RU2612266C1

RU2612266C1 - Method for primary pharmacological estimation of specific anti-hypoxic activity of medication

Info

Publication number: RU2612266C1
Application number: RU2015155506A
Authority: RU
Inventors: Николай Федорович Фаращук; Наталья Николаевна Блажко; Юлия Петровна Корякина; Анна Петровна Гераськина
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2015-12-23
Publication date: 2017-03-03

Abstract

FIELD: medicine, pharmaceutics.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely to pharmacology, and can be used for primary pharmacological estimation of anti-hypoxic activity of newly synthesised substances. Method consists in the fact that sexually mature earthworms of equal size are subjected to hypoxia with hypercapnia in hermetic space. Hermetic space is filled with boiled tap water of room temperature for animals of control group and solution of medication to be analysed, prepared with application of the same water, for animals of experimental group. Not less than 40 individuals are used in each group. Earthworms are kept at temperature 24°C for 20 hours. Conclusion about anti-hypoxic activity of medication is made basing on the number of individuals that survived in both groups.

EFFECT: method ensures objective primary selection of prospective anti-hypoxic medications, is simple and economical in application.

1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для фармакологической оценки антигипоксической активности новых препаратов среди вновь синтезируемых веществ.The invention relates to medicine, namely to pharmacology, and can be used for pharmacological evaluation of the antihypoxic activity of new drugs among newly synthesized substances.

Известны способы первичной фармакологической оценки антигипоксической активности на моделях гипоксической гипоксии. В основе этих методов лежит снижение концентрации кислорода в гермообъеме. Снижение концентрации кислорода достигается различными путями, при этом активность антигипоксического действия определяется по времени жизни животных в экспериментальных условиях или по количеству выживших животных.Known methods for the primary pharmacological evaluation of antihypoxic activity in hypoxic hypoxia models. The basis of these methods is a decrease in the concentration of oxygen in the pressurized volume. The decrease in oxygen concentration is achieved in various ways, while the activity of antihypoxic action is determined by the life time of animals in experimental conditions or by the number of surviving animals.

Известный способ первичной фармакологической оценки специфической антигипоксической активности на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме заключается в том, что животных контрольной и опытной групп (обычно мышей) по одиночке помещают в стеклянные банки одинакового объема, которые герметично закрывают. По мере потребления кислорода животными его концентрация в сосуде снижается, что приводит к их гибели. Сравнивая время выживания животных в контрольной и опытной группах, судят об антигипоксической активности испытуемого препарата, который предварительно вводят животным экспериментальной группы. («Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств» ФК МЗ СССР под редакцией Л.Д. Лукьяновой. – М., 1990 - С. 10). Основным недостатком метода является его экономическая затратность и высокая трудоемкость, а также нарушение этических норм работы с позвоночными животными. В процессе поиска и отбора эффективных антигипоксических средств необходимо проводить многочисленные эксперименты, которые требуют огромного количества животных. Введение лекарственного вещества или контрольного раствора каждому животному внутрь или внутрибрюшинно требуют профессиональных навыков экспериментатора и затрат времени.A known method of primary pharmacological evaluation of specific antihypoxic activity in a model of hypoxia with hypercapnia in a hermetic volume is that animals of the control and experimental groups (usually mice) are individually placed in glass jars of the same volume, which are hermetically sealed. As oxygen is consumed by animals, its concentration in the vessel decreases, which leads to their death. Comparing the survival time of animals in the control and experimental groups, the antihypoxic activity of the test drug, which is previously administered to the animals of the experimental group, is judged. ("Methodological recommendations for the experimental study of drugs proposed for clinical study as antihypoxic drugs" FC of the Ministry of Health of the USSR, edited by L.D. Lukyanova. - M., 1990 - S. 10). The main disadvantage of this method is its economic cost and high complexity, as well as a violation of ethical standards for working with vertebrate animals. In the process of searching and selecting effective antihypoxic drugs, it is necessary to conduct numerous experiments that require a huge number of animals. The introduction of a medicinal substance or control solution to each animal inside or intraperitoneally requires the professional skills of the experimenter and time.

Техническим результатом изобретения является упрощение и удешевление способа, а также соблюдение этических норм работы с позвоночными животными.The technical result of the invention is to simplify and reduce the cost of the method, as well as compliance with ethical standards for working with vertebrate animals.

Сущность способа первичной специфической фармакологической оценки антигипоксической активности препарата на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме состоит в том, что в качестве животных используют дождевых червей, гермообъем заполняют кипяченой водопроводной водой комнатной температуры в контрольной группе и раствором исследуемого препарата, приготовленного на такой же воде, - в опытной, и выдерживают при температуре 24°С в течение 20 часов, а об антигипоксической активности препарата судят по количеству выживших особей в контрольной и опытной группах.The essence of the method of the primary specific pharmacological evaluation of the antihypoxic activity of the drug on the hypoxia model with hypercapnia in the hermetic volume is that earthworms are used as animals, the hermetic volume is filled with boiled tap water at room temperature in the control group and a solution of the studied drug prepared on the same water - in experimental, and kept at a temperature of 24 ° C for 20 hours, and antihypoxic activity of the drug is judged by the number of surviving individuals in the control Flax and experimental groups.

Дождевые черви потребляют незначительное количество кислорода, поэтому даже небольшое количество воздуха в сосуде обеспечивает им длительное выживание. Например, объем 10 мл воздуха обеспечит выживание дождевого червя в течение 10 суток и более (Вызова Ю.Б. О влиянии напряжения кислорода на интенсивность дыхания у дождевых червей) // Журн. эвол, биохим. и физиол., 1967. Т. 3. №1. С. 74-75). Для червей неблагоприятным фактором является высыхание их покровов в воздушной среде, в то время как в водной среде в открытом сосуде они могут жить довольно долго (Roots B.J. 1956. The water relations of earthworms. II. Resistance to dessication and immersion and bahaviour when submerged and when allowed a choice of environment // J. Exp. Boil. Vol. 33. No. 1. P. 20-44).Earthworms consume a small amount of oxygen, so even a small amount of air in the vessel provides them with long-term survival. For example, a volume of 10 ml of air will ensure the survival of an earthworm for 10 days or more (Challenge Yu.B. On the effect of oxygen stress on the respiration rate in earthworms) // Zhurn. Evol, biochem. and Fiziol., 1967. T. 3. No. 1. S. 74-75). For worms, an unfavorable factor is the drying of their covers in air, while in an open vessel they can live quite a long time (Roots BJ 1956. The water relations of earthworms. II. Resistance to dessication and immersion and bahaviour when submerged and when allowed a choice of environment // J. Exp. Boil. Vol. 33. No. 1. P. 20-44).

Способ осуществляется следующим образом. Отбирают половозрелых дождевых червей вида Eisenia felida andrei (красный калифорнийский червь) одинакового размера и по одному помещают в контейнеры для забора крови без антикоагулянта объемом 5 мл. Контейнеры в контрольной группе заполняют кипяченой водопроводной водой комнатной температуры. В опытной группе контейнеры с червями заполняют раствором изучаемого вещества, приготовленного на такой же воде. Концентрацию растворов исследуемых веществ устанавливают опытным путем по методу В.Б. Прозоровского (Прозоровский В.Б., Прозоровский М.П., Демченко В.М. Экспресс метод определения средней дозы и ее ошибки // Фармакол. и токсикология. - 1978. - №4. - С. 497-502). Контейнеры закрывают пробками и помещают в термостат при температуре 24°С. Это температура является верхним пределом оптимального температурного режима жизнедеятельности этого вида червей (Dominguez J. 2004. State-of-the Art and New Perspectiveson Vermicomposting Research. CRC Press. USA. 456 p). Время содержания червей в термостате составляет 20 часов. Это время определялось опытным путем. За этот период в контрольных опытах погибало в среднем 80% особей. Таким образом, черви могли использовать только небольшое количество кислорода, содержащегося в 5 мл воды в растворенном виде, учитывая их возможность кожного дыхания. Через 20 часов контрольные и опытные контейнеры вынимают из термостата, содержимое их выливают в чашки Петри и определяют количество выживших особей по их подвижности. Оценку антигипоксической активности препарата производят путем сравнения количества выживших биологических объектов в опытной и контрольной группах.The method is as follows. Sexually mature earthworms of the species Eisenia felida andrei (California red worm) of the same size are selected and placed one by one in 5 ml blood collection containers without anticoagulant. The containers in the control group are filled with boiled tap water at room temperature. In the experimental group, containers with worms are filled with a solution of the studied substance prepared in the same water. The concentration of the solutions of the investigated substances is established empirically by the method of B. B. Prozorovsky (Prozorovsky VB, Prozorovsky MP, Demchenko VM Express method for determining the average dose and its errors // Farmakol. And toxicology. - 1978. - No. 4. - S. 497-502). The containers are closed with stoppers and placed in a thermostat at a temperature of 24 ° C. This temperature is the upper limit of the optimal temperature regime for the activity of this species of worms (Dominguez J. 2004. State-of-the Art and New Perspectiveson Vermicomposting Research. CRC Press. USA. 456 p). The time for keeping the worms in the thermostat is 20 hours. This time was determined empirically. During this period, an average of 80% of individuals died in control experiments. Thus, worms could use only a small amount of oxygen contained in 5 ml of dissolved water, given their potential for skin respiration. After 20 hours, the control and experimental containers are removed from the thermostat, their contents are poured into Petri dishes and the number of surviving individuals is determined by their mobility. The antihypoxic activity of the drug is estimated by comparing the number of surviving biological objects in the experimental and control groups.

Пример. Отобрали 20 половозрелых дождевых червей одинакового размера и по одному поместили в контейнеры для забора крови объемом 5 мл. 10 контейнеров заполнили 0,004% раствором соединения πQ1968, приготовленным на кипяченой водопроводной воде комнатной температуры, закрыли пробками, поместили в штатив. 10 контейнеров (контрольная группа) заполнили кипяченой водопроводной водой комнатной температуры, закрыли пробками, поместили в штатив. Оба штатива поставили в термостат при температуре 24°С на 20 часов. Через 20 часов извлекли штативы с контейнерами из термостата. Содержимое контейнеров опытной и контрольной групп вылили в разные чашки Петри. Установили, что в опытной группе из 10 червей проявили подвижность 7 особей, а в контрольной группе 2 особи. Для увеличения доказательности различий повторили такой опыт четыре раза. В общей сложности в опыте из 40 червей выжило 29 особей, а в контрольной группе из 40 особей выжило 9. При статистической обработке контрольных и опытных данных устанавливаем, что степень достоверности различий составляет <0,001.Example. Twenty sexually mature earthworms of the same size were selected and placed one by one in 5 ml blood collection containers. 10 containers were filled with a 0.004% solution of compound πQ1968 prepared in boiled tap water at room temperature, closed with stoppers, and placed in a tripod. 10 containers (control group) were filled with boiled tap water at room temperature, closed with stoppers, placed in a tripod. Both tripods were placed in a thermostat at a temperature of 24 ° C for 20 hours. After 20 hours, the tripods with containers were removed from the thermostat. The contents of the containers of the experimental and control groups were poured into different Petri dishes. It was found that in the experimental group of 10 worms, 7 individuals showed mobility, and in the control group 2 individuals. To increase the evidence for differences, this experiment was repeated four times. In total, 29 individuals survived in the experiment of 40 worms, and 9 survived in the control group of 40. In the statistical processing of control and experimental data, we establish that the degree of significance of the differences is <0.001.

Всего было проведено 3 группы исследований, в которых оценивалась антигипоксическая активность мексидола, химического соединения под шифром πQ1968, изученных Е.О. Марковой (Маркова Е.О. Антигипоксантные свойства новых комплексных соединений аскорбиновой кислоты: Дис…канд. биолог. наук. Смоленск. 2013 - 162 с.), и соединения πQ1981, изученного Д.В. Сосиным (Сосин Д.В. Селенсодержащие металлокомплексные соединения при острой экзогенной гипоксии: Дис…докт. мед. наук. Санкт-Петербург. 2015 - 312 с.).In total, 3 groups of studies were conducted in which the antihypoxic activity of mexidol, a chemical compound under the code πQ1968, studied by E.O. Markova (Markova EO Antihypoxic properties of new complex compounds of ascorbic acid: Dis ... Ph.D. Biology. Smolensk. 2013 - 162 p.), And compound πQ1981, studied by D.V. Sosin (Sosin D.V. Selenium-containing metal complex compounds in acute exogenous hypoxia: Dis ... Doctorate. Medical Sciences. St. Petersburg. 2015 - 312 p.).

Результаты исследований этих соединений на антигипоксическую активность с использованием дождевых червей представлены в таблице: выживаемость дождевых червей в растворах с исследуемыми веществами в условиях гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.The results of studies of these compounds on antihypoxic activity using earthworms are presented in the table: survival of earthworms in solutions with the studied substances under hypoxia with hypercapnia in a pressurized volume.

Математическую обработку данных проводили методом оценки статистических различий частностей случайных событий (Петри А. Наглядная медицинская статистика: учеб. пособие / А. Петри, К. Сэбин; пер. с анг. Под ред. В.П. Леонова. - 3-е изд., перераб. и доп. - М., ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 216. с.: ил.). Для получения достоверных данных о различии выживаемости животных в различных группах следует использовать в каждой группе не менее 40 червей. Из таблицы следует, что результаты изучения антигипоксической активности исследуемых препаратов полностью соответствуют данным, полученным ранее на позвоночных животных (мышах) в условиях модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме. Специфическая антигипоксическая активность выявлена у мексидола и соединения πQ1968 и не установлена у соединения πQ1981. Также в наших опытах мексидол показал (по количеству выживших особей) меньшую активность, чем πQ1968.Mathematical data processing was performed by the method of assessing statistical differences in the particulars of random events (Petri A. Visual medical statistics: study guide / A. Petri, K. Sabin; translated from English; edited by V.P. Leonov. - 3rd ed. ., revised and additional - M., GEOTAR-Media, 2015 .-- 216. p .: ill.). To obtain reliable data on the difference in animal survival in different groups, at least 40 worms should be used in each group. From the table it follows that the results of studying the antihypoxic activity of the studied drugs are fully consistent with the data obtained previously on vertebrates (mice) under the conditions of a hypoxia model with hypercapnia in a hermetic volume. Specific antihypoxic activity was detected in mexidol and compound πQ1968 and was not found in compound πQ1981. Also in our experiments, Mexidol showed (in the number of surviving individuals) less activity than πQ1968.

Предлагаемый способ обеспечивает следующие преимущества:The proposed method provides the following advantages:

1. Вместо позвоночных животных (мышей и крыс) для этих целей можно использовать червей, что представляет высокий экономический эффект. Стоимость одной мышки в настоящее время составляет 380 рублей, одной крысы 650 рублей, а стоимость одного червя составляет 2 рубля.1. Instead of vertebrates (mice and rats) for these purposes, you can use worms, which represents a high economic effect. The cost of one mouse is currently 380 rubles, one rat is 650 rubles, and the cost of one worm is 2 rubles.

2. Можно одновременно проводить опыт с несколькими десятками животных, что актуально при проведении скрининга лекарственных веществ.2. You can simultaneously conduct an experiment with several dozen animals, which is important when conducting screening of medicinal substances.

3. Трудоемкость процесса минимальна в связи с тем, что нет необходимости вводить животным внутрь или внутрибрюшинно растворы исследуемых веществ или контрольные растворы. При этом исключаются технические ошибки, которые возможны при проведении данных манипуляций.3. The complexity of the process is minimal due to the fact that there is no need to administer to the animals inside or intraperitoneally solutions of the test substances or control solutions. This eliminates technical errors that are possible when carrying out these manipulations.

4. Для исследования необходимо меньшее количество исследуемого вещества, что очень важно при исследовании новых синтезированных веществ. Расход вещества при работе на дождевых червях примерно в десять раз меньше, чем при работе на позвоночных животных.4. For research, a smaller amount of the test substance is required, which is very important when researching new synthesized substances. The consumption of a substance when working on earthworms is about ten times less than when working on vertebrate animals.

5. В соответствии с международными этическими нормами работы с лабораторными животными («Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях», Страсбург, 18 марта 1896 г.) замена позвоночных животных на беспозвоночных является несомненным преимуществом.5. In accordance with international ethical standards for working with laboratory animals (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experiments or for Other Scientific Purposes, Strasbourg, March 18, 1896), the replacement of vertebrate animals with invertebrates is an undeniable advantage.

Таким образом, исследования антигипоксической активности химических соединений на дождевых червях позволяет проводить объективный первичный отбор перспективных антигипоксических средств при малых экономических затратах и малой трудоемкости эксперимента, небольшом количестве исследуемого вещества и в соответствии с рекомендациями по соблюдению этических норм по работе с животными.Thus, studies of the antihypoxic activity of chemical compounds on earthworms allow an objective primary selection of promising antihypoxic drugs at low economic cost and low laboriousness of the experiment, a small amount of the test substance and in accordance with recommendations for observing ethical standards for working with animals.

Claims

The method of primary assessment of the specific antihypoxic activity of the drug on a hypoxia model with hypercapnia when placing the animal in a pressurized volume, characterized in that sexually mature earthworms of the same size are used as animals, the pressurized volume is filled with boiled tap water at room temperature for animals of the control group and a solution of the studied drug, prepared on the same water, for animals of the experimental group, using at least 40 individuals in each group, the worms withstand 24ºS mperature for 20 hours and about antigipoksicheskoy drug activity is judged by the number of survivors in both groups.