RU2613306C1 - Method of quantitative determination of hexachlorobenzene in blood by method of gas chromatographic analysis - Google Patents
Method of quantitative determination of hexachlorobenzene in blood by method of gas chromatographic analysis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2613306C1 RU2613306C1 RU2016117510A RU2016117510A RU2613306C1 RU 2613306 C1 RU2613306 C1 RU 2613306C1 RU 2016117510 A RU2016117510 A RU 2016117510A RU 2016117510 A RU2016117510 A RU 2016117510A RU 2613306 C1 RU2613306 C1 RU 2613306C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- hexachlorobenzene
- extraction
- gas chromatographic
- chromatographic analysis
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения гексахлорбензола (далее - ГХБ) в крови.The invention relates to medical toxicological studies, in particular to sanitary toxicology, and can be used for the quantitative determination of hexachlorobenzene (hereinafter - HCB) in the blood.
Известен способ газохроматографического определения гексахлорбензола в почве (Патент РФ № 2427832). Использование синтетических пестицидов для борьбы с вредными организмами приводит к насыщению биосферы веществами, токсичными для человека, сельскохозяйственных животных, полезной флоры и фауны. Указанный способ определения гексахлорбензола включает в себя экстракцию пробы почвы органическим растворителем после измельчения. При этом в качестве растворителя используют о-ксилол (25 мл экстрагента/10г почвы), а определение осуществляют газохроматографическим методом.A known method of gas chromatographic determination of hexachlorobenzene in the soil (RF Patent No. 2427832). The use of synthetic pesticides to control pests leads to the saturation of the biosphere with substances toxic to humans, farm animals, beneficial flora and fauna. The specified method for the determination of hexachlorobenzene involves the extraction of a soil sample with an organic solvent after grinding. In this case, o-xylene (25 ml of extractant / 10 g of soil) is used as a solvent, and the determination is carried out by gas chromatographic method.
Однако этот способ невозможно использовать при определении концентрации ГХБ в биосредах.However, this method cannot be used to determine the concentration of HCB in biological media.
Из Методических указаний МУК 4.1.2112-06 (утверждены Роспотребнадзором 09.08.2006) «Определение массовой концентрации хлороформа, дихлорэтана, тетрахлорметана, хлорбензола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом» известно определение гомолога ГХБ - хлорбензола. Известный способ основан на предварительном концентрировании алифатических хлорированных соединений (хлороформ, тетрахлорметан, 1,2-дихлорэтан) и ароматических (хлорбензол) при рН 8-10 из биологического материала (кровь) экстракцией диэтиловым эфиром и последующем газохроматографическом анализе экстрактов. Выполнение измерений массовой концентрации указанных хлорированных углеводородов проводят методом газовой хроматографии с детектором электронного захвата. Определению не мешают ацетон, ароматические углеводороды, алифатические спирты, трихлорэтилен при содержании каждого из указанных веществ не более 0,5 мкг/см3.From the Methodological Instructions of MUK 4.1.2112-06 (approved by Rospotrebnadzor on 08.09.2006) “Determination of the mass concentration of chloroform, dichloroethane, carbon tetrachloride, chlorobenzene in biological media (blood) by gas chromatographic method” the definition of the HCB homolog — chlorobenzene is known. The known method is based on the preliminary concentration of aliphatic chlorinated compounds (chloroform, carbon tetrachloride, 1,2-dichloroethane) and aromatic (chlorobenzene) at pH 8-10 from biological material (blood) by extraction with diethyl ether and subsequent gas chromatographic analysis of the extracts. Measurements of the mass concentration of these chlorinated hydrocarbons are carried out by gas chromatography with an electron capture detector. The determination does not interfere with acetone, aromatic hydrocarbons, aliphatic alcohols, trichlorethylene with a content of each of these substances no more than 0.5 μg / cm 3 .
Выполнение измерений по указанному способу выполняют следующим образом. Пробу крови в объеме 2 см3 доводят до 50 см3 бидистиллированной водой, помещают в делительную воронку объемом 250 см3, добавляют 30 г высаливателя - хлорида натрия, подщелачивают 30%-ным раствором гидроксида натрия до достижения рН 8-10 и экстрагируют 10 см3 диэтилового эфира. Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин, после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку. Далее пробу центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин для денатурации белка. После отстаивания эфирный экстракт сливают в другую пробирку. Полученный центрифугат в объеме 10 мм3 хроматографируют и проводят количественное определение анализируемых соединений в подготовленной пробе по калибровочному графику.Performing measurements according to the specified method is as follows. A blood sample in a volume of 2 cm 3 is brought to 50 cm 3 with double-distilled water, placed in a 250 cm 3 separatory funnel, 30 g of a salting out agent - sodium chloride are added, alkalized with a 30% sodium hydroxide solution until pH 8-10 is reached and extracted with 10 cm 3 diethyl ether. The contents of the funnel are vigorously shaken for 10 minutes, after sedimentation, the ether extract is poured into a test tube. The sample is then centrifuged at 7000 rpm for 10 minutes to denature the protein. After settling, the ether extract is poured into another test tube. The obtained centrifugate in a volume of 10 mm 3 is chromatographed and the analyzed compounds are quantified in the prepared sample according to the calibration schedule.
Недостатком указанного известного способа является то, что используются трудоемкие способы подготовки образцов крови к химическому анализу, требующие очистки и концентрирования, а также много операций в подготовке биопроб к химическому анализу.The disadvantage of this known method is that it uses laborious methods of preparing blood samples for chemical analysis, requiring purification and concentration, as well as many operations in preparing a bioassay for chemical analysis.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа, описанный в «Методических указаниях по избирательному газохроматографическому определению хлорорганических пестицидов в биологических средах (моче, крови, жировой ткани и грудном женском молоке)», (утверждены Минздравом СССР 27 ноября 1984 г. № 3151-84). Согласно этому способу цельную кровь (1-2 мл), помещенную в пробирку на шлифе, экстрагируют со средней интенсивностью 5 мл экстрагента-гексана на аппарате для встряхивания в течение 10 мин, используя приспособление для фиксации пробирок. После разделения слоев гексановый экстракт тщательно отбирают с помощью пипетки, соединенной с грушей, и фильтруют через безводный сульфат натрия. При повышенной свертываемости крови сыворотку и сгусток экстрагируют раздельно. Сгусток отделяют от сыворотки, декантируя последнюю в пробирку на шлифе, затем растирают в фарфоровой ступке с избыточным количеством безводного сульфата натрия (до сыпучего состояния). Гомогенат переносят в колбу на шлифе и заливают 1,5-кратным по объему количеством гексана. Фарфоровую ступку дважды споласкивают гексаном (по 2 мл), который присоединяют к содержимому колбы.Closest to the proposed invention in technical essence is a method for the quantitative determination of hexachlorobenzene in the blood by gas chromatographic analysis described in the "Guidelines for the selective gas chromatographic determination of organochlorine pesticides in biological media (urine, blood, adipose tissue and breast milk)", (approved by the Ministry of Health USSR November 27, 1984 No. 3151-84). According to this method, whole blood (1-2 ml), placed in a test tube on a thin section, is extracted with an average intensity of 5 ml of hexane extractant on a shaker for 10 minutes using a tube fixation device. After separation of the layers, the hexane extract was carefully taken with a pipette connected to a pear and filtered through anhydrous sodium sulfate. With increased blood coagulability, the serum and clot are extracted separately. The clot is separated from the serum by decanting the latter into a test tube on a thin section, then triturated in a porcelain mortar with an excess of anhydrous sodium sulfate (to a friable state). The homogenate is transferred to a flask on a thin section and poured with 1.5 times the amount of hexane. The porcelain mortar is rinsed twice with hexane (2 ml each), which is attached to the contents of the flask.
Экстракцию проводят путем настаивания при периодическом перемешивании в течение 15-20 мин. Растворитель декантируют в колбу на шлифе вместимостью 100 мл, дополнительно фильтруя через слой безводного сульфата натрия. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют. Содержимое колбы дополнительно промывают два раза гексаном (по 3-5 мл), присоединяя последний к основному экстракту. С сывороткой поступают так же, как с цельной кровью. Экстракты из сгустка и сыворотки крови объединяют.The extraction is carried out by insisting with periodic stirring for 15-20 minutes The solvent is decanted into a flask on a thin section with a capacity of 100 ml, additionally filtering through a layer of anhydrous sodium sulfate. The extraction is repeated, the extracts are combined. The contents of the flask are additionally washed twice with hexane (3-5 ml each), attaching the latter to the main extract. Serum is treated in the same way as with whole blood. Extracts from a clot and blood serum are combined.
Затем производят очистку экстрактов. Объединенные экстракты очищают в плоскодонных колбах на шлифе путем 5-7-минутного встряхивания с 5-10 мл насыщенного раствора безводного сульфата натрия в концентрированной серной кислоте. Экстракт после отстаивания осторожно декантируют в другую колбу. Содержимое колбы с кислотой после первичной очистки споласкивают 1-2 мл гексана, который присоединяют к основному экстракту. Очистку повторяют несколько раз до тех пор, пока слой кислоты после перемешивания не станет бесцветным.Then the extracts are purified. The combined extracts are purified in flat-bottomed flasks on a thin section by shaking for 5-7 minutes with 5-10 ml of a saturated solution of anhydrous sodium sulfate in concentrated sulfuric acid. After settling, the extract is carefully decanted into another flask. After the initial purification, the contents of the acid flask are rinsed with 1-2 ml of hexane, which is attached to the main extract. The purification is repeated several times until the acid layer, after mixing, becomes colorless.
Очищенный экстракт переносят в делительную воронку, приливают 2-5 мл 0,5 н. раствора бикарбоната натрия, затем встряхивают 1-2 мин, водный раствор отбрасывают и далее экстракт промывают дистиллированной водой (2-3 раза по 10-15 мл) до нейтральной реакции промывных вод. Конечный экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия в колбу для отгонки растворителя.The purified extract is transferred to a separatory funnel, 2-5 ml of 0.5 N are added. sodium bicarbonate solution, then shake for 1-2 minutes, the aqueous solution is discarded and then the extract is washed with distilled water (2-3 times 10-15 ml) until the washings are neutral. The final extract was filtered through anhydrous sodium sulfate into a flask to distill off the solvent.
Растворитель упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани 35-40°С под вакуумом до небольшого объема (5-7 мл), затем в токе азота особой чистоты до объема 0,5-1,0 мл и анализируют ГЖХ.The solvent is evaporated on a rotary evaporator at a water bath temperature of 35-40 ° C under vacuum to a small volume (5-7 ml), then in a stream of high purity nitrogen to a volume of 0.5-1.0 ml and analyzed by GLC.
Хроматографирование. Газохроматографический анализ проводят на колонке длиной 1 м с 5% SE-30 на хроматоне N-AW-HMDS (0,12-0,16 мм). Гексановый экстракт (5 мкл) анализируют с ДЭЗ (детектор электронного захвата) на колонке 1 м с 5% SE-30 с использованием стандартной смеси хлорорганических препаратов.Chromatography Gas chromatographic analysis was carried out on a 1 m column with 5% SE-30 on an N-AW-HMDS chromaton (0.12-0.16 mm). Hexane extract (5 μl) was analyzed with a DEZ (electron capture detector) on a 1 m column with 5% SE-30 using a standard mixture of organochlorine preparations.
В указанном известном способе процент выделения ГХБ из крови составляет 79,06%; предел определения 0,5 мкг/л; стандартное отклонение ±17,66%; доверительный интервал ±21,92%.In the specified known method, the percentage of HCB from the blood is 79.06%; limit of determination of 0.5 μg / l; standard deviation ± 17.66%; confidence interval ± 21.92%.
Недостатками этого известного способа являются:The disadvantages of this known method are:
- невысокая полнота извлечения гексахлорбензола из крови 79,06% при нижнем пределе определения всего 0,0005 мкг/мл;- low completeness of extraction of hexachlorobenzene from the blood 79.06% with a lower limit of determination of only 0.0005 μg / ml;
- анализ выполняется на набивной колонке длиной всего 1 м. На набивных колонках возможно наложение химических соединений (в крови возможно присутствие одновременно и других хлорорганических соединений - хлороформ, тетрахлорметан, хлорбензол и др.), близких по физико-химическим свойствам, что приводит к завышению результата измерений.- the analysis is performed on a packed column with a length of only 1 m. On packed columns, chemical compounds can be applied (other organochlorine compounds, such as chloroform, carbon tetrachloride, chlorobenzene, etc., similar in physicochemical properties are possible at the same time in the blood, which leads to overstatement measurement result.
Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в повышении степени извлечения ГХБ из пробы крови, а также в повышении точности и селективности.The technical result achieved by the proposed method is to increase the degree of extraction of HCB from a blood sample, as well as to increase the accuracy and selectivity.
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения гексахлорбензола в крови методом газохроматографического анализа, включающим отбор пробы крови, экстракцию экстрагентом из указанной пробы гексахлорбензола и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика, при этом новым является то, что после отбора пробы крови ее подкисляют до рН 6-7 водным раствором серной кислоты, в качестве экстрагента используют толуол, взятый в объемном соотношении к пробе крови как 0,6 к 1,0 соответственно, а экстракцию ведут дважды последовательно по 5 мин каждую, затем полученный экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 7000 об/мин, далее определяют количество гексахлорбензола методом газохроматографического анализа с использованием детектора электронного захвата на капиллярной колонке НР-1 35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм при температурном режиме: капиллярная колонка - 70°С-230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя - азота - 20 см3/мин.The specified technical result is achieved by the proposed method for the quantitative determination of hexachlorobenzene in the blood by gas chromatographic analysis, including blood sampling, extraction of hexachlorobenzene with an extractant from the specified sample and determination of its quantity by gas chromatographic analysis using a calibration graph, while the new is that after blood sampling acidified to pH 6-7 with an aqueous solution of sulfuric acid, toluene taken in bulk is used as an extractant The ratio to the blood sample is 0.6 to 1.0, respectively, and the extraction is carried out twice successively for 5 minutes each, then the obtained extract is centrifuged for 15 minutes at 7000 rpm, then the amount of hexachlorobenzene is determined by gas chromatographic analysis using an electron capture detector on the capillary column НР-1 35 m * 0.32 mm * 0.25 μm at temperature conditions: capillary column - 70 ° С-230 ° С; evaporator - 270 ° C; detector - 270 ° C; the carrier gas — nitrogen consumption is 20 cm 3 / min.
В качестве раствора серной кислоты используют 1%-ный водный раствор.As a solution of sulfuric acid using a 1% aqueous solution.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего.The technical result is achieved due to the following.
Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых и достигается высокая чувствительность определения гексахлорбензола в пробе крови, а также упрощается способ.It was found experimentally that the specified technical result is provided precisely by the totality of the proposed features, the implementation of which ensures the high sensitivity of the determination of hexachlorobenzene in the blood sample, and also simplifies the method.
Высокая эффективность предлагаемого способа определения гексахлорбензола в крови достигнута путем подбора оптимальных условий газохроматографического анализа: капиллярной колонки серии НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм длиной 35 м и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 μm при оптимальном температурном режиме: колонка - 70 - скорость нагревания 25°С/мин - 180°С - скорость нагревания 10°С/мин - 210°С - скорость нагревания 5°С/мин - 230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя (азот) - 20 см3/мин, и высокоспецифического детектора электронного захвата (ДЭЗ) к хлорорганическим соединениям.The high efficiency of the proposed method for the determination of hexachlorobenzene in blood was achieved by selecting the optimal conditions for gas chromatographic analysis: a capillary column of the НР-1-35 m * 0.32 mm * 0.25 μm series with a length of 35 m and a film thickness of the stationary phase of 0.25 μm at the optimum temperature mode: column - 70 - heating rate 25 ° C / min - 180 ° C - heating rate 10 ° C / min - 210 ° C - heating rate 5 ° C / min - 230 ° C; evaporator - 270 ° C; detector - 270 ° C; the carrier gas (nitrogen) consumption is 20 cm 3 / min, and a highly specific electron capture detector (DEZ) for organochlorine compounds.
Кроме того, заявляемый способ позволяет с высокой точностью и селективностью определять исследуемое соединение ХГБ на уровне 0,00015-0,005 мг/дм3 при погрешности определения не более 16%. Предел обнаружения (LOD) гексахлорбензола в крови составил Cmin=0,000007 мкг/см3. Предел количественного определения (LOQ) гексахлорбензола составил Cmin=0,000024 мкг/см3. Полнота извлечения гексахлорбензола из крови составляет 99,9%. Исследования проводятся на капиллярной колонке НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм длиной 35 м, которая обладает высокой разрешающей способностью и оптимально делит мешающие соединения, которые могут находиться в матрице крови.In addition, the inventive method allows with high accuracy and selectivity to determine the test compound CGB at the level of 0.00015-0.005 mg / DM 3 with an error of determination of not more than 16%. The detection limit (LOD) of hexachlorobenzene in the blood was C min = 0.000007 μg / cm 3 . The limit of quantitative determination (LOQ) of hexachlorobenzene was C min = 0.000024 μg / cm 3 . The completeness of the extraction of hexachlorobenzene from the blood is 99.9%. Studies are conducted on a capillary column HP-1-35 m * 0.32 mm * 0.25 μm, 35 m long, which has a high resolution and optimally divides interfering compounds that may be in the blood matrix.
При реализации предлагаемого способа при подготовке пробы крови к газохроматографическому анализу проводят экстракционное концентрирование ГХБ из пробы крови методом жидкостной экстракции органическим экстрагентом в слабокислой среде. Эта стадия предназначена для перевода ГХБ в более удобную для последующего газохроматографического анализа органическую фазу, для повышения его концентрации в экстракте и для отделения мешающих компонентов из биологической матрицы.When implementing the proposed method in the preparation of a blood sample for gas chromatographic analysis, extraction is carried out of HCB from a blood sample by liquid extraction with an organic extractant in a slightly acidic medium. This stage is designed to transfer HCB into an organic phase more convenient for subsequent gas chromatographic analysis, to increase its concentration in the extract and to separate interfering components from the biological matrix.
Таким образом, пробоподготовка в предлагаемом способе является значительно более простой, чем в прототипе, как по времени, так и по трудоемкости.Thus, the sample preparation in the proposed method is much simpler than in the prototype, both in time and in complexity.
В современном химико-токсикологическом анализе одним из перспективных методов разделения и концентрирования органических соединений является гетерогенная жидкостная экстракция. Задача экстракции состоит в том, чтобы полно и селективно перевести аналит из биологической среды в органическую фазу.In modern chemical-toxicological analysis, one of the promising methods for the separation and concentration of organic compounds is heterogeneous liquid extraction. The task of extraction is to fully and selectively transfer the analyte from the biological medium to the organic phase.
На экстракцию химических веществ органическими растворителями оказывают влияние различные факторы: природа экстрагируемого вещества, экстрагента, число экстракций, объем экстрагента, рН среды, скорость взбалтывания (время достижения равновесия).Various factors influence the extraction of chemicals with organic solvents: the nature of the extractable substance, the extractant, the number of extracts, the volume of extractant, the pH of the medium, the agitation rate (time to reach equilibrium).
Для обеспечения полноты извлечения гексахлорбензола из биосреды (кровь) были подобраны условия экстракции: выбор органического растворителя, объем экстрагента, рН среды, число экстракций и время достижения равновесия.To ensure the completeness of the extraction of hexachlorobenzene from the biological medium (blood), extraction conditions were selected: the choice of an organic solvent, the volume of extractant, the pH of the medium, the number of extractions and the time to reach equilibrium.
В ходе экспериментальных работ по выбору экстрагента и для эффективного извлечения гексахлорбензола из крови применена жидкостная экстракция различными органическими растворителями, изучены экстракционные характеристики. Данные приведены в таблице 1.In the course of experimental work on the choice of extractant and for the effective extraction of hexachlorobenzene from the blood, liquid extraction with various organic solvents was applied, and extraction characteristics were studied. The data are shown in table 1.
Результаты исследований полноты экстракции гексахлорбензола из крови различными объемами растворителя (толуол) приведены в таблице 2.The results of studies of the completeness of extraction of hexachlorobenzene from the blood with various volumes of solvent (toluene) are shown in table 2.
В процессе исследований было установлено время контакта фаз для достижения равновесия в экстракционной системе, обеспечивающее количественный выход гексахлорбензола (таблица 3).In the process of research, the phase contact time was established to achieve equilibrium in the extraction system, providing a quantitative yield of hexachlorobenzene (table 3).
Известно, что чем больше объем органической фазы экстрагента, тем больше степень извлечения экстрагируемого вещества. Однако увеличение числа экстракций сильнее влияет на степень извлечения экстрагируемого вещества, чем увеличение объема экстрагента, поэтому одну и ту же степень извлечения можно получить, уменьшая объем экстрагента, но увеличивая число экстракций. В исследованиях использовали объем экстрагента толуола объемом 3 см3 и применяли 2 последовательные экстракции по 5 мин. Объем пробы крови при этом брали 5 см3. Таким образом, объемное соотношение пробы крови и толуола составляло 1:0,6. Было установлено, что это является оптимальным соотношением, при котором и будет достигнута высокая точность и селективность предлагаемого способа.It is known that the larger the volume of the organic phase of the extractant, the greater the degree of extraction of the extracted substance. However, an increase in the number of extracts has a stronger effect on the degree of extraction of the extractable substance than an increase in the volume of extractant; therefore, the same degree of extraction can be obtained by reducing the volume of extractant, but increasing the number of extracts. The studies used a volume of toluene extractant with a volume of 3 cm 3 and used 2 sequential extractions of 5 minutes each. The volume of the blood sample was taken 5 cm 3 . Thus, the volume ratio of the blood sample and toluene was 1: 0.6. It was found that this is the optimal ratio at which high accuracy and selectivity of the proposed method will be achieved.
В процессе экспериментальных исследований по установлению оптимального значения рН биосреды, при котором наблюдается эффективное извлечение гексахлорбензола из крови и наиболее полное и быстрое выпадение белка в осадок, применяли различные минеральные кислоты: серная, соляная, и щелочи: гидрооксид калия. Кислоты и щелочи при взаимодействии с белком вызывают его денатурацию. Это связано с тем, что кислоты удаляют гидратную оболочку и нейтрализуют заряд молекулы. Результаты исследований представлены в таблице 4.In the process of experimental studies to establish the optimal pH of the biological medium, at which the effective extraction of hexachlorobenzene from the blood and the most complete and fast protein precipitation is observed, various mineral acids were used: sulfuric, hydrochloric, and alkalis: potassium hydroxide. Acids and alkalis, when interacting with a protein, cause its denaturation. This is due to the fact that acids remove the hydration shell and neutralize the charge of the molecule. The research results are presented in table 4.
Для осаждения белков из крови применяли центрифугирование образца при различных скоростях и оптимально подобранных условиях экстракции (таблица 5).To precipitate proteins from the blood, centrifugation of the sample was used at various speeds and optimally selected extraction conditions (table 5).
Оптимальные условия процесса экстракции гексахлорбензола из крови предлагаемым способом представлены в таблице 6.The optimal conditions for the extraction of hexachlorobenzene from the blood of the proposed method are presented in table 6.
Максимальная полнота извлечения гексахлорбензола из крови - 99,9 %, достигнута при подобранных оптимальных условиях подготовки пробы для газохроматографического анализа путем подкисления пробы крови до рН 6-7 водным раствором серной кислоты, концентрирования из крови (время контакта 5 мин) органическим растворителем-экстрагентом, (толуол) объем 3 см3 в две стадии, денатурации белка центрифугированием биосреды при 7000 об/мин в течение 15 мин при рН 6-7, и последующем определении на газовом хроматографе с детектором электронного захвата (ДЭЗ).The maximum completeness of the extraction of hexachlorobenzene from the blood is 99.9%, achieved under optimal conditions for sample preparation for gas chromatographic analysis by acidification of the blood sample to pH 6-7 with an aqueous solution of sulfuric acid, concentration from the blood (contact time 5 min) with an organic solvent-extractant, (toluene) volume of 3 cm 3 in two stages, protein denaturation by centrifugation of the biomedia at 7000 rpm for 15 min at pH 6-7, and subsequent determination on a gas chromatograph with an electron capture detector (DEZ).
Благодаря тому, что образующийся при пробоподготовке экстракт анализируют методом газовой хроматографии с детектором электронного захвата, обеспечивает максимально возможное по чувствительности газохроматографическое определение. Определение количества ГХБ в крови методом газохроматографического анализа проводят с использованием градуировочного графика. Для его построения выполняют следующие действия.Due to the fact that the extract formed during sample preparation is analyzed by gas chromatography with an electron capture detector, it provides the maximum possible gas chromatographic determination of sensitivity. The determination of the amount of HCB in the blood by gas chromatographic analysis is carried out using a calibration graph. To build it perform the following steps.
Готовят исходный раствор. Для этого в мерную пробирку объемом 10 см3 дозатором добавляют бидистиллированную воду в объеме 4 см3, вводят микрошприцем 2 мм3 ГСО (государственный стандартный образец) гексахлорбензола С=100 мкг/см3. Концентрация исходного раствора будет 0,05 мкг/см3. Срок хранения раствора 12 часов.Prepare the stock solution. For this, bidistilled water in a volume of 4 cm 3 is added to a measuring tube with a volume of 10 cm 3 , a 2 mm 3 GSO (state standard sample) hexachlorobenzene C = 100 μg / cm 3 is introduced using a microsyringe. The concentration of the initial solution will be 0.05 μg / cm 3 . The shelf life of the solution is 12 hours.
Далее готовят градуировочные растворы. Градуировочные растворы гексахлорбензола готовят в мерных пробирках объемом 5 см3. Для этого в каждую пробирку дозатором вносят дистиллированную воду и исходный раствор в соответствии с таблицей 7 и тщательно перемешивают.Next, prepare calibration solutions. Hexachlorobenzene calibration solutions are prepared in 5 cm 3 volumetric tubes. For this, distilled water and the initial solution are added to each tube with a dispenser in accordance with table 7 and mixed thoroughly.
Построение градуировочной характеристики. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц⋅с) от массовой концентрации гексахлорбензола (мг/дм3) в стандартном растворе, устанавливают по 6 сериям измерений по 5 концентрациям вещества в каждой серии для каждого диапазона.Construction of calibration characteristics. A calibration characteristic expressing the dependence of the chromatographic peak area (Hz⋅s) on the mass concentration of hexachlorobenzene (mg / dm 3 ) in a standard solution is established for 6 series of measurements for 5 concentrations of the substance in each series for each range.
В приготовленный градуировочный раствор объемом 5 см3 дозатором добавляют органический растворитель (толуол) объемом 3 см3 и выполняют дважды жидкостную экстракцию (время контакта фаз 5 мин). После экстракции раствор центрифугируют при 7000 об/мин в течение 15 мин. Затем 1 мм3 верхнего слоя органического растворителя (толуол) вкалывают в хроматографическую колонку через испаритель. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков компонента и по средним результатам из 6 серий строят градуировочный график.An organic solvent (toluene) of 3 cm 3 is added to the prepared calibration solution with a volume of 5 cm 3 and a liquid extraction is performed twice (phase contact time 5 min). After extraction, the solution is centrifuged at 7000 rpm for 15 minutes. Then 1 mm 3 of the upper layer of organic solvent (toluene) is injected into the chromatographic column through an evaporator. The procedure is repeated similarly for each calibration solution. On the obtained chromatogram, the peak areas of the component are determined and, based on average results from 6 series, a calibration graph is built.
Пример реализации предлагаемого способаAn example implementation of the proposed method
Пробы крови объемом 5 см3 помещают в мерную пробирку объемом 10 см3, подкисляют до рН 6-7 водным раствором 1%-ной серной кислоты. Далее дозатором добавляют органический растворитель (толуол) объемом 3 см3 и выполняют жидкостную экстракцию (время контакта фаз 5 мин дважды). Для денатурации белка выполняют центрифугирование биосреды при 7000 об/мин в течение 15 мин при рН 6-7. Затем 1 мм3 верхнего слоя органического растворителя (толуол) вкалывают в хроматографическую колонку через испаритель. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови.Blood samples with a volume of 5 cm 3 are placed in a measuring tube with a volume of 10 cm 3 , acidified to pH 6-7 with an aqueous solution of 1% sulfuric acid. Next, an organic solvent (toluene) of 3 cm 3 was added with a dispenser and liquid extraction was performed (phase contact time 5 min twice). For protein denaturation, the biomedia is centrifuged at 7000 rpm for 15 min at a pH of 6-7. Then 1 mm 3 of the upper layer of organic solvent (toluene) is injected into the chromatographic column through an evaporator. The procedure is repeated similarly for the second sample and two parallel blood samples are measured.
В ходе лабораторных испытаний также были определены оптимальные условия газохроматографического определения гексахлорбензола с применением стандартных растворов.In laboratory tests, the optimal conditions for the gas chromatographic determination of hexachlorobenzene using standard solutions were also determined.
Были изучены условия определения ГХБ на капиллярных колонках с различными характеристиками неподвижных жидких фаз:The conditions for determining HCB on capillary columns with various characteristics of stationary liquid phases were studied:
- DB-624-25 m⋅0,32 ⋅ mm ⋅ 5,0 μm (полярная цианопропильная фаза; температурный предел от 60°С до 260/300°С);- DB-624-25 m⋅0.32 ⋅ mm ⋅ 5.0 μm (polar cyanopropyl phase; temperature range from 60 ° C to 260/300 ° C);
- HP-FFAP-50m⋅0,32mm⋅0,5μm (полярная фаза с покрытием нитротерефталевой кислотой; температурный предел от 60°С до 240/250°С);- HP-FFAP-50m ⋅ 0.32mm⋅0.5μm (polar phase coated with nitroterephthalic acid; temperature range from 60 ° C to 240/250 ° C);
- НР-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм (неполярная фаза с покрытием 100% диметил- (поли)силоксан; температурный предел от 60°С до 325/350°С).- НР-1-35 m * 0.32 mm * 0.25 μm (non-polar phase coated with 100% dimethyl- (poly) siloxane; temperature range from 60 ° C to 325/350 ° C).
Опыты показали, что полнота разделения гексахлорбензола с другими углеводородами достигнута на капиллярной колонке HP-1-35 м * 0,32 мм * 0,25 мкм. При этом установленные температурные режимы для нее представлены в таблице 8.The experiments showed that the complete separation of hexachlorobenzene with other hydrocarbons was achieved on a capillary column HP-1-35 m * 0.32 mm * 0.25 μm. Moreover, the established temperature conditions for it are presented in table 8.
Качественное разделение гексахлорбензола с другими соединениями было достигнуто в режиме 2 (таблица 8) при температурном режиме: колонка - 70°С-скорость нагревания 25°С/мин - 180°С - скорость нагревания 10°С/мин - 210°С - скорость нагревания 5°С/мин - 230°С; испаритель - 270°С; детектор - 270°С; расход газа-носителя (азот) - 20 см3/мин.Qualitative separation of hexachlorobenzene with other compounds was achieved in mode 2 (table 8) at temperature conditions: column - 70 ° C - heating rate 25 ° C / min - 180 ° C - heating rate 10 ° C / min - 210 ° C - speed heating 5 ° C / min - 230 ° C; evaporator - 270 ° C; detector - 270 ° C; carrier gas consumption (nitrogen) - 20 cm 3 / min.
Для обнаружения гексахлорбензола в биологической среде (кровь) использовали высокоспецифичный электронно-захватный детектор (ДЭЗ).To detect hexachlorobenzene in a biological medium (blood), a highly specific electron-capture detector (DEZ) was used.
Характеристики газохроматографического анализа гексахлорбензола представлены в таблице 9.Characteristics of gas chromatographic analysis of hexachlorobenzene are presented in table 9.
Предлагаемый способ устанавливает порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовых концентраций гексахлорбензола в пробах крови в диапазоне концентраций от 0,00015 до 0,005 мкг/мл. В заявляемом способе полнота извлечения ГХБ составляет 99,9%; предел определения 0,00015 мкг/мл; стандартное отклонение не более 10%; погрешность 16% и анализ выполняется на капиллярной колонке длиной 35 м.The proposed method establishes the application of the method of capillary gas chromatography for measuring mass concentrations of hexachlorobenzene in blood samples in the concentration range from 0.00015 to 0.005 μg / ml. In the inventive method, the completeness of the extraction of HCB is 99.9%; detection limit 0.00015 μg / ml; standard deviation no more than 10%; the error is 16% and the analysis is performed on a capillary column 35 m long.
В известном же способе по прототипу процент выделения ГХБ из крови составляет 79,06%; предел определения 0,0005 мкг/мл; стандартное отклонение ±17,66%; доверительный интервал ±21,92%,In the known method according to the prototype, the percentage of HCB from the blood is 79.06%; detection limit 0.0005 μg / ml; standard deviation ± 17.66%; confidence interval ± 21.92%,
При этом в заявляемом способе определению не мешают хлороформ, тетрахлорметан и другие хлорбензолы в количествах, не превышающих установленную величину.Moreover, in the claimed method, chloroform, carbon tetrachloride and other chlorobenzenes do not interfere with the determination in amounts not exceeding the established value.
Длительность анализа, включая экстракцию биопробы, 1 час.The duration of the analysis, including the extraction of biological samples, 1 hour.
Предлагаемый способ был опробован при оценке воздействия биомаркера экспозиции (гексахлорбензола) на здоровье детей Пермского края.The proposed method was tested in assessing the impact of a biomarker of exposure (hexachlorobenzene) on the health of children in the Perm Territory.
Для сравнительной оценки уровней ГХБ в крови были выбраны две группы детей: группа наблюдения (n=25), дети которой проживали на территории экологического неблагополучия, и группа сравнения (n=25), дети которой были практически здоровы и проживали вне зоны антропогенного влияния. Разработанная методика позволила определить содержание гексахлорбензола в крови обследуемых детей. Результаты анализа представлены в таблице 10.For a comparative assessment of HCB levels in the blood, two groups of children were selected: the observation group (n = 25), whose children lived in the territory of ecological distress, and the comparison group (n = 25), whose children were practically healthy and lived outside the zone of anthropogenic influence. The developed technique allowed us to determine the content of hexachlorobenzene in the blood of the examined children. The results of the analysis are presented in table 10.
В процессе исследований было установлено, что у обследуемых детей группы наблюдения, проживающих в зоне экспозиции, количество проб крови с содержанием гексахлорбензола составило 50% при средней концентрации 0,00003±0,00001 мкг/см3. Установленное количество биопроб с повышенным содержанием гексахлорбензола в крови детей этой группы наблюдения составило 30%. Установлены минимальная и максимальная концентрации гексахлорбензола в крови таких детей Cmin=0,00003 и Cmax=0,00007 мкг/см3 соответственно.In the process of research, it was found that in the examined children of the observation group living in the exposure zone, the number of blood samples containing hexachlorobenzene was 50% at an average concentration of 0.00003 ± 0.00001 μg / cm 3 . The established amount of bioassay with a high content of hexachlorobenzene in the blood of children of this observation group was 30%. The minimum and maximum concentrations of hexachlorobenzene in the blood of such children were established C min = 0.00003 and C max = 0.00007 μg / cm 3, respectively.
Проведенные исследования показали, что средние концентрации гексахлорбензола в образцах крови детей, проживающих в зоне экспозиции, достоверно выше (p≤0,0-0,05), чем у детей группы сравнения в 3 раза.Studies have shown that the average concentration of hexachlorobenzene in blood samples of children living in the exposure zone is significantly higher (p≤0.0-0.05) than 3 times in children in the comparison group.
Таким образом, разработанный способ определения ГХБ позволяет адекватно диагностировать химическую нагрузку в крови детей, что является доказательным звеном воздействия химических факторов окружающей среды на здоровье.Thus, the developed method for the determination of HCB makes it possible to adequately diagnose the chemical load in the blood of children, which is an evidence link in the health effects of chemical environmental factors.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016117510A RU2613306C1 (en) | 2016-05-04 | 2016-05-04 | Method of quantitative determination of hexachlorobenzene in blood by method of gas chromatographic analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016117510A RU2613306C1 (en) | 2016-05-04 | 2016-05-04 | Method of quantitative determination of hexachlorobenzene in blood by method of gas chromatographic analysis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2613306C1 true RU2613306C1 (en) | 2017-03-15 |
Family
ID=58458204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016117510A RU2613306C1 (en) | 2016-05-04 | 2016-05-04 | Method of quantitative determination of hexachlorobenzene in blood by method of gas chromatographic analysis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2613306C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114002349A (en) * | 2021-10-27 | 2022-02-01 | 江苏新河农用化工有限公司 | Gas chromatography-mass spectrometry detection method for hexachlorobenzene and decachlorobiphenyl in chlorothalonil |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU27A1 (en) * | 1917-01-17 | 1924-09-15 | А.К. Кауфман | The device with two prisms |
| JP2001124748A (en) * | 1999-10-27 | 2001-05-11 | Mitsubishi Electric Corp | Method and apparatus for high-speed analysis of chlorobenzene |
| RU2427832C1 (en) * | 2010-02-12 | 2011-08-27 | Владимир Фёдорович Воржев | Gas chromatography method of determining hexachlorobenzene |
-
2016
- 2016-05-04 RU RU2016117510A patent/RU2613306C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU27A1 (en) * | 1917-01-17 | 1924-09-15 | А.К. Кауфман | The device with two prisms |
| JP2001124748A (en) * | 1999-10-27 | 2001-05-11 | Mitsubishi Electric Corp | Method and apparatus for high-speed analysis of chlorobenzene |
| RU2427832C1 (en) * | 2010-02-12 | 2011-08-27 | Владимир Фёдорович Воржев | Gas chromatography method of determining hexachlorobenzene |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| N 3151-84. * |
| Методические указания по избирательному газохроматографическому определению хлороорганических пестицидов в биологических средах (моче, крови, жировой ткани и грудном женском молоке). Утверждены Минздравом * |
| Методические указания по избирательному газохроматографическому определению хлороорганических пестицидов в биологических средах (моче, крови, жировой ткани и грудном женском молоке). Утверждены Минздравом СССР 27.11.1984 * |
| РД 52.24.412-95 Методические указания. Методика выполнения измерений массовой концентрации гексахлорбензола, альфа-, бета-, и гамма-ГХЦГ, дикофола, дигидрогептанхлора, 4, 4'-ДДТ, 4, 4'-ДДЕ, 4, 4'-ДДД, трифлуралина в водах газохроматографическим методом. Введено в действие 01.07.1995 (см. разд. 6-8). * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114002349A (en) * | 2021-10-27 | 2022-02-01 | 江苏新河农用化工有限公司 | Gas chromatography-mass spectrometry detection method for hexachlorobenzene and decachlorobiphenyl in chlorothalonil |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shen et al. | Screening, determination and confirmation of chloramphenicol in seafood, meat and honey using ELISA, HPLC–UVD, GC–ECD, GC–MS–EI–SIM and GCMS–NCI–SIM methods | |
| Buszewski et al. | Analytical and unconventional methods of cancer detection using odor | |
| Moeder et al. | At-line microextraction by packed sorbent-gas chromatography–mass spectrometry for the determination of UV filter and polycyclic musk compounds in water samples | |
| Kondo et al. | Determination of five phthalate monoesters in human urine using gas chromatography-mass spectrometry | |
| Manousi et al. | Green sample preparation of alternative biosamples in forensic toxicology | |
| CN108152430A (en) | Oophoroma marker detection kit and detection method based on PRM detections | |
| RU2613306C1 (en) | Method of quantitative determination of hexachlorobenzene in blood by method of gas chromatographic analysis | |
| RU2713661C1 (en) | Method of sample preparation for gas-chromatographic determination of organochlorine compounds in biomaterial | |
| RU2456597C1 (en) | Method of detecting 2-methoxy-4-allylhyroxybenzene in biological material | |
| Logothetis | A study of free amino acids in the human cerebrospinal fluid | |
| US3275416A (en) | Process and device for separating barbituric acid derivatives from biological samples, and for analyzing same | |
| RU2696010C1 (en) | Method for bacitracin determination in meat and meat products using high-performance liquid chromatography | |
| RU2687887C1 (en) | Method for determining 1-hydroxypyren in urine by chromatography-mass-spectrometric analysis | |
| RU2806370C1 (en) | Method of simultaneous quantitative determination of persistent organochlorine pesticides in animal hair using gas chromatography-mass spectrometry | |
| RU2466406C1 (en) | Method of quantitative analysis of urine benzapyrene by liquid chromatography | |
| RU2226692C1 (en) | Method for quantitative detecting urinary chlorobenzene | |
| RU2786509C1 (en) | Method for determination of mass concentrations of phenol and pyrocatechol in blood by high performance liquid chromatography | |
| EP3265816B1 (en) | Detection method and kit | |
| RU2416798C1 (en) | Method of blood dichlorobromomethane measurement | |
| Rosenfeld et al. | Development of an impregnated reagent and automation of solid-phase analytical derivatization for carbonyls: Proof of principle | |
| Tsygankov et al. | Methods to Determine Persistent Organic Pollutants in Various Components of Ecosystems in the Far Eastern Region | |
| Mottaleb et al. | Formation of nitro musk adducts of rainbow trout hemoglobin for potential use as biomarkers of exposure | |
| RU2151395C1 (en) | Method for quantitative determination of chloroform and 1,2- dichloroethane in urine | |
| RU2430372C1 (en) | Method of determining 2,4-dinitrophenol and 2-amino-4-nitrophenol when both are present in biological fluids | |
| SU877427A1 (en) | Method of quantitative determination of 2-isoproxyphenil-h-methylcarbamate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180505 |