной заявке упоминаются также микрочиповые технологии, нозерн-блоттинг и гибридизация in situ. Постулируется, что для РПЖ характерно повышение хотя бы одной микроРНК из списка, включающего 21 микроРНК (miR-32, miR-182, miR-31, miR-26a-1/2, miR-200c, miR-375, miR-196a-112, miR-370, miR-425, miR-194-112, miR-181a-112, miR-34b, let-7i, miR-188, miR-25, miR-106b, miR-449, miR-99b, miR-93, miR-92-112, miR-125a), и/или понижение хотя бы одной из другого списка из 21 микроРНК (miR-520h, miR-494, miR-490, miR-133a-1, miR-1-2, miR-218-2, miR-220, miR-128a, miR-221, miR-499, miR-329, miR-340, miR-345, miR-410, miR-126, miR-205, miR-7-1/2, miR-145, miR-34a, miR-487, let-7b). При анализе в опухолевых и неопухолевых образцах набора из 23 микроРНК (37 зондов) в отношении диагностики РПЖ была обнаружена чувствительность 80% (верно определились 48 из 60 опухолевых образцов) и специфичность 100% (16 из 16 неопухолевых образцов). Недостатками метода является необходимость получения ткани предстательной железы, что связано с привлечением высококвалифицированных специалистов, дополнительными возможными осложнениями инвазивной процедуры и увеличением времени пробоподготовки.Another closest test system is described in patent AU 2014202735 (A1), which relates to the field of molecular biology, specifically to means and methods for diagnosing, predicting and treating prostate cancer. The essence of the method is to determine the number of miRNAs in fresh tissue of the prostate gland and comparison with the level in the control. The primary search for markers was carried out using microarray technologies for the analysis of both mRNA as a whole and microRNA separately. Confirmed miRNAs were determined by PCR-RV. Among the methods for assessing microRNA levels in the patent application are also mentioned microarray technologies, Northern blotting and in situ hybridization. It is postulated that prostate cancer is characterized by an increase in at least one microRNA from a list of 21 microRNAs (miR-32, miR-182, miR-31, miR-26a-1/2, miR-200c, miR-375, miR-196a- 112, miR-370, miR-425, miR-194-112, miR-181a-112, miR-34b, let-7i, miR-188, miR-25, miR-106b, miR-449, miR-99b, miR-93, miR-92-112, miR-125a), and / or reduction of at least one of the other list of 21 microRNAs (miR-520h, miR-494, miR-490, miR-133a-1, miR-1 -2, miR-218-2, miR-220, miR-128a, miR-221, miR-499, miR-329, miR-340, miR-345, miR-410, miR-126, miR-205, miR -7-1 / 2, miR-145, miR-34a, miR-487, let-7b). When analyzing a set of 23 microRNAs (37 probes) in tumor and non-tumor samples, a sensitivity of 80% (48 out of 60 tumor samples were correctly identified) and a specificity of 100% (16 out of 16 non-tumor samples) were detected with respect to the diagnosis of prostate cancer. The disadvantages of the method are the need to obtain tissue of the prostate gland, which is associated with the involvement of highly qualified specialists, additional possible complications of the invasive procedure and an increase in the time of sample preparation.

Прототипом изобретения авторами выбран патент RU 2521389 С2, адаптированный к измерению величины экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184 в плазме периферической крови человека методом микрочипового анализа.The prototype of the invention, the authors chose patent RU 2521389 C2, adapted to measure the expression of hsa-miR-619-5p and hsa-miR-1184 miRNAs in human peripheral blood plasma by microarray analysis.

Недостатками данного метода с нашей точки зрения являлись его относительная низкая специфичность и чувствительность.The disadvantages of this method from our point of view were its relatively low specificity and sensitivity.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики ДГПЖ и рака предстательной железы, обладающего высокой специфичностью, экономически выгодного и простого в применении.The objective of the invention is to develop a method for the differential diagnosis of BPH and prostate cancer, which has high specificity, cost-effective and easy to use.

Анализ патентной документации свидетельствует о том, что поиск эффективных решений, направленных на дифференциальную диагностику ДГПЖ и РПЖ, является крайне актуальной задачей.The analysis of patent documentation indicates that the search for effective solutions aimed at the differential diagnosis of BPH and prostate cancer is an extremely urgent task.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей предлагаемого технического решения является разработка новых диагностических маркеров ДГПЖ и РПЖ, позволяющих осуществлять дифференциальную диагностику ДГПЖ от РПЖ, а также разработка на их основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа дифференциальной диагностики ДГПЖ от РПЖ.The objective of the proposed technical solution is the development of new diagnostic markers of BPH and prostate cancer, allowing differential diagnosis of BPH from prostate cancer, as well as the development of a simple, sensitive, reliable, applicable in clinical or outpatient medical institutions method for the differential diagnosis of BPH from prostate cancer.

Заявляемое изобретение расширяет арсенал диагностических тестов посредством получения новых диагностических маркеров ДГПЖ и РПЖ, позволяющих при сопоставимой достоверности и специфичности осуществлять дифференциальную диагностику ДГПЖ от РПЖ.The claimed invention extends the arsenal of diagnostic tests by obtaining new diagnostic markers of BPH and prostate cancer, allowing for comparable reliability and specificity to carry out differential diagnosis of BPH from prostate cancer.

Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к способу дифференциальной диагностики ДГПЖ от РПЖ у человека, включающему:The present invention in its first aspect relates to a method for the differential diagnosis of BPH from prostate cancer in humans, including:

- получение образца периферической крови пациента;- obtaining a sample of peripheral blood of the patient;

- выделение плазмы крови из образца;- selection of blood plasma from the sample;

- выделение РНК из плазмы крови;- RNA isolation from blood plasma;

- проведение микрочипового анализа экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184 с получением для каждого из перечисленных маркеров их количественных оценок представленности Q(g) и дифференциальной диагностикой ДГПЖ от РПЖ путем сравнения оценок представленности Q(g) с предустановленными порогами:- microarray analysis of hsa-miR-619-5p and hsa-miR-1184 microRNA expression with obtaining for each of the listed markers their quantitative estimates of the presence of Q (g) and differential diagnosis of BPH from prostate cancer by comparing the estimates of the representation of Q (g) with the preset thresholds:

при получении значений Q(hsa-miR-619-5p) больше 1,25 и Q(hsa-miR-1184) более 3,5 делают вывод о раке предстательной железы, при Q(hsa-miR-619-5p) менее 1,25 и Q(hsa-miR-1184) менее 3,5 делают вывод и низком риске возникновения рецидива, при получении значений Q(hsa-miR-619-5p) более или равном 1,25 и Q(hsa-miR-1184) менее 3,5 или Q(hsa-miR-619-5p) менее 1,25 и Q(hsa-miR-1184) более или равном 3,5 считают риск неопределенным.when obtaining values of Q (hsa-miR-619-5p) greater than 1.25 and Q (hsa-miR-1184) greater than 3.5 make a conclusion about prostate cancer, with Q (hsa-miR-619-5p) less than 1 , 25 and Q (hsa-miR-1184) of less than 3.5 conclude that there is a low risk of relapse, when Q (hsa-miR-619-5p) is greater than or equal to 1.25 and Q (hsa-miR-1184 ) less than 3.5 or Q (hsa-miR-619-5p) less than 1.25 and Q (hsa-miR-1184) greater than or equal to 3.5 consider the risk uncertain.

Предпочтительно для выделения плазмы крови из образца использовать два этапа центрифугирования по 10 минут каждый при температуре 22±2°С: первый - при 2000g с последующим переносом верхней фазы в новую пробирку, второй - при 4000g.It is preferable to separate blood plasma from the sample using two centrifugation steps of 10 minutes each at a temperature of 22 ± 2 ° C: the first at 2000g followed by the transfer of the upper phase to a new tube, the second at 4000g.

Предпочтительно выделение РНК из плазмы крови осуществлять с помощью набора реагентов miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ).It is preferable to isolate RNA from blood plasma using the miRNeasy Serum / Plasma Kit reagent kit (Qiagen, Germany).

Предпочтительно для проведения микрочипового анализа использовать чипы GeneChip miRNA 4.0 Array (Affymetrix, США).It is preferable to use GeneChip miRNA 4.0 Array chips (Affymetrix, USA) for microarray analysis.

Предпочтительно осуществлять предобработку результата микрочипового анализа совместно со стандартным нормирующим набором GSE60715 [Sonia A. Melo et al., "Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis," Cancer Cell 26, no. 5 (October 10, 2014): 707-21, doi: 10.1016/j.ccell. 2014.09.005].It is preferable to pre-process the result of microarray analysis in conjunction with the standard standardization set GSE60715 [Sonia A. Melo et al., "Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis," Cancer Cell 26, no. 5 (October 10, 2014): 707-21, doi: 10.1016 / j.ccell. 2014.09.005].

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

В изобретении представлены новые молекулярно-генетические маркеры для дифференциальной диагностики доброкачественной гиперплазии предстательной железы от рака предстательной железы, основанной на определении количественных оценок представленности двух микроРНК: hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184. Это простой, надежный и малоинвазивный способ дифференциальной диагностики доброкачественной гиперплазии предстательной железы от рака предстательной железы.The invention provides new molecular genetic markers for the differential diagnosis of benign prostatic hyperplasia from prostate cancer, based on quantification of the representation of two miRNAs: hsa-miR-619-5p and hsa-miR-1184. This is a simple, reliable and minimally invasive method for the differential diagnosis of benign prostatic hyperplasia from prostate cancer.

В качестве образца для проведения анализа используется плазма периферической крови.Peripheral blood plasma is used as a sample for analysis.

Способы получения плазмы крови хорошо известны специалистам [М.Ю. Шкурников et al., "Профиль микроРНК плазмы крови здоровых доноров," Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 160, no. 11 (2015): 577-79] и, как правило, включают следующие стадии: забор периферической крови пациента в пробирки с антикоагулянтом (например, вакуумно-аспирационные пробирки S-Monovette EDTA-KE 8 мл (Sarstedt, ФРГ)); отделение плазмы крови от клеточных компонентов с помощью центрифуги (например, 5810 R (Eppendorf, ФРГ)) в два этапа по 10 минут каждый при комнатной температуре: первый - при 2000g, с последующим переносом верхней фазы в новую пробирку, второй этап проводился при 4000g.Methods of obtaining blood plasma are well known to specialists [M.Yu. Skurnikov et al., “MicroRNA Profile of Blood Plasma from Healthy Donors,” Bulletin of Experimental Biology and Medicine 160, no. 11 (2015): 577-79] and, as a rule, include the following stages: collecting the patient’s peripheral blood into tubes with an anticoagulant (for example, 8 ml S-Monovette EDTA-KE vacuum aspiration tubes (Sarstedt, Germany)); separation of blood plasma from cellular components using a centrifuge (for example, 5810 R (Eppendorf, Germany)) in two stages of 10 minutes each at room temperature: the first at 2000g, followed by transfer of the upper phase to a new tube, the second stage was carried out at 4000g .

Быстрое и качественное выделение РНК из плазмы крови проводят с использованием ряда коммерчески доступных наборов (miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, ФРГ); NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL, ФРГ); Direct-zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, США) и т.д.).Rapid and high-quality isolation of RNA from blood plasma is carried out using a number of commercially available kits (miRNeasy Serum / Plasma Kit (Qiagen, Germany); NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL, Germany); Direct-zol RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, USA ) etc.).

Проведение микрочипового анализа экспрессии микроРНК осуществляется по стандартным методикам для микрочипов GeneChip miRNA 4.0 (Affymetrix, США). Результат микрочипового исследования образца предобрабатывается совместно со стандартным нормирующим набором GSE60715 [Melo et al., "Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis"]. Использование стандартного нормирующего набора необходимо для приведения результатов разных микрочипов в единую шкалу. Предобработка и оценка экспрессии осуществляется с использованием метода RMA [Irizarry R.A. и др. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data // Biostatistics. 2003. T. 4 C. 249-264].Microarray analysis of microRNA expression is carried out according to standard methods for GeneChip miRNA 4.0 microarrays (Affymetrix, USA). The result of the microarray study of the sample is processed in conjunction with the standard standardization kit GSE60715 [Melo et al., "Cancer Exosomes Perform Cell-Independent MicroRNA Biogenesis and Promote Tumorigenesis"]. The use of a standard normative set is necessary to bring the results of different microchips into a single scale. Pretreatment and evaluation of expression is carried out using the RMA method [Irizarry R.A. et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data // Biostatistics. 2003. T. 4 C. 249-264].

После предобработки в качестве оценок количественной представленности транскриптов Q(hsa-miR-619-5p) и Q(hsa-miR-1184) берут полученные в результате предобработки значения, ассоциированные с соответствующими микроРНК-маркерам наборами проб микрочипа. Значения берутся в логарифмической шкале с основанием два.After preprocessing, the values obtained as a result of preprocessing associated with the corresponding microRNA markers of microarray samples are taken as estimates of the quantitative representation of transcripts Q (hsa-miR-619-5p) and Q (hsa-miR-1184). Values are taken in a logarithmic scale with a base of two.

Следует отметить, что отбор транскриптов, используемых непосредственно для формирования прогноза, осуществлялся на основе анализа собственных данных о профиле микроРНК плазмы крови 256 пациентов с РПЖ, 65 пациентов с ДГПЖ и 61 здорового пациента, полученных на базе МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. В основе отбора лежало построение бинарного (двухклассового) классификатора, различающего пациентов, у которых был диагностирован рак предстательной железы, и пациентов, у которых была диагностирована гиперплазия предстательной железы.It should be noted that the selection of transcripts used directly for the formation of the prognosis was carried out on the basis of the analysis of our own data on the microRNA profile of blood plasma of 256 patients with prostate cancer, 65 patients with BPH and 61 healthy patients, obtained on the basis of the Moscow Scientific Research Institute for Advanced Medicine. P.A. Herzen - a branch of the FSBI "NIIRTS" Ministry of Health of Russia. The selection was based on the construction of a binary (two-class) classifier that distinguishes between patients who have been diagnosed with prostate cancer and patients who have been diagnosed with prostatic hyperplasia.

При фиксированном наборе транскриптов для построения классификатора, использующего в точности этот набор транскриптов, применялся однофакторный непарный дисперсионный анализ с поправкой Бенджамини-Хохберга на множественность сравнений.For a fixed set of transcripts, a one-way unpaired variance analysis adjusted by Benjamini-Hochberg for multiplicity of comparisons was used to construct a classifier that uses exactly this set of transcripts.

Валидация итогового набора микроРНК-маркеров осуществлялась на валидационной выборке, образцы которой не использовались ни при отборе транскриптов.Validation of the final set of microRNA markers was carried out on a validation sample, the samples of which were not used in the selection of transcripts.

Примеры конкретного выполненияCase Studies

Изобретение поясняется следующими примерами осуществления.The invention is illustrated by the following examples of implementation.

Пример 1. Получение плазмы кровиExample 1. Obtaining blood plasma

Забор крови производился с использованием вакуумно-аспирационных пробирок S-Monovette EDTA-KE 8 мл (Sarstedt, ФРГ). Выделение плазмы производилось с помощью центрифуги 5810 R (Eppendorf, ФРГ). Центрифугирование проводилось при комнатной температуре в два этапа: на первом этапе центрифугирование производилось при ускорении 2000g в течение 10 минут со средней скоростью разгона и торможения. Затем верхняя фаза жидкости переносилась в новую пробирку и производился второй этап центрифугирования при ускорении 4000g. После второго этапа аккуратно отбиралась вся полученная плазма кроме 10% объема у дна пробирки.Blood sampling was carried out using vacuum aspiration tubes S-Monovette EDTA-KE 8 ml (Sarstedt, Germany). Plasma was isolated using a 5810 R centrifuge (Eppendorf, Germany). Centrifugation was carried out at room temperature in two stages: in the first stage, centrifugation was carried out at an acceleration of 2000 g for 10 minutes with an average speed of acceleration and deceleration. Then the upper phase of the liquid was transferred to a new tube and a second centrifugation step was carried out at an acceleration of 4000g. After the second stage, all plasma obtained was carefully selected except 10% of the volume at the bottom of the tube.

Пример 2. Выделение РНКExample 2. The selection of RNA

1. Смешать в отдельной пробирке 1,2 мл TRIzol LS Reagent (Life Techologies, США) и 3 мкл miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control (108 копий/мкл).1. Mix in a separate tube 1.2 ml of TRIzol LS Reagent (Life Techologies, USA) and 3 μl of miRNeasy Serum / Plasma Spike-in Control (10 8 copies / μl).

2. Перенести 400 мкл образца плазмы крови в чистую пробирку 2 мл.2. Transfer 400 μl of a blood plasma sample to a clean 2 ml tube.

3. Добавить в пробирку с плазмой 1,2 мл TRIzol LS Reagent с miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control.3. Add 1.2 ml TRIzol LS Reagent with miRNeasy Serum / Plasma Spike-in Control to the plasma tube.

4. Тщательно перемешать на вортексе.4. Vortex thoroughly.

5. Поставить пробирку в штатив и инкубировать 10 минут при комнатной температуре.5. Place the tube in a tripod and incubate for 10 minutes at room temperature.

6. Добавить в пробирку 1 мкл GlycoBlue Coprecipitant (15 мг/мл), перемешать на вортексе.6. Add 1 μl GlycoBlue Coprecipitant (15 mg / ml) to the tube, mix on a vortex.

7. Добавить 320 мкл хлороформа и тщательно перемешать на вортексе 15 сек.7. Add 320 μl of chloroform and mix thoroughly on a vortex for 15 sec.

8. Поставить пробирку в штатив и инкубировать при комнатной температуре 2-3 мин.8. Place the tube in a tripod and incubate at room temperature for 2-3 minutes.

9. Поставить пробирку в центрифугу, предварительно охлажденную до 4°С, и центрифугировать в течение 15 мин при ускорении 12000g при 4°С.9. Place the tube in a centrifuge pre-cooled to 4 ° C and centrifuge for 15 min at an acceleration of 12000g at 4 ° C.

10. Перенести водную фазу в чистую пробирку на 2 мл, измерить объем водной фазы и добавить 1,5 объема 100% этанола. Хорошо перемешать с помощью пипетки. Не центрифугировать.10. Transfer the aqueous phase to a clean 2 ml tube, measure the volume of the aqueous phase and add 1.5 volumes of 100% ethanol. Mix well with a pipette. Do not centrifuge.

11. Перенести 700 мкл образца, включая осадок, если он выпал, на колонку RNeasy Mini Spin. Центрифугировать 15 сек при 12000g.11. Transfer 700 μl of the sample, including the precipitate, if precipitated, to the RNeasy Mini Spin column. Centrifuge for 15 sec at 12000g.

12. Удалить раствор, прошедший через колонку, перенести на нее оставшуюся часть образца и повторить центрифугирование. Снова удалить раствор, прошедший через колонку.12. Remove the solution that has passed through the column, transfer the remainder of the sample to it, and repeat centrifugation. Remove the solution that has passed through the column again.

13. Нанести на колонку RNeasy Mini Spin 700 мкл RWT-буфера, центрифугировать 15 сек при 12000g. Удалить раствор, прошедший через колонку.13. Add 700 μl of RWT buffer to the RNeasy Mini Spin column, centrifuge for 15 sec at 12000g. Remove the solution that has passed through the column.

14. Нанести на колонку RNeasy Mini Spin 500 мкл буфера RPE, центрифугировать 15 сек при 12000g. Удалить раствор, прошедший через колонку.14. Pipet 500 µl of RPE buffer onto the RNeasy Mini Spin column, centrifuge for 15 sec at 12000g. Remove the solution that has passed through the column.

15. Добавить на колонку RNeasy Mini Spin 500 мкл буфера RPE, центрифугировать 2 мин при 12000g, чтобы высушить мембрану колонки.15. Add 500 μl RPE buffer to the RNeasy Mini Spin column, centrifuge for 2 min at 12000g to dry the membrane of the column.

16. Перенести колонку RNeasy Mini Spin в чистую пробирку на 2 мл и центрифугировать 5 мин при открытой крышке, чтобы полностью удалить остатки жидкости.16. Transfer the RNeasy Mini Spin column to a clean 2 ml tube and centrifuge for 5 min with the lid open to completely remove any remaining fluid.

17. Перенести колонку RNeasy Mini Spin в чистую пробирку на 1,5 мл для элюции образца. Аккуратно нанести 30 мкл воды, свободной от РНКаз, непосредственно на мембрану колонки. Центрифугировать 1 мин при максимальном ускорении. 17. Transfer the RNeasy Mini Spin column to a clean 1.5 ml tube to elute the sample. Gently apply 30 μl of RNase-free water directly to the column membrane. Centrifuge for 1 min at maximum acceleration.

18. Вынуть из пробирки колонку, перемешать элюированный раствор, осадить и определить объем раствора тотальной РНК с помощью пипетки. Хранить на льду до продолжения эксперимента или заморозить при минус 20°С для непродолжительного хранения либо при минус 80°С для длительного хранения.18. Remove the column from the tube, mix the eluted solution, precipitate and determine the volume of the total RNA solution using a pipette. Store on ice until the experiment continues or freeze at minus 20 ° C for short-term storage or at minus 80 ° C for long-term storage.

Пример 3. Проведение микрочипового анализа экспрессииExample 3. Carrying out a microarray analysis of expression

Для анализа брали 150 нг тотальной РНК. На первой стадии проводили реакцию неспецифического синтеза поли-А олигонуклеотидов на 3'-конце молекул РНК с помощью поли-А-полимеразы. Для этого к 1000 нг РНК в 8 мкл воды (категории Nuclease-free) добавляли 2 мкл RNA Spike Control Oligos и 5 мкл Poly A Tailing Master Mix (Таблица 1), аккуратно перемешивали, инкубировали 15 минут при 37°С.150 ng of total RNA were taken for analysis. At the first stage, a nonspecific synthesis of poly-A oligonucleotides was carried out at the 3'-end of RNA molecules using poly-A polymerase. For this, 2 μl of RNA Spike Control Oligos and 5 μl of Poly A Tailing Master Mix (Table 1) were added to 1000 ng of RNA in 8 μl of water (Nuclease-free category), gently mixed, incubated for 15 minutes at 37 ° C.

Figure 00000001
Figure 00000001

Далее проводили стадию лигирования для мечения каждой молекулы РНК специальной Biotin-labeled3DNA меткой, содержащей биотином. Для этого после наращивания поли-А-концов к реакционной смеси добавляли 4 мкл 5х FlashTag Biotin HSR Ligation Mix, 2 мкл T4 DNA Ligase, аккуратно перемешивали и инкубировали 30 мин при 25°С, после чего останавливали реакцию, добавлением 2,5 мкл HSR Stop Solution. Затем из 23,5 мкл реакционной смеси отбирали по 2 мкл для анализа ELOSA QC Assay, оставшиеся 21,5 мкл использовали для гибридизации на микрочипе.Next, a ligation step was performed to label each RNA molecule with a special Biotin-labeled3DNA tag containing biotin. For this, after the poly-A ends were built up, 4 μl of 5x FlashTag Biotin HSR Ligation Mix, 2 μl of T4 DNA Ligase were added to the reaction mixture, gently mixed and incubated for 30 min at 25 ° С, after which the reaction was stopped by adding 2.5 μl of HSR Stop Solution. Then, 2 μl were taken from 23.5 μl of the reaction mixture for ELOSA QC Assay analysis, the remaining 21.5 μl was used for microarray hybridization.

Анализ ELOSA QC Assay (Enzyme Linked Oligosorbent Assay) проводится для оценки качества проведенных реакций, поэтому этот анализ проводится до стадии гибридизации. ELOSA QC Assay проводили с тремя контролями: положительный контроль, содержащий ELOSA Positive Control (олигонуклеотиды, меченые биотином и проверенные на качество производителем), отрицательный контроль, содержащий все реагенты для мечения РНК, кроме RNA Spike Control Oligos, отрицательный контроль, содержащий все реагенты для мечения РНК, кроме RNA Spike Control Oligos и тотальной РНК. Для проведения анализа сначала разводили ELOSA Spotting Oligos в растворе 1x PBS: например, для трех образцов 4,5 мкл ELOSA Spotting Oligos растворяли в 220,5 мкл 1x PBS. Разведенные ELOSA Spotting Oligos добавляли по 75 мкл в каждую лунку на плашке для ELOSA. После этого плашку с ELOSA Spotting Oligos оставляли на ночь в холодильнике при 2-8°С. Затем плашку промывали дважды раствором 0,02% Tween-20 в 1x PBS, добавляли 150 мкл 5% BSA в 1x PBS в каждую лунку, после этого инкубировали плашку 1 час при комнатной температуре. Раствор удаляли из плашки.The ELOSA QC Assay (Enzyme Linked Oligosorbent Assay) analysis is performed to evaluate the quality of the reactions performed, therefore this analysis is carried out before the hybridization stage. ELOSA QC Assay was carried out with three controls: a positive control containing ELOSA Positive Control (oligonucleotides labeled with biotin and tested for quality by the manufacturer), a negative control containing all reagents for RNA labeling, except RNA Spike Control Oligos, a negative control containing all reagents for RNA labeling, except RNA Spike Control Oligos and total RNA. For analysis, ELOSA Spotting Oligos was first diluted in 1x PBS solution: for example, for three samples, 4.5 μl of ELOSA Spotting Oligos was dissolved in 220.5 μl of 1x PBS. Diluted ELOSA Spotting Oligos was added 75 μl to each well on the ELOSA plate. After that, the ELOSA Spotting Oligos plate was left overnight in the refrigerator at 2-8 ° C. The plate was then washed twice with a solution of 0.02% Tween-20 in 1x PBS, 150 μl of 5% BSA in 1x PBS was added to each well, after which the plate was incubated for 1 hour at room temperature. The solution was removed from the plate.

На следующем этапе готовили Hybridization Master Mix (Таблица 2) и заполняли 50,5 мкл этого раствора каждую лунку. Далее добавляли либо 2 мкл воды (для отрицательного контроля), либо 2 мкл ELOSA Positive Control (для положительного контроля), либо 2 мкл меченого образца. Плашку хорошо заклеивали и инкубировали 1 час при комнатной температуре.In the next step, a Hybridization Master Mix was prepared (Table 2) and 50.5 μl of this solution was filled in each well. Next, either 2 μl of water (for a negative control), or 2 μl of ELOSA Positive Control (for a positive control), or 2 μl of a labeled sample was added. The plate was well sealed and incubated for 1 hour at room temperature.

Figure 00000002
Figure 00000002

Далее проводили связывание с SA-HRP. Лунки промывали 3 раза 0,02%-ным раствором Tween в 1x PBS, потом в каждую добавляли 75 мкл SA-HRP, разведенного в соотношении 1:4000 раствором 5%-ного BSA в 1x PBS. Плашку заклеивали и инкубировали 1 час при комнатной температуре. После этого лунки промывали 3 раза раствором 0,02% Tween в 1x PBS, добавляли 100 мкл ТМВ Substrate в каждую лунку, заклеивали плашку, заворачивали в фольгу и оставляли так в темноте на 7 минут. Синий цвет раствора в лунке означает положительный результат: лунки с положительным контролем оказывались синими, а лунки с неокрашенным раствором - содержали отрицательные контроли. Если раствор в лунках с образцами оказывался синим, то считали, что стадия мечения прошла успешно, и образцы использовали дальше для гибридизации на микрочип.Next, binding to SA-HRP was performed. Wells were washed 3 times with a 0.02% Tween solution in 1x PBS, then 75 μl of SA-HRP diluted 1: 4000 with a solution of 5% BSA in 1x PBS was added to each. The plate was sealed and incubated for 1 hour at room temperature. After this, the wells were washed 3 times with a solution of 0.02% Tween in 1x PBS, 100 μl of TMB Substrate was added to each well, the plate was sealed, wrapped in foil and left in the dark for 7 minutes. The blue color of the solution in the well indicates a positive result: the wells with the positive control turned blue, and the wells with the unpainted solution contained negative controls. If the solution in the wells with the samples turned out to be blue, then it was believed that the labeling stage was successful, and the samples were used further for hybridization to the microchip.

Для гибридизации готовили Hybridization Master Mix (Таблица 3), при этом 20х Eukaryotic Hybridization Controls перед добавлением в реакционную смесь инкубировали 5 мин при 65°С. Готовый раствор Hybridization Master Mix добавляли по 110,5 мкл к 21,5 мкл меченого образца для составления Hybridization Cocktail. Полученный раствор инкубировали 5 мин при 99°С, а затем 5 мин при 45°С. Затем 130 мкл Hybridization Cocktail переносили в микрочип GeneChip miRNA 4.0. Чипы помещали в разогретую до 48°С гибридизационную печь Affymetrix® Hybridization Oven 645 и оставляли в ней на 16 часов при скорости вращения 60 rpm.A Hybridization Master Mix was prepared for hybridization (Table 3), with 20x Eukaryotic Hybridization Controls being incubated for 5 min at 65 ° C before being added to the reaction mixture. The finished Hybridization Master Mix solution was added 110.5 μl to 21.5 μl of the labeled sample to form the Hybridization Cocktail. The resulting solution was incubated for 5 min at 99 ° C, and then 5 min at 45 ° C. Then 130 μl of the Hybridization Cocktail was transferred to the GeneChip miRNA 4.0 microchip. The chips were placed in an Affymetrix® Hybridization Oven 645 hybridization oven heated to 48 ° C and left there for 16 hours at a rotation speed of 60 rpm.

Figure 00000003
Figure 00000003

По истечении 16 часов чипы вынимали из гибридизационной печи, удаляли из них гибридизационную смесь (при необходимости смесь можно сохранить и нанести на новый чип), заполняли чип буфером Array Holding Buffer и далее, следуя протоколу «GeneChip Expression Wash, Stain and Scan User Manual», промывали и прокрашивали с помощью GeneChipFluidics Station 450.After 16 hours, the chips were removed from the hybridization furnace, the hybridization mixture was removed from them (if necessary, the mixture can be saved and applied to a new chip), the chip was filled with Array Holding Buffer, and then, following the GeneChip Expression Wash, Stain and Scan User Manual protocol , washed and stained with GeneChip Fluidics Station 450.

После промывки и прокрашивания чипы сканировали с помощью сканнера GeneChipScanner 3000 7G. В результате сканирование получали файл с расширением «.CEL», в котором хранится информация об интенсивности свечения каждой точки на микрочипе.After washing and staining, the chips were scanned using a GeneChipScanner 3000 7G scanner. As a result, the scan received a file with the extension .CEL, which stores information about the intensity of the glow of each point on the microchip.

Пример 4. Предобработка данных микрочипового анализа и получение количественных оценок представленности hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184Example 4. Pre-processing of microarray analysis data and obtaining quantitative estimates of the representation of hsa-miR-619-5p and hsa-miR-1184

Полученные данные микрочипового исследования (файл с расширением «.CEL») были совместно предобработаны со стандартным нормирующим набором GSE60715. Предобработка и оценка экспрессии проводились с использованием реализации метода RMA [Rafael A Irizarry et al., "Exploration, Normalization, and Summaries of High Density Oligonucleotide Array Probe Level Data.," Biostatistics (Oxford, England) 4, no. 2 (April 2003): 249-64, doi: 10.1093/biostatistics/4.2.249] в программном обеспечении Affymetrix Expression Console. Предобработка включала в себя коррекцию фона с использованием глобальной модели распределения интенсивностей проб [R.A. Irizarry, "From CEL Files to Annotated Lists of Interesting Genes - Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor.: Springer. P. 431-442", ed. W. Huber R. Gentlemen, V. Carey, S. Dudoit, R. Irizarry (New York: Springer, 2005), 431-42] и квантильную нормализацию уровней проб [В М Bolstad et al., "A Comparison of Normalization Methods for High Density Oligonucleotide Array Data Based on Variance and Bias.", Bioinformatics (Oxford, England) 19, no. 2 (January 2003): 185-93]. Оценка экспрессии наборов проб по интенсивностям отдельных проб осуществлялась с использованием устойчивого построения линейной модели методом медианной подгонки [John W. Tukey, Exploratory Data Analysis, Biometrics, vol. 33 (Addison-Wesley, 1977), doi: 10.2307/2529486].The obtained microarray research data (file with the extension “.CEL”) were jointly pre-processed with the standard standard set GSE60715. Pretreatment and expression evaluation were performed using the RMA method [Rafael A Irizarry et al., "Exploration, Normalization, and Summaries of High Density Oligonucleotide Array Probe Level Data.," Biostatistics (Oxford, England) 4, no. 2 (April 2003): 249-64, doi: 10.1093 / biostatistics / 4.2.249] in the Affymetrix Expression Console software. The preprocessing included background correction using a global sample intensity distribution model [R.A. Irizarry, "From CEL Files to Annotated Lists of Interesting Genes - Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor .: Springer. P. 431-442", ed. W. Huber R. Gentlemen, V. Carey, S. Dudoit, R. Irizarry (New York: Springer, 2005), 431-42] and quantile normalization of sample levels [B. M Bolstad et al., "A Comparison of Normalization Methods for High Density Oligonucleotide Array Data Based on Variance and Bias. ", Bioinformatics (Oxford, England) 19, no. 2 (January 2003): 185-93]. The evaluation of the expression of sample sets by the intensities of individual samples was carried out using a stable construction of a linear model by the median fitting method [John W. Tukey, Exploratory Data Analysis, Biometrics, vol. 33 (Addison-Wesley, 1977), doi: 10.2307 / 2529486].

В качестве количественной оценки представленности Q(hsa-miR-619-5p) использовали оценку экспрессии кластера транскрипта №20504364 (Transcript Cluster ID), а для Q(hsa-miR-1184) - кластера транскрипта №20506716.As a quantitative assessment of the presence of Q (hsa-miR-619-5p), we used transcript cluster expression no. 20504364 (Transcript Cluster ID), and for Q (hsa-miR-1184), transcript cluster no. 20506716.

Пример 5.Example 5

Пациент М-ов, 66 лет.Patient Ms, 66 years old.

В феврале 2013 г. проходил обследование в поликлинике МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России с предварительным диагнозом гиперплазия предстательной железы. Жалобы на учащенное мочеиспускание.In February 2013, he was examined at the clinic of the Moscow P.A. Herzen is a branch of the FSBI NIIRTS of the Ministry of Health of Russia with a preliminary diagnosis of prostatic hyperplasia. Complaints of frequent urination.

Общий анализ мочи - норма. Лабораторная диагностика: ПСА=1,8 нг/мл. Urinalysis is the norm. Laboratory diagnosis: PSA = 1.8 ng / ml.

Результатыresults

Пациенту было проведено исследование согласно заявляемому способу.The patient was tested according to the claimed method.

Q(hsa-miR-619-5p)=2,13.Q (hsa-miR-619-5p) = 2.13.

Q(hsa-miR-1184)=5,90.Q (hsa-miR-1184) = 5.90.

Так как Q(hsa-miR-619-5p)>1,25 и Q(hsa-miR-1184)>3,5 было сделано заключение о наличии РПЖ.Since Q (hsa-miR-619-5p)> 1.25 and Q (hsa-miR-1184)> 3.5, a conclusion was made about the presence of PCa.

В результате биопсии предстательной железы был поставлен диагноз - рак предстательной железы (T2cN0M0).A prostate biopsy was diagnosed with prostate cancer (T2cN0M0).

Пример 6.Example 6

Пациент К-ов, 75 лет.Patient Ks, 75 years old.

В марте 2013 г. проходил обследование в поликлинике МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России с предварительным диагнозом гиперплазия предстательной железы. Жалобы на учащенное мочеиспускание.In March 2013, he was examined at the clinic of the Moscow P.A. Herzen is a branch of the FSBI NIIRTS of the Ministry of Health of Russia with a preliminary diagnosis of prostatic hyperplasia. Complaints of frequent urination.

Общий анализ мочи - норма. Лабораторная диагностика: ПСА=17,1 нг/мл. Urinalysis is the norm. Laboratory diagnosis: PSA = 17.1 ng / ml.

Результатыresults

Пациенту было проведено исследование согласно заявляемому способу.The patient was tested according to the claimed method.

Q(hsa-miR-619-5p)=1,18.Q (hsa-miR-619-5p) = 1.18.

Q(hsa-miR-1184)=2,47.Q (hsa-miR-1184) = 2.47.

Так как Q(hsa-miR-619-5p)≤1,25 и Q(hsa-miR-1184)≤3,5 было сделано заключение о наличии ДГПЖ.Since Q (hsa-miR-619-5p) ≤1.25 and Q (hsa-miR-1184) ≤3.5, it was concluded that BPH was present.

В результате биопсии предстательной железы был поставлен диагноз - доброкачественная гиперплазия предстательной железы.A prostate biopsy was diagnosed with benign prostatic hyperplasia.

Claims (1)

Способ дифференциальной диагностики рака предстательной железы путем исследования биологической жидкости больного, отличающийся тем, что в плазме периферической крови пациента методом микрочипового анализа измеряют экспрессию микроРНК hsa-miR-619-5p и hsa-miR-1184 и при величинах экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p в log2-шкале более 1,25 и микроРНК hsa-miR-1184 более 3,5 диагностируют рак предстательной железы, если величина экспрессии микроРНК hsa-miR-619-5p в log2-шкале менее 1,25 и микроРНК hsa-miR-1184 менее 3,5, диагностируют доброкачественную гиперплазию предстательной железы.A method for the differential diagnosis of prostate cancer by examining a patient’s biological fluid, characterized in that the microsaid expression of hsa-miR-619-5p and hsa-miR-1184 and for hsa-miR-619 miRNA expression are measured in the plasma of a patient’s peripheral blood by microarray analysis -5p in a log2 scale of more than 1.25 and hsa-miR-1184 miRNAs of more than 3.5 diagnose prostate cancer if the expression value of hsa-miR-619-5p miRNAs in a log2 scale of less than 1.25 and hsa-miR miRNAs -1184 less than 3.5, diagnosed with benign prostatic hyperplasia PS.
RU2016100243A 2016-01-12 2016-01-12 Method for prostate cancer differential diagnosis based on plasma micrornas analysis RU2618409C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016100243A RU2618409C1 (en) 2016-01-12 2016-01-12 Method for prostate cancer differential diagnosis based on plasma micrornas analysis

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016100243A RU2618409C1 (en) 2016-01-12 2016-01-12 Method for prostate cancer differential diagnosis based on plasma micrornas analysis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2618409C1 true RU2618409C1 (en) 2017-05-03

Family

ID=58697694

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016100243A RU2618409C1 (en) 2016-01-12 2016-01-12 Method for prostate cancer differential diagnosis based on plasma micrornas analysis

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2618409C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130053264A1 (en) * 2009-12-30 2013-02-28 Febit Holding Gmbh Mirna fingerprint in the diagnosis of prostate cancer
RU2521389C2 (en) * 2012-09-25 2014-06-27 Михаил Иосифович Коган Differential diagnostic technique for prostate cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130053264A1 (en) * 2009-12-30 2013-02-28 Febit Holding Gmbh Mirna fingerprint in the diagnosis of prostate cancer
RU2521389C2 (en) * 2012-09-25 2014-06-27 Михаил Иосифович Коган Differential diagnostic technique for prostate cancer

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
КУНИН И.С. и др. Молекулярные маркеры метастазирования аденокарциномы предстательной железы. Онкоурология. 2012; 4: 48-52. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220356528A1 (en) Microrna assay for detection and management of pancreatic cancer precursors
Dong et al. Circulating long RNAs in serum extracellular vesicles: their characterization and potential application as biomarkers for diagnosis of colorectal cancer
Zhu et al. A panel of microRNA signature in serum for colorectal cancer diagnosis
Wittmann et al. Serum microRNAs as powerful cancer biomarkers
JP6720260B2 (en) Methods and kits for diagnosing a subject at risk of developing cancer
US10822661B2 (en) Method of multivariate molecule analysis
EP3506912B1 (en) Micrornas as biomarkers for endometriosis
Kashyap et al. Cell-free miRNAs as non-invasive biomarkers in breast cancer: Significance in early diagnosis and metastasis prediction
Salido‑Guadarrama et al. Urinary microRNA-based signature improves accuracy of detection of clinically relevant prostate cancer within the prostate-specific antigen grey zone
US20170002428A1 (en) Detection and quantification of microRNAs in the circulation and the use of circulating microRNAs as biomarkers in cancer
Liu et al. Blood-based liquid biopsy: Insights into early detection and clinical management of lung cancer
US20110251098A1 (en) Biomarkers in Peripheral Blood Mononuclear Cells for Diagnosing or Detecting Lung Cancers
Cheung et al. The potential of circulating cell free RNA as a biomarker in cancer
Zhang et al. Altered serum MicroRNA profile may serve as an auxiliary tool for discriminating aggressive thyroid carcinoma from nonaggressive thyroid cancer and benign thyroid nodules
EP3122905B1 (en) Circulating micrornas as biomarkers for endometriosis
WO2017223216A1 (en) Compositions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles
US20130323740A1 (en) Direct blood assay for detection of circulating microrna in cancer patients
Gablo et al. Cell-free microRNAs as non-invasive diagnostic and prognostic biomarkers in pancreatic cancer
CN109929932A (en) Application in blood in two kinds of long-chain non-coding RNA Combining diagnosis esophageal squamous cell carcinomas
Constâncio et al. MiRNA biomarkers in cancers of the male reproductive system: are we approaching clinical application?
Rao et al. Identification of plasma exosomes long non-coding RNA HAGLR and circulating tumor cells as potential prognosis biomarkers in non-small cell lung cancer
Bandini Urinary microRNA and mRNA in Tumors
RU2618409C1 (en) Method for prostate cancer differential diagnosis based on plasma micrornas analysis
Jen-Tai et al. Circulating miRNAs Act as Diagnostic Biomarkers for Bladder Cancer in Urine
Salfer et al. Novel Urinary Liquid Biopsy Biomarkers and Their Role in Detecting Genitourinary Cancers