RU2607226C2

RU2607226C2 - Method of producing three-dimensional female elements

Info

Publication number: RU2607226C2
Application number: RU2015116621A
Authority: RU
Inventors: Антон Владимирович Миронов; Владимир Карпович Попов; Владимир Исаакович Юсупов
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2017-01-10
Also published as: RU2015116621A

Abstract

FIELD: manufacturing technology.

SUBSTANCE: invention can be used for making female elements for individual bioactive implants and artificial organs. For producing three-dimensional female elements used is a machine consisting of a control system, a three-dimensional coordinate system for a syringe dispenser displacements and a working reservoir. Control software of the control system is loaded with a digital three-dimensional model of the female element. Solution of polylactoglycolide in tetraethylene glycol is stirred at the temperature of 20–60 °C for at least 3 hours. Solution is then injected in layers first onto the bottom of the working reservoir with a liquid. Every next layer is applied on the surface of the three-dimensional female element being formed by moving the syringe dispenser while forming each layer in horizontal directions. Syringe dispenser every time before forming the next layer is lifted at a height equal to the thickness of a separate layer. Speed of the syringe dispenser displacement in the horizontal directions is selected of 3–7 mm/sec. When the forming is complete the three-dimensional female element is maintained for 2–3 hours in the liquid for final fixation, then dried in the air at room temperature.

EFFECT: invention enables to obtain not having cytotoxicity three-dimensional female elements of a given structure and shape on the basis of their digital three-dimensional models.

5 cl, 3 dwg

Description

Изобретение относится к аддитивным технологиям, биотехнологии и медицине, а именно к областям тканевой инженерии и регенеративной медицины, и может быть использовано, например, для создания различных тканеинженерных конструкций, матриц для индивидуальных биоактивных имплантатов и искусственных органов.The invention relates to additive technologies, biotechnology and medicine, in particular to the fields of tissue engineering and regenerative medicine, and can be used, for example, to create various tissue-engineering structures, matrices for individual bioactive implants and artificial organs.

Известен способ получения трехмерных матриц из расплава биосовместимых полиэфиров и сополимеров на их основе путем инжекции расплава (Cho-Pei Jiang, Yo-Yu Chen, Min-Fa Hsieh. Biofabrication and in vitro study of hydroxyapatite/mPEG-PCL-mPEG scaffolds for bone tissue engineering using air pressure-aided deposition technology // Materials Science and Engineering: C. 2013. V. 33. N. 2. P. 680-690). В указанном способе расплав полимера в вязко-текучем состоянии выдавливается из герметичной нагреваемой камеры через полую иглу при помощи сжатого воздуха при давлении до 1 МПа. Инжекция осуществляется на трехкоординатный подвижный столик по координатам, заданным в цифровой трехмерной модели. К недостаткам способа относится необходимость нагрева полимера до температуры выше температуры плавления, что делает проблематичным использование термолабильных биорезорбируемых полимеров и биологически активных добавок.A known method for producing three-dimensional matrices from a melt of biocompatible polyesters and copolymers based on them by injection of a melt (Cho-Pei Jiang, Yo-Yu Chen, Min-Fa Hsieh. Biofabrication and in vitro study of hydroxyapatite / mPEG-PCL-mPEG scaffolds for bone tissue engineering using air pressure-aided deposition technology // Materials Science and Engineering: C. 2013. V. 33. N. 2. P. 680-690). In this method, the polymer melt in a viscous-fluid state is squeezed out of a sealed heated chamber through a hollow needle using compressed air at a pressure of up to 1 MPa. Injection is carried out on a three-coordinate movable stage according to the coordinates specified in the digital three-dimensional model. The disadvantages of the method include the need to heat the polymer to a temperature above the melting point, which makes it problematic to use thermolabile bioresorbable polymers and dietary supplements.

Известен способ получения трехмерных матриц, описанный в патенте РФ 100948. Способ основан на послойном лазерном спекании полимерных порошков по траектории, заданной в цифровой модели. В известном способе формирование трехмерных матриц производится путем послойного нанесения полимерного порошка с светопоглощающими добавками сначала на поверхность технологической платформы, а для каждого последующего слоя - на поверхность формирующейся трехмерной матрицы, перемещения сфокусированного лазерного луча по поверхности формирующейся матрицы в горизонтальных направлениях и ступенчатым на толщину слоя перемещением технологической платформы, на которой формируется трехмерная матрица, в вертикальном направлении. Известный способ позволяет получить практически любую геометрию объекта. К недостаткам способа следует отнести необходимость использования светопоглощающих добавок (например, частиц углерода), что увеличивает цитотоксичность матрицы, и наличие интенсивного локального нагрева материала при спекании, что исключает возможность включения термолабильных биоактивных веществ в объем материала.A known method for producing three-dimensional matrices is described in RF patent 100948. The method is based on layer-by-layer laser sintering of polymer powders along the path specified in the digital model. In the known method, the formation of three-dimensional matrices is carried out by layer-by-layer deposition of polymer powder with light-absorbing additives first on the surface of the technological platform, and for each subsequent layer on the surface of the forming three-dimensional matrix, moving the focused laser beam along the surface of the forming matrix in horizontal directions and moving stepwise by layer thickness technological platform, on which a three-dimensional matrix is formed, in the vertical direction. The known method allows to obtain almost any geometry of the object. The disadvantages of the method include the need to use light-absorbing additives (for example, carbon particles), which increases the cytotoxicity of the matrix, and the presence of intense local heating of the material during sintering, which excludes the possibility of including thermolabile bioactive substances in the volume of the material.

Указанных недостатков лишен наиболее близкий к заявляемому способ получения трехмерных матриц путем инъекционного введения в рабочий резервуар с фосфатным буфером отверждаемых биосовместимых композиций на основе смеси полилактогликолида с тетраэтиленгликолем (Krebs М.D., Sutter K.A., Lin A.S., Guldberg R.Е., & Alsberg Е. Injectable poly (lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering // Acta biomaterialia. 2009. V. 5. N. 8. P. 2847-2859). Известный способ заключается в том, что 10% (масс.) раствор полилактогликолида в тетраэтиленгликоле, полученный путем перемешивания компонентов в течение нескольких часов при температуре 60°C, дополнительно смешивается с порошком водорастворимой соли и инъекционно с помощью шприцевого диспенсера вводится в рабочий резервуар с фосфатным буфером. В результате диффузии тетраэтиленгликоля в фосфатный буфер происходит отверждение структуры полилактогликолидного матрикса. Вместе с этим происходит вымывание частиц водорастворимой соли, что приводит к получению пористой структуры. В известном способе использовался 10% (масс.) раствор полилактогликолида в тетраэтиленгликоле, а в качестве водорастворимых солей применялись порошки хлорида натрия, бикарбоната натрия, бикарбоната аммония или сахарозы с размером зерен от 100 до 230 мкм. В качестве шприцевого диспенсера использовался шприц емкостью 3 мл, в качестве рабочего резервуара - стеклянная чашка. Согласно результатам проведенных авторами исследований известный способ приводил к получению не обладающих цитотоксичностью трехмерных матриц с пористостью до 70%.These drawbacks are devoid of the closest to the claimed method for producing three-dimensional matrices by injecting into the working tank with a phosphate buffer curable biocompatible compositions based on a mixture of polylactoglycolide with tetraethylene glycol (Krebs M.D., Sutter KA, Lin AS, Guldberg R.E., & Alsberg E. Injectable poly (lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering // Acta biomaterialia. 2009. V. 5. N. 8. P. 2847-2859). The known method consists in the fact that a 10% (mass.) Solution of polylactoglycolide in tetraethylene glycol, obtained by mixing the components for several hours at a temperature of 60 ° C, is additionally mixed with a powder of water-soluble salt and injected using a syringe dispenser into a working tank with phosphate the buffer. As a result of the diffusion of tetraethylene glycol into the phosphate buffer, the structure of the polylactoglycolide matrix is cured. Along with this, the particles of water-soluble salt are washed out, which leads to the formation of a porous structure. In the known method, a 10% (mass) solution of polylactoglycolide in tetraethylene glycol was used, and powders of sodium chloride, sodium bicarbonate, ammonium bicarbonate or sucrose with grain sizes from 100 to 230 μm were used as water-soluble salts. A 3 ml syringe was used as a syringe dispenser, and a glass cup was used as a working reservoir. According to the results of the studies conducted by the authors, the known method led to the production of non-cytotoxic three-dimensional matrices with porosity up to 70%.

Существенным недостатком известного способа является принципиальная невозможность создания трехмерных матриц заданной формы и структуры на основе трехмерных моделей.A significant disadvantage of this method is the fundamental impossibility of creating three-dimensional matrices of a given shape and structure based on three-dimensional models.

Задача изобретения состоит в получении не обладающих цитотоксичностью трехмерных матриц заданной формы и структуры на основе их цифровых трехмерных моделей.The objective of the invention is to obtain non-cytotoxic three-dimensional matrices of a given shape and structure based on their digital three-dimensional models.

Поставленная задача решается формированием трехмерных матриц следующим способом.The problem is solved by the formation of three-dimensional matrices in the following way.

2-15% (масс.) раствор полилактогликолида в тетраэтиленгликоле, полученный путем перемешивания компонентов в течение нескольких часов при температуре 20-60°C, инъекционно с помощью шприцевого диспенсера послойно наносится сначала на дно рабочего резервуара с дистиллированной водой, а для каждого последующего слоя - на поверхность формирующейся в рабочем резервуаре с дистиллированной водой трехмерной матрицы, путем перемещения шприцевого диспенсера при формировании каждого слоя в горизонтальных направлениях, который каждый раз перед началом формировании последующего слоя поднимается на высоту, равную толщине отдельного слоя, при этом после завершения формирования трехмерная матрица выдерживается в течение нескольких часов в дистиллированной воде для окончательной фиксации и затем высушивается на воздухе при комнатной температуре.A 2-15% (mass.) Solution of polylactoglycolide in tetraethylene glycol, obtained by mixing the components for several hours at a temperature of 20-60 ° C, is injected using a syringe dispenser, first applied in layers to the bottom of the working tank with distilled water, and for each subsequent layer - on the surface of a three-dimensional matrix formed in the working tank with distilled water, by moving the syringe dispenser during the formation of each layer in horizontal directions, which each time before starting The formation of the subsequent layer rises to a height equal to the thickness of the individual layer, and after completion of the formation, the three-dimensional matrix is held for several hours in distilled water for final fixation and then dried in air at room temperature.

На фиг. 1 представлена фотография образца трехмерной матрицы в виде цилиндра с толщиной стенок 1 мм.In FIG. 1 is a photograph of a sample of a three-dimensional matrix in the form of a cylinder with a wall thickness of 1 mm.

На фиг. 2 показано полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа изображение поверхности полимерной нити трехмерной матрицы.In FIG. 2 shows the image of the surface of the polymer filament of a three-dimensional matrix obtained using a scanning electron microscope.

На фиг. 3 показано полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа изображение внутренней структуры полимерной нити трехмерной матрицы.In FIG. Figure 3 shows the image obtained by scanning electron microscope of the internal structure of the polymer filament of a three-dimensional matrix.

Авторами проведена проверка предлагаемого способа получения трехмерных матриц. Способ реализован на установке, состоящей из системы управления, трехкоординатной системы перемещения шприцевого диспенсера и рабочего резервуара с дистиллированной водой. Линейное перемещение шприцевого диспенсера осуществлялось за счет шаговых приводов с винтовой передачей с точностью позиционирования 50 мкм. Система управления была выполнена на микроконтроллере. В качестве рабочего резервуара использовалась стандартная чашка Петри диаметром 120 мм. Шприцевой диспенсер был выполнен на базе стандартного инсулинового шприца объемом 2.5 мл, шагового микропривода поршня и сменных тефлоновых наконечников с внутренним диаметром отверстия от 100 до 700 мкм.The authors verified the proposed method for producing three-dimensional matrices. The method is implemented on an installation consisting of a control system, a three-coordinate system for moving a syringe dispenser and a working tank with distilled water. The linear movement of the syringe dispenser was carried out by step drives with screw transmission with a positioning accuracy of 50 μm. The control system was implemented on a microcontroller. A standard Petri dish 120 mm in diameter was used as a working reservoir. The syringe dispenser was made on the basis of a standard 2.5 ml insulin syringe, a stepper micro-drive piston and interchangeable Teflon tips with an internal hole diameter of 100 to 700 microns.

Первоначально готовился 2-15% (масс.) раствор полилактогликолида PDLG7507 (PURAC, Нидерланды) в тетраэтиленгликоле. Для этого компоненты смешивались на магнитной мешалке в течение не менее 3 ч при температуре 20-60°C до получения однородной вязкого раствора. Шприцевой диспенсер заполнялся готовым раствором и отводился на парковочную позицию. В управляющее программное обеспечение системы управления загружалась цифровая трехмерная модель матрицы. Рабочий резервуар заполнялся дистиллированной водой. Затем запускался процесс формирования матрицы, при котором шприцевой диспенсер опускался к поверхности дна рабочего резервуара и раствор из шприцевого диспенсера начинал инжектироваться в виде полимерных нитей на дно резервуара при перемещении шприцевого диспенсера в горизонтальных направлениях по заданной траектории. После завершения формирования каждого слоя шприцевой диспенсер поднимался на толщину слоя и затем начиналось формирование последующего слоя. Цикл повторялся до полного формирования трехмерной матрицы. После завершения процесса формирования матрицы шприцевой диспенсер отводился на парковочную позицию, а полученная трехмерная матрица для окончательного закрепления структуры в течение 2-3 ч выдерживалась в рабочем резервуаре при постоянном обновлении дистиллированной воды. Затем трехмерная матрица извлекалась из рабочего резервуара и высушивалась при комнатной температуре. В реализованном способе система управления и трехкоординатная система перемещения шприцевого диспенсера позволяла добиться пространственного разрешения при получении матрицы до 100 мкм.Initially, a 2-15% (mass) solution of PDLG7507 polylactoglycolide (PURAC, the Netherlands) in tetraethylene glycol was prepared. For this, the components were mixed on a magnetic stirrer for at least 3 hours at a temperature of 20-60 ° C until a homogeneous viscous solution was obtained. The syringe dispenser was filled with the finished solution and was diverted to the parking position. A digital three-dimensional matrix model was loaded into the control software of the control system. The working tank was filled with distilled water. Then, the matrix formation process was started, in which the syringe dispenser fell to the surface of the bottom of the working tank and the solution from the syringe dispenser began to be injected in the form of polymer filaments to the bottom of the tank when the syringe dispenser was moved in horizontal directions along a predetermined path. After the formation of each layer was completed, the syringe dispenser rose to the thickness of the layer and then the formation of the subsequent layer began. The cycle was repeated until the formation of a three-dimensional matrix. After completion of the matrix formation process, the syringe dispenser was diverted to the parking position, and the obtained three-dimensional matrix was held in the working tank for constant fixing of the structure for 2-3 hours with constant renewal of distilled water. Then the three-dimensional matrix was removed from the working tank and dried at room temperature. In the implemented method, the control system and the three-coordinate system for moving the syringe dispenser made it possible to achieve spatial resolution upon receipt of a matrix of up to 100 μm.

Поскольку трехмерная матрица формировалась, а затем выдерживалась в воде, то из нее в объем воды происходила постоянная диффузия тетраэтиленгликоля, что приводило к постепенному отверждению полимерных нитей матрицы. Скорость перемещения шприцевого диспенсера в горизонтальных направлениях подбиралась таким образом, чтобы обеспечить надежную адгезию полимерных нитей к поверхности дна рабочего резервуара и между собой и не допустить деформации формирующейся матрицы. В диапазоне 2-15% (масс.) концентраций полилактогликолида в тетраэтиленгликоле скорость перемещения шприцевого диспенсера в горизонтальных направлениях составляла 3-7 мм/с. При этом с увеличением концентрации скорость перемещения снижали, поскольку вязкость раствора увеличивалась.Since a three-dimensional matrix was formed and then aged in water, constant diffusion of tetraethylene glycol from it into the water volume occurred, which led to the gradual curing of the polymer strands of the matrix. The speed of movement of the syringe dispenser in horizontal directions was selected in such a way as to ensure reliable adhesion of the polymer threads to the surface of the bottom of the working tank and between each other and to prevent deformation of the forming matrix. In the range of 2-15% (mass.) Concentrations of polylactoglycolide in tetraethylene glycol, the speed of movement of the syringe dispenser in horizontal directions was 3-7 mm / s. Moreover, with increasing concentration, the rate of movement was reduced, since the viscosity of the solution increased.

С помощью сканирующего электронного микроскопа было проведено исследование морфологии поверхности и внутренней структуры полученных полимерных нитей матрицы. Исследование показало, что в диапазоне 2-15% (масс.) концентраций полилактогликолида в тетраэтиленгликоле формируются полимерные нити с гладкой и достаточно плотной поверхностью (фиг. 2) и развитой пористой структурой (фиг. 3).Using a scanning electron microscope, a study was made of the surface morphology and internal structure of the obtained polymer matrix strands. The study showed that in the range of 2-15% (mass.) Concentrations of polylactoglycolide in tetraethylene glycol, polymer filaments with a smooth and fairly dense surface (Fig. 2) and a developed porous structure (Fig. 3) are formed.

Для исследований на цитотоксичность были изготовлены образцы трехмерных матриц в виде цилиндров высотой 8.5 мм, диаметром 10 мм с толщиной стенки 1 мм (фиг. 1). Испытания проводились на культуре фибробластов мыши линии NIH 3T3 в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993.1-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования» и ГОСТ Р ИСО 10993.5-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro». Перед тестированием образцы стерилизовали обработкой в 70% спиртовом растворе в течение 30 мин с последующей двукратной промывкой стерильным раствором Хенкса. Цитотоксичность оценивали методами прямого контакта с образцами. Согласно выводам протокола цитотоксичность полученных образцов оценена как «0», т.е. заявленный способ приводил к получению не обладающих цитотоксичностью трехмерных матриц.For cytotoxicity studies, samples of three-dimensional matrices were made in the form of cylinders 8.5 mm high, 10 mm in diameter with a wall thickness of 1 mm (Fig. 1). The tests were carried out on a mouse fibroblast culture of the NIH 3T3 line in accordance with GOST R ISO 10993.1-99 “Medical devices. Assessment of the biological effects of medical devices. Part 1. Assessment and research ”and GOST R ISO 10993.5-99“ Medical devices. Assessment of the biological effects of medical devices. Part 5. Cytotoxicity test: in vitro methods. " Before testing, the samples were sterilized by treatment in a 70% alcohol solution for 30 min, followed by a double wash with sterile Hanks solution. Cytotoxicity was evaluated by direct contact with samples. According to the conclusions of the protocol, the cytotoxicity of the obtained samples was rated as “0”, i.e. The claimed method led to the production of non-cytotoxic three-dimensional matrices.

По предложенному способу авторами были изготовлены трехмерные матрицы, когда в качестве жидкости в рабочем резервуаре использовались фосфатный буфер, культуральная сыворотка или плазмы крови. Трехмерные матрицы, полученные по предложенному способу при использовании в качестве жидкости в рабочем резервуаре фосфатного буфера, культуральной сыворотки или плазмы крови морфологически и по показателю цитотоксичности не отличались от образцов, полученных в дистиллированной воде.According to the proposed method, the authors made three-dimensional matrices when phosphate buffer, culture serum or blood plasma were used as a liquid in the working tank. Three-dimensional matrices obtained by the proposed method when using phosphate buffer, culture serum or blood plasma as a liquid in a working reservoir did not differ morphologically and in terms of cytotoxicity from samples obtained in distilled water.

Трехмерные матрицы, полученные по предложенному способу при использовании в качестве жидкости в рабочем резервуаре фосфатного буфера, могут быть полезны, когда предполагается использование матриц в pH-чувствительных средах, так как в основном способе с применением воды происходит незначительное защелачивание среды. Использование фосфатного буфера позволяет стабилизировать значение pH на уровне 7.4. Данный буфер является одним из компонентов стандартных сред для культивирования клеток.Three-dimensional matrices obtained by the proposed method when using a phosphate buffer as a liquid in a working tank can be useful when using matrices in pH-sensitive environments, since in the main method using water there is a slight alkalization of the medium. The use of phosphate buffer helps to stabilize the pH value at 7.4. This buffer is one of the components of standard cell culture media.

Преимущество трехмерных матриц, полученных по предложенному способу при использовании в качестве жидкости в рабочем резервуаре культуральной сыворотки, заключается в том, что трехмерная матрица создается непосредственно в среде обитания живых клеток. При этом в процессе трехмерной печати происходит заселение поверхности культурой.The advantage of three-dimensional matrices obtained by the proposed method when using culture serum as a liquid in a working reservoir is that a three-dimensional matrix is created directly in the living environment of living cells. Moreover, in the process of three-dimensional printing, the surface is populated by culture.

При тестировании были использованы сыворотка «Сферогель» (ЗАО "БИОМИР сервис", РФ) и искусственная среда DMEM (ПанЭко, РФ). Преимущество такого способа заключается в том, что трехмерные матрицы, полученные по предложенному способу при использовании в качестве жидкости в рабочем резервуаре плазмы крови, также морфологически не отличаются от образцов, полученных в дистиллированной воде. Данный способ позволяет включить в трехмерную пористую структуру трехмерного объекта белки, содержащиеся в плазме крови. Такая модификация может улучшить способность образца поддерживать закрепление и размножение клеток некоторых типов ткани.During testing, we used Spherogel serum (CJSC BIOMIR Service, Russian Federation) and artificial medium DMEM (PanEco, Russian Federation). The advantage of this method is that three-dimensional matrices obtained by the proposed method when used as a liquid in a working reservoir of blood plasma also morphologically do not differ from samples obtained in distilled water. This method allows you to include in the three-dimensional porous structure of the three-dimensional object of the proteins contained in the blood plasma. Such a modification may improve the ability of a sample to support cell attachment and propagation of certain types of tissue.

Предложенный способ формирования трехмерных матриц может быть также осуществлен с раствором любых алифатических полиэфиров в тетраэтиленгликоле, а не только полилактогликолида. Это объясняется тем, что все алифатические полиэфиры, так же как и полилактогликолид, гидрофобны и способны эффективно растворяться в тетраэтиленгликоле.The proposed method for the formation of three-dimensional matrices can also be carried out with a solution of any aliphatic polyesters in tetraethylene glycol, and not just polylactoglycolide. This is because all aliphatic polyesters, as well as polylactoglycolide, are hydrophobic and are able to dissolve effectively in tetraethylene glycol.

Таким образом, заявленный способ позволил достичь поставленных целей, а именно получать не обладающие цитотоксичностью трехмерные матрицы заданной формы и структуры на основе их цифровых трехмерных моделей.Thus, the claimed method allowed us to achieve our goals, namely to obtain non-cytotoxic three-dimensional matrices of a given shape and structure based on their digital three-dimensional models.

Claims

1. A method for producing three-dimensional matrices, comprising preparing a solution of polylactoglycolide in tetraethylene glycol by mixing the components and injecting it with a syringe dispenser into a working tank, characterized in that they use a system consisting of a control system, a three-coordinate moving system for the syringe dispenser and a working tank, in control software of the control system download a digital three-dimensional model of the matrix, with 2-15% wt. a solution of polylactoglycolide in tetraethylene glycol is stirred at a temperature of 20-60 ° C for at least 3 hours and then first injected layer by layer is applied to the bottom of the working tank with liquid, and each subsequent layer is applied to the surface of a three-dimensional matrix formed in the working tank with liquid by moving the syringe dispenser during the formation of each layer in horizontal directions, the syringe dispenser is raised each time before the formation of the next layer to a height equal to the thickness of a separate layer, the speed of movement of the syringe dispenser in horizontal directions is chosen 3-7 mm / s, after completion of the formation, the three-dimensional matrix is kept for 2-3 hours in the liquid for final fixation and then dried in air at room temperature.

2. The method according to p. 1, characterized in that as the liquid in the working tank using distilled water.

3. The method according to p. 1, characterized in that as a liquid in the working tank using phosphate buffer.

4. The method according to p. 1, characterized in that the quality of the liquid in the working tank using culture serum.

5. The method according to p. 1, characterized in that as a liquid in the working tank using blood plasma.