RU2604672C1

RU2604672C1 - Method of treating septic shock accompanied with agranulocytosis

Info

Publication number: RU2604672C1
Application number: RU2015121543/15A
Authority: RU
Inventors: Полина Михайловна Макарова; Геннадий Мартинович Галстян; Эдуард Георгиевич Гемджян; Елена Николаевна Паровичникова; Лариса Анатольевна Кузьмина; Нина Иосифовна Дризе; Наталья Арнольдовна Петинати; Валерий Григорьевич Савченко
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2016-12-10

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely to intensive therapy, and can be used for septic shock treating. This is ensured by intravenous introduction of multipotent mesenchymal stem cells derived from the donor's bone marrow, grown on a medium with human blood plasma enriched with lyzed thrombocytes in amount of 1-1.5×10⁶ of the transplanted cells per 1 kg of patient's body weight once in the first 10 hours from the moment of septic shock developing.

EFFECT: given method enables to use multipotent mesenchymal stem cells, reducing the intensity of multiple organ failure and thereby improving therapeutic effects of septic shock treatment accompanied with agranulocytosis.

1 cl, 3 ex, 2 dwg

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к интенсивной терапии и реаниматологии.The invention relates to medicine, namely to intensive care and resuscitation.

Септический шок является одной из основных причин смерти больных с агранулоцитозом. У больных с агранулоцитозом септический шок, искусственная вентиляция легких и тяжесть состояния больных более 27 баллов по шкале APACHE II в 82% случаев приводит к летальному исходу [1]. Проблема улучшения результатов лечения септического шока у больных в агранулоцитозе остается крайне актуальной.Septic shock is one of the main causes of death in patients with agranulocytosis. In patients with agranulocytosis, septic shock, mechanical ventilation, and the severity of patients over 27 points on the APACHE II scale in 82% of cases leads to death [1]. The problem of improving the results of treatment of septic shock in patients with agranulocytosis remains extremely urgent.

Известен способ лечения септического шока, включающий: антибиотическую терапию, инфузионную терапию, введение вазопрессоров и глюкокортикостероидных препаратов, искусственную вентиляцию легких, коррекцию гемостаза, гемодиализ, нутритивную поддержку [2].A known method of treating septic shock, including: antibiotic therapy, infusion therapy, the introduction of vasopressors and glucocorticosteroid drugs, mechanical ventilation, correction of hemostasis, hemodialysis, nutritional support [2].

Недостатками этого способа являются сохраняющаяся высокая смертность пациентов в первые часы развития септического шока, так как уделяется мало внимания иммунному статусу пациента [3, 4], учитывается только микробиологическая составляющая инфекционного процесса, не учитываются происходящие в организме человека изменения иммунной системы. Особенно актуально это при септическом шоке среди иммунокомпрометированных больных, в том числе больных в состоянии агранулоцитоза, среди которых выживаемость при септическом шоке в 1,7 раз меньше чем среди больных без иммунодефицита [5].The disadvantages of this method are the persistent high mortality of patients in the first hours of the development of septic shock, since little attention is paid to the patient’s immune status [3, 4], only the microbiological component of the infection process is taken into account, changes in the immune system that occur in the human body are not taken into account. This is especially true in case of septic shock among immunocompromised patients, including patients in a state of agranulocytosis, among whom survival in septic shock is 1.7 times less than among patients without immunodeficiency [5].

Другим способом лечения септического шока у больных кроме проводимой комплексной терапии служит рекомбинантный активированный протеин С, который воздействует на систему воспаления несколькими путями: снижает присоединение селектинов к лейкоцитам, снижает высвобождение цитокинов из моноцитов, блокирует высвобождение фактора некроза опухоли-α из лейкоцитов, угнетает выработку тромбина, который потенцирует воспалительный ответ. В исследовании PROWES [6] было показано снижение смертности при введение активированного протеина C больных с сепсисом в течение 96 ч в дозе 24 мкг/кг мин.In addition to the complex therapy, another method of treating septic shock in patients is the recombinant activated protein C, which affects the inflammation system in several ways: it reduces the attachment of selectins to leukocytes, reduces the release of cytokines from monocytes, blocks the release of tumor necrosis factor-α from leukocytes, and inhibits the production of thrombin which potentiates the inflammatory response. The PROWES study [6] showed a decrease in mortality with the administration of activated protein C in patients with sepsis for 96 hours at a dose of 24 mcg / kg min.

Недостатками этого способа лечения являются высокий риск развития геморрагических осложнений [7], а также отсутствие увеличения выживаемости у больных в выполненном позже исследовании PROWES-SHOCK [8].The disadvantages of this method of treatment are a high risk of developing hemorrhagic complications [7], as well as the absence of an increase in survival in patients in the later PROWES-SHOCK study [8].

Еще одним способом лечения септического шока является терапия человеческими иммуноглобулинами, действие которых направлено непосредственно против антигенов, находящихся на поверхности микроорганизмов. Также происходит прямая инактивация медиаторов сепсиса и нейтрализация рецепторов для этих медиаторов, расположенных на поверхности клеток.Another way to treat septic shock is the treatment with human immunoglobulins, whose action is directed directly against antigens located on the surface of microorganisms. Direct inactivation of sepsis mediators and neutralization of receptors for these mediators located on the cell surface also occur.

Недостатком этого метода является отсутствие доказанного влияния на выживаемость у пациентов с сепсисом и септическим шоком [9].The disadvantage of this method is the lack of a proven effect on survival in patients with sepsis and septic shock [9].

Прототипом способа лечения сепсиса и септического шока является способ профилактики острой реакции трансплантат против хозяина после трансплантации аллогенного костного мозга (патент на изобретение №2454247, 2010 год), при котором используется введение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток для лечения и профилактики острой реакции «трансплантат против хозяина», возникающей после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток [10, 11]. При этом способе мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора, полученные из костного мозга, выращенные на среде с плазмой крови человека, обогащенной лизированными тромбоцитами, вводят внутривенно в количестве 1×10⁶ трансплантируемых клеток на кг веса больного в момент восстановления лейкоцитов в периферической крови больного после трансплантации аллогенного костного мозга более 1,0×10⁹/л. Способ обеспечивает эффективную профилактику острой реакции трансплантат против хозяина при аллогенной трансплантации костного мозга.The prototype of the method for the treatment of sepsis and septic shock is a method for the prevention of acute graft versus host reaction after allogeneic bone marrow transplantation (patent for invention No. 2454247, 2010), which uses the introduction of multipotent mesenchymal stromal cells for the treatment and prevention of acute graft versus host disease arising after transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells [10, 11]. In this method, multipotent mesenchymal stromal donor stromal cells obtained from bone marrow grown on a medium with human blood plasma enriched with lysed platelets are injected intravenously in the amount of 1 × 10 ⁶ transplanted cells per kg of patient weight at the time of recovery of white blood cells in the patient’s peripheral blood after transplantation allogeneic bone marrow more than 1.0 × 10 ⁹ / L. The method provides effective prophylaxis of acute transplant versus host reaction in allogeneic bone marrow transplantation.

Недостатками метода являются применение его у больных без инфекционных осложнений, только с признаками острой реакции «трансплантат против хозяина», невозможность его использования у больных в состоянии агранулоцитоза (с числом лейкоцитов менее 1×10⁹/л).The disadvantages of the method are its use in patients without infectious complications, only with signs of an acute transplant versus host reaction, and the impossibility of its use in patients in a state of agranulocytosis (with a white blood cell count of less than 1 × 10 ⁹ / L).

Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности лечения больных с септическим шоком в состоянии агранулоцитоза.The objective of the present invention is to increase the effectiveness of the treatment of patients with septic shock in a state of agranulocytosis.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что больному в состоянии агранулоцитоза в первые 10 часов с момента развития септического шока вводят внутривенно мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора в количестве 1-1,5 млн на кг массы тела больного однократно.The problem is solved by the method consisting in the fact that a patient in the state of agranulocytosis in the first 10 hours from the development of septic shock is injected intravenously with multipotent mesenchymal stromal donor cells in the amount of 1-1.5 million per kg of patient body weight once.

При внедрении в организм инфекционного агента мультипотентные мезенхимные стромальные клетки выделяют факторы роста, которые регулируют иммунный эффект T- и B-клеток, дендритных клеток, моноцитов, нейтрофилов, макрофагов, влияя тем самым на эндотелиальную и эпителиальную проницаемость, продукцию противовоспалительных и провоспалительных цитокинов и уменьшая выраженность воспаления [12, 13]. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки отвечают на наличие инфекционного агента увеличением синтеза простагландина E2, активацией рецепторов простагландина Е2 на макрофагах, увеличением синтеза интерлейкина-10 и уменьшением синтеза интерлейкина-6 и фактора некроза опухоли-α. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки способствуют бактериальному киллингу и клиренсу через паракринные взаимодействия с локальными иммунными клетками, замедляют созревание B-клеток и нарушают в них переключение синтеза антител, подавляя хемотаксис и регулируя тем самым синтез антител. Секретируемые мультипотентными мезенхимные стромальными клетками растворимые факторы (трансформирующий ростовой фактор-β, фактора роста гепатоцитов, простагландин Е2 и NO) ингибируют пролиферацию T-клеток и продукцию цитокинов, уменьшают цитотоксический эффект цитолитических Т-клеток [14, 15]. Эффективность мультипотентных мезенхимных стромальных клеток при сепсисе подтверждена в экспериментальных моделях сепсиса на животных [15]. Данные о их применении для лечения сепсиса и септического шока у людей отсутствуют.When an infectious agent is introduced into the body, multipotent mesenchymal stromal cells secrete growth factors that regulate the immune effect of T and B cells, dendritic cells, monocytes, neutrophils, macrophages, thereby affecting the endothelial and epithelial permeability, production of anti-inflammatory and pro-inflammatory cytokines and reducing severity of inflammation [12, 13]. Multipotent mesenchymal stromal cells respond to the presence of an infectious agent by increasing prostaglandin E2 synthesis, activating prostaglandin E2 receptors on macrophages, increasing interleukin-10 synthesis, and decreasing synthesis of interleukin-6 and tumor necrosis factor-α. Multipotent mesenchymal stromal cells promote bacterial killing and clearance through paracrine interactions with local immune cells, slow down the maturation of B-cells and disrupt the switching of antibody synthesis in them, suppressing chemotaxis and thereby regulating antibody synthesis. Soluble factors secreted by multipotent mesenchymal stromal cells (transforming growth factor-β, hepatocyte growth factor, prostaglandin E2 and NO) inhibit T-cell proliferation and cytokine production, reduce the cytotoxic effect of cytolytic T-cells [14, 15]. The efficacy of multipotent mesenchymal stromal cells in sepsis has been confirmed in experimental animal sepsis models [15]. Data on their use for the treatment of sepsis and septic shock in humans are not available.

Практически способ осуществляют следующим образом.In practice, the method is as follows.

Сепсис - патологический процесс, в основе которого лежит реакция организма в виде генерализованного (системного) воспаления на инфекцию различной этиологии (бактериальной, вирусной, грибковой). При этом происходит системная продукция ряда цитокинов клетками-эффекторами воспаления (Т-лимфоциты, макрофаги, эндотелиоциты, тромбоциты), при нарушении существующего равновесия между провоспалительными (интерлейкины-1, -6, -8, фактор некроза опухоли) и противовоспалительными (интерлейкины-4, -10, -14, растворимые рецепторы к фактору некроза опухоли) медиаторами развивается септический шок [3]. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора, полученные из костного мозга, выращенные на среде с плазмой крови человека, обогащенной лизированными тромбоцитами, вводят внутривенно в количестве 1-1,5×10⁶ трансплантируемых клеток на кг массы тела больного однократно в первые десять часов от момента развития септического шока.Sepsis is a pathological process based on the body's reaction in the form of generalized (systemic) inflammation to an infection of various etiologies (bacterial, viral, fungal). In this case, the systemic production of a number of cytokines by inflammatory effector cells (T-lymphocytes, macrophages, endotheliocytes, platelets) occurs, if the existing balance between pro-inflammatory (interleukins-1, -6, -8, tumor necrosis factor) and anti-inflammatory (interleukins-4) are disturbed , -10, -14, soluble receptors for the tumor necrosis factor) mediators develop septic shock [3]. Multipotent donor mesenchymal stromal cells obtained from bone marrow grown on a medium with human blood plasma enriched with lysed platelets are injected intravenously in the amount of 1-1.5 × 10 ⁶ transplanted cells per kg of patient’s body weight once in the first ten hours from the moment of development septic shock.

Получают мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора из ядросодержащих клеток костного мозга донора [16]. Ядросодержащие клетки костного мозга донора получают ресуспендированием костного мозга в питательной среде с 0,1% метилцеллулозы, инкубацией смеси при комнатной температуре в течение 40 минут и последующим центрифугированием фракции, не содержащей эритроцитов, при 1500 об/мин в течение 10 минут. Ядросодержащие клетки культивируют в среде MEM с 4% плазмы, обогащенной тромбоцитами, 200 мМ L-глутамина и антибиотиками в концентрации 120000 клеток на один см² площади дна флакона. Плазму крови человека, обогащенную тромбоцитами (концентрация тромбоцитов 0,5-1.9×10⁹/мл), получают в результате размораживания предварительно замороженного при -70°C концентрата тромбоцитов с последующим осаждением лизата тромбоцитов при 12000 об/мин в течение 15 минут. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора, достигшие конфлуэнтности, снимают с подложки с помощью 0,025% трипсина и пассируют в концентрации 4500 клеток на 1 см² площади дна флакона. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора после снятия с подложки центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут и ресуспендируют в полиглюкине в необходимом количестве. Далее клетки замораживают в пробирках в жидком азоте. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора вводят в количестве 1-1,5×10⁶ /кг веса больного внутривенно в течение 10 мин однократно. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки донора могут быть использованы как непосредственно после их получения, так и после размораживания клеток, ранее замороженных в парах жидкого азота в среде с 10% диметилсульфоксида.Multipotent donor mesenchymal stromal cells are obtained from nucleated donor bone marrow cells [16]. Nucleating donor bone marrow cells are obtained by resuspending the bone marrow in a culture medium with 0.1% methylcellulose, incubating the mixture at room temperature for 40 minutes and then centrifuging the erythrocyte-free fraction at 1500 rpm for 10 minutes. Nucleated cells were cultured in MEM medium with 4% platelet-rich plasma, 200 mM L-glutamine and antibiotics at a concentration of 120,000 cells per cm ^{2 of} the bottom area of the vial. Human blood plasma enriched with platelets (platelet concentration 0.5-1.9 × 10 ⁹ / ml) is obtained by thawing a platelet concentrate previously frozen at -70 ° C, followed by precipitation of platelet lysate at 12,000 rpm for 15 minutes. Multipotent donor mesenchymal stromal cells that have reached confluency are removed from the substrate using 0.025% trypsin and passaged at a concentration of 4500 cells per 1 cm ^{2 of} the bottom area of the vial. After removal from the substrate, the multipotent mesenchymal stromal cells of the donor are centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes and resuspended in polyglucin in the required amount. Next, the cells are frozen in test tubes in liquid nitrogen. Multipotent mesenchymal stromal donor cells are administered in an amount of 1-1.5 × 10 ⁶ / kg of patient weight intravenously for 10 minutes once. Multipotent donor mesenchymal stromal cells can be used both immediately after their preparation and after thawing of cells previously frozen in liquid nitrogen vapors in an environment with 10% dimethyl sulfoxide.

Непосредственно перед введением мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в организм больного септическим шоком в состоянии агранулоцитоза пробирка с клетками размораживается в теплой воде с температурой не более 37°C. Сразу же после размораживания мультипотентные мезенхимные стромальные клетки вводятся внутривенно пациенту.Immediately before the introduction of multipotent mesenchymal stromal cells into the patient's body with septic shock in a state of agranulocytosis, the cell tube is thawed in warm water with a temperature of no more than 37 ° C. Immediately after thawing, multipotent mesenchymal stromal cells are administered intravenously to the patient.

Клинический пример 1Clinical example 1

Больной З., 31 г. с впервые диагностированным острым миеломонобластным лейкозом, протекающим с гиперлейкоцитозом, с 24.01.2014 по 30.01.2014 был проведен индукционный курс химиотерапии по программе 7+3 [17]. После окончания химиотерапии у больной развился миелотоксический агранулоцитоз (лейкоциты крови 0,3×10⁹/л), течение которого осложнилось развитием синегнойного сепсиса: лихорадка до 40°C, двусторонняя пневмония, повышение сывороточной концентрации прокальцитонина более 10 нг/мл (полуколичественный метод), C-реактивного белка (СРБ) до 124 г/л, в посевах крови получен рост Pseudomonas aeruginosae. В связи с развитием острой дыхательной недостаточности (PaO₂/FiO₂=120) больная была переведена на искусственную вентиляцию легких. В повторных посевах образцов крови, мочи, жидкости бронхоальвеолярного лаважа выявлены штаммы Pseudomonas aeruginosae, резистентные к цефалоспоринам, карбапенемам, аминогликозидам, но сохранявшие чувствительность к колистину и фосфомицину. Была назначена антибактериальная терапия меропенемом (6 г/сут), колистином (10 млн/сут) и фосфомицином (12 г/сут). Однако несмотря на это спустя неделю у больной развился септический шок: артериальная гипотензия до 65/30 мм рт.ст., концентрация лактата в артериальной крови 6 ммоль/л, по данным транспульмональной термодилюции - гиперкинетический тип гемодинамики (сердечный индекс 7,2 л/мин/м², ударный индекс 57 мл/м², индекс общего периферического сосудистого сопротивления 480 дин сек м²/см⁵). Сывороточная концентрация прокальцитонина составила 21 нг/мл, СРБ - 227 мг/л, концентрация пресепсина в плазме - 2550 пг/мл. Начата вазопрессорная терапия норадреналином (1,4 мкг/кг/мин), гидрокортизоном (200 мг/сут). Больная была включена в проспективный исследовательский протокол терапии септического шока у больных с агранулоцитозом. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. В рамках протокола на третий час развития септического шока ей внутривенно были введены мультипотентные мезенхимные стромальные клетки в количестве 1,28 млн/кг (вес больной составил 74 кг), которые были получены из костного мозга донора-женщины в возрасте 34 лет. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки культивировали по стандартной методике (в среде альфа MEM с добавлением 4% человеческой плазмы, обогащенной тромбоцитами). Клетки были использованы на 1-м пассаже. Антибиотическая терапия была продолжена в прежнем объеме. Спустя 2-е суток после введения мультипотентных мезенхимных стромальных клеток отмечено восстановление лейкопоэза (лейкоциты крови 1,5×10⁹/л), стабилизация АД, нормализация сердечного индекса и периферического сосудистого сопротивления, прекращена инфузия норадреналина, сохранялась лихорадка до 39,6°C. Концентрация прокальцитонина сыворотки снизилась до 12 нг/мл, СРБ - до 160 мг/л, концентрация пресепсина в плазме - 2789 пг/мл. Постепенно состояние больной улучшилось: нормализовалась температура тела, регрессировали воспалительные изменения в легких, регрессировала острая дыхательная недостаточность. Синегнойная палочка прекратила выделяться из крови спустя 23 сут. Спустя 57 сут прекращена искусственная вентиляция легких, и больная была выписана из отделения реанимации. По данным исследования костного мозга констатирована ремиссия острого лейкоза. В последующем ей было проведено еще несколько курсов химиотерапии. 9 января 2015 г. больной выполнена трансплантация аллогенного костного мозга от неродственного донора. В течение пяти месяцев у больной сохраняется ремиссия заболевания, выписана из стационара домой.Patient Z., 31, with first diagnosed acute myelomonoblastic leukemia with hyperleukocytosis, from January 24, 2014 to January 30, 2014, an induction chemotherapy course was carried out according to the 7 + 3 program [17]. After chemotherapy, the patient developed myelotoxic agranulocytosis (blood leukocytes 0.3 × 10 ⁹ / L), which was complicated by the development of Pseudomonas sepsis: fever up to 40 ° C, bilateral pneumonia, increased serum concentration of procalcitonin more than 10 ng / ml (semi-quantitative method) , C-reactive protein (CRP) up to 124 g / l, in the blood cultures the growth of Pseudomonas aeruginosae was obtained. In connection with the development of acute respiratory failure (PaO ₂ / FiO ₂ = 120), the patient was transferred to artificial lung ventilation. In repeated cultures of blood, urine, and bronchoalveolar lavage fluid samples, Pseudomonas aeruginosae strains were found that were resistant to cephalosporins, carbapenems, aminoglycosides, but retained sensitivity to colistin and phosphomycin. Antibacterial therapy was prescribed with meropenem (6 g / day), colistin (10 million / day) and phosphomycin (12 g / day). However, despite this, a week later the patient developed septic shock: arterial hypotension up to 65/30 mm Hg, the concentration of lactate in arterial blood 6 mmol / l, according to transpulmonary thermodilution, the hyperkinetic type of hemodynamics (heart index 7.2 l / min / m ² , stroke index 57 ml / m ² , total peripheral vascular resistance index 480 dyne sec m ² / cm ⁵ ). The serum concentration of procalcitonin was 21 ng / ml, CRP - 227 mg / l, the concentration of presepsin in plasma - 2550 pg / ml. Vasopressor therapy with norepinephrine (1.4 μg / kg / min) and hydrocortisone (200 mg / day) has been started. The patient was included in a prospective research protocol for the treatment of septic shock in patients with agranulocytosis. The study was approved by the ethics committee of the FSBI SSC of the Ministry of Health of the Russian Federation. As part of the protocol, at the third hour of the development of septic shock, she was intravenously injected with multipotent mesenchymal stromal cells in the amount of 1.28 million / kg (patient weight was 74 kg), which were obtained from the bone marrow of a female donor at the age of 34 years. Multipotent mesenchymal stromal cells were cultured according to a standard method (in alpha MEM supplemented with 4% human platelet-rich plasma). Cells were used at the 1st passage. Antibiotic therapy was continued in the same volume. 2 days after the administration of multipotent mesenchymal stromal cells, leukopoiesis (blood leukocytes 1.5 × 10 ⁹ / L) was restored, blood pressure stabilized, cardiac index and peripheral vascular resistance normalized, norepinephrine infusion was stopped, and fever continued to 39.6 ° C . The serum procalcitonin concentration decreased to 12 ng / ml, CRP - to 160 mg / l, the plasma prespepsin concentration - 2789 pg / ml. Gradually, the patient's condition improved: body temperature returned to normal, inflammatory changes in the lungs regressed, and acute respiratory failure regressed. Pseudomonas aeruginosa ceased to be excreted from the blood after 23 days. After 57 days, mechanical ventilation was stopped, and the patient was discharged from the intensive care unit. According to a study of bone marrow, remission of acute leukemia was observed. Subsequently, she was given several more chemotherapy courses. On January 9, 2015, the patient underwent allogeneic bone marrow transplantation from an unrelated donor. Within five months, the patient remains in remission of the disease, was discharged from the hospital home.

Данный результат указывает на эффективность терапии мультипотентными мезенхимными стромальными клетками сепсиса и септического шока у больной с миелотоксическим агранулоцитозом.This result indicates the effectiveness of therapy with multipotent mesenchymal stromal cells of sepsis and septic shock in a patient with myelotoxic agranulocytosis.

Пример 2. Данные проспективного контролируемого рандомизированного исследованияExample 2. Data from a prospective controlled randomized trial

В рамках проводимого в ФГБУ «Гематологический научный центр» (ГНЦ) МЗ РФ проспективного контролируемого рандомизированного исследования изучалась эффективность терапии септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Критериями включения в исследование было развитие септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза, подписанное информированное согласие больного на включение в исследование. Критериями исключения из исследования были резистентность к химиотерапии и плохой прогноз заболевания системы крови. В качестве главного критерия эффективности лечения выбрана выживаемость пациентов за 28-дневный период наблюдения. Пациенты с септическим шоком в состоянии агранулоцитоза были распределены случайным образом на две группы:In the framework of a prospective controlled randomized study conducted at the Hematological Scientific Center (HSC) of the Ministry of Health of the Russian Federation, the effectiveness of the treatment of septic shock in patients with agranulocytosis with multipotent mesenchymal stem cells was studied. The study was approved by the ethics committee of the FSBI SSC MH RF. The criteria for inclusion in the study was the development of septic shock in patients in a state of agranulocytosis, signed informed consent of the patient to be included in the study. Exclusion criteria were chemotherapy resistance and poor prognosis of blood system disease. The main criterion for the effectiveness of treatment was the survival of patients over a 28-day observation period. Patients with septic shock in a state of agranulocytosis were randomly assigned to two groups:

- группу, которая получала стандартную терапию септического шока, включающую антибиотическую, инфузионную терапию, введение вазопрессоров и глюкокортикостероидных гормонов, нутритивную поддержку, по показаниям - искусственную вентиляцию легких, заместительную почечную терапию;- a group that received standard therapy for septic shock, including antibiotic, infusion therapy, the introduction of vasopressors and glucocorticosteroid hormones, nutritional support, according to indications - mechanical ventilation, renal replacement therapy;

- группу лечения мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, в которой наряду со стандартной терапией септического шока в течение первых 10 ч его развития внутривенно однократно вводили 1-1,5 млн/кг массы тела больного мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, полученных из костного мозга доноров. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки культивировали по стандартной методике (в среде альфа MEM с добавлением 4% человеческой плазмы, обогащенной тромбоцитами). Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки вводили внутривенно в течение 10 мин. Статистический анализ. Эффективность применения мультипотентных мезенимальных стволовых клеток в лечении СШ больных в состоянии агранулоцитоза оценивали по выживаемости больных септическим шоком с применением лог-ранг критерия и критерия Вилкоксона.- a group of treatment with multipotent mesenchymal stem cells, in which, along with standard therapy for septic shock, during the first 10 hours of its development, 1-1.5 million / kg of patient’s body weight of multipotent mesenchymal stem cells obtained from donor bone marrow was injected intravenously. Multipotent mesenchymal stem cells were cultured according to a standard technique (in alpha MEM supplemented with 4% human platelet-rich plasma). Multipotent mesenchymal stem cells were administered intravenously for 10 minutes. Statistical analysis. The effectiveness of the use of multipotent mesenymal stem cells in the treatment of secondary school patients in the state of agranulocytosis was evaluated by the survival of patients with septic shock using the log-rank criterion and Wilcoxon criterion.

При включении в исследование не было статистически значимых различий между группами: группа больных, получивших только стандартную терапию, состояла из 12 пациентов (6 мужчин, 6 женщин) в возрасте от 41 до 81 года (медиана 58 лет); группа больных, получивших терапию мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, состояла из 14 человек (6 мужчин, 8 женщин) в возрасте от 30 до 75 лет (медиана 47 лет). При включении в исследование группа стандартной терапии не отличалась значимо от группы, леченной мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, по тяжести состояния, оцененной по шкале APACHE II (соответственно 32,5±5,9 и 29,9±5,2 баллов). Больные из группы мультипотентных мезенхимных стволовых клеток получили в первые 10 ч развития септического шока однократно 1-1,5 млн/кг мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, полученных от здоровых доноров костного мозга.When included in the study, there were no statistically significant differences between the groups: the group of patients who received only standard therapy consisted of 12 patients (6 men, 6 women) aged 41 to 81 years (median 58 years); the group of patients treated with multipotent mesenchymal stem cells consisted of 14 people (6 men, 8 women) aged 30 to 75 years (median 47 years). When included in the study, the standard therapy group did not differ significantly from the group treated with multipotent mesenchymal stem cells in the severity of the condition, assessed using the APACHE II scale (32.5 ± 5.9 and 29.9 ± 5.2 points, respectively). Patients from the group of multipotent mesenchymal stem cells received 1-1.5 million / kg of multipotent mesenchymal stem cells obtained from healthy bone marrow donors in the first 10 hours of septic shock.

На рисунке 1 изображен показатель общей выживаемости для группы больных с септическим шоком в состоянии агранулоцитоза, с использованием мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (МСК+), который статистически значимо выше, чем для группы больных, леченных без мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (МСК-): 51% (SE 15) против 17% (SE 15); медианы выживаемости: 29 мес. против 7 мес. соответственно (p=0,01, логранговый критерий и критерий Вилкоксона; SE - стандартная ошибка показателя выживаемости); риск летального исхода при лечении без использования мультипотентных мезенхимных стволовых клеток увеличивается в 3 раза: отношение рисков (Hazard Ratio, HR) равно 3,0 (95% ДИ: 1,2-7,0).Figure 1 shows the overall survival rate for a group of patients with septic shock in a state of agranulocytosis using multipotent mesenchymal stem cells (MSC +), which is statistically significantly higher than for a group of patients treated without multipotent mesenchymal stem cells (MSC-): 51 % (SE 15) vs 17% (SE 15); median survival: 29 months. against 7 months respectively (p = 0.01, log-rank test and Wilcoxon test; SE - standard error of survival rate); the risk of death in treatment without the use of multipotent mesenchymal stem cells increases 3 times: the risk ratio (Hazard Ratio, HR) is 3.0 (95% CI: 1.2-7.0).

Выживаемость в группе больных, получивших наряду со стандартной терапией септического шока мультипотентные мезенхимные стволовые клетки, была значимо выше, чем среди больных, которые получили только стандартную терапию: 6 (43%) из 14 против 1 (8%) из 12 против (рис. 1). Риск летального исхода у больных, леченных только по схеме стандартной терапии, был в 3 раза выше, чем при использовании наряду со стандартной терапией мультипотентных мезенхимных стволовых клеток: HR=3.0 (95% ДИ 1,2-7,0), причем летальные исходы в группе стандартной терапии происходили в течение 10 первых дней после развития септического шока. В группе терапии мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками летальные исходы наступали позже (примерно на неделю) и были более растянуты во времени (рис. 1). Таким образом, включение мультипотентных мезенхимных стволовых клеток в терапию септического шока позволяет достичь большей выживаемости при лечении септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза по сравнению со стандартной терапией.Survival in the group of patients who received, along with standard therapy for septic shock, multipotent mesenchymal stem cells was significantly higher than among patients who received only standard therapy: 6 (43%) of 14 versus 1 (8%) of 12 versus (Fig. one). The risk of death in patients treated only with standard therapy was 3 times higher than when used along with standard therapy with multipotent mesenchymal stem cells: HR = 3.0 (95% CI 1.2-7.0), with lethal outcomes in the standard therapy group, they occurred within the first 10 days after the development of septic shock. In the group of therapy with multipotent mesenchymal stem cells, deaths occurred later (about a week) and were more prolonged in time (Fig. 1). Thus, the inclusion of multipotent mesenchymal stem cells in septic shock therapy allows for greater survival in the treatment of septic shock in patients with agranulocytosis compared with standard therapy.

Пример 3. Данные об эффективности терапии септического шока у больных в состоянии агранулоцитозаExample 3. Data on the effectiveness of treatment of septic shock in patients in a state of agranulocytosis

В рамках проводимого в ФГБУ «Гематологический научный центр» (ГНЦ) МЗ РФ проспективного контролируемого рандомизированного исследования изучалась эффективность терапии септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ ГНЦ МЗ РФ. Критериями включения в исследование было развитие септического шока у больных в состоянии агранулоцитоза, подписанное информированное согласие больного на включение в исследование. Критериями исключения из исследования были резистентность к химиотерапии и плохой прогноз заболевания системы крови. В качестве критерия эффективности лечения выбрано изменения выраженности полиорганной недостаточности, оцененной по шкале SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) [18]. Пациенты с септическим шоком в состоянии агранулоцитоза были распределены случайным образом на две группы:In the framework of a prospective controlled randomized study conducted at the Hematological Scientific Center (HSC) of the Ministry of Health of the Russian Federation, the effectiveness of the treatment of septic shock in patients with agranulocytosis with multipotent mesenchymal stem cells was studied. The study was approved by the ethics committee of the FSBI SSC MH RF. The criteria for inclusion in the study was the development of septic shock in patients in a state of agranulocytosis, signed informed consent of the patient to be included in the study. Exclusion criteria were chemotherapy resistance and poor prognosis of blood system disease. As a criterion for the effectiveness of treatment, changes in the severity of multiple organ failure assessed according to the Sepsis-related Organ Failure Assessment (SOFA) scale were selected [18]. Patients with septic shock in a state of agranulocytosis were randomly assigned to two groups:

- группу лечения мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, в которой наряду со стандартной терапией септического шока в течение первых 10 ч его развития внутривенно однократно вводили 1-1,5 млн/кг массы тела больного мультипотентных мезенхимных стволовых клеток, полученных из костного мозга доноров.- a group of treatment with multipotent mesenchymal stem cells, in which, along with standard therapy for septic shock, during the first 10 hours of its development, 1-1.5 million / kg of patient’s body weight of multipotent mesenchymal stem cells obtained from donor bone marrow was injected intravenously.

На рисунке 2 показаны изменения баллов по шкале SOFA у больных, леченных мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками. При развитии септического шока группа больных, получавшая только стандартную терапию, не отличалась от группы больных, леченных стандартной терапией и мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, по выраженности полиорганной недостаточности, оцененной по шкале SOFA (соответственно 16,5±2,1 и 15,9±2,0 баллов). В процессе лечения в группе стандартной терапии выраженность органной недостаточности по шкале SOFA значимо не изменилась за все время наблюдения. В группе больных, леченных мультипотентными мезенхимными стволовыми клетками, начиная со второй недели лечения, отмечено уменьшения выраженности органной недостаточности, оцененной по шкале SOFA (рис. 2).Figure 2 shows the changes in scores on the SOFA scale in patients treated with multipotent mesenchymal stem cells. With the development of septic shock, the group of patients who received only standard therapy did not differ from the group of patients treated with standard therapy and multipotent mesenchymal stem cells, according to the severity of multiple organ failure, assessed on the SOFA scale (16.5 ± 2.1 and 15.9 ± respectively 2.0 points). During treatment in the standard therapy group, the severity of organ failure on the SOFA scale did not significantly change over the entire observation period. In the group of patients treated with multipotent mesenchymal stem cells, starting from the second week of treatment, there was a decrease in the severity of organ failure, estimated according to the SOFA scale (Fig. 2).

Таким образом, включение мультипотентных мезенхимных стволовых клеток в терапию септического шока позволяет уменьшить выраженность полиорганной недостаточности и тем самым улучшает результаты лечения больных септическим шоком в состоянии агранулоцитоза, увеличить выживаемость больных в состоянии агранулоцитоза при септическом шоке.Thus, the inclusion of multipotent mesenchymal stem cells in the treatment of septic shock can reduce the severity of multiple organ failure and thereby improve the results of treatment of patients with septic shock in the state of agranulocytosis, increase the survival of patients in the state of agranulocytosis in septic shock.

Список литературыBibliography

1. Khwankeaw J, Bhurayanontachai R. Mortality correlation factors in patients with lymphoma and acute myeloid leukemia admitted into the intensive care unit at a referral center in the south of Thailand. J Med Assoc Thai. 2014 Jan; 97 Suppl 1: S77-83.1. Khwankeaw J, Bhurayanontachai R. Mortality correlation factors in patients with lymphoma and acute myeloid leukemia admitted into the intensive care unit at a referral center in the south of Thailand. J Med Assoc Thai. 2014 Jan; 97 Suppl 1: S77-83.

2. Dellinger RP, Levy MM, Rhodes A, Annane D, Gerlach H, Opal SM, Sevransky JE, Sprung CL, Douglas IS, Jaeschke R, Osborn TM, Nunnally ME, Townsend SR, Reinhart K, Kleinpell RM, Angus DC, Deutschman CS, Machado FR, Rubenfeld GD, Webb S, Beale RJ, Vincent JL, Moreno R; Surviving Sepsis Campaign Guidelines Committee including The Pediatric Subgroup. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012. Intensive Care Med. 2013 Feb; 39(2): 165-228.2. Dellinger RP, Levy MM, Rhodes A, Annane D, Gerlach H, Opal SM, Sevransky JE, Sprung CL, Douglas IS, Jaeschke R, OsbornTM, Nunnally ME, Townsend SR, Reinhart K, Kleinpell RM, Angus DC, Deutschman CS, Machado FR, Rubenfeld GD, Webb S, Beale RJ, Vincent JL, Moreno R; Surviving Sepsis Campaign Guidelines Committee including The Pediatric Subgroup. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012. Intensive Care Med. 2013 Feb; 39 (2): 165-228.

3. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med. 2003; 348(2): 138-150.3. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med. 2003; 348 (2): 138-150.

4. Remick DG. Pathophysiology of sepsis. Am J Pathol. 2007; 170(5): 1435-1444.4. Remick DG. Pathophysiology of sepsis. Am J Pathol. 2007; 170 (5): 1435-1444.

5. Tolsma V, Schwebel C, Azoulay E, Darmon M, Souweine B, Vesin A, Goldgran-Toledano D, Lugosi M, Jamali S, Cheval С, Adrie С, Kallel H, Descorps-Declere A, Garrouste-Orgeas M, Bouadma L, Timsit JF. Sepsis severe or septic shock: outcome according to immune status and immunodeficiency profile. Chest. 2014; 146 (5): 1205-13.5. Tolsma V, Schwebel C, Azoulay E, Darmon M, Souweine B, Vesin A, Goldgran-Toledano D, Lugosi M, Jamali S, Cheval C, Adrie C, Kallel H, Descorps-Declere A, Garrouste-Orgeas M, Bouadma L, Timsit JF. Sepsis severe or septic shock: outcome according to immune status and immunodeficiency profile. Chest. 2014; 146 (5): 1205-13.

6. http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/DrugSafetyPodcasts/ucm277212.htm. Accessed 18 Dec. 2011.6. http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/DrugSafetyPodcasts/ucm277212.htm. Accessed 18 Dec. 2011.

7. Bernard G.R., Vincent J-L., Laterre P-F., et al. Efficacy and safety of recombinant human activated protein С for severe sepsis. N. Engl. J. Med. 2001; 344: 699-709.7. Bernard G.R., Vincent J-L., Laterre P-F., Et al. Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis. N. Engl. J. Med. 2001; 344: 699-709.

8. Ranieri V.M., Thompson В.T., Philip S.В., et al. Drotrecogin Alfa (Activated) in Adults with Septic Shock. The new England journal of medicine. 2012; vol. 366: no. 22.8. Ranieri V.M., Thompson B.T., Philip S.V., et al. Drotrecogin Alfa (Activated) in Adults with Septic Shock. The new England journal of medicine. 2012; vol. 366: no. 22.

9. Werdan K, Pilz G, Bujdoso O, Frauberger P, Neeser G, Schmeider RE, et al. Score-based immunoglobulin G therapy of patients with sepsis: The SBITS study. Critical Care Med. 2007; 35: 2693-701.9. Werdan K, Pilz G, Bujdoso O, Frauberger P, Neeser G, Schmeider RE, et al. Score-based immunoglobulin G therapy of patients with sepsis: The SBITS study. Critical Care Med. 2007; 35: 2693-701.

10. Introna M., Rambaldi A. Mesenchymal stromal cells for prevention and treatment of graft-versus-host disease: successes and hurdles. Curr. Opin. Organ Transplant. 2015, 20(1): 72-78.10. Introna M., Rambaldi A. Mesenchymal stromal cells for prevention and treatment of graft-versus-host disease: successes and hurdles. Curr. Opin. Organ Transplant. 2015, 20 (1): 72-78.

11. Kuzmina L.A., Petinati N.A., Parovichnikova E.N. et al. Multipotent Mesenchymal Stromal Cells for the Prophylaxis of Acute Graft-versus-Host Disease-Α Phase II Study. Stem Cells Int. 2012 2012 968213.11. Kuzmina L.A., Petinati N.A., Parovichnikova E.N. et al. Multipotent Mesenchymal Stromal Cells for the Prophylaxis of Acute Graft-versus-Host Disease-Α Phase II Study. Stem Cells Int. 2012 2012 968,213.

12. Jones B.J. and McTaggart S.J. Immunosuppression by mesenchymal stromal cells: from culture to clinic. Exp. Hematol. 2008, 36(6): 733-741.12. Jones B.J. and McTaggart S.J. Immunosuppression by mesenchymal stromal cells: from culture to clinic. Exp. Hematol. 2008, 36 (6): 733-741.

13. Stagg J. and Galipeau J. Mechanisms of Immune Modulation by Mesenchymal Stromal Cells and Clinical Translation. Curr. Mol. Med. 2013, 13(5): 856-867.13. Stagg J. and Galipeau J. Mechanisms of Immune Modulation by Mesenchymal Stromal Cells and Clinical Translation. Curr. Mol. Med. 2013, 13 (5): 856-867.

14. Wannemuehler T.J., Manukyan M.C., Brewster B.D., Rouch J., Poynter J.A., Wang Y., Meldrum D.R. Advances in Mesenchymal Stem Cell Research in Sepsis. J Surg Res. 2012; 173(1): 113-26.14. Wannemuehler T.J., Manukyan M.C., Brewster B.D., Rouch J., Poynter J.A., Wang Y., Meldrum D.R. Advances in Mesenchymal Stem Cell Research in Sepsis. J Surg Res. 2012; 173 (1): 113-26.

15. Németh К., Leelahavanichkul Α., Yuen P.S., Mayer В., Parmelee Α., Doi K., Robey P.G., Leelahavanichkul K., Koller B.H., Brown J.M., Hu X., Jelinek I., Star R.A., Mezey E. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat Med. 2009; 15 (1): 42-9.15. Németh K., Leelahavanichkul Α., Yuen PS, Mayer B., Parmelee Α., Doi K., Robey PG, Leelahavanichkul K., Koller BH, Brown JM, Hu X., Jelinek I., Star RA, Mezey E. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E (2) -dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat Med. 2009; 15 (1): 42-9.

16. Svinareva DA, Shipunova IN, Ol′shanskaia I, Momotiuk KS, Drize NI, Savchenko VG. The basic properties of mesenchymal stromal cells from the donor bone marrow: superficial markers. Ter. Arkh. 2010; 82: 52-56.16. Svinareva DA, Shipunova IN, Ol′shanskaia I, Momotiuk KS, Drize NI, Savchenko VG. The basic properties of mesenchymal stromal cells from the donor bone marrow: superficial markers. Ter. Arkh. 2010; 82: 52-56.

17. Программное лечение заболеваний системы крови. Сборник алгоритмов диагностики и протоколов лечения заболеваний системы крови. Под ред. Савченко В.Г. Том II. Практика 2012. - 1056 с.17. Program treatment of diseases of the blood system. A collection of diagnostic algorithms and protocols for the treatment of diseases of the blood system. Ed. Savchenko V.G. Volume II Practice 2012 .-- 1056 s.

18. Vincent J.-L., Moreno R., Takala J., et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction/failure. Intensive Care Med. 1996; 22: 707-710.18. Vincent J.-L., Moreno R., Takala J., et al. The SOFA (Sepsis-related Organ Failure Assessment) score to describe organ dysfunction / failure. Intensive Care Med. 1996; 22: 707-710.

Claims

A method of treating septic shock in a state of agranulocytosis, namely, that the patient is administered intravenously multipotent mesenchymal stem cells of the donor obtained from the bone marrow of the donor grown on a medium with human blood plasma enriched with lysed platelets in an amount of 1-1.5 × 10 ⁶ transplanted cells per 1 kg of patient weight once in the first 10 hours from the development of septic shock.