RU2606030C1 - Strain of influenza virus a/common muskrat/chany lake/226/05 h2n2-subtype for use in diagnostics of influenza virus by methods of rtga and pcr and studying efficacy of antiviral preparations in vitro and in vivo - Google Patents

Strain of influenza virus a/common muskrat/chany lake/226/05 h2n2-subtype for use in diagnostics of influenza virus by methods of rtga and pcr and studying efficacy of antiviral preparations in vitro and in vivo Download PDF

Info

Publication number
RU2606030C1
RU2606030C1 RU2015155635A RU2015155635A RU2606030C1 RU 2606030 C1 RU2606030 C1 RU 2606030C1 RU 2015155635 A RU2015155635 A RU 2015155635A RU 2015155635 A RU2015155635 A RU 2015155635A RU 2606030 C1 RU2606030 C1 RU 2606030C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
influenza
strain
subtype
virus
influenza virus
Prior art date
Application number
RU2015155635A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Кирилл Александрович Шаршов
Марина Александровна Гуляева
Александр Юрьевич Алексеев
Александр Михайлович Шестопалов
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины" (НИИЭКМ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины" (НИИЭКМ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины" (НИИЭКМ)
Priority to RU2015155635A priority Critical patent/RU2606030C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2606030C1 publication Critical patent/RU2606030C1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and concerns influenza virus strain. Presented strain of virus of bird flu A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-subtype, deposited in collection of microorganisms of Federal budgetary institution of science "State Research Centre for virology and biotechnology "Vector" under registration number V-623.
EFFECT: invention can be used to study the efficacy of therapeutic and preventive preparations for influenza, for preparation of antigen-containing substrate and serum for serodiagnosis of influenza H2-subtype in RTGA, for use as a control reference sample when evaluating specificity of test systems based on polymerase chain reaction, as well as for studying efficacy of antiviral preparations in vitro and in vivo.
1 cl, 4 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к штаммам вируса гриппа H2N2-субтипа и может быть использовано в медицине, ветеринарии и микробиологии. Указанный штамм предназначен для приготовления антигенсодержащего препарата и сыворотки для серодиагностики гриппа Н2-субтипа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), как компонента панели поликлональных сывороток к различным субтипам вируса гриппа А (H1-H18) для типирования вновь выделяемых из природы вариантов вируса гриппа в РТГА, а также выявления антител к вирусу гриппа Н2-субтипа в сыворотках крови диких животных для оценки популяционного иммунитета к вирусу гриппа данного субтипа в РТГА. Штамм может быть применен в качестве контрольного референс-штамма Н2 при проведении диагностических работ методом ПЦР. Штамм также может быть использован для эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа.The invention relates to strains of influenza virus H2N2-subtype and can be used in medicine, veterinary medicine and microbiology. The indicated strain is intended for the preparation of an antigen-containing preparation and serum for serodiagnosis of the H2 subtype influenza in the hemagglutination inhibition reaction (RTGA) as a component of the panel of polyclonal sera to various subtypes of influenza A virus (H1-H18) for typing the newly isolated from the nature variants of the influenza virus in RTGA as well as detection of antibodies to the H2-subtype influenza virus in the blood serum of wild animals to assess population immunity to the influenza virus of this subtype in RTGA. The strain can be used as a control reference strain of H2 during diagnostic work by PCR. The strain can also be used for the effectiveness of therapeutic and prophylactic drugs against influenza.

Вирусы гриппа A (Orthomyxoviridae, Influenzavirus А) имеют широкий круг хозяев среди млекопитающих и птиц, но их основным резервуаром в природе являются дикие птицы околоводного комплекса (Львов, Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С. 4-11) [1]. Вирусы гриппа А подразделяются на субтипы на основании антигенных свойств их поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина и нейраминидазы. На сегодняшний день известно 17 субтипов гемагглютинина (Н) и 10 субтипов нейраминидазы (N) [1, 2]. К настоящему моменту циркуляция вирусов гриппа А со всеми известными подтипами гемагглютинина и нейраминидазы, кроме H17N10, зарегистрирована только среди птиц. В процессе эволюции нередко возникают высокопатогенные для человека и животных варианты вируса гриппа. Яркий пример - возникновение нового азиатского варианта вируса H5N1-субтипа, впервые зарегистрированного у домашних птиц в 1996 (Львов Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С. 4-11), (Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109(11):4269-74). [1, 2].Influenza A viruses (Orthomyxoviridae, Influenzavirus A) have a wide range of hosts among mammals and birds, but their main reservoir in nature are wild birds of the near-water complex (Lvov, D.K. Interpopulation interactions in the system of influenza A viruses - animals - humans / D. K. Lvov // Questions of Virology. - 2005. - No. 4. - S. 4-11) [1]. Influenza A viruses are divided into subtypes based on the antigenic properties of their surface glycoproteins - hemagglutinin and neuraminidase. To date, 17 subtypes of hemagglutinin (N) and 10 subtypes of neuraminidase (N) are known [1, 2]. To date, the circulation of influenza A viruses with all known subtypes of hemagglutinin and neuraminidase, except for H17N10, has been registered only among birds. In the process of evolution, variants of the influenza virus that are highly pathogenic for humans and animals often arise. A striking example is the emergence of a new Asian variant of the H5N1-subtype virus, first registered in poultry in 1996 (Lvov D.K. Interpopulation interactions in the system of influenza A viruses - animals - humans / D.K. Lvov // Virology Issues. - 2005. - No. 4. - S. 4-11), (Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109 (11): 4269-74). [12].

У человека сезонные эпидемии гриппа ежегодно наносят значительный ущерб. Пандемии гриппа происходили четыре раза в течение последнего столетия. Для них были характерны очень быстрое распространение, вовлечение всех континентов, высокий процент заболеваемости и высокая смертность в некоторых группах населения. Это подчеркивает серьезность проблемы диагностики вируса для человечества.In humans, seasonal flu epidemics cause significant damage each year. Influenza pandemics have occurred four times during the last century. They were characterized by a very rapid spread, the involvement of all continents, a high incidence rate and high mortality in some population groups. This underlines the seriousness of the virus diagnostic problem for humanity.

Чтобы подготовиться к будущим пандемиям, организации мер профилактики и диагностики на Международной конференции по вакцине против пандемического гриппа в 2003 году был предложен приоритетный план и классификация кандидатных пандемических вирусов. При этом, субтипы H1, Н2 и Н3, которые, как известно, привели к предыдущим пандемиям, имеют самый высокий уровень; субтипы Н5, Н6, Н7, Н9 имеют второй по важности уровень приоритета (Isakova-Sivak I, de Jonge J, Smolonogina T, Rekstin A, van Amerongen G, van Dijken H, Mouthaan J, Roholl P, Kuznetsova V, Doroshenko E, Tsvetnitsky V, Rudenko L. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014 Jul 24; 9(7):e102339) [3].In order to prepare for future pandemics and to organize preventive and diagnostic measures at the 2003 International Pandemic Influenza Vaccine Conference, a priority plan and classification of candidate pandemic viruses was proposed. At the same time, the subtypes H1, H2 and H3, which are known to have led to previous pandemics, have the highest level; subtypes H5, H6, H7, H9 have the second priority level (Isakova-Sivak I, de Jonge J, Smolonogina T, Rekstin A, van Amerongen G, van Dijken H, Mouthaan J, Roholl P, Kuznetsova V, Doroshenko E, Tsvetnitsky V, Rudenko L. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014 Jul 24; 9 (7): e102339) [3].

Вирус гриппа H2N2-субтипа представляет собой один из наиболее актуальных и потенциально опасных для человека вирусов. H2N2 вирусы гриппа не циркулировали в человеческой популяции, начиная с 1968 года, поэтому люди, родившиеся после этого года, не имеют иммунитета к ним и поэтому они будут уязвимы к этому вирусу при новой пандемииThe H2N2 subtype influenza virus is one of the most relevant and potentially dangerous viruses for humans. H2N2 influenza viruses have not circulated in the human population since 1968, so people born after this year do not have immunity to them and therefore they will be vulnerable to this virus in a new pandemic

(Nabel GJ, Wei CJ, Ledgerwood JE. Vaccinate for the next H2N2 pandemic now. Nature, 2011. 471: 157-158). [4]. Согласно архивным данным, этот подтип вызвал пандемию 1889 и был распространен до 1901 года, после чего она был вытеснен «Испанкой» H1N1. Тем не менее, 56 лет спустя, вирусы H2N2 в 1957 году вернулись, вызвав пандемию "Азиатского гриппа", унесшую более двух миллионов жизней (Pappas С, Yang Н, Carney PJ, Pearce MB, Katz JM, Stevens J, Tumpey TM. Assessment of transmission, pathogenesis and adaptation of H2 subtype influenza viruses in ferrets. Virology. 2015 Mar; 477:61-71. doi: 10.1016/j.virol.2015.01.002. Epub 2015 Feb 5) [5], (Jones JC, Baranovich T, Marathe BM, Danner AF, Seiler JP, Franks J, Govorkova EA, Krauss S, Webster RG. Risk assessment of H2N2 influenza viruses from the avian reservoir. J Virol. 2014 Jan; 88(2): 1175-88. doi: 10.1128/JVI.02526-13. Epub 2013 Nov 13) [6].(Nabel GJ, Wei CJ, Ledgerwood JE. Vaccinate for the next H2N2 pandemic now. Nature, 2011.471: 157-158). [four]. According to archival data, this subtype caused the pandemic of 1889 and was distributed until 1901, after which it was supplanted by the Spanish Woman H1N1. However, 56 years later, the H2N2 viruses returned in 1957, triggering an Asian flu pandemic that claimed more than two million lives (Pappas C, Yang H, Carney PJ, Pearce MB, Katz JM, Stevens J, Tumpey TM. Assessment of transmission, pathogenesis and adaptation of H2 subtype influenza viruses in ferrets. Virology. 2015 Mar; 477: 61-71. doi: 10.1016 / j.virol.2015.01.002. Epub 2015 Feb 5) [5], (Jones JC, Baranovich T, Marathe BM, Danner AF, Seiler JP, Franks J, Govorkova EA, Krauss S, Webster RG. Risk assessment of H2N2 influenza viruses from the avian reservoir. J Virol. 2014 Jan; 88 (2): 1175-88. doi: 10.1128 / JVI.02526-13. Epub 2013 Nov 13) [6].

В настоящее время H2N2 вирусы гриппа продолжают постоянно циркулировать среди птиц, подчеркивая вероятность их возвращения к человеческой популяции.Currently, H2N2 influenza viruses continue to circulate constantly among birds, emphasizing the likelihood of their return to the human population.

Так, было показано на хорьковой модели, что ряд птичьих вирусов Н2 субтипа эффективно передаются между млекопитающими аэрозольно и очень быстро адаптируются к этим животным [5].Thus, it was shown in the ferret model that a number of bird H2 subtype viruses are aerosolized and efficiently adapted between mammals and adapt very quickly to these animals [5].

В течение двух последних лет проводились серьезные исследования H2N2-субтипа вируса в отношении антигенных и генетических свойств, специфичности связывания с рецепторами, первичной репликации в нормальных человеческих клетках эпителия бронхов (NHBE) и клеток трахеи свиньи, патогенности и передачи в животных моделях, и чувствительности к противовирусным препаратам [6]. В связи с этим ведущие вирусологи рекомендуют проводить разработки по совершенствованию диагностики, профилактики и лечения данного субтипа вируса.Serious studies of the H2N2 subtype of the virus have been conducted over the past two years regarding antigenic and genetic properties, specificity of binding to receptors, primary replication in normal human bronchial epithelial cells (NHBE) and pig tracheal cells, pathogenicity and transmission in animal models, and sensitivity to antiviral drugs [6]. In this regard, leading virologists recommend developing to improve the diagnosis, prevention and treatment of this subtype of the virus.

Большинство имеющихся сегодня коммерческих штаммов вируса H2N2 субтипа устарели (выделены более 30 лет назад) и имеют длительную пассажную историю. Они являются антигенно отличными от циркулирующих в настоящее время в природе вариантов и непригодны для использования в диагностике. Эффективная диагностика вируса требует комбинирования различных методов с использованием адекватных контролей (референс-штаммов), таких как анализ клинических симптомов (в том числе и гистологический анализ), выделение и наработка вирусного материала, серологический анализ, молекулярно-биологические методы на основе ПЦР.Most of the commercial subtype H2N2 virus strains available today are outdated (isolated more than 30 years ago) and have a long passage history. They are antigenically distinct from the currently circulating in nature variants and are unsuitable for use in diagnostics. Effective virus diagnosis requires a combination of various methods using adequate controls (reference strains), such as analysis of clinical symptoms (including histological analysis), isolation and production of viral material, serological analysis, and molecular biological methods based on PCR.

Таким образом, очевидна необходимость создания современного референс-штамма вируса гриппа H2N2-субтипа для использования в диагностике вируса гриппа методами РТГА и ПЦР и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo.Thus, the need for creating a modern reference strain of the H2N2 subtype influenza virus is obvious for use in the diagnosis of influenza virus by RTGA and PCR and to study the effectiveness of antiviral drugs in vitro and in vivo.

Предлагаемый в качестве изобретения штамм является уникальным птичьим вариантом вируса гриппа H2N2-субтипа, выделенным от млекопитающего ондатры (Ondatra zibethicus). Новый вирус гриппа был выделен от околоводного вида, обитающего в тесном контакте с птицами-носителями. Наиболее вероятно, что этот вариант вируса, циркулирующий в диких водоплавающих птицах, пересек видовой барьер, закрепился в новом хозяине, обладает способностью реплицироваться в легких млекопитающих и вызывать патологические изменения. В связи с этим целесообразно использовать этот современный штамм с особенными характеристиками для разработки методов диагностики и исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo.The strain proposed as an invention is a unique avian variant of the H2N2 subtype influenza virus isolated from a mammal of a muskrat (Ondatra zibethicus). A new influenza virus has been isolated from a near-water species living in close contact with carrier birds. Most likely, this variant of the virus, circulating in wild waterfowl, crossed the species barrier, fixed itself in a new host, has the ability to replicate in the lungs of mammals and cause pathological changes. In this regard, it is advisable to use this modern strain with special characteristics for the development of diagnostic methods and study the effectiveness of antiviral drugs in vitro and in vivo.

Источники содержат информацию о нескольких штаммах, использовавшихся ранее в диагностике, в том числе с использованием метода РТГА и медицинских исследованиях.Sources contain information about several strains that were previously used in diagnostics, including using the RTGA method and medical research.

Однако в указанных ниже источниках литературы присутствует информация только о некоторых свойствах вируса гриппа Н2-субтипа, которой недостаточно для использования штаммов при создании на их основе диагностических препаратов, в частности методами РТГА и ПЦР. Вместе с тем, описанные штаммы по причине быстрой изменчивости вируса гриппа А могут значительно отличаться антигенно от современных вариантов вируса гриппа Н2-субтипа. При этом для корректной и достоверной диагностики необходимо использовать современные варианты вируса гриппа Н2-субтипа, как компоненты диагностических тест-систем. Все отечественные штаммы имеют ряд недостатков. Одним из основных является отсутствие данных о возможности использования в диагностике методами РТГА и ПЦР.However, in the following literature sources there is information only on some properties of the H2-subtype influenza virus, which is not enough for using strains when creating diagnostic products based on them, in particular, RTGA and PCR methods. At the same time, the described strains, due to the rapid variability of the influenza A virus, can significantly differ antigenically from modern variants of the H2 subtype influenza virus. At the same time, for correct and reliable diagnosis, it is necessary to use modern variants of the H2 subtype influenza virus as components of diagnostic test systems. All domestic strains have several disadvantages. One of the main ones is the lack of data on the possibility of using RTGA and PCR in diagnostics.

Существует штамм вируса гриппа А/Япония/1/57(H2N1) для моделирования инфекции у мышей (Патент SU 1735363; Львов Д.К. с соавторами) [7]. Адаптирован к размножению в легких мышей.There is a strain of influenza virus A / Japan / 1/57 (H2N1) for modeling infection in mice (Patent SU 1735363; Lvov D.K. et al.) [7]. Adapted to reproduction in the lungs of mice.

Существует холодоадаптированный штамм вируса гриппа А/Краснодар/101/59/35 (H2N2) для получения реассортантных штаммов живой гриппозной вакцины штамм (патент РФ №2354695; Гендон Ю.З. с соавторами) [8]. Он предназначен в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантных холодоадаптированных вакцинных штаммов для живой гриппозной вакцины, изготавливают при использовании в качестве субстрата как куриных эмбрионов, так и линии клеток MDCK. Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа.There is a cold-adapted strain of influenza A virus / Krasnodar / 101/59/35 (H2N2) for producing reassortant strains of a live influenza vaccine strain (RF patent No. 2354695; Gendon Yu.Z. et al.) [8]. It is intended as an attenuation donor strain for obtaining reassorted cold-adapted vaccine strains for a live influenza vaccine; it is made using both chicken embryos and the MDCK cell line as a substrate. The invention relates to medical virology and can be used in the production of live cold-adapted attenuated influenza vaccines.

Существует также Штамм вируса гриппа A(H2N3) ГКВ 2237 птиц для моделирования инфекции гриппа (Патент RU 2021354; Смирнов Ю.А. с соавторами; от 05.05.1991) [9]. Изобретение относится к вирусологии и представляет собой штамм вируса гриппа А птиц (А/черная утка/Нью-Джерси/1580/78), вызывающий у мышей манифестную инфекцию, регистрируемую по вирусологическим и серологическим показателям. Возможно его использование для экологических наблюдений над вирусами гриппа А, предусматривающих моделирование экспериментальной гриппозной инфекции.There is also a Strain of influenza A virus (H2N3) of GBV 2237 birds for modeling influenza infection (Patent RU 2021354; Smirnov Yu.A. et al; 05/05/1991) [9]. The invention relates to virology and is a strain of avian influenza A virus (A / black duck / New Jersey / 1580/78), causing a manifest infection in mice, registered by virological and serological indicators. It can be used for environmental observations of influenza A viruses, providing for the modeling of experimental influenza infection.

Он является наиболее близким аналогом, является штаммом-прототипом. Однако недостатком является невозможность его использования для приготовления антигенсодержащего субстрата и применения в диагностике методами РТГА и ПЦР. Он был выделен от дикой птицы.It is the closest analogue, is a prototype strain. However, the disadvantage is the impossibility of its use for the preparation of an antigen-containing substrate and for use in diagnostics by RTGA and PCR. It was isolated from a wild bird.

Поэтому предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н2-субтипа, выделенным от млекопитающего на территории России и единственным известным в мире штаммом вируса гриппа H2N3-субтипа от околоводного млекопитающего с опубликованной последовательностью нуклеотидных остатков всех сегментов генома. Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа Н2-субтипа в России в РТГА не существует.Therefore, the proposed strain is the only known strain of the H2 subtype influenza virus isolated from a mammal in Russia and the only known worldwide strain of the H2N3 subtype influenza virus from a near-water mammal with a published sequence of nucleotide residues of all segments of the genome. The obvious need for its use in the development of a modern diagnostic system of influenza virus of various subtypes in RTGA. To date, there is no commercial antigen and serum for the diagnosis of the H2 subtype influenza virus in rtga in Russia.

За рубежом для РТГА в основном используются следующий референс-штамм A/Singapore/1/57 (H2N2), выделенный более полувека назад (Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer ТМ, Herfst S, Smith D, Rimmelzwaan GF, Olsen B, Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79(5):2814-2) [10]. Он является человеческим и непригоден для использования в диагностике гриппа птиц вследствие антигенного отличия. По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности, поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. Наряду с ним ранее использовался птичий А/mallard/Alberta/77/1977 (H2N3). Однако он антигенно устарел, не является адекватным в настоящий момент.Abroad, for RTGA, the following reference strain A / Singapore / 1/57 (H2N2), isolated more than half a century ago (Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer TM, Herfst S, Smith D, Rimmelzwaan GF, Olsen B, is mainly used , Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79 (5): 2814-2) [10]. It is human and unsuitable for use in the diagnosis of avian influenza due to antigenic differences. Due to the rapid variability of influenza A virus and its antigenic properties, it is imperative to constantly monitor antigenic changes (in particular, surface hemagglutinin HA glycoprotein) to timely replace the producer strain for serodiagnosis of influenza A. Along with it, bird A / mallard / Alberta / was previously used 77/1977 (H2N3). However, it is antigenically outdated; it is not adequate at the moment.

В настоящее время в основном используются тест-системы для определения субтипов вируса гриппа на основе полимеразной цепной реакции и на основе микрочипов (В.А. Рябинин, Е.В. Костина, Г.А. Максакова, А.Н. Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа а с использованием гибридизационного микрочипа // Биоорганическая Химия, 2010, том 36, №6, с. 849-852; Михайлович В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис. … доктор, биол. наук / В.М. Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с) [11], (Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr; 27(2): 120-31). [12], (Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar; 54(3):129-34) [13], (Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep; 160(1-2):163-6.) [14],Currently, test systems are mainly used to determine influenza virus subtypes based on polymerase chain reaction and based on microarrays (V. A. Ryabinin, E. V. Kostina, G. A. Maksakova, A. N. Sinyakov. Hemagglutinin typing influenza a virus using a hybridization microchip // Bioorganic Chemistry, 2010, Volume 36, No. 6, pp. 849-852; Mikhailovich V. M. Identification of infectious agents, genetic determinants of pathogenicity and drug resistance of microorganisms and viruses on biological microarrays: dis. ... doctor, biol. N Uk / V. M. Mikhailovich. - Moscow, 2009. - 197 p.) [11], (Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr; 27 (2): 120-31). [12], (Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar; 54 (3): 129-34) [ 13], (Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep; 160 (1-2): 163-6.) [14],

Однако при апробации этих тест-систем, необходимо применять контрольный референс-штамм Н2 субтипа, наиболее близкий к циркулирующим в настоящее время в природе. В вышеупомянутых исследованиях проверки систем в отношении штамма вируса гриппа Н2 проведено не было. Это связано, в том числе, с отсутствием на отечественном рынке коммерческого референс-штамма Н2.However, when testing these test systems, it is necessary to apply a control reference strain of the H2 subtype that is closest to the currently circulating in nature. In the aforementioned studies, systems were not tested for the influenza virus strain H2. This is due, inter alia, to the lack of a commercial reference strain of H2 in the domestic market.

За рубежом для исследований и в качестве компонента панели референс-штаммов для РТГА и ПЦР применяют целый ряд вирусов.Abroad, a number of viruses are used for research and as a component of the panel of reference strains for rtga and PCR.

Штаммы H2N2 CK/NY/3749-7/96 и H2N4 DK/LA/8174/86 применялись как контрольные при апробации ПЦР-системы детекции вирусов гриппа А и В в реальном времени (Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and В viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1(4): 167-75) [15].Strains H2N2 CK / NY / 3749-7 / 96 and H2N4 DK / LA / 8174/86 were used as control strains for testing the real-time influenza A and B PCR systems (Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and B viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1 (4): 167-75) [15].

При проведении исследований методом нейтрализации с моноклональными антителами к H5N1 (ELISA), в качестве контрольного был использован также штамм A/Duck/Hokkaido/95/2001 (H2N2) (Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell СJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies) [16].When conducting neutralization studies with monoclonal antibodies to H5N1 (ELISA), the strain A / Duck / Hokkaido / 95/2001 (H2N2) (Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis was also used as a control J, Higgins G, Burrell CJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies) [16].

Другой штамм H2N3 A/Duck/Germany/1215/73 был использован в качестве контрольного для разработки и исследования иммуномагнитной ПЦР ловушки вируса гриппа (Dhumpa R, Handberg KJ, Jørgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar; 69(3):258-65) [17].Another strain H2N3 A / Duck / Germany / 1215/73 was used as a control for the development and study of immunomagnetic PCR of the influenza virus trap (Dhumpa R, Handberg KJ, Jørgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar; 69 (3): 258-65) [17].

Для апробации тест-системы экспресс-диагностики высокопатогенного вируса гриппа Н7 была применена панель контрольных штаммов вируса гриппа различных субтипов, которая включала штамм A/duck/Hokkaido/17/2001 (H2N3). Нуклеотидная последовательность этого же штамма была использована для филогенетического анализа штаммов вируса гриппа, выделенных на территории Японии (Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P. 4-21 [18].To test the express diagnostic test system for the highly pathogenic H7 influenza virus, a panel of control strains of influenza virus of various subtypes was used, which included strain A / duck / Hokkaido / 17/2001 (H2N3). The nucleotide sequence of the same strain was used for phylogenetic analysis of influenza virus strains isolated in Japan (Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P. 4- 21 [18].

Для апробации экспресс тест-системы Н5 Dot ELISA на основе двух комплементарных моноклональных антител к вирусу гриппа Н5 субтипа в качестве контроля был использован штамм A/duck/Nanchang/4-184/2000 (H2N9) (Не F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama M, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of H5 avian influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30; 10:330 [19].To test the express test system H5 Dot ELISA based on two complementary monoclonal antibodies to the H5 influenza virus subtype, strain A / duck / Nanchang / 4-184 / 2000 (H2N9) (Not F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama M, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of H5 avian influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30; 10: 330 [19].

На мировом рынке компания Sino Biological Inc. предлагает продукцию, компонентом которой являются рекомбинантные штаммы H2N2:In the global market, Sino Biological Inc. offers products whose component are recombinant strains of H2N2:

Influenza A H2N2 (A/Japan/305/1957)Influenza A H2N2 (A / Japan / 305/1957)

Influenza A H2N2 (A/Canada/720/2005)Influenza A H2N2 (A / Canada / 720/2005)

Influenza A H2N2 (A/Guiyang/1/1957)Influenza A H2N2 (A / Guiyang / 1/1957)

Таким образом, для производства коммерческих систем и наборов, а также для научных исследований ранее использовалось несколько штаммов вируса гриппа Н2 субтипа. Однако все они имеют ряд недостатков. Основная масса штаммов была выделена более двадцати лет назад, и антигенно может быть отличным от ныне существующих вариантов (данные о сравнительных исследованиях отсутствуют). Отсутствует и подробная антигенная характеристика, поэтому применение их в дальнейшем как компонента диагностических систем является нецелесообразным.Thus, several strains of the H2 subtype influenza virus have previously been used for the production of commercial systems and kits, as well as for scientific research. However, they all have a number of disadvantages. The bulk of the strains was isolated more than twenty years ago, and can be antigenically different from the existing options (data on comparative studies are not available). There is also no detailed antigenic characteristic; therefore, their further use as a component of diagnostic systems is impractical.

Предлагаемый штамм отличается от ближайшего аналога (штамм вируса гриппа A(H2N3) ГКВ 2237 птиц для моделирования инфекции гриппа; Патент RU 2021354; Смирнов Ю.А. с соавторами; от 05.05.1991) [9] тем, что в нем отсутствуют указанные недостатки и он пригоден для использования в заявляемой области.The proposed strain differs from the closest analogue (strain of the influenza A (H2N3) virus of the GB bills 2237 for modeling an influenza infection; Patent RU 2021354; Smirnov Yu.A. et al; from 05.05.1991) [9] in that it does not have these drawbacks and it is suitable for use in the claimed field.

Задачей настоящего изобретения получение оригинального штамма-продуцента вируса гриппа H2N2-субтипа, который обладает по сравнению с аналогами следующими преимуществами:The objective of the present invention to obtain the original producer strain of the influenza virus H2N2-subtype, which has compared with analogues of the following advantages:

1. Антигенными характеристиками, позволяющими проводить реакцию торможения гемагглютинации для диагностики современных штаммов вируса гриппа.1. Antigenic characteristics that allow the hemagglutination inhibition test to diagnose modern influenza virus strains.

2. Нуклеотидными последовательностями генов НА и NA, обладающими более 95% идентичности с другими вирусами H2N2 субтипа, выделенными за последние 10 лет, что позволит использовать штамм как контрольный при проведении диагностики.2. The nucleotide sequences of the HA and NA genes, which have more than 95% identity with other H2N2 subtype viruses isolated over the past 10 years, which will allow the strain to be used as a control during diagnostics.

3. Выделен от млекопитающих и способен размножаться на моделях in vivo и in vitro (культура клеток MDCK, мышиная экспериментальная модель, куры); достигать высоких титров - не менее 5 lg TCID50/ml.3. Isolated from mammals and able to breed in vivo and in vitro models (MDCK cell culture, mouse experimental model, chickens); reach high titers - at least 5 lg TCID 50 / ml.

Указанная задача решена выделением, детальной характеристикой и использованием оригинального паспортизованного штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа.This problem was solved by isolation, detailed characterization and use of the original certified A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 strain of the H2N2 subtype.

Технический результат достигается получением штамма вируса гриппа птиц A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа, используемого для приготовления антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей, для применения его в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo, депонированный в государственной Коллекции вирусных инфекций и риккетсиозов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) под регистрационным номером V-623.The technical result is achieved by obtaining a strain of avian influenza virus A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 subtype used for the preparation of antigen-containing preparation and polyclonal serum for diagnostic purposes, for use as a control reference sample for assessing the specificity of test systems based on polymerase chain reaction, as well as to study the effectiveness of antiviral drugs in vitro and in vivo, deposited in the State Collection of viral infections and rickettsioses of the Federal budget rezhdeniya science "State Research Center of Virology and Biotechnology" Vector "(Koltsovo, Novosibirsk Region) under the registration number V-623.

Предлагаемый штамм является единственным известным штаммом вируса гриппа Н2-субтипа, выделенным от млекопитающего за последние 10 лет. Этот факт подчеркивает важность его использования для тестирования лекарственных препаратов на животной модели (мыши, хорьки). Очевидна необходимость использования его при разработке современной диагностической системы вируса гриппа различных субтипов в РТГА.The proposed strain is the only known strain of influenza virus H2 subtype isolated from a mammal over the past 10 years. This fact underlines the importance of its use for testing drugs in animal models (mice, ferrets). The obvious need for its use in the development of a modern diagnostic system of influenza virus of various subtypes in RTGA.

По причине быстрой изменчивости вируса гриппа А, его антигенных свойств крайне необходимо постоянно отслеживать антигенные изменения (в частности, поверхностного гликопротеина гемагглютинина НА) для своевременной замены штамма-продуцента для серодиагностики вируса гриппа А. На сегодняшний день коммерческого антигена и сыворотки для диагностики вируса гриппа Н2-субтипа в России в РТГА не существует.Due to the rapid variability of influenza A virus and its antigenic properties, it is imperative to constantly monitor antigenic changes (in particular, surface hemagglutinin HA glycoprotein) to timely replace the producer strain for serodiagnosis of influenza A virus. Today, there is a commercial antigen and serum for the diagnosis of influenza H2 virus -subtype in Russia in the RTGA does not exist.

Характеристика штамма:Characteristic strain:

Штамм принят на патентное депонирование под номером V-623 в Коллекцию микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Новосибирская область).The strain was accepted for patent deposition under the number V-623 in the Collection of microorganisms of the Federal State Budget Scientific Center of the SEC of the World Bank "Vector" (Koltsovo, Novosibirsk Region).

Штамм был выделен от околоводного млекопитающего ондатры (Ondatra zibethicus) на территории Новосибирской области. Принадлежность к H2N2-субтипу определена методом PCR. Подтвержден в реакции PCR с типирующими праймерами на гемагглютинин (H1-H16) и нейраминидазу (N1-N9) (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105P) [20], (Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P. 193-198). [21].The strain was isolated from a near-water mammal of a muskrat (Ondatra zibethicus) in the territory of the Novosibirsk region. Belonging to the H2N2 subtype was determined by PCR. Confirmed in the PCR reaction with typing primers for hemagglutinin (H1-H16) and neuraminidase (N1-N9) (Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105P) [20], (Bao- Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P. 193-198). [21].

Принадлежность гемагглютинина штамма к Н2-субтипу подтверждена определением и сравнительным анализом нуклеотидной последовательности фрагмента гена гемагглютинина (1701 н.о.).The belonging of the hemagglutinin strain to the H2 subtype is confirmed by the determination and comparative analysis of the nucleotide sequence of the hemagglutinin gene fragment (1701 n.a.).

Определены первичные последовательности полного генома исследуемого штамма (табл. 1).The primary sequences of the complete genome of the studied strain were determined (Table 1).

Figure 00000001
Figure 00000001

Был проведен филогенетический анализ гена геагглютинина методом максимального правдоподобия с бутстреп анализом (1000 повторов). Ниже представлено филогенетическое дерево гена гемагглютинина Н2-субтипа, исследуемый штамм отмечен. Как видно из дендрограммы, наиболее родственен штамма, выделенным ранее на территории Европы, Монголии, стран Юго-Восточной Азии. Данный результат может свидетельствовать о персистенции данной генетический линии Н2-субтипа на территории Евразийского континента. При сравнении исследуемого штамма с ранними референс-штаммами было показано, что штаммы филогенетически различны. Штаммы не только принадлежат генетически к отдаленным линиям вируса, но и разделены достаточно длительным промежутком времени. А в связи с быстрой изменчивостью вируса гриппа, это может приводить к значительным генетическим изменениям. Что и показано с помощью филогенетического анализа.The phagogenetic analysis of the geagglutinin gene was carried out using the maximum likelihood method with bootstrap analysis (1000 repetitions). Below is the phylogenetic tree of the H2 subtype hemagglutinin gene, the studied strain is marked. As can be seen from the dendrogram, the most closely related strain isolated earlier in Europe, Mongolia, and the countries of Southeast Asia. This result may indicate the persistence of this genetic line of the H2 subtype on the territory of the Eurasian continent. When comparing the studied strain with early reference strains, it was shown that the strains are phylogenetically different. The strains not only belong genetically to distant lines of the virus, but are also separated by a fairly long period of time. And due to the rapid variability of the influenza virus, this can lead to significant genetic changes. As shown by phylogenetic analysis.

Figure 00000002
Figure 00000002

Анализ показывает актуальность, и целесообразность использования штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа для создания антигенсодержащего препарата вируса гриппа Н2-субтипа, который далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н2-субтипа.The analysis shows the relevance and feasibility of using the A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 subtype strain to create an antigen-containing preparation of the H2 subtype influenza virus, which can then be used to perform the hemagglutination inhibition reaction to detect influenza H2 hemagglutinin antibodies subtype.

При культивировании в системе развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) данного штамма инфекционный титр достигал 6,4 lg EID50/мл, в культуре клеток MDCK 5,375 TCID50/ml. Максимальная продукция гемагглютинина в аллантоисной жидкости РКЭ составляла 1280 ГАЕ/мл. Данные свойства позволяют эффективно использовать предлагаемый штамм для получения антигена штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2.When cultured in the system of developing chicken embryos (RKE) of this strain, the infectious titer reached 6.4 lg EID50 / ml, in an MDCK cell culture 5.375 TCID 50 / ml. The maximum production of hemagglutinin in the allantoic fluid of RCE was 1280 GAU / ml. These properties allow you to effectively use the proposed strain to obtain the antigen strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2.

В эксперименте штамм имеет одинаковые, титры в реакции гемагглютинации с эритроцитами следующих видов животных: курица, гусь, лошадь.In the experiment, the strain has the same titers in the hemagglutination reaction with red blood cells of the following animal species: chicken, goose, horse.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:The invention is illustrated by the following examples:

Пример 1. Получение поликлональной сыворотки на штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 вируса гриппа H2N2-субтипа.Example 1. Obtaining polyclonal serum for strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 influenza virus H2N2 subtype.

Трем 8-недельным курицам породы Род-Айленд (кросс Изобраун) была внутривенно (в подкрыльцовую вену) введена вируссодержащая жидкость, содержащая 640 ГАЕ/мл. Жидкость представляла собой раствор вируссодержащей аллантоисной жидкости в физиологическом растворе (1:1). Объем вируссодержащего раствора составил 2,5 мл на каждое животное. До заражения у каждого животного была отобрана кровь (1 мл) для контрольной постановки РТГА сыворотки с антигеном штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. РТГА дала отрицательный результат. По истечении 21 суток после инфицирования была тотально отобрана кровь и получена сыворотка крови в объеме 5-10 мл от каждого животного.Three 8-week-old Rhode Island chickens (cross Isobraun) received a virus-containing liquid containing 640 GAU / ml intravenously (in the axillary vein). The liquid was a solution of virus-containing allantoic fluid in physiological saline (1: 1). The volume of the virus-containing solution was 2.5 ml per animal. Prior to infection, blood (1 ml) was taken from each animal for the control formulation of rtga of serum with antigen of strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2. RTGA gave a negative result. After 21 days after infection, blood was totally taken and blood serum was obtained in a volume of 5-10 ml from each animal.

После 10 суток после инфицирования была отобрана кровь для постановки промежуточной реакции торможения гемагглютинации.After 10 days after infection, blood was taken for an intermediate hemagglutination inhibition reaction.

Титр сыворотки в РТГА с антигеном предлагаемого штамма составил 1/320-1/640 (табл. 2). Диагностическим является значение титра сыворотки в РТГА≥1/40 [21]. Таким образом, при заражении кур получена сыворотка, которая может использоваться для определения принадлежности к Н2-субтипу вариантов вируса гриппа, антигенно близких штамму A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. Для серодиагностики необходимо использовать поликлональную сыворотку в паре с антигеном данного штамма (см. пример 2).The serum titer in rtga with the antigen of the proposed strain was 1 / 320-1 / 640 (table. 2). Diagnostic is the value of serum titer in rtga≥1 / 40 [21]. Thus, when the chickens were infected, a serum was obtained that can be used to determine the belonging to the H2 subtype of influenza virus variants antigenically close to strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2. For serodiagnosis, it is necessary to use polyclonal serum paired with the antigen of this strain (see example 2).

Figure 00000003
Figure 00000003

Пример 2. Приготовление антигенсодержащего диагностического препарата на основе штамма вируса гриппа A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа.Example 2. Preparation of an antigen-containing diagnostic preparation based on the influenza virus strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 subtype.

Для приготовления антигенсодержащего препарата вируссодержащую аллантоисную жидкость инактивируют 0,05% β-пропиолактоном при температуре 37 С в течение 2 ч. Далее необходимо подтвердить инактивацию вируса заражением чувствительной системы-3 пассажа (РКЭ). Полученный антигенсодержащий субстрат хранится при температуре +4-+7С, без снижения гемагглютинирующего титра в течение 12 месяцев.To prepare an antigen-containing preparation, the virus-containing allantoic fluid is inactivated with 0.05% β-propiolactone at a temperature of 37 ° C for 2 hours. Next, the inactivation of the virus must be confirmed by infection of the sensitive passage system-3 (RCE). The resulting antigen-containing substrate is stored at a temperature of + 4- + 7C, without reducing the hemagglutinating titer for 12 months.

Таким образом, полученный антигенсодержащий препарат вируса гриппа Н2-субтипа далее может быть использован при проведении реакции торможения гемагглютинации для детектирования антител к гемагглютинину вируса гриппа Н2-субтипа в сыворотке крови. Применение предлагаемого штамма в качестве антигена для проведения РТГА описано в примере 1 (табл. 2).Thus, the resulting antigen-containing preparation of the H2-subtype influenza virus can then be used in the hemagglutination inhibition reaction to detect serum H2-subtype influenza hemagglutinin antibodies. The use of the proposed strain as an antigen for conducting rtga is described in example 1 (table. 2).

Пример 3. Подтверждение специфичности разработанного праймера, предназначенного для диагностики Н2-субтипа гемагглютинина методом ПЦР.Example 3. Confirmation of the specificity of the developed primer designed for the diagnosis of the H2 subtype of hemagglutinin by PCR.

Для типирования изолятов методом ПЦР амплификацию проводили набором Fast PCR Mix (Fermentas, США) с парами подтипспецифичных праймеров - для определения подтипов изолятовFor typing of isolates by PCR amplification was performed using a Fast PCR Mix kit (Fermentas, USA) with pairs of subtype-specific primers - to determine the subtypes of isolates

Состав реакционной смеси:The composition of the reaction mixture:

1) MasterMix - 10 мкл1) MasterMix - 10 μl

2) кДНК - 2 мкл2) cDNA - 2 μl

3) Прямой праймер (2 o.u) - 1 мкл3) Direct primer (2 o.u) - 1 μl

4) Обратный праймер (2 o.u) - 1 мкл4) Reverse primer (2 o.u) - 1 μl

5) Вода Nuclease-free - 4 мкл5) Nuclease-free water - 4 μl

Figure 00000004
Figure 00000004

Для наработки ПЦР продукта для определения первичной последовательности проводили амплификацию с праймерами, специфичными к генам НА и NA.To produce a PCR product for determining the primary sequence, amplification was performed with primers specific for the HA and NA genes.

Программа для амплификатораProgram for the amplifier

1) T=95°C, 10 секунд,1) T = 95 ° C, 10 seconds,

2) T=52°C, 30 секунд2) T = 52 ° C, 30 seconds

3) T=72°C, 20 секунд3) T = 72 ° C, 20 seconds

4) T=4°C хранение.4) T = 4 ° C storage.

В таблице 3 приведены результаты контрольной реакции ПЦР с использованием разработанного праймера Н2. В качестве контрольных используются штаммы референс-панели (St. Jude Research Hospital, США) и предлагаемый штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2.Table 3 shows the results of the control PCR reaction using the developed H2 primer. As control strains are used reference panel (St. Jude Research Hospital, USA) and the proposed strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2.

Таким образом, штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа был использован как контрольный при постановке реакции ПЦР с использованием разработанного праймера для субтипирования Н2 гемагглютинина. Положительный результат получен исключительно со штаммом A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. Праймер не проявил специфичности к контрольным референс-штаммам всех остальных субтипов (H1-H15).Thus, the A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 strain of the H2N2 subtype was used as a control when setting up the PCR reaction using the developed primer for subtyping H2 hemagglutinin. A positive result was obtained exclusively with strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2. The primer did not show specificity for the control reference strains of all other subtypes (H1-H15).

Пример 4. Адаптация штамма вируса гриппа A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 и моделирование летальной гриппозной инфекции у мышей линии BALB/c.Example 4. Adaptation of a strain of influenza virus A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 and modeling of lethal influenza infection in BALB / c mice.

Штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 адаптировали в серии последовательных пассажей через легкие мышей линии BALB/c. Для чего по три мыши заражали интраназально 50 мкл физиологического раствора, содержащего 103 TCID50 вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. Эта доза заражения выбрана, исходя из того, что в предварительных экспериментах было показано наличие выраженных симптомов заболевания на третьи-четвертые сутки после инфицирования мышей в этом диапазоне концентраций. На третьи сутки после инфицирования мышей умерщвляли и из их легких готовили 10%-ные гомогенаты на физиологическом растворе. После этого вновь проводили интраназальное заражение мышей 10%-ми гомогенатами легких в объеме 50 мкл. Параллельно инфекционные титры вируса в легких мышей определяли титрованием 10%-го гомогената на клетках MDCK (табл. 4).Strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 was adapted in a series of consecutive passages through the lungs of BALB / c mice. What three mice were challenged intranasally with 50 .mu.l of physiological saline containing March 10 TCID 50 of the virus A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2. This dose of infection was chosen based on the fact that preliminary experiments showed the presence of severe symptoms of the disease on the third or fourth day after infection of mice in this concentration range. On the third day after infection, the mice were sacrificed and 10% homogenates in physiological saline were prepared from their lungs. After this, intranasal infection of mice with 10% lung homogenates was again carried out in a volume of 50 μl. In parallel, infectious virus titers in the lungs of mice were determined by titration of 10% homogenate on MDCK cells (Table 4).

Figure 00000005
Figure 00000005

Как следует из данных, представленных в табл. 4, инфекционный титр вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 увеличивался от пассажа к пассажу. После того как вирус прошел восемь пассажей на мышах, был наработан его пул на клетках MDCK. Инфекционный титр пула вируса сравнялся с титром исходного вируса и составил 5,65±0,24 lg TCID50/мл. При этом 50%-ная летальная для мышей доза (MLD50) составила 1,6±0,1 lg TCID50/мл.As follows from the data presented in table. 4, the infectious titer of the A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 virus increased from passage to passage. After the virus went through eight passages in mice, its pool on MDCK cells was developed. The infectious titer of the virus pool was equal to the titer of the original virus and amounted to 5.65 ± 0.24 log TCID50 / ml. Moreover, the 50% lethal dose for mice (MLD 50 ) was 1.6 ± 0.1 lg TCID 50 / ml.

Поскольку доклинические испытания противогриппозных лекарственных препаратов проводят, главным образом, на мышах, патогенность полученного штамма была тщательно исследована в экспериментах на этих животных с использованием различных доз заражения.Since preclinical trials of anti-influenza drugs are carried out mainly on mice, the pathogenicity of the obtained strain was carefully studied in experiments on these animals using various doses of infection.

Пул вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 использовали для интраназального заражения мышей линии BALB/c. На растворе Хенкса готовили десятичные разведения вируса в диапазоне концентраций 10-1-10-5. Под легким эфирным наркозом по 10 мышей заражали подготовленными разведениями вируса в объеме 50 мкл. В течение 21 сут вели наблюдение за мышами: ежедневно проводили учет павших животных. Дозу вируса, вызывающую 50%-ую гибель мышей, рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина (Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - М.:, Медгиз, 1962. - 179 с) [22]. Рассчитанное значение MLD50 составило 1,6±0,1 lg TCID50/мл.A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 virus pool was used for intranasal infection of BALB / c mice. Decimal dilutions of the virus were prepared on a Hanks solution in a concentration range of 10 -1 -10 -5 . Under mild ether anesthesia, 10 mice were infected with prepared dilutions of the virus in a volume of 50 μl. Mice were monitored for 21 days: fallen animals were counted daily. The dose of the virus that causes 50% death of mice was calculated according to the Kerber method in the modification of Ashmarin (Ashmarin, I.P. Statistical methods in microbiological research / I.P. Ashmarin, A.A. Vorobyov. - M.: Medgiz, 1962. - 179 s) [22]. The calculated value of MLD 50 was 1.6 ± 0.1 log TCID 50 / ml.

После определения MLD50 были проведены эксперименты по моделированию гриппозной пневмонии мышей с различной степенью летальности. Для этого мышей заражали 0,5 и 10 MLD50. Наблюдение за мышами вели в течение 16 дней после инфицирования. Мышей взвешивали через день. Ежедневно учитывали павших животных и высчитывали среднюю продолжительность жизни мышей (MSD) по формуле: MSD=Σf(d-1)/n, где f - количество мышей умерших на день d, а также мыши, выжившие на момент завершения эксперимента (d в этом случае - 15), n - количество мышей в группе.After determining the MLD 50 , experiments were carried out to simulate influenza pneumonia in mice with varying degrees of mortality. For this, mice were infected with 0.5 and 10 MLD 50 . Mice were monitored for 16 days after infection. Mice were weighed every other day. The dead animals were counted daily and the average life expectancy of mice (MSD) was calculated by the formula: MSD = Σf (d-1) / n, where f is the number of mice that died on day d, as well as the mice that survived at the time of the experiment (d in this case - 15), n is the number of mice in the group.

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 0,5MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости на 7-8 день после инфицирования наблюдали клинические симптомы заболевания (снижение активности, потеря аппетита, одышка, тремор, изменение качества шерсти), а также снижение массы тела на 12±7%. На 14 день после заражения две мыши погибли (MSD - 14,6 дней). Снижение массы тела прекратилось после 13-го дня наблюденияDuring intranasal infection of BALB / c mice (n = 10) 0.5MLD 50 in 50 μl of virus-containing fluid 7-8 days after infection, clinical symptoms of the disease were observed (decreased activity, loss of appetite, shortness of breath, tremor, change in coat quality), and also a decrease in body weight by 12 ± 7%. On the 14th day after infection, two mice died (MSD - 14.6 days). Weight loss stopped after the 13th day of observation

При интраназальном заражении мышей линии BALB/c (n=10) 10MLD50 в 50 мкл вируссодержащей жидкости первые признаки заболевания, а также снижение массы тела на 14±4% наблюдали уже на 3-4 сутки после инфицирования. Гибель мышей регистрировали, начиная с шестого дня после заражения. Потеря массы тела быстро прогрессировала и доходила до 35%. К 10 сут наблюдения все 10 мышей погибли, а средняя продолжительность жизни мышей составила 6,1±0,6 дней.With intranasal infection of BALB / c mice (n = 10) 10MLD 50 in 50 μl of virus-containing fluid, the first signs of the disease, as well as a 14 ± 4% decrease in body weight, were observed already 3-4 days after infection. The death of mice was recorded starting from the sixth day after infection. Weight loss progressed rapidly and reached 35%. By 10 days of observation, all 10 mice died, and the average life expectancy of mice was 6.1 ± 0.6 days.

В то же время дикий штамм A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 в эквивалентных в пересчете на TCID50 дозах не оказывал видимого негативного воздействия на мышей. Однако при заражении мышей линии BALB/c штаммом A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 в диапазоне концентраций 104-106 TCID50/мышь через 2-3 сут после инфицирования отмечали описанные выше симптомы заболевания, а на 4 сут от момента инфицирования наблюдали полное клиническое выздоровление животных.At the same time, the wild strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 in equivalent doses in terms of TCID 50 did not have a visible negative effect on mice. However, when BALB / c mice were infected with strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 in the concentration range 10 4 -10 6 TCID 50 / mouse, the symptoms described above were noted 2-3 days after infection, and on day 4 from the time of infection, the animals were observed to be fully clinically recovering.

Была определена кинетика репликации дикого и адаптированного штаммов в легких подопытных животных. Гомогенаты легких мышей, зараженных 10 MLD50 штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 - ADAPT и 106 TCID50 штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2, титровали через 1, 3, 6 и 9 сут после заражения. Титр адаптированого вируса в течение всего периода наблюдения был на 1-2 lg выше титра вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2. Вирус адаптированный реплицировался в легких мышей вплоть до 9 сут. В то же время на 9-е сут нам не удалось зарегистрировать размножения вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 в культуре клеток MDCK. Надо отметить, что к этому времени у мышей исчезли клинические симптомы заболевания, что, видимо, напрямую связано со снижением эффективности репликации вируса в легких животных.The kinetics of replication of wild and adapted strains in the lungs of experimental animals was determined. The homogenates of the lungs of mice infected with 10 MLD 50 strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 - ADAPT and 10 6 TCID 50 strain A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 were titrated through 1, 3, 6 and 9 days after infection. The titer of the adapted virus during the entire observation period was 1-2 lg higher than the titer of the virus A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2. The adapted virus replicated in the lungs of mice up to 9 days. At the same time, on the 9th day, we were not able to register the propagation of the A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 virus in the MDCK cell culture. It should be noted that by this time the clinical symptoms of the disease disappeared in mice, which, apparently, is directly associated with a decrease in the efficiency of virus replication in the lungs of animals.

Таким образом, при адаптации вируса A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2 к легким мышей, был получен летальный вариант вируса. При помощи модели гриппозной пневмонии мышей, созданной с использованием адаптированного штамма A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2, можно осуществлять оценку эффективности противогриппозных лекарственных препаратов in vivo.Thus, upon adaptation of the A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 virus to the lungs of mice, a lethal variant of the virus was obtained. Using the mouse influenza pneumonia model created using the adapted A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2 strain, the in vivo efficacy of anti-influenza drugs can be evaluated.

Использованные источники информацииInformation Sources Used

1. Львов, Д.К. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А - животные - человек / Д.К. Львов // Вопросы вирусологии. - 2005. - №4. - С. 4-11.1. Lviv, D.K. Inter-population interactions in the system of influenza A viruses - animals - humans / D.K. Lviv // Questions of Virology. - 2005. - No. 4. - S. 4-11.

2. Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht СЕ, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109(11):4269-74).2. Tong S, Li Y, Rivailler P, Conrardy C, Castillo DA, Chen LM, Recuenco S, Ellison JA, Davis CT, York IA, Turmelle AS, Moran D, Rogers S, Shi M, Tao Y, Weil MR, Tang K, Rowe LA, Sammons S, Xu X, Frace M, Lindblade KA, Cox NJ, Anderson LJ, Rupprecht CE, Donis RO A distinct lineage of influenza A virus from bats. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 Mar 13; 109 (11): 4269-74).

3. Isakova-Sivak I, de Jonge J, Smolonogina T, Rekstin A, van Amerongen G, van Dijken H, Mouthaan J, Roholl P, Kuznetsova V, Doroshenko E, Tsvetnitsky V, Rudenko L. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. PLoS One. 2014 Jul 24; 9(7):e102339.3. Isakova-Sivak I, de Jonge J, Smolonogina T, Rekstin A, van Amerongen G, van Dijken H, Mouthaan J, Roholl P, Kuznetsova V, Doroshenko E, Tsvetnitsky V, Rudenko L. Development and pre-clinical evaluation of two LAIV strains against potentially pandemic H2N2 influenza virus. Plos one. 2014 Jul 24; 9 (7): e102339.

4. Nabel GJ, Wei CJ, Ledgerwood JE. Vaccinate for the next H2N2 pandemic now. Nature, 2011. 471: 157-158.4. Nabel GJ, Wei CJ, Ledgerwood JE. Vaccinate for the next H2N2 pandemic now. Nature, 2011.471: 157-158.

5. Pappas C, Yang H, Carney PJ, Pearce MB, Katz JM, Stevens J, Tumpey TM. Assessment of transmission, pathogenesis and adaptation of H2 subtype influenza viruses in ferrets. Virology. 2015 Mar; 477:61-71. doi: 10.1016/j.virol.2015.01.002. Epub 2015 Feb 5.5. Pappas C, Yang H, Carney PJ, Pearce MB, Katz JM, Stevens J, Tumpey TM. Assessment of transmission, pathogenesis and adaptation of H2 subtype influenza viruses in ferrets. Virology. 2015 Mar; 477: 61-71. doi: 10.1016 / j.virol.2015.01.002. Epub 2015 Feb 5.

6. Jones JC, Baranovich T, Marathe BM, Danner AF, Seiler JP, Franks J, Govorkova EA, Krauss S, Webster RG. Risk assessment of H2N2 influenza viruses from the avian reservoir. J Virol. 2014 Jan; 88(2): 1175-88. doi: 10.1128/JVI.02526-13. Epub 2013 Nov 13.6. Jones JC, Baranovich T, Marathe BM, Danner AF, Seiler JP, Franks J, Govorkova EA, Krauss S, Webster RG. Risk assessment of H2N2 influenza viruses from the avian reservoir. J Virol. 2014 Jan; 88 (2): 1175-88. doi: 10.1128 / JVI.02526-13. Epub 2013 Nov 13.

7. Патент SU 1735363 от 09.07.1990, патентообладатель Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского7. Patent SU 1735363 dated July 9, 1990, patent holder of the Institute of Virology named after DI. Ivanovsky

8. Патент РФ №2354695 от 07.07.2007, патентообладатель ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова8. Patent of the Russian Federation No. 2354695 dated 07/07/2007, patent holder of the GU NIIIVS im. I.I. Mechnikov

9. Патент RU 2021354 от 05.05.1991. патентообладатель НИИ вирусологии им Д.И. Ивановского РАМН9. Patent RU 2021354 dated 05/05/1991. patent holder of the Research Institute of Virology named after D.I. Ivanovo RAMS

10. Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer TM, Herfst S, Smith D, Rimmelzwaan GF, Olsen B, Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79(5):2814-2210. Fouchier RA, Munster V, Wallensten A, Bestebroer TM, Herfst S, Smith D, Rimmelzwaan GF, Olsen B, Osterhaus AD. Characterization of a novel influenza A virus hemagglutinin subtype (H16) obtained from black-headed gulls. J Virol. 2005 Mar; 79 (5): 2814-22

11. В.А. Рябинин, E.В. Костина, Г.А. Максакова, A.H. Синяков. Типирование гемагглютинина вируса гриппа А с использованием гибридизационного микрочипа // Биоорганическая Химия, 2010, том 36, №6, с. 849-852; Михайлович, В.М. Идентификация инфекционных агентов, генетических детерминант патогенности и лекарственной устойчивости микроорганизмов и вирусов на биологических микрочипах: дис. … доктор, биол. наук / В.М. Михайлович. - Москва, 2009. - 197 с.11. V.A. Ryabinin, E.V. Kostina, G.A. Maksakova, A.H. Sinyakov. Typing of influenza A virus hemagglutinin using a hybridization microchip // Bioorganic Chemistry, 2010, Volume 36, No. 6, p. 849-852; Mikhailovich, V.M. Identification of infectious agents, genetic determinants of pathogenicity and drug resistance of microorganisms and viruses on biological microarrays: dis. ... doctor, biol. sciences / V.M. Mikhailovich. - Moscow, 2009 .-- 197 p.

12. Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr; 27(2):120-31.12. Qin ZF, Sun J, Lu TK, Zeng SL, Hua QY, Ling QY, Chen SK, Lv JQ, Zhang CH, Cheng B, Ruan ZX, Bi YZ, Giambrone JJ, Wu HZ. Subtyping animal influenza virus with general multiplex RT-PCR and Liquichip high throughput (GMPLex). Virol Sin. 2012 Apr; 27 (2): 120-31.

13. Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar; 54(3):129-34.13. Inoue E, Wang X, Osawa Y, Okazaki K. Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers. Microbiol Immunol. 2010 Mar; 54 (3): 129-34.

14. Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep; 160(1-2):163-6.).14. Jindal N, Chander Y, de Abin M, Sreevatsan S, Stallknecht D, Halvorson DA, Goyal SM. Amplification of four genes of influenza A viruses using a degenerate primer set in a one step RT-PCR method. J Virol Methods. 2009 Sep; 160 (1-2): 163-6.).

15. Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and В viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1(4):167-75.15. Daum LT, Canas LC, Arulanandam BP, Niemeyer D, Valdes JJ, Chambers JP. Real-time RT-PCR assays for type and subtype detection of influenza A and B viruses. Influenza Other Respi Viruses. 2007 Jul; 1 (4): 167-75.

16. Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell CJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies to different clades of Influenza A H5N1 viruses. J Virol Methods. 2009 May; 157(2):161-7.16. Oh S, Selleck P, Temperton NJ, Chan PK, Capecchi B, Manavis J, Higgins G, Burrell CJ, Kok T. Neutralizing monoclonal antibodies to different clades of Influenza A H5N1 viruses. J Virol Methods. 2009 May; 157 (2): 161-7.

17. Dhumpa R, Handberg KJ, Jørgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar; 69(3):258-65.17. Dhumpa R, Handberg KJ, Jørgensen PH, Yi S, Wolff A, Bang DD. Rapid detection of avian influenza virus in chicken fecal samples by immunomagnetic capture reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 Mar; 69 (3): 258-65.

18. Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P. 4-21.18. Rashid Manzoor. Studies on the Diagnosis and Molecular Epidemiology of Avian Influenza. 2008, Hokkaido University Collection of Scholarly and Academic Papers: HUSCAP. P. 4-21.

19. He F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama M, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of H5 avian influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30; 10:330.19. He F, Soejoedono RD, Murtini S, Goutama M, Kwang J. Complementary monoclonal antibody-based dot ELISA for universal detection of H5 avian influenza virus. BMC Microbiol. 2010 Dec 30; 10: 330.

20. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105 P.;20. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. World Health Organization (WHO). - 2002. - 105 P .;

21. Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P. 193-198.).21. Bao-Feng Qiu et al. A reverse transcription-PCR for subtyping of the neuraminidase of avian influenza viruses // Journal of Virological Methods. - 2009. - 155. - P. 193-198.).

22. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - М.:, Медгиз, 1962. - 179 с.22. Ashmarin, I.P. Statistical methods in microbiological research / I.P. Ashmarin, A.A. Vorobiev. - M.: Medgiz, 1962 .-- 179 p.

Claims (1)

Штамм вируса гриппа птиц A/Common Muskrat/Chany Lake/226/05 H2N2-субтипа для приготовления антигенсодержащего субстрата и сыворотки для серодиагностики гриппа Н2-субтипа в РТГА, для применения в качестве контрольного референс-образца при оценке специфичности тест-систем на основе полимеразной цепной реакции, а также для исследования эффективности противовирусных препаратов in vitro и in vivo, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером V-623.The strain of avian influenza virus A / Common Muskrat / Chany Lake / 226/05 H2N2-subtype for the preparation of antigen-containing substrate and serum for serodiagnosis of influenza H2-subtype in rtga, for use as a reference reference sample in assessing the specificity of test systems based on polymerase chain reaction, as well as to study the effectiveness of antiviral drugs in vitro and in vivo, deposited in the Collection of microorganisms of the Federal budget institution of science "State scientific center of virology and biotechnology" Vector "under the register Part number V-623.
RU2015155635A 2015-12-24 2015-12-24 Strain of influenza virus a/common muskrat/chany lake/226/05 h2n2-subtype for use in diagnostics of influenza virus by methods of rtga and pcr and studying efficacy of antiviral preparations in vitro and in vivo RU2606030C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015155635A RU2606030C1 (en) 2015-12-24 2015-12-24 Strain of influenza virus a/common muskrat/chany lake/226/05 h2n2-subtype for use in diagnostics of influenza virus by methods of rtga and pcr and studying efficacy of antiviral preparations in vitro and in vivo

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015155635A RU2606030C1 (en) 2015-12-24 2015-12-24 Strain of influenza virus a/common muskrat/chany lake/226/05 h2n2-subtype for use in diagnostics of influenza virus by methods of rtga and pcr and studying efficacy of antiviral preparations in vitro and in vivo

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2606030C1 true RU2606030C1 (en) 2017-01-10

Family

ID=58452287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015155635A RU2606030C1 (en) 2015-12-24 2015-12-24 Strain of influenza virus a/common muskrat/chany lake/226/05 h2n2-subtype for use in diagnostics of influenza virus by methods of rtga and pcr and studying efficacy of antiviral preparations in vitro and in vivo

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2606030C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2354695C1 (en) * 2007-07-17 2009-05-10 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова) Attenuated cold-adapted strain of influenza virus a/krasnodar/101/59/35(h2n2) for obtaining strains of live intranasal influenza vaccine
RU2496872C1 (en) * 2012-06-04 2013-10-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (НГУ) STRAIN OF FLU VIRUS A/common gull/Altai/804/2011/H16NO-SUBTYPE FOR PRODUCTION OF ANTIGENE-CONTAINING PREPARATION, POLYCLONAL SERUM AND APPLICATION AS CONTROL REFERENCE-SAMPLE WHEN ASSESSING SPECIFICITY OF TEST-SYSTEMS BASED ON POLYMERASE CHAIN REACTION

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2354695C1 (en) * 2007-07-17 2009-05-10 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова) Attenuated cold-adapted strain of influenza virus a/krasnodar/101/59/35(h2n2) for obtaining strains of live intranasal influenza vaccine
RU2496872C1 (en) * 2012-06-04 2013-10-27 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (НГУ) STRAIN OF FLU VIRUS A/common gull/Altai/804/2011/H16NO-SUBTYPE FOR PRODUCTION OF ANTIGENE-CONTAINING PREPARATION, POLYCLONAL SERUM AND APPLICATION AS CONTROL REFERENCE-SAMPLE WHEN ASSESSING SPECIFICITY OF TEST-SYSTEMS BASED ON POLYMERASE CHAIN REACTION

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NEROME K et al., Persistence of Q strain of H2N2 influenza virus in avian species: antigenic, biological and genetic analysis of avian and human H2N2 viruses, Arch Virol., 1984, Vol.81, pp.239-50. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Linster et al. Identification, characterization, and natural selection of mutations driving airborne transmission of A/H5N1 virus
Shanmuganatham et al. Antigenic and molecular characterization of avian influenza A (H9N2) viruses, Bangladesh
Löndt et al. Pathogenesis of highly pathogenic avian influenza A/turkey/Turkey/1/2005 H5N1 in Pekin ducks (Anas platyrhynchos) infected experimentally
Ansari et al. Surveillance, epidemiological, and virological detection of highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses in duck and poultry from Bangladesh
Yuan et al. Pathogenicity and transmission of H5N1 avian influenza viruses in different birds
El Zowalaty et al. Avian influenza: virology, diagnosis and surveillance
Bragstad et al. New avian influenza A virus subtype combination H5N7 identified in Danish mallard ducks
Sitaras et al. Immune escape mutants of highly pathogenic avian influenza H5N1 selected using polyclonal sera: identification of key amino acids in the HA protein
Hagag et al. Pathogenicity of highly pathogenic avian influenza virus H5N1 in naturally infected poultry in Egypt
European Food Safety Authority et al. Avian influenza overview November 2018–February 2019
Almayahi et al. First report of human infection with avian influenza A (H9N2) virus in Oman: The need for a One Health approach
Cox et al. Public health implications of animal influenza viruses
Sharshov et al. Molecular characterization and phylogenetics of a reassortant H13N8 influenza virus isolated from gulls in Mongolia
RU2522813C1 (en) STRAIN OF INFLUENZA VIRUS OF SUBTYPE A/pochard/Siberia/249/08-MA H10N7 FOR OBTAINING ANTIGEN-CONTAINING DIAGNOSTIC PREPARATION AND DIAGNOSTIC POLYCLONAL SERUM, APPLICATION AS CONTROL REFERENCE-SAMPLE IN EVALUATING SPECIFICITY OF TEST SYSTEMS BASED ON PCR AND FOR STUDY OF ANTIVIRAL PREPARATIONS in vitro AND in vivo
Lenny et al. Replication capacity of avian influenza A (H9N2) virus in pet birds and mammals, Bangladesh
Thor et al. Detection and characterization of clade 1 reassortant H5N1 viruses isolated from human cases in Vietnam during 2013
Mo et al. The pathogenicity and transmission of live bird market H2N2 avian influenza viruses in chickens, Pekin ducks, and guinea fowl
RU2606030C1 (en) Strain of influenza virus a/common muskrat/chany lake/226/05 h2n2-subtype for use in diagnostics of influenza virus by methods of rtga and pcr and studying efficacy of antiviral preparations in vitro and in vivo
Gharieb et al. Influenza A viruses in birds and humans: Prevalence, molecular characterization, zoonotic significance and risk factors' assessment in poultry farms
Cox et al. Public health implications of avian influenza viruses
RU2631932C1 (en) Strain of influenza virus a/black-headed gull/kamchatka/123/2013 h11n8-subtitle for use in influenza virus diagnosis by hir and pcr methods and study of effectiveness of in vitro and in vivo anti-viral preparations
Shrestha et al. Avian/Bird flu: A review: H5N1 outbreaks in Nepal
Abozaid et al. Widespread of H5N1 infections in apparently healthy backyard poultry
RU2496872C1 (en) STRAIN OF FLU VIRUS A/common gull/Altai/804/2011/H16NO-SUBTYPE FOR PRODUCTION OF ANTIGENE-CONTAINING PREPARATION, POLYCLONAL SERUM AND APPLICATION AS CONTROL REFERENCE-SAMPLE WHEN ASSESSING SPECIFICITY OF TEST-SYSTEMS BASED ON POLYMERASE CHAIN REACTION
Couacy‐Hymann et al. The first specific detection of a highly pathogenic avian influenza virus (H5N1) in Ivory Coast

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner