RU2616866C1 - Bioresorbable micro-carrier for cell delivery to region of wound healing and regeneration - Google Patents
Bioresorbable micro-carrier for cell delivery to region of wound healing and regeneration Download PDFInfo
- Publication number
- RU2616866C1 RU2616866C1 RU2015157141A RU2015157141A RU2616866C1 RU 2616866 C1 RU2616866 C1 RU 2616866C1 RU 2015157141 A RU2015157141 A RU 2015157141A RU 2015157141 A RU2015157141 A RU 2015157141A RU 2616866 C1 RU2616866 C1 RU 2616866C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- fibroin
- regeneration
- carrier
- microcarriers
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
- C12M3/006—Cell injection or fusion devices
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Более подробно изобретение относится к области создания биорезорбируемых микроносителей для доставки клеток в область заживления и регенерации ран.The invention relates to biotechnology and medicine. In more detail, the invention relates to the field of creating bioresorbable microcarriers for delivering cells to the area of wound healing and regeneration.
Уровень техникиState of the art
Кожный покров играет важную роль в жизнедеятельности организма, обеспечивая целый ряд важных функций, таких как механическая, термическая и химическая защита тканей тела, барьер для микроорганизмов, поддержание гомеостаза, обеспечение механической рецепции. Наличие долго незаживающих ран может стать причиной развития инфекций, привести к инвалидности или смерти пациента.The skin plays an important role in the life of the body, providing a number of important functions, such as mechanical, thermal and chemical protection of body tissues, a barrier to microorganisms, maintaining homeostasis, and providing mechanical reception. The presence of long non-healing wounds can cause infections, lead to disability or death of the patient.
Кроме того, на месте обширных повреждений вследствие процессов заживления может образоваться рубцовая ткань, которая отличается по механическим и физиологическим свойствам от нормальной кожи. Это может приводить как к проявлениям дискомфорта и неудобств косметического характера, так и к ограничениям функциональности отдельных частей тела. Заживление раны - сложный процесс, включающий в себя взаимодействие между клетками эпидермиса и дермы, компонентами внеклеточного матрикса и миграцию клеток с соседних неповрежденных участков. При нарушении целостности капилляров в слое дермы происходит образование тромба, что, в свою очередь, приводит к высвобождению противовоспалительных факторов, таких как трансформирующие факторы роста α и β (TGF-α, TGF-β) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF). В области раны начинает расти число нейтрофилов и макрофагов, начинается процесс воспаления. Выделение макрофагами цитокина TGF-β1 вызывает дифференцировку дермальных фибробластов в миофибробласты, которые синтезируют внеклеточный матрикс, преимущественно состоящий из фибронектина и гиалуроновой кислоты, стимулирующей миграцию фибробластов. Миграция кератиноцитов приводит к восстановлению барьерной функции. После этого происходит апоптоз миофибробластов с последующим их замещением фибробластами из прилегающих участков кожи, создающих коллагеновый внеклеточный матрикс.In addition, scar tissue may form at the site of extensive damage due to healing processes, which differs in mechanical and physiological properties from normal skin. This can lead to manifestations of discomfort and inconvenience of a cosmetic nature, as well as to limitations in the functionality of individual parts of the body. Wound healing is a complex process that involves the interaction between the cells of the epidermis and dermis, the components of the extracellular matrix, and the migration of cells from neighboring intact areas. If capillary integrity is impaired, a thrombus forms in the dermis layer, which in turn leads to the release of anti-inflammatory factors, such as transforming growth factors α and β (TGF-α, TGF-β) and platelet growth factor (PDGF). In the wound area, the number of neutrophils and macrophages begins to grow, and the process of inflammation begins. Macrophage isolation of the cytokine TGF-β1 causes the differentiation of dermal fibroblasts into myofibroblasts, which synthesize the extracellular matrix, mainly consisting of fibronectin and hyaluronic acid, which stimulates the migration of fibroblasts. The migration of keratinocytes leads to the restoration of barrier function. After this, apoptosis of myofibroblasts occurs, followed by their replacement with fibroblasts from adjacent skin areas that create a collagen extracellular matrix.
Таким образом, в процессы заживления и регенерации вовлечено множество клеток разных типов и биологически активных веществ. Использование их в различных сочетаниях с биомедицинскими изделиями может качественно изменить подходы к восстановлению не только кожных покровов после различных повреждений.Thus, many cells of various types and biologically active substances are involved in the healing and regeneration processes. Their use in various combinations with biomedical products can qualitatively change approaches to the restoration of not only the skin after various injuries.
При образовании глубоких ран кожи или обширных повреждений важной проблемой является заполнение промежутка между здоровыми тканями при невозможности сведения краев раны. Глубокие ожоги могут вызвать полное разрушение эпидермиса и дермы. Вследствие этого могут быть уничтожены эпителиальные стволовые клетки, которые находятся в базальном слое и глубоко внутри волосяного фолликула [Fuchs, Е. Skin stem cells: rising to the surface. J Cell Biol 180, 273, 2008; Fuchs, E. Finding one's niche in the skin. Cell Stem Cell 4, 499, 2009]. При этом кожа теряет возможность нормальной регенерации и заживление возможно только миграцией эпителиальных клеток с краев раны с постепенным ее сжатием. Хотя сведение раны является частью нормального процесса заживления, в случае обширных повреждений это может привести к серьезным деформациям, шрамам и контрактурам, которые часто бывают болезненными. Лечение таких состояний является весьма дорогостоящим с точки зрения здравоохранения. Сокращение поверхности раны происходит за счет работы миофибробластов, в которые дифференцируются фибробласты в ответ на механические стимулы и высвобождения трасформирующего ростового фактора TGF-beta1 [Hinz, В., Phan, S.H., Thannickal, V.J., Galli, A., Bochaton-Piallat, M.L., and Gabbiani, G. The myofibroblast: one function, multiple origins. Am J Pathol 170, 1807, 2007; Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. J Invest Dermatol 127, 526, 2007]. Существует тонкий баланс между слишком сильным и слишком слабым сокращением раны. Слишком активная работа миофибробластов также может приводить к чрезмерному стягиванию и формированию кожных деформаций.In the formation of deep skin wounds or extensive lesions, an important problem is filling the gap between healthy tissues when it is impossible to reduce the edges of the wound. Deep burns can cause complete destruction of the epidermis and dermis. As a result, epithelial stem cells that are located in the basal layer and deep inside the hair follicle can be destroyed [Fuchs, E. Skin stem cells: rising to the surface. J Cell Biol 180, 273, 2008; Fuchs, E. Finding one's niche in the skin. Cell Stem Cell 4, 499, 2009]. In this case, the skin loses the possibility of normal regeneration and healing is possible only by migration of epithelial cells from the edges of the wound with its gradual compression. Although wound repair is part of the normal healing process, in the case of extensive damage, this can lead to severe deformations, scars and contractures, which are often painful. The treatment of such conditions is very expensive from a health point of view. The contraction of the wound surface occurs due to the work of myofibroblasts, into which fibroblasts differentiate in response to mechanical stimuli and the release of the transforming growth factor TGF-beta1 [Hinz, B., Phan, SH, Thannickal, VJ, Galli, A., Bochaton-Piallat, ML , and Gabbiani, G. The myofibroblast: one function, multiple origins. Am J Pathol 170, 1807, 2007; Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. J Invest Dermatol 127, 526, 2007]. There is a delicate balance between too much and too little wound reduction. Too active work of myofibroblasts can also lead to excessive constriction and the formation of skin deformities.
Известно, что трансплантация кожи активно используется для закрытия и уменьшения времени эпителизации ран.It is known that skin transplantation is actively used to close and reduce the time of wound epithelization.
Также разрабатываются и используются клеточные суспензии для спрейного нанесения на поверхность повреждения. В обоих подходах есть свои плюсы и минусы.Cell suspensions are also developed and used for spray application to the surface of damage. Both approaches have their pros and cons.
Так, использование ферментов для снятия с культурального пластика листа кератиноцитов для последующей трансплантации может повреждать адгезионные белки, что приводит к механической нестабильности трансплантата [Desai, М.Н., Mlakar, J.M., McCauley, R.L., Abdullah, K.M., Rutan, R.L., Waymack, J.P., Robson, M.C., and Herndon, D.N. Lack of long-term durability of cultured keratinocyte burn-wound coverage: a case report. J Burn Care Rehabil 12, 540, 1991]. При тестировании клеточных суспензий было показано, что они слабо прикрепляются в процессе операции, в результате чего теряется значительное количество клеток [Currie, L.J., Martin, R., Sharpe, J.R., and James, S.E. A comparison of keratinocyte cell sprays with and without fibrin glue. Burns 29, 677, 2003] и уменьшается эффективность лечения.So, the use of enzymes to remove keratinocyte leaf from the culture plastic for subsequent transplantation can damage the adhesion proteins, which leads to mechanical instability of the graft [Desai, MN, Mlakar, JM, McCauley, RL, Abdullah, KM, Rutan, RL, Waymack , JP, Robson, MC, and Herndon, DN Lack of long-term durability of cultured keratinocyte burn-wound coverage: a case report. J Burn Care Rehabil 12, 540, 1991]. When testing cell suspensions, it was shown that they are weakly attached during the operation, resulting in a significant number of cells being lost [Currie, L.J., Martin, R., Sharpe, J.R., and James, S.E. A comparison of keratinocyte cell sprays with and without fibrin glue. Burns 29, 677, 2003] and the effectiveness of the treatment is reduced.
Использование клеточных технологий в терапии повреждений кожи является перспективным направлением исследований, поскольку восстановление или замена поврежденной ткани, а также нормализация ее функций происходит за счет оптимального соотношения вводимых клеточных факторов, что ускоряет этот процесс и делает его более эффективным. При лечении обширных повреждений методы клеточной терапии могут существенно уменьшить время заживления и уменьшить вплоть до полного исчезновения образование рубцовой ткани.The use of cellular technologies in the treatment of skin lesions is a promising area of research, since the restoration or replacement of damaged tissue, as well as the normalization of its functions, occurs due to the optimal ratio of introduced cellular factors, which accelerates this process and makes it more effective. In the treatment of extensive lesions, cell therapy methods can significantly reduce the healing time and reduce the formation of scar tissue up to the complete disappearance.
В результате того, что восстановление происходит путем индукции миграции и пролиферации клеток с соседних участков, восстановленная ткань практически не отличается по своим свойствам от окружающей здоровой ткани.As a result of the fact that restoration occurs by inducing the migration and proliferation of cells from neighboring areas, the restored tissue practically does not differ in its properties from the surrounding healthy tissue.
Кроме того, такой подход снижает хирургическую нагрузку на пациента и является менее трудоемким для медицинского персонала. В настоящее время активно развивается направление использования клеток и биосовместимых материалов, выступающих в роли носителей. Такие материалы должны обеспечивать доставку, дифференцировку и миграцию клеток в месте повреждения, а, кроме того, впоследствии должны замещаться клетками нормальной ткани пациента, быть биологически безопасными и обладать адекватными механическими характеристиками. Для проверки свойств такой системы носитель - клетки, клетки и материал должны использоваться вместе, что дает возможность оценить биосовместимость, их взаимодействие и деградацию побочных продуктов. Простота в использовании конечного продукта будет иметь большое значение в его клиническом применении.In addition, this approach reduces the surgical burden on the patient and is less time consuming for medical personnel. Currently, the direction of using cells and biocompatible materials acting as carriers is actively developing. Such materials must ensure the delivery, differentiation and migration of cells at the site of damage, and, in addition, subsequently must be replaced by cells of normal patient tissue, be biologically safe and have adequate mechanical characteristics. To verify the properties of such a carrier system, cells, cells and material should be used together, which makes it possible to evaluate biocompatibility, their interaction and degradation of by-products. The ease of use of the final product will be of great importance in its clinical application.
Одним из наиболее перспективных направлений тканевой инженерии и регенеративной медицины в настоящее время является разработка, исследование и клиническое использование комплексов, состоящих из искусственного внеклеточного матрикса и клеток, использующих матрикс как субстрат в результате их нанесения и культивирования in vitro или спонтанного заселения in vivo.One of the most promising areas of tissue engineering and regenerative medicine at present is the development, research and clinical use of complexes consisting of artificial extracellular matrix and cells using the matrix as a substrate as a result of their application and cultivation in vitro or spontaneous population in vivo.
Матрикс представляет собой изделие, которое отвечает таким требованиям, как биосовместимость, определенные механические, физические свойства и предоставляет субстрат для нормального функционирования клеток. Многими научными группами продолжается поиск адекватных носителей для трансплантируемых клеток, позволяющих упростить технологию трансплантации и усовершенствовать методики лечения заболеваний, обусловленных дефектами клеточных структур и тканей. Современные исследования в этой области сосредоточены на создании жизнеспособных культивируемых трансплантатов, комбинированных с кератиноцитами или другими клеточными линиями.Matrix is a product that meets such requirements as biocompatibility, certain mechanical, physical properties and provides a substrate for the normal functioning of cells. Many scientific groups continue to search for adequate carriers for transplanted cells, which simplify the technology of transplantation and improve treatment methods for diseases caused by defects in cell structures and tissues. Current research in this area has focused on creating viable cultured grafts combined with keratinocytes or other cell lines.
При заживлении глубоких повреждений кожа склонна к образованию грубых гипертрофических рубцов, поэтому усилия многих научных групп направлены на модификацию аутотрансплантатов кожи, а также на создание недифференцированных суспензионных клеточных носителей для заполнения обширных и глубоких дефектов кожи. Такой подход способствует как большей выживаемости вводимых клеток, так и повышает скорость и полноту регенерации кожи.When healing deep lesions, the skin is prone to the formation of gross hypertrophic scars, so the efforts of many scientific groups are aimed at modifying skin autografts, as well as creating undifferentiated suspension cell carriers to fill in extensive and deep skin defects. This approach contributes to both greater survival of the introduced cells and increases the speed and completeness of skin regeneration.
В настоящее время уже используются разнообразные биорезорбируемые матриксы для ускорения заживления и регенерации кожных ран, проводятся разработки композитных трансплантатов.A variety of bioresorbable matrices are already being used to accelerate the healing and regeneration of skin wounds, and composite grafts are being developed.
Однако многочисленные методологические проблемы, связанные с самой процедурой трансплантации, а также процессами спонтанной деградации до конца не решены [Horch RE, Debus М, Wagner G, Stark GB. Cultured human keratinocytes on type I collagen membranes to reconstitute the epidermis. Tissue Eng 2000; 1: 53-67].However, numerous methodological problems associated with the transplantation process itself, as well as processes of spontaneous degradation, have not been completely resolved [Horch RE, Debus M, Wagner G, Stark GB. Cultured human keratinocytes on type I collagen membranes to reconstitute the epidermis. Tissue Eng 2000; 1: 53-67].
Использование микроносителей является альтернативной технологией заполнения и активации регенерации обширных повреждений кожи. Микроносители - это частицы от 100 до 400 мкм в диаметре, которые изготавливаются из различных материалов и могут использоваться для прикрепления клеток и последующего введения в рану. Впервые такой подход был описан van Wezel и соавт. [van Wezel, A.L. The large-scale cultivation of diploid cell strains in microcarrier culture. Improvement of microcarriers. Dev Biol Stand 37, 143, 1976]. Первые микроносители были изготовлены из DEAE Sephadex А-50. В настоящее время до клинических испытаний были доведены только микроносители из модифицированного желатина [Liu, J.Y., Hafner, J., Dragieva, G., Seifert, В., and Burg, G. Autologous cultured keratinocytes on porcine gelatin microbeads effectively heal chronic venous leg ulcers. Wound Repair Regen 12, 148, 2004] и было достоверно показано, что они способствуют реэпителизации и уменьшению размера ран. В последнее время для изготовления микроносителей используют различные материалы: полистирен, коллаген, желатин, полилактид и др. [Microcarriers and their potential in tissue regeneration. [Martin Y, Eldardiri M, Lawrence-Watt DJ, Sharpe JR. Tissue Eng Part В Rev. 2011 Feb; 17(1): 71-80].The use of microcarriers is an alternative technology for filling and activating the regeneration of extensive skin lesions. Microcarriers are particles from 100 to 400 microns in diameter, which are made from various materials and can be used to attach cells and then enter into the wound. This approach was first described by van Wezel et al. [van Wezel, A.L. The large-scale cultivation of diploid cell strains in microcarrier culture. Improvement of microcarriers. Dev Biol Stand 37, 143, 1976]. The first microcarriers were made from DEAE Sephadex A-50. Currently, only modified gelatin microcarriers have been brought to clinical trials [Liu, JY, Hafner, J., Dragieva, G., Seifert, B., and Burg, G. Autologous cultured keratinocytes on porcine gelatin microbeads effectively heal chronic venous leg ulcers. Wound Repair Regen 12, 148, 2004] and it has been reliably shown that they contribute to re-epithelialization and reduce the size of wounds. Recently, various materials have been used for the manufacture of microcarriers: polystyrene, collagen, gelatin, polylactide, etc. [Microcarriers and their potential in tissue regeneration. [Martin Y, Eldardiri M, Lawrence-Watt DJ, Sharpe JR. Tissue Eng Part In Rev. 2011 Feb; 17 (1): 71-80].
Данные последних исследований в этой области показывают, что введение в кожные раны пористых биорезорбируемых микроносителей, загруженных культивированными кератиноцитами человека, способствовало не только оптимальной реэпителизации раны, но и стимулировало регенерацию всех поврежденных слоев кожи [Gustafson CJ, Birgisson A, Junker J, Huss F, Salemark L, Johnson H, et al. Employing human keratinocytes cultured on macroporous gelatin spheres to treat full thicknesswounds: an in vivo study on athymic rats. Burns 2007; 6: 726-35].Recent studies in this area show that the introduction into the skin wounds of porous bioresorbable microcarriers loaded with cultured human keratinocytes not only facilitated optimal re-epithelialization of the wound, but also stimulated the regeneration of all damaged layers of the skin [Gustafson CJ, Birgisson A, Junker J, Huss F, Salemark L, Johnson H, et al. Employing human keratinocytes cultured on macroporous gelatin spheres to treat full thicknesswounds: an in vivo study on athymic rats. Burns 2007; 6: 726-35].
Таким образом, разработка биорезорбируемых материалов для создания суспензионных препаратов для эффективного лечения глубоких дефектов кожи является чрезвычайно актуальной задачей.Thus, the development of bioresorbable materials to create suspension preparations for the effective treatment of deep skin defects is an extremely urgent task.
Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является заменитель живой кожи, включающий биосовместимый носитель и культуру клеток кожи, отличающийся тем, что он содержит в качестве биосовместимого носителя микросферы из биорезорбируемого in vivo материала, имеющие средний диаметр 50-500 мкм, предпочтительно 80-250 мкм, и культуру клеток кожи в виде покрытия, нанесенного на поверхность этих микросфер, известный из документа RU 2104039 С1.The closest analogue of the present invention is a substitute for living skin, comprising a biocompatible carrier and a skin cell culture, characterized in that it contains as a biocompatible carrier microspheres from bioresorbable in vivo material having an average diameter of 50-500 μm, preferably 80-250 μm, and culture of skin cells in the form of a coating deposited on the surface of these microspheres, known from document RU 2104039 C1.
Существенным недостатком известного изобретения является использование в качестве материала микросфер полигидроксибутирата, сополимера полигидроксибутирата и полигидроксивалериата, полимеров лактидогликолидов, полилактонов, полиэфиров, полилактидов, полиглюколидов, полиангидридов, поскольку данные материалы являются биостабильными и их использование отрицательно сказывается на биосовместимости носителя и удорожает его.A significant disadvantage of the known invention is the use as a material of microspheres of polyhydroxybutyrate, a copolymer of polyhydroxybutyrate and polyhydroxyvalerate, polymers of lactidoglycolides, polylactones, polyesters, polylactides, polyglucolides, polyanhydrides, since these materials are biostable and their use negatively affects its biocompatibility.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задачей изобретения является создание биорезорбируемых микроносителей для доставки клеток в область заживления и регенерации ран, представляющих собой частицы на основе фиброина шелка Bombyx mori.The objective of the invention is the creation of bioresorbable microcarriers for the delivery of cells to the area of healing and regeneration of wounds, which are particles based on fibroin silk Bombyx mori.
Поставленная задача решается биорезорбируемым микроносителем для доставки клеток в область повреждения для заживления и регенерации ран, представляющим собой частицы диаметром 50-300 мкм, обладающие отрицательным зарядом при физиологических значениях рН (6,0-7,5), полученным измельчением трехмерных матриксов на основе фиброина шелка Bombyx mori.The problem is solved by a bioresorbable microcarrier for delivering cells to the area of damage for wound healing and regeneration, representing particles with a diameter of 50-300 μm, having a negative charge at physiological pH values (6.0-7.5) obtained by grinding three-dimensional fibroin-based matrices Silk Bombyx mori.
Указанный микроноситель получают измельчением трехмерных матриксов на основе фиброина шелка по следующей схеме:The specified microcarrier is obtained by grinding three-dimensional matrices based on silk fibroin according to the following scheme:
a) сначала замораживают трехмерный пористый матрикс течение 12-24 часов при от -80 до -90°С,a) first freeze the three-dimensional porous matrix for 12-24 hours at from -80 to -90 ° C,
b) затем криоизмельчают матрикс с применением диспергатора.b) then the cryo-grind matrix using a dispersant.
Причем трехмерные пористые матриксы на основе фиброина шелка получены путем замораживания-оттаивания водного раствора фиброина следующим образом:Moreover, three-dimensional porous matrices based on silk fibroin are obtained by freezing and thawing an aqueous solution of fibroin as follows:
- получают водный раствора фиброина с концентрацией 18-30 мг/мл с использованием смеси CaCl2:C2H5OH:H2O при следующем соотношении частей 1:2:8;- get an aqueous solution of fibroin with a concentration of 18-30 mg / ml using a mixture of CaCl 2 : C 2 H 5 OH: H 2 O in the following ratio of parts 1: 2: 8;
- замораживают смеси полученного раствора фиброина с ДМСО, при этом содержание ДМСО в растворе составляет 0,5-2%;- freeze the mixture of the obtained fibroin solution with DMSO, while the content of DMSO in the solution is 0.5-2%;
- размораживание и обработку этанолом заготовки трехмерного матрикса- thawing and ethanol treatment of a three-dimensional matrix blank
Полученный микроноситель дополнительно может содержать специфическую среду для культивирования, подбираемую под линию клеток.The resulting microcarrier may additionally contain a specific culture medium selected for the cell line.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является способность доставлять клетки в область повреждения для заживления и регенерации ран, возможность выполнения функции каркаса для функционирующих клеток в условиях in vitro и in vivo и способность регулирования скорости биодеградации микроносителя. Использование изобретения позволяет также иммобилизировать на носителе большее количество клеток, чем в известных решениях.The technical result achieved by using the invention is the ability to deliver cells to the area of damage for healing and regeneration of wounds, the ability to perform the function of the frame for functioning cells in vitro and in vivo, and the ability to control the rate of biodegradation of the microcarrier. The use of the invention also allows the immobilization of a larger number of cells on a carrier than in known solutions.
Области применения: тканевая инженерия, регенеративная медицина, травматология, хирургия, косметология. Разработка и использование микроносителей из безопасных биодеградируемых материалов имеет значительный потенциал как в фундаментальном, так и прикладном значении. Микроносители могут быть использованы для решения задач клеточной биологии, например воздействия ростовых факторов на дифференцировку стволовых клеток. Создание с их помощью адекватной трехмерной среды роста для многих клеток является важнейшим фактором нормального функционирования, что позволит изучать различные внутриклеточные процессы в состоянии, максимально приближенном к естественному. На основе микроносителей созданы модельные системы для исследования клеточной миграции, ангиогенеза, остеогенеза и других процессов. Кроме того, эта технология чрезвычайно перспективна в медицинском аспекте как основа для заполнения существенных кожных дефектов и ускорения регенерации кожных покровов, так и лечения повреждений различных типов тканей в условиях затрудненного к ним доступа. К ним относятся костная и хрящевая ткани, ткани печени, центральной нервной системы и др. С помощью гепатоцитов, культивированных на микроносителях, возможно создание экстракорпорального биоискусственного устройства для пациентов с тяжелыми поражениями печени, ожидающими ее пересадки. Культивирование человеческих стволовых клеток на микроносителях позволяет сохранить их плюрипотентность и направлять их дифференцировку, что открывает широкие возможности их использования в области регенеративной медицины. Создаваемые биодеградируемые микроносители в виде суспензий могут использоваться и в качестве резервуаров для таргетной доставки лекарств при лечении широкого спектра заболеваний.Fields of application: tissue engineering, regenerative medicine, traumatology, surgery, cosmetology. The development and use of microcarriers made of safe biodegradable materials has significant potential both in fundamental and in practical terms. Microcarriers can be used to solve problems of cell biology, for example, the influence of growth factors on the differentiation of stem cells. The creation with their help of an adequate three-dimensional growth medium for many cells is an important factor in normal functioning, which will allow us to study various intracellular processes in a state as close to natural as possible. Based on microcarriers, model systems have been created for studying cell migration, angiogenesis, osteogenesis, and other processes. In addition, this technology is extremely promising in the medical aspect, as the basis for filling in significant skin defects and accelerating the regeneration of the skin, and for treating injuries of various types of tissues in conditions of difficult access to them. These include bone and cartilage, liver, central nervous system, and others. Using hepatocytes cultured on microcarriers, it is possible to create an extracorporeal bio-artificial device for patients with severe liver damage awaiting transplantation. Cultivation of human stem cells on microcarriers allows preserving their pluripotency and directing their differentiation, which opens up wide possibilities for their use in the field of regenerative medicine. The created biodegradable microcarriers in the form of suspensions can also be used as reservoirs for targeted drug delivery in the treatment of a wide range of diseases.
Правильный подбор материала при разработке микроносителей - основополагающий параметр при создании биорезорбируемого микроносителя для доставки клеток в область заживления и регенерации ран. Микроносители должны выполнять роль субстратов для адгезии клеток, вовлеченных в процессы заживления и регенерации ран, способствовать поддержанию пролиферативной активности и жизнеспособности клеток, а также должны обеспечивать доставку, дифференцировку и миграцию клеток в месте повреждения и замещаться клетками нормальной ткани пациента. В связи с этим, для изготовления таких изделий предпочтение отдается биосовместимым полимерам природного происхождения (биополимерам) и различным композитным материалам на их основе, таким как: альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновую кислоту, полиэфиры бактериального происхождения. Биополимеры должны быть биологически безопасны: обладать высокой биосовместимостью, способностью к биодеградации, быть не токсичными, не вызывать иммунной реакции при введении в организм. Поиск материалов с необходимыми свойствами привел к возрождению интереса к полимерам, созданным на основе шелка. Источниками таких полимеров являются нити кокона шелкопряда и белки каркасной нити паутины. Они обладают впечатляющими механическими свойствами: высокой прочностью на разрыв и высокой эластичностью. Иммуногенность этих белков крайне низкая и конструкции на их основе разрушаются с образованием нетоксичных продуктов. Оба эти материала могут быть использованы для создания биосовместимых биорезорбируемых конструкций. В качестве основы для создания микроносителей для доставки клеток в область заживления и регенерации ран нами был выбран фиброин шелка Bombyx mori. По химическим свойствам фиброин шелка - амфифильный белок с перевесом в сторону гидрофобности, его изоэлектрическая точка pI=4.2. В физиологических условиях фиброин шелка приобретает отрицательный заряд. Это способствует снижению скорости адгезии клеток и увеличению скорости их миграции. Каждый природный полимер имеет свои характерные преимущества и недостатки. Поэтому перспективным направлением является создание конструкций на основе двух или более материалов. Как правило, такие конструкции обладают улучшенными характеристиками по сравнению со своими однокомпонентными аналогами. Внесение в состав микроносителей на основе фиброина шелка различных веществ может усилить адгезию клеток к поверхности изделия, для этой цели часто используются компоненты внеклеточного матрикса. Также в состав микроносителя могут быть включены биологически активные соединения, например, стимулирующие дифференцировку клеток или подавляющие их дедифференцировку. Изделия на основе фиброина характеризуются высокой прочностью и эластичностью, внесение в структуру таких изделий желатина - продукта денатурации коллагена, способствует существенному увеличению адгезии и скорости пролиферации клеток. Этот полипептид содержит специфическую последовательность RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), которая узнается интегринами - рецепторами на поверхности клетки, участвующими в регуляции их адгезии и пролиферации. Поэтому в качестве модификатора, повышающего адгезивные свойства микроносителей, будет использоваться желатин, представляющий собой биодеградируемый полимерный продукт частичного гидролиза коллагена, сохраняющий биологические свойства, сходные со свойствами нативного коллагена. Использование желатина обусловлено его доступностью и более низкой по сравнению с коллагеном ценой. Кроме того, желатин уже долгое время используется для создания биосовместимых и биоразлагаемых материалов.The correct selection of material during the development of microcarriers is a fundamental parameter when creating a bioresorbable microcarrier for delivering cells to the area of wound healing and regeneration. Microcarriers should act as substrates for the adhesion of cells involved in wound healing and regeneration processes, help to maintain proliferative activity and cell viability, and should also ensure delivery, differentiation and migration of cells at the site of damage and be replaced by cells of normal patient tissue. In this regard, for the manufacture of such products, preference is given to biocompatible polymers of natural origin (biopolymers) and various composite materials based on them, such as: alginates, collagen, gelatin, chitosan, hyaluronic acid, polyesters of bacterial origin. Biopolymers should be biologically safe: have high biocompatibility, the ability to biodegradation, be non-toxic, not cause an immune reaction when introduced into the body. The search for materials with the necessary properties has led to a revival of interest in polymers based on silk. Sources of such polymers are silkworm cocoon strands and cobweb frame strand proteins. They have impressive mechanical properties: high tensile strength and high elasticity. The immunogenicity of these proteins is extremely low and structures based on them are destroyed with the formation of non-toxic products. Both of these materials can be used to create biocompatible bioresorbable structures. As the basis for creating microcarriers for delivering cells to the area of wound healing and regeneration, we selected Bombyx mori silk fibroin. By its chemical properties, silk fibroin is an amphiphilic protein with an advantage in the direction of hydrophobicity; its isoelectric point is pI = 4.2. Under physiological conditions, silk fibroin acquires a negative charge. This helps to reduce the rate of cell adhesion and increase the rate of their migration. Each natural polymer has its own characteristic advantages and disadvantages. Therefore, a promising direction is the creation of structures based on two or more materials. Typically, such designs have improved characteristics compared to their one-component counterparts. The addition of various substances to the composition of microcarriers based on silk fibroin can enhance cell adhesion to the surface of the product; for this purpose, extracellular matrix components are often used. Also, biologically active compounds can be included in the microcarrier composition, for example, stimulating the differentiation of cells or inhibiting their dedifferentiation. Fibroin-based products are characterized by high strength and elasticity, the introduction of gelatin into the structure of such products, a product of collagen denaturation, contributes to a significant increase in the adhesion and proliferation rate of cells. This polypeptide contains a specific sequence of RGD (arginine-glycine-aspartic acid), which is recognized by integrins - receptors on the cell surface that are involved in the regulation of their adhesion and proliferation. Therefore, as a modifier that increases the adhesive properties of microcarriers, gelatin will be used, which is a biodegradable polymer product of partial collagen hydrolysis, preserving biological properties similar to those of native collagen. The use of gelatin is due to its availability and lower cost compared to collagen. In addition, gelatin has long been used to create biocompatible and biodegradable materials.
Выбор метода получения микроносителей в основном зависит от используемого материала. Среди основных подходов для создания микрочастиц выделяют следующие: самосборка кополимеров в водном растворе, получение эмульсий с последующим удалением растворителей высушиванием, метод, основанный на преципитации, и получение частиц микрогеля из гидрогеля путем механического разрушения последнего. Фиброин шелка нерастворим как в воде, так и в разбавленных растворах многих кислот и щелочей. Однако возможно получение водных растворов фиброина шелка. Наиболее часто для получения таких растворов используют 9,8 М водный раствор бромида лития или смесь CaCl2:C2H5OH:H2O в молярном соотношении 1:2:8. Длительная инкубация при высоких температурах в таких средах и последующее удаление низкомолекулярных соединений путем диализа позволяет получить водные растворы фиброина шелка с концентрацией до 150 мг/мл. Из водных растворов фиброина шелка могут быть получены трехмерные пористые матриксы методом замораживания-оттаивания. Для изготовления матриксов методом замораживания-оттаивания водный раствор фиброина, содержащий небольшое количество органического растворителя, способного смешиваться с водой (обычно используют ДМСО), помещают в форму и инкубируют при температуре ниже точки плавления. Добавление органического растворителя вызывает образование наноскопических самоорганизующихся агрегатов фиброина, который частично переходит в β-кристаллическую форму. При формировании кристаллов льда молекулы фиброина выходят из водной фазы и концентрируются вокруг агрегатов. Поры формируются на месте кристаллов льда при его оттаивании. Поры, соединенные отверстиями и каналами, формируют сложную незамкнутую внутреннюю поверхность. Их диаметр, а также пористость и механические свойства зависят от температуры замораживания, концентраций фиброина и органического растворителя. Этот метод прост и технологичен, он позволяет получать большие партии изделий с хорошей воспроизводимостью, что важно для возможности использования его в промышленных масштабах. Стенки пор таких матриксов обладают микро-/ и нанорельефом, что делает их поверхность привлекательной для эукариотических клеток. При механическом разрушении матриксов могут быть получены трехмерные поверхности сложной формы с высоким соотношением [площадь поверхности]/[объем частицы], что позволит получать клеточные композиции на микроносителях с высокой клеточной плотностью в небольшом объеме. Причем размер пор измельчаемого матрикса не оказывает влияния на свойства получаемого микроносителя. Также будут получены модифицированные трехмерные пористые матриксы из фиброина и желатина методом замораживания-оттаивания. Введение желатина в структуру матрикса не приводит к изменениям общей структуры трехмерной конструкции, а рельеф поверхности стенок пор таких матриксов становится более выраженным. Кроме того, введение желатина в состав матриксов приводит к увеличению адгезии и скорости пролиферации эукариотических клеток, в частности эмбриональных мышиных фибробластов. Таким образом, биорезорбируемые микроносители для доставки клеток в область заживления и регенерации ран будут получены путем криофрагментации трехмерных пористых матриксов на основе фиброина и модифицированных трехмерных пористых матриксов из фиброина и желатина и последующим сортингом микрочастиц. Будут отобраны микрочастицы размером 50-300 мкм, что позволит вводить их в организм посредством инъекций.The choice of the method of obtaining microcarriers mainly depends on the material used. Among the main approaches for creating microparticles, the following are distinguished: self-assembly of copolymers in an aqueous solution, obtaining emulsions, followed by removal of the solvents by drying, a precipitation-based method, and obtaining microgel particles from a hydrogel by mechanical destruction of the latter. Silk fibroin is insoluble both in water and in dilute solutions of many acids and alkalis. However, it is possible to obtain aqueous solutions of silk fibroin. Most often, a 9.8 M aqueous solution of lithium bromide or a mixture of CaCl 2 : C 2 H 5 OH: H 2 O in a molar ratio of 1: 2: 8 is used to obtain such solutions. Long-term incubation at high temperatures in such media and the subsequent removal of low molecular weight compounds by dialysis allows one to obtain aqueous solutions of silk fibroin with a concentration of up to 150 mg / ml. From aqueous solutions of silk fibroin, three-dimensional porous matrices can be obtained by the method of freezing and thawing. For the manufacture of freeze-thaw matrices, an aqueous solution of fibroin containing a small amount of an organic solvent that can mix with water (usually DMSO is used) is placed in a mold and incubated at a temperature below the melting point. The addition of an organic solvent causes the formation of nanoscopic self-organizing aggregates of fibroin, which partially transforms into a β-crystalline form. During the formation of ice crystals, fibroin molecules leave the aqueous phase and concentrate around aggregates. Pores form in place of ice crystals during thawing. Pores connected by openings and channels form a complex, unclosed inner surface. Their diameter, as well as porosity and mechanical properties depend on the freezing temperature, the concentrations of fibroin and organic solvent. This method is simple and technological, it allows you to get large batches of products with good reproducibility, which is important for the possibility of its use on an industrial scale. The pore walls of such matrices have a micro- and nanorelief, which makes their surface attractive for eukaryotic cells. With the mechanical destruction of the matrices, three-dimensional surfaces of complex shape with a high ratio of [surface area] / [particle volume] can be obtained, which will make it possible to obtain cell compositions on microcarriers with high cell density in a small volume. Moreover, the pore size of the ground matrix does not affect the properties of the resulting microcarrier. Also, modified three-dimensional porous matrices from fibroin and gelatin will be obtained by the method of freezing and thawing. The introduction of gelatin into the matrix structure does not lead to changes in the general structure of the three-dimensional structure, and the surface relief of the pore walls of such matrices becomes more pronounced. In addition, the introduction of gelatin into the matrix leads to an increase in the adhesion and proliferation rate of eukaryotic cells, in particular embryonic murine fibroblasts. Thus, bioresorbable microcarriers for delivering cells to the area of wound healing and regeneration will be obtained by cryo-fragmentation of three-dimensional porous matrices based on fibroin and modified three-dimensional porous matrices from fibroin and gelatin and subsequent sorting of microparticles. Microparticles 50-300 microns in size will be selected, which will allow them to be injected into the body.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
На фиг. 1 представлена деструкция образцов микроносителейIn FIG. 1 shows the destruction of microcarrier samples
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
Настоящее изобретение подкреплено следующими примерами.The present invention is supported by the following examples.
Пример 1. Получение биорезорбируемых микроносителей для доставки клеток в область заживления и регенерации ран.Example 1. Obtaining bioresorbable microcarriers to deliver cells to the area of healing and regeneration of wounds.
1. Подготовка рабочих растворов:1. Preparation of working solutions:
1.1. Подготовка раствора 1.1.1.
Готовят раствор хлорида кальция в смеси этанола и воды. Молярное соотношение компонентов CaCl2:C2H5OH:H2O в молярном соотношении 1:2:8.A solution of calcium chloride in a mixture of ethanol and water is prepared. The molar ratio of the components of CaCl 2 : C 2 H 5 OH: H 2 O in a molar ratio of 1: 2: 8.
1.2. Подготовка раствора 2.1.2. Solution preparation 2.
Готовят навеску шелка из расчета 150 мг на 1 мл раствора 1 и переносят в емкость с раствором 1. Инкубируют в течение 5 часов на водяной бане при 70°С. Полученный раствор центрифугируют 15 минут при 13400 об/мин и супернатант диализуют против дистиллированной воды, проводя 4 смены диализа. Полученный раствор центрифугируют 15 минут при 13400 об/мин и определяют концентрацию фиброина по оптической плотности при 280 нм. Доводят раствор до концентрации фиброина 20 мг/мл, вносят 1% ДМСО и используют на стадии 2.Prepare a weighed silk at the rate of 150 mg per 1 ml of
2. Формирование матриксов2. Formation of matrices
Раствор 2 вносят в форму и замораживают в морозильной камере при -20°С в течение 7 дней. Обрабатывают 96% этанолом полученные заготовки матриксов 3 раза по 45 минут. Полученные матриксы переносят в дистиллированную воду и используют на стадии 3.Solution 2 is introduced into the form and frozen in a freezer at -20 ° C for 7 days. The resulting matrix blanks are treated with 96% ethanol 3 times for 45 minutes. The resulting matrices are transferred to distilled water and used in stage 3.
3. Получение микрочастиц из матриксов3. Obtaining microparticles from matrices
Матриксы, полученные на стадии 2, погружают в воду и помещают на ночь в морозильную камеру при -20°С. Переносят замороженные в воде матриксы в морозильную камеру на 4 часа при -90°С. За это время охлаждают нож-диспергатор. Для этого помещают лед в полиэтиленовый пакет и прикладывают к ножу. Замороженные в воде матриксы переносят в диспергатор и размельчают в течение 45 секунд. Полученную взвесь переносят в 50 мл центрифужные пробирки и используют на стадии 4.The matrices obtained in stage 2 are immersed in water and placed overnight in a freezer at -20 ° C. Matrices frozen in water are transferred to the freezer for 4 hours at -90 ° C. During this time, the dispersant knife is cooled. To do this, put ice in a plastic bag and apply it to a knife. Matrices frozen in water are transferred to a dispersant and crushed for 45 seconds. The resulting suspension is transferred to 50 ml centrifuge tubes and used in stage 4.
4. Сортинг и стерилизация микрочастиц из матриксов4. Sorting and sterilization of microparticles from matrices
Полученные микрочастицы отбирают шприцем и переносят в 2 мл эппендорфы. Центрифугируют суспензию при 13400 об/мин. Супернатант отбирают, вносят 70% этанол, ресуспендируют и хранят при +4°С.The resulting microparticles are taken with a syringe and transferred into 2 ml of eppendorf. Centrifuge the suspension at 13,400 rpm. The supernatant is removed, 70% ethanol is added, resuspended and stored at + 4 ° C.
Пример 2. Определение деструкции микроносителей в модельных системах in vitro Деструкцию образцов микроносителей в нейтральной среде определяли инкубацией в фосфатно-солевом буфере. Испытание окислительной деструкции образцов проводили в реактиве Фентона. Последний содержит 0,1 М соли Fe2+ и 1 мМ раствора 3% Н2О2. Образцы в этих средах инкубировали в течение 3 недель. Изменение массы образцов отмечали, взвешивая образцы каждые 7 дней. Результаты представлены на фиг. 1.Example 2. Determination of the destruction of microcarriers in model systems in vitro The destruction of microcarrier samples in a neutral medium was determined by incubation in phosphate-buffered saline. Test oxidative degradation of the samples was carried out in Fenton's reagent. The latter contains 0.1 M salt of Fe2 + and 1 mm solution of 3% H 2 About 2 . Samples in these media were incubated for 3 weeks. The change in mass of the samples was noted by weighing the samples every 7 days. The results are shown in FIG. one.
Анализ данных показал, что при продолжительной инкубации в нейтральной среде образцы микроносителей были стабильны, после 21 дня инкубации их масса изменялась не более чем на 15%.An analysis of the data showed that during prolonged incubation in a neutral medium, the microcarrier samples were stable; after 21 days of incubation, their mass changed by no more than 15%.
Под воздействием гидроксильных радикалов реактива Фентона образцы микроносителей разрушаются к 3-й неделе менее чем на 50%.Under the influence of hydroxyl radicals of the Fenton reagent, microcarrier samples are destroyed by less than 50% by the 3rd week.
Таким образом, образцы микроносителей устойчивы к деградации в окисляющей среде в течение 3 недель. Деградация материала предполагает также и биорезорбцию микроносителей в условиях выраженного клеточного ответа или при развитии воспалительных процессов.Thus, microcarrier samples are resistant to degradation in an oxidizing medium for 3 weeks. Degradation of the material also involves bioresorption of microcarriers under conditions of a pronounced cellular response or with the development of inflammatory processes.
Пример 3. Витализация экспериментальных образцов биорезорбируемого микроносителя для направленной доставки клетокExample 3. Vitalization of experimental samples of bioresorbable microcarrier for targeted delivery of cells
1. Подготовка микроносителей1. Preparation of microcarriers
Стерильную навеску микроносителя переносят в среду культивирования ДМЕМ в центрифужную пробирку из расчета 5 мг на 1 мл, ресуспендируют и центрифугируют 3 минуты при 1500 об/мин. Заменяют супернатант на 1 мл ДМЕМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и инкубируют при 37°С 1 час. Полученную суспензию используют на стадии 3.A sterile sample of microcarrier is transferred to a DMEM cultivation medium in a centrifuge tube at the rate of 5 mg per 1 ml, resuspended and centrifuged for 3 minutes at 1500 rpm. Replace the supernatant with 1 ml of DMEM with 10% fetal calf serum (ETS) and incubate at 37 ° C for 1 hour. The resulting suspension is used in stage 3.
2. Подготовка суспензии фибробластов мыши 3Т32. Preparation of mouse 3T3 fibroblast suspension
Фибробласты мыши 3Т3 снимают раствором трипсин-Версена, трипсин инактивируют ЭТС и переносят в центрифужные пробирки в ДМЕМ с 10% ЭТС, осаждают клетки, центрифугируя при 1500 об/мин в течение 7 минут. Супернатант удаляют и ресуспендируют осадок к ДМЕМ. Проводят подсчет клеток в камере Горяева и готовят суспензию, содержащую 200 тыс. клеток в 1 мл ДМЕМ с 10% ЭТС. Полученную суспензию используют на стадии 3.Mouse 3T3 fibroblasts were removed with trypsin-Versen solution, trypsin inactivated ETS and transferred to centrifuge tubes in DMEM with 10% ETS, pelleted cells, centrifuged at 1500 rpm for 7 minutes. The supernatant is removed and the residue is resuspended to DMEM. Cells are counted in a Goryaev chamber and a suspension is prepared containing 200 thousand cells in 1 ml of DMEM with 10% ETS. The resulting suspension is used in stage 3.
3. Иммобилизация клеток на микроносителе3. Cell immobilization on a microcarrier
Суспензию микрочастиц, полученную на стадии 1, вносят в лунки 96-луночной круглодонной плашки по 50 мкл на 1 лунку и добавляют по 100 мкл суспензии клеток, полученной на стадии 2. Помещают плашку в СО2-инкубатор и инкубируют 6 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2. Суспензию микроносителей с иммобилизованными клетками переносят в лунки 24-луночной плашки. Содержащие 1,5 мл культуральной среды ДМЕМ с 10% ЭТС. Планшет помещают в СО2-инкубатор на 37°C с 5% СО2 в атмосфере.The microparticle suspension obtained in
4. Культивирование фибробластов мыши линии 3Т3 на микроносителях4. Cultivation of mouse fibroblasts of the 3T3 line on microcarriers
Фибробласты мыши 3Т3 культивируют на микроносителях в течение 7 дней в культуральной среде ДМЕМ с 10% ЭТС. На 3, 5 и 7 день проводят смену культуральной среды: отбирают старую среду и вносят 1,5 мл ДМЕМ с 10% ЭТС.3T3 mouse fibroblasts were cultured on microcarriers for 7 days in a DMEM culture medium with 10% ETS. On the 3rd, 5th and 7th day, the culture medium is changed: the old medium is taken and 1.5 ml of DMEM with 10% ETS are added.
5. Культивирование различных концентраций фибробластов мыши линии 3Т3 на микроносителях5. Cultivation of various concentrations of mouse fibroblasts of the 3T3 line on microcarriers
На основе ранее полученных данных по адгезии и пролиферации фибробластов мыши 3Т3 на трехмерных пористых матриксах из фиброина шелка были выбраны 3 концентрации инокулируемых клеток: 10000/лунку, 20000/лунку и 40000/лунку. Также была выбрана оптимальная концентрация микрочастиц на основе 3 подходов: 1 мг/мл, 5 мг/ мл и 10 мг/мл. Фибробласты мыши 3Т3 культивировали на микроносителях в течение 7 дней. На 1, 3 и 7 день образцы фиксировали 4% параформальдегидом и исследовали методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Проводили подсчет частиц, на которых выявлялись клетки, и определяли количество клеток на микрочастицах. Результаты экспериментов приведены в таблицах 1-3.Based on previously obtained data on the adhesion and proliferation of 3T3 mouse fibroblasts on three-dimensional porous matrices, 3 concentrations of inoculated cells were selected from silk fibroin: 10,000 / well, 20,000 / well and 40,000 / well. The optimal concentration of microparticles was also selected based on 3 approaches: 1 mg / ml, 5 mg / ml and 10 mg / ml. Mouse 3T3 fibroblasts were cultured on microcarriers for 7 days. On
При внесении клеток в концентрации 10000/лунку вне зависимости от содержания микроносителя количество частиц с прикрепившимися клетками было значительно ниже, чем в более высоких концентрациях. При этом на 3 день культивирования количество частиц, на которых выявлялись клетки, стало ниже, чем на первый день. При высокой плотности суспензии микрочастиц (10 мг/мл) также выявляется значительно меньше микроносителей, содержащих клетки. В связи с этим, количественный подсчет клеток на микроносителях проводился для витализированных микроносителей при внесении 20000/лунку и 40000/лунку и суспензии микрочастиц с концентрацией 1 мг/мл и 5 мг/мл.When introducing cells at a concentration of 10,000 / well, regardless of the microcarrier content, the number of particles with attached cells was significantly lower than at higher concentrations. Moreover, on the 3rd day of cultivation, the number of particles on which the cells were detected became lower than on the first day. At a high density of a suspension of microparticles (10 mg / ml), significantly less microcarriers containing cells are also detected. In this regard, the quantitative counting of cells on microcarriers was carried out for vitalized microcarriers with the addition of 20,000 / well and 40,000 / well and a suspension of microparticles with a concentration of 1 mg / ml and 5 mg / ml.
Как следует из анализа данных таблицы 3, наиболее оптимальные условия для роста фибробластов мыши 3Т3 на микроносителях создаются при использовании суспензии микрочастиц с концентрацией 5 мг/мл и внесении 20000 клеток на лунку.As follows from the analysis of the data in Table 3, the most optimal conditions for the growth of 3T3 mouse fibroblasts on microcarriers are created by using a suspension of microparticles with a concentration of 5 mg / ml and adding 20,000 cells per well.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015157141A RU2616866C1 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Bioresorbable micro-carrier for cell delivery to region of wound healing and regeneration |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015157141A RU2616866C1 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Bioresorbable micro-carrier for cell delivery to region of wound healing and regeneration |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2616866C1 true RU2616866C1 (en) | 2017-04-18 |
Family
ID=58642550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015157141A RU2616866C1 (en) | 2015-12-31 | 2015-12-31 | Bioresorbable micro-carrier for cell delivery to region of wound healing and regeneration |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2616866C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2104039C1 (en) * | 1992-05-18 | 1998-02-10 | Нэшнл Ресеч Консил оф Канада | Live skin substituent, method of its preparing and method of live skin lesion treatment |
| RU2483756C1 (en) * | 2012-01-24 | 2013-06-10 | Игорь Иванович Агапов | METHOD FOR PREPARING BIODEGRADED COMPOSITE MATRIX OF REGENERATED SILK FIBROIN Bombyx mori AND ITS USE |
-
2015
- 2015-12-31 RU RU2015157141A patent/RU2616866C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2104039C1 (en) * | 1992-05-18 | 1998-02-10 | Нэшнл Ресеч Консил оф Канада | Live skin substituent, method of its preparing and method of live skin lesion treatment |
| RU2483756C1 (en) * | 2012-01-24 | 2013-06-10 | Игорь Иванович Агапов | METHOD FOR PREPARING BIODEGRADED COMPOSITE MATRIX OF REGENERATED SILK FIBROIN Bombyx mori AND ITS USE |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| АГАПОВ И.И. и др., Биодеградируемые матриксы из регенерированного шелка Bombix mori // Доклады Академии Наук, 2010, т.433, N5, стр.1-4. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2834155B2 (en) | Collagen flake body | |
| Huang et al. | Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration | |
| Mohamed et al. | Nanomaterials and nanotechnology for skin tissue engineering | |
| JP3646882B2 (en) | Artificial skin containing a biocompatible substance based on a hyaluronic acid derivative as a support | |
| JPH0747043B2 (en) | Synthetic living skin equivalent | |
| MX2012008215A (en) | Bioengineered tissue constructs and methods for producing and using thereof. | |
| RU2483756C1 (en) | METHOD FOR PREPARING BIODEGRADED COMPOSITE MATRIX OF REGENERATED SILK FIBROIN Bombyx mori AND ITS USE | |
| Firipis et al. | Tuneable hybrid hydrogels via complementary self-assembly of a bioactive peptide with a robust polysaccharide | |
| US10149924B1 (en) | Ready to use biodegradable and biocompatible artificial skin substitute and a method of preparation thereof | |
| Huang et al. | Multifunctional implantable particles for skin tissue regeneration: preparation, characterization, in vitro and in vivo studies | |
| Chhibber et al. | Hydrogels in tissue engineering | |
| US20030202965A1 (en) | Methods and compositions for the preparation of cell transplants | |
| Joshi et al. | Self-Assembled Fibrinogen Scaffolds Support Cocultivation of Human Dermal Fibroblasts and HaCaT Keratinocytes | |
| US9259445B2 (en) | Integrated implant system (IIS) biocompatible, biodegradable and bioactive, comprising a biocompatible sterile porous polymeric matrix and a gel, integrating in situ the tridimensional matrix structure | |
| JP2014524269A (en) | Self-transplantation system preparation method and transplantation system obtained thereby | |
| RU2616866C1 (en) | Bioresorbable micro-carrier for cell delivery to region of wound healing and regeneration | |
| RU2658707C1 (en) | Method of skin recovery | |
| Krivoshchekov et al. | Application of bioplastic, cellular and biological material for the healing of the wounds | |
| EP2040766A2 (en) | Integrated implant system (iis) biocompatible, biodegradable and bioactive, comprising a biocompatible sterile porous polymeric matrix and a gel, integrating in situ the tridimensional matrix structure | |
| RU2644306C1 (en) | Method of recovery of defects of covering tissues | |
| Shved et al. | Interaction of cultured skin cells with the polylactide matrix coved with different collagen structural isoforms | |
| Obulapuram et al. | Role of natural cellulose and hydrogel matrices in stem cell therapy of diabetic foot ulcer | |
| Hunt | An alginate hydrogel matrix for the localised delivery of a fibroblast/keratinocyte co-culture to expedite wound healing | |
| RU2644633C1 (en) | Method for skin cover restoration | |
| James et al. | Clinical approaches to skin regeneration |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190318 Effective date: 20190318 |