RU2603269C1 - Recombinant single-domain antibodies specifically binding human interleukin-6, method for their preparing and using for detection of this protein - Google Patents

Recombinant single-domain antibodies specifically binding human interleukin-6, method for their preparing and using for detection of this protein Download PDF

Info

Publication number
RU2603269C1
RU2603269C1 RU2015145831/10A RU2015145831A RU2603269C1 RU 2603269 C1 RU2603269 C1 RU 2603269C1 RU 2015145831/10 A RU2015145831/10 A RU 2015145831/10A RU 2015145831 A RU2015145831 A RU 2015145831A RU 2603269 C1 RU2603269 C1 RU 2603269C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibodies
protein
domain antibodies
human
recombinant
Prior art date
Application number
RU2015145831/10A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Сергей Владимирович Тиллиб
Сергей Артурович Недоспасов
Григорий Александрович Ефимов
Марина Сергеевна Друцкая
Андрей Алексеевич Круглов
Оксана Сергеевна Горяйнова
Татьяна Ильинична Иванова
Original Assignee
Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) filed Critical Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран)
Priority to RU2015145831/10A priority Critical patent/RU2603269C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2603269C1 publication Critical patent/RU2603269C1/en

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244Interleukins [IL]
    • C07K16/248IL-6
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology; medicine.
SUBSTANCE: present invention relates to molecular immunology, biotechnology and medicine. Recombinant variants of a single-domain antibody (VHH) are presented, which specifically binds human interleukin-6 (IL-6) and is characterized by amino acid sequences. Single-domain antibodies disclosed herein are obtained on basis of antigen-recognizing antibody domains of lamp (Lama glama).
EFFECT: present invention can find further application in diagnosing and treating IL-6-mediated diseases.
3 cl, 4 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области молекулярной иммунологии, биотехнологии и медицины, а именно к получению рекомбинантных однодоменных наноантител (VHH), избирательно связывающих интерлейкин-6 (ИЛ-6).The invention relates to the field of molecular immunology, biotechnology and medicine, namely to the production of recombinant single-domain nanoantibodies (VHH) that selectively bind interleukin-6 (IL-6).

Уровень техникиState of the art

Интерлейкин-6 (ИЛ-6) - мультифункциональный провоспалительный цитокин, обладающий широким спектром иммунорегуляторных свойств, а также являющийся медиатором образования, роста и прогрессии опухолей различной природы и локализации. ИЛ-6 был открыт в 80-х годах в нескольких лабораториях под разными названиями (фактор-2, стимулирующий В-клетки; интерферон - бета-2; фактор роста гибридом; фактор стимуляции гепатоцитов), что отражает плейотропность этого цитокина [Hirano Т. et al., Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces В lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature, 324: 73-76, 1986. - Комплементарная ДНК для нового человеческого интерлейкина (BSF-2), который индуцирует продукцию иммуноглобулина В-лимфоцитами; Zilberstein A. et al., Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J. 1986 Oct; 5(10): 2529-37. - Структура и экспрессия кДНК и генов интерферона-бета-2, различные виды индуцируются посредством ростстимулирующих цитокинов; Lansdorp, P. М. et al., A Growth-Factor Dependent B-Cell Hybridoma. Mechanisms in B-Cell Neoplasia. Current Topics in Microbiology and Immunology Volume 132, 1986, pp. 105-113- В клеточная гибридома, зависимая от ростового фактора. Механизмы в В-клеточной неоплазии].Interleukin-6 (IL-6) is a multifunctional pro-inflammatory cytokine with a wide range of immunoregulatory properties, as well as a mediator of the formation, growth and progression of tumors of various nature and localization. IL-6 was discovered in the 80s in several laboratories under different names (factor-2, stimulating B cells; interferon-beta-2; growth factor hybridomas; hepatocyte stimulation factor), which reflects the pleiotropy of this cytokine [Hirano T. et al., Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature, 324: 73-76, 1986. - Complementary DNA for the new human interleukin (BSF-2), which induces the production of immunoglobulin B-lymphocytes; Zilberstein A. et al., Structure and expression of cDNA and genes for human interferon-beta-2, a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines. EMBO J. 1986 Oct; 5 (10): 2529-37. - The structure and expression of cDNA and interferon-beta-2 genes, various species are induced by growth-stimulating cytokines; Lansdorp, P. M. et al., A Growth-Factor Dependent B-Cell Hybridoma. Mechanisms in B-Cell Neoplasia. Current Topics in Microbiology and Immunology Volume 132, 1986, pp. 105-113- B cell hybridoma dependent on growth factor. Mechanisms in B-cell neoplasia].

Ген ИЛ-6 человека расположен на коротком плече 7-й хромосомы [Sehgal Р.В. Regulation of IL-6 gene expression. Res. Immunol., 1992. P. 724-734. - Регуляция экспрессии гена ИЛ-6]. ИЛ-6 человека представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 26 кДа, состоящий из 184 аминокислот [Yao X. et al., Targeting interleukin-6 in inflammatory autoimmune diseases and cancers. Pharmacol Ther. 2014, 141(2), 125-139. - ИЛ-6 - терапевтическая мишень при воспалительных аутоиммунных и онкологических заболеваниях].The human IL-6 gene is located on the short arm of the 7th chromosome [Sehgal R.V. Regulation of IL-6 gene expression. Res. Immunol., 1992. P. 724-734. - Regulation of gene expression of IL-6]. Human IL-6 is a glycoprotein with a molecular weight of 26 kDa, consisting of 184 amino acids [Yao X. et al., Targeting interleukin-6 in inflammatory autoimmune diseases and cancers. Pharmacol Ther. 2014, 141 (2), 125-139. - IL-6 - therapeutic target for inflammatory autoimmune and oncological diseases].

ИЛ-6 продуцируется макрофагами, Т- и В-лимфоцитами, фибробластами, эндотелиальными, эпидермальными и микроглиальными клетками, хондроцитами, остеоцитами, а также некоторыми опухолевыми клетками [Ohsugi Y. Recent advances in immunopathophysiology of interleukin-6: an innovative therapeutic drug, Tocilizumab (recombinant humanized anti-human interleukin-6 receptor antibody), unveils the mysterious etiology of immune-mediated inflammatory diseases. Biol. Pharm. Bull., 2007. P. 2001-2006. - Последние достижения в иммунопатофизиологии интерлейкина-6: инновационное терапевтическое лекарственное средство, Тоцилизумаб (рекомбинантное гуманизированное антитело к человеческому рецептору интерлейкина-6), раскрывает тайну этиологии иммуноопосредованных воспалительных заболеваний].IL-6 is produced by macrophages, T and B lymphocytes, fibroblasts, endothelial, epidermal and microglial cells, chondrocytes, osteocytes, as well as some tumor cells [Ohsugi Y. Recent advances in immunopathophysiology of interleukin-6: an innovative therapeutic drug, Tocilizumab (recombinant humanized anti-human interleukin-6 receptor antibody), unveils the mysterious etiology of immune-mediated inflammatory diseases. Biol. Pharm. Bull., 2007. P. 2001-2006. - Recent advances in the immunopathophysiology of interleukin-6: an innovative therapeutic drug, Tocilizumab (a recombinant humanized antibody to the human receptor for interleukin-6), reveals the secret of the etiology of immune-mediated inflammatory diseases].

Биологическая активность ИЛ-6 реализуется посредством взаимодействия с мембранно-связанной субъединицей рецептора, которая не обладает сигнальной функцией с последующей передачей сигнала через трансмембранный гликопротеин gp130. Это классический путь передачи сигнала ИЛ-6 клеткам, экспрессирующим мембранно-связанную субъединицу рецептора ИЛ-6. Существует и альтернативный механизм передачи сигнала, в котором задействована растворимая субъединица рецептора ИЛ-6. Комплекс ИЛ-6 с растворимой субъединицей рецептора ИЛ-6 может активировать клетки, не экспрессирующие мембранно-связанную субъединицу рецептора ИЛ-6, но имеющие на своей поверхности гликопротеин gp130. Такой альтернативный механизм передачи сигнала существенно увеличивает число клеток-мишеней ИЛ-6 [Scheller J., Interleukin-6: from basic biology to selective blockade of pro-inflammatory activities. Semin Immunol. 2014. P. 2-12. - Интерлейкин-6: от основ биологии до селективной блокировки провоспалительной активности; Астраханцева И.В. и др. Современная антицитокиновая терапия аутоиммунных заболеваний. Биохимия, 2014, 79(12), 1607-1618].The biological activity of IL-6 is realized through interaction with a membrane-bound subunit of the receptor, which does not have a signal function, followed by signal transmission through the transmembrane glycoprotein gp130. This is a classic IL-6 signaling pathway for cells expressing the membrane-bound subunit of the IL-6 receptor. There is an alternative signal transmission mechanism in which the soluble subunit of the IL-6 receptor is involved. The complex of IL-6 with the soluble subunit of the IL-6 receptor can activate cells that do not express the membrane-bound subunit of the IL-6 receptor, but have gp130 glycoprotein on their surface. Such an alternative signal transmission mechanism significantly increases the number of IL-6 target cells [Scheller J., Interleukin-6: from basic biology to selective blockade of pro-inflammatory activities. Semin Immunol. 2014.P. 2-12. - Interleukin-6: from the basics of biology to the selective blocking of pro-inflammatory activity; Astrakhantseva I.V. et al. Modern anticytokine therapy of autoimmune diseases. Biochemistry, 2014, 79 (12), 1607-1618].

ИЛ-6 является одним из ключевых факторов в развитии некоторых аутоиммунных заболеваний, а также некоторых видов неоплазий. Гиперэкспрессия этого цитокина приводит к запуску воспалительного каскада и повреждению тканей клетками иммунной системы. Блокировка ИЛ-6 с помощью рекомбинантных моноклональных антител показала высокую клиническую эффективность и является компонентом терапии ИЛ-6 зависимых заболеваний (ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, болезнь Крона, язвенный колит, множественная миелома, болезнь Кастлемана, злокачественная лимфома, рак почек и др.) [Montero-Julian F.A. Pharmacokinetic study of anti-interleukin-6 (IL-6) therapy with monoclonal antibodies: enhancement of IL-6 clearance by cocktails of anti-IL-6 antibodies. Blood. 1995. P.917-924. - Фармакокинетическое исследование моноклональных антител для анти-ИЛ-6 терапии: усиление клиренса ИЛ-6 с помощью коктейля анти-ИЛ-6 антител; Trikha, M. et al., Targeted anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for cancer: a review of the rationale and clinical evidence. Clin Cancer Res.; 2003. P. 4653-4665. - Использование моноклональных антител к ИЛ-6 для таргетированной терапии рака: обзор клинических данных; Woodrick, R. and Ruderman, Е.М. Anti-interleukin-6 therapy in rheumatoid arthritis. Bull NYU Hosp Jt Dis. 2010. P.211-217. - Анти-интерлейкин-6 терапия ревматоидного артрита].IL-6 is one of the key factors in the development of some autoimmune diseases, as well as some types of neoplasia. Overexpression of this cytokine leads to the launch of an inflammatory cascade and tissue damage by cells of the immune system. Blocking IL-6 using recombinant monoclonal antibodies has shown high clinical efficacy and is a component of the treatment of IL-6 dependent diseases (rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, Crohn's disease, ulcerative colitis, multiple myeloma, Castleman’s disease, malignant lymphoma, kidney cancer, etc. ) [Montero-Julian FA Pharmacokinetic study of anti-interleukin-6 (IL-6) therapy with monoclonal antibodies: enhancement of IL-6 clearance by cocktails of anti-IL-6 antibodies. Blood 1995. P. 917-924. - Pharmacokinetic study of monoclonal antibodies for anti-IL-6 therapy: increased clearance of IL-6 using a cocktail of anti-IL-6 antibodies; Trikha, M. et al., Targeted anti-interleukin-6 monoclonal antibody therapy for cancer: a review of the rationale and clinical evidence. Clin Cancer Res .; 2003. P. 4653-4665. - The use of monoclonal antibodies to IL-6 for targeted cancer therapy: a review of clinical data; Woodrick, R. and Ruderman, E.M. Anti-interleukin-6 therapy in rheumatoid arthritis. Bull NYU Hosp Jt Dis. 2010. P.211-217. - Anti-interleukin-6 therapy for rheumatoid arthritis].

Целый ряд рекомбинантных блокаторов ИЛ-6 успешно проходит клинические испытания при лечении аутоиммунных и неопластических заболеваний: агликозилированные, гуманизированные моноклональные антитела к ИЛ-6 Клазакизумаб (ALD518/BMS-945429), человеческие моноклональные антитела к α-субъединице ИЛ6Р Сарилумаб (Sarilumab, SAR15319/1REG), человеческие моноклональные антитела к растворимому ИЛ6 Сирукумаб (Sirukumab, CNTO 136), высокоаффинные моноклональные антитела ИЛ-6, которые блокируют финальный этап сборки комплекса ИЛ6/ИЛ6Р Олокизумаб (Olokizumab, CD6038). Успешно применяется в клинической практике для лечения ревматоидного артрита (при недостаточной эффективности или непереносимости ингибиторов ФИО) рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело к человеческому рецептору ИЛ-6 Тоцилизумаб (Actemra/Актемра).A number of recombinant IL-6 blockers are successfully undergoing clinical trials in the treatment of autoimmune and neoplastic diseases: aglycosylated, humanized monoclonal antibodies to IL-6 Clazacizumab (ALD518 / BMS-945429), human monoclonal antibodies to IL-6 subunit SARilab Sarilum α6 subunit (Sarilab 1REG), human monoclonal antibodies to soluble IL6 Sirukumab (Sirukumab, CNTO 136), high-affinity monoclonal antibodies IL-6, which block the final stage of assembly of the IL6 / IL6P Olokizumab complex (Olokizumab, CD6038). It is successfully used in clinical practice for the treatment of rheumatoid arthritis (with insufficient efficacy or intolerance to name inhibitors), a recombinant humanized monoclonal antibody to the human IL-6 receptor Tocilizumab (Actemra / Actemra).

Основным ограничением к широкому применению анти-ИЛ-6 терапии в Российской Федерации является ее высокая стоимость. Отсутствие на фармацевтическом рынке блокаторов ИЛ-6 отечественного производства приводит к тому, что терапия ингибиторами ИЛ-6 остается недоступной для большинства пациентов.The main limitation to the widespread use of anti-IL-6 therapy in the Russian Federation is its high cost. The absence of domestic production of IL-6 blockers on the pharmaceutical market leads to the fact that therapy with IL-6 inhibitors remains unavailable to most patients.

Примеры блокирующих ИЛ-6 антител широко отражены в международных и российских патентах, например в патенте WO/2010/056948 "Humanized anti-IL-6 antibodies" - «Гуманизированные анти-ИЛ-6 антитела»; в патенте US 8992920 В2 "Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis" - Анти-ИЛ-6 антитела для лечения артритов»; в патенте US 8623362 В2 "Anti-IL-6 antibodies" - «Анти-ИЛ-6 антитела»; в патенте RU 2550262 «Моноклональное антитело против интерлейкина-6 человека и гибридома, продуцирующая данное моноклональное антитело», в патенте RU 2532826 «Гуманизированные антитела против IL-6».Examples of IL-6 blocking antibodies are widely reflected in international and Russian patents, for example, in patent WO / 2010/056948 "Humanized anti-IL-6 antibodies" - "Humanized anti-IL-6 antibodies"; in US patent 8992920 B2 "Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis" - Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis "; in US Pat. No. 8623362 B2 "Anti-IL-6 antibodies" - "Anti-IL-6 antibodies"; in patent RU 2550262 "Monoclonal antibody against human interleukin-6 and a hybridoma producing this monoclonal antibody", in patent RU 2532826 "Humanized antibodies against IL-6".

В качестве ближайшего аналога технического решения, составляющего основу настоящего изобретения, можно привести следующий пример.As the closest analogue of the technical solution that forms the basis of the present invention, the following example can be given.

Патент WO/2010/056948 "Humanized anti-IL-6 antibodies" - "Гуманизированные анти-ИЛ-6 антитела».Patent WO / 2010/056948 "Humanized anti-IL-6 antibodies" - "Humanized anti-IL-6 antibodies."

В данном патенте заявлено получение моноклональных гуманизированных антител против ИЛ-6. Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования, выбрано авторами настоящего изобретения за прототип.This patent claims the production of monoclonal humanized antibodies against IL-6. This technical solution, as the closest to the claimed by the composition of the active substance and the method of its use, is selected by the authors of the present invention for the prototype.

Недостатками прототипа являются:The disadvantages of the prototype are:

- Относительно дорогостоящее производство антител, высокие требования к условиям культивирования и качеству используемых реактивов, сложность поддержания и хранения продуцента.- Relatively expensive production of antibodies, high requirements for cultivation conditions and the quality of the reagents used, the complexity of maintaining and storing the producer.

- Относительно большой размер получаемых антител, что обуславливает пониженную проницаемость тканей.- The relatively large size of the resulting antibodies, which leads to reduced tissue permeability.

- Структурные особенности антител накладывают ограничение на узнавание некоторых «скрытых» эпитопов, находящихся, например, в углублениях, щелях малого размера в структуре белков.- The structural features of antibodies impose a restriction on the recognition of certain "hidden" epitopes located, for example, in recesses, small gaps in the structure of proteins.

- Ограниченность и относительная трудоемкость генно-инженерных манипуляций, адаптаций для конкретных задач, сложность создания многовалентных и многофункциональных производных заявленных антител.- The limited and relative complexity of genetic engineering manipulations, adaptations for specific tasks, the complexity of creating multivalent and multifunctional derivatives of the claimed antibodies.

Таким образом, существует потребность в разработке новых антител (антиген-узнающих молекул), лишенных указанных выше недостатков и специфически узнающих ИЛ-6.Thus, there is a need for the development of new antibodies (antigen-recognizing molecules) lacking the above disadvantages and specifically recognizing IL-6.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание новых антител, способных специфически связываться с ИЛ-6 человека, не оказывая существенного влияния на его функционирование, получение этих антител, производство и хранение которых должно быть экономичным. Новые антитела должны быть эффективны и относительно просты; их размер должен быть в несколько раз меньше, чем у классических антител. Такие антитела в перспективе могут найти применение в биоинженерии молекулярных сенсоров ИЛ-6, которые позволят проводить системный и локальный мониторинг уровня ИЛ-6 в живых системах.The task to which the invention is directed is to create new antibodies that can specifically bind to human IL-6 without significantly affecting its functioning, the production of these antibodies, the production and storage of which should be economical. New antibodies must be effective and relatively simple; their size should be several times smaller than that of classical antibodies. In the future, such antibodies can find application in the bioengineering of molecular sensors IL-6, which will allow for systemic and local monitoring of the level of IL-6 in living systems.

При этом способ получения однодоменных антител к белку ИЛ-6 включает в себя иммунизацию ламы (Lama glama) рекомбинантным аффинноочищенным ИЛ-6 человека, клонирование всего репертуара кДНК-последовательностей антиген-узнающих доменов антител ламы в фагмидный вектор, селекцию библиотеки последовательностей, кодирующих однодоменные антитела, специфически связывающиеся с рекомбинантным белком ИЛ-6, с помощью метода фагового дисплея, продукцию антител в бактериальной системе экспрессии и последующую очистку.The method of producing single-domain antibodies to the IL-6 protein includes immunization of a llama (Lama glama) with recombinant human affinity-purified IL-6, cloning the entire repertoire of cDNA sequences of antigen-recognizing domains of the llama antibodies into a phagemid vector, selection of a library of sequences encoding single-domain antibodies that specifically bind to the recombinant protein IL-6 using the phage display method, the production of antibodies in the bacterial expression system and subsequent purification.

В основе настоящего изобретения находятся не классические бивалентные антитела, которые рассматриваются в качестве прототипа, а малые однодоменные антитела, которые имеют ряд преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний. Поскольку однодоменные антитела (молекулярная масса около 12-15 кДа) на порядок меньше по размеру традиционных классических антител, они приобретают ряд новых положительных качеств, имеющих практическую значимость. Однодоменные антитела могут обладать новыми структурными особенностями, в принципе позволяющими им узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы.The present invention is based not on classical bivalent antibodies, which are considered as a prototype, but on small single-domain antibodies, which have several advantages, which suggests a great potential for their future use in various studies and in the creation of new biotechnological devices, as well as for clinical purposes diagnosis and treatment of diseases. Since single domain antibodies (molecular weight of about 12-15 kDa) are an order of magnitude smaller in size than traditional classical antibodies, they acquire a number of new positive qualities that are of practical importance. Single domain antibodies may possess new structural features that, in principle, allow them to recognize some epitopes that are “hidden” to ordinary antibodies.

Способ получения однодоменных антител, связывающих антигенные эпитопы белка ИЛ-6 человека, включает следующие принципиальные этапы:The method of obtaining single-domain antibodies that bind antigenic epitopes of the human IL-6 protein includes the following principal steps:

1) индукция образования специфических антител в результате иммунизации ламы рекомбинантным белком ИЛ-6;1) the induction of the formation of specific antibodies as a result of immunization of the llama with the recombinant protein IL-6;

2) клонирование последовательностей антиген-узнающих доменов особых одноцепочечных антител, синтезирующихся в лимфоцитах иммунизированного животного, в фагмидном векторе (использующимся в последующей процедуре фагового дисплея), получение специфически обогащенной библиотеки последовательностей, кодирующих наноантитела;2) cloning of the sequences of antigen-recognizing domains of specific single-chain antibodies synthesized in the lymphocytes of the immunized animal in the phagemid vector (used in the subsequent phage display procedure), obtaining a specifically enriched library of sequences encoding nanoantibodies;

3) селекция методом фагового дисплея клонов наноантител, связывающихся с заданным антигеном, белком ИЛ-6, из полученной библиотеки антител;3) selection by phage display of clones of nanoantibodies that bind to a given antigen, protein IL-6, from the resulting antibody library;

4) проведение переклонирования и генно-инженерных модификаций кодирующих последовательностей отобранных наноантител с целью их эффективной наработки в бактериальной системе экспрессии и последующей эффективной очистки (в качестве продуцента действующего вещества используются бактерии E.coli).4) carrying out the cloning and genetic engineering modifications of the coding sequences of the selected nanoantibodies with the aim of their effective production in the bacterial expression system and subsequent effective purification (E. coli bacteria are used as the producer of the active substance).

В качестве антигена для иммунизации и селекции использовали рекомбинантный белок ИЛ-6, наработанный в бактериях E.coli. Колонии E.coli штамм BL21-DE3-pLysS были трансформированы экспрессионным вектором pRSET, содержащим кДНК ИЛ-6 человека. Экспрессию гена и выделение белка проводили по ранее описанному протоколу [van Dam et al. Structure-function analysis of interleukin-6 utilizing human/murine chimeric molecules. Involvement of two separate domains in receptor binding. J Biol Chem 1993, 268(20), 15285-15290. - Структурно-функциональный анализ интерлейкина-6, используя человеческие/мышиные химерные молекулы. Участие двух отдельных доменов в связывании рецептора]. Чистота рекомбинантного белка ИЛ-6 составляла более 95%. Чистоту белка ИЛ-6 проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в ПААГ и гель-фильтрации (Описанный рекомбинантный белок был любезно предоставлен проф. Rose-John S., Department of Biochemistry, University of Kiel, Germany).As an antigen for immunization and selection, the recombinant protein IL-6 obtained in E. coli bacteria was used. Colonies of E. coli strain BL21-DE3-pLysS were transformed with pRSET expression vector containing human IL-6 cDNA. Gene expression and protein isolation were carried out according to the previously described protocol [van Dam et al. Structure-function analysis of interleukin-6 utilizing human / murine chimeric molecules. Involvement of two separate domains in receptor binding. J Biol Chem 1993, 268 (20), 15285-15290. - Structural and functional analysis of interleukin-6 using human / mouse chimeric molecules. The participation of two separate domains in receptor binding]. The purity of the recombinant protein IL-6 was more than 95%. The purity of the IL-6 protein was checked by denaturing PAGE and gel filtration (The described recombinant protein was kindly provided by Prof. Rose-John S., Department of Biochemistry, University of Kiel, Germany).

Способ получения однодоменных антител описан в примерах 1 и 2. Возможность использования полученных антител для детекции белка ИЛ-6 и их функциональные характеристики показаны в примерах 3-5.A method for producing single domain antibodies is described in examples 1 and 2. The possibility of using the obtained antibodies to detect IL-6 protein and their functional characteristics are shown in examples 3-5.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Фиг. 1. Очищенные форматированные однодоменные антитела, специфически узнающие белок ИЛ-6 человека, фракционированные в 14% SDS-полиакриламидном геле.FIG. 1. Purified formatted single-domain antibodies that specifically recognize human IL-6 protein, fractionated in 14% SDS-polyacrylamide gel.

Фиг. 2. Результаты иммуноферментного анализа узнавания рекомбинантного белка ИЛ-6 человека, иммобилизованного в лунках иммунологической плашки, отобранными тремя однодоменными форматированными антителами (обозначены в нижней части рисунка под номером от 1 до 3). Контрольные лунки не содержали антиген, но далее были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном). Ось ординат соответствует данным поглощения в экспериментальных ячейках при длине волны 405 нм. Представлены усредненные результаты трех повторов данного анализа (с указанными диапазонами разброса полученных значений).FIG. 2. The results of an enzyme-linked immunosorbent assay for recognition of the recombinant human IL-6 protein immobilized in the wells of an immunological plate, selected by three single-domain formatted antibodies (indicated at the bottom of the figure, numbered 1 to 3). Control wells did not contain antigen, but were then blocked and processed in parallel with experimental cells (with antigen). The ordinate axis corresponds to the absorption data in the experimental cells at a wavelength of 405 nm. The averaged results of three repetitions of this analysis are presented (with the indicated ranges of the scatter of the obtained values).

Фиг. 3. Измерение константы связывания и диссоциации однодоменных антител к ИЛ-6 с рекомбинантным белком ИЛ-6 человека методом поверхностного-плазмонного резонанса. На рисунке показаны сенсограммы, полученные в результате 5 взаимодействий для каждого из антител. Результаты анализировались с помощью ProteOn Manager Software (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра.FIG. 3. Measurement of the binding and dissociation constants of single domain antibodies to IL-6 with recombinant human IL-6 protein by surface plasmon resonance. The figure shows the sensograms obtained as a result of 5 interactions for each of the antibodies. The results were analyzed using ProteOn Manager Software (Bio-Rad) using the Langmuir model.

Фиг. 4. Отобранные однодоменные антитела (VHH 44, VHH 87) не влияют на пролиферацию клеток, зависимую от IL-6. Для третьего антитела (VHH 49) данные были аналогичны (не показано). Клеточную линию Ba/F3-gp130-hIL-6R стимулировали рекомбинатным IL-6 человека (10 нг/мл) в присутствии различных концентраций анти-IL-6 антител. Пролиферативную активность оценивали с помощью МТТ-теста. Активность МТТ в присутствии IL-6 без ингибитора была принята за 100%. В качестве положительного контроля использовали коммерческие анти- hIL-6 антитела (MQ2-13A5, eBioscience), которые блокируют IL-6 и подавляют пролиферацию клеток.FIG. 4. Selected single domain antibodies (VHH 44, VHH 87) do not affect cell proliferation dependent on IL-6. For the third antibody (VHH 49), the data were similar (not shown). The Ba / F3-gp130-hIL-6R cell line was stimulated with recombinant human IL-6 (10 ng / ml) in the presence of various concentrations of anti-IL-6 antibodies. Proliferative activity was evaluated using the MTT test. MTT activity in the presence of IL-6 without inhibitor was taken as 100%. As a positive control, commercial anti-hIL-6 antibodies (MQ2-13A5, eBioscience), which block IL-6 and inhibit cell proliferation, were used.

Осуществление настоящего изобретенияThe implementation of the present invention

Пример 1. Получение библиотеки вариабельных доменов одноцепочечных антител.Example 1. Obtaining a library of variable domains of single-chain antibodies.

Для генерирования in vivo однодоменных антител, специфически узнающих белок ИЛ-6, была проведена иммунизация ламы (Lama glama).To generate in vivo single domain antibodies that specifically recognize the IL-6 protein, immunization was carried out with Lama (Lama glama).

В качестве антигена для иммунизации использовали специально синтезированный для этой цели рекомбинантный белок ИЛ-6, который был экспрессирован в прокариотической системе. Препарат рекомбинантного белка ИЛ-6 разделили на 6 равных частей по 0,5 мг (первые 5 частей - для 5 последовательных инъекций, а также оставили аликвоту для последующих этапов селекции и анализа заданных наноантител). Все аликвоты замораживали для хранения при -70°С. Перед проведением каждого этапа иммунизации одну из хранящихся при -70°С аликвот препарата размораживали и непосредственно перед инъекцией смешивали в равных пропорциях с адъювантом LQ (фирмы Gerbu, Heidelberg, Германия). Перед 1-й иммунизацией от ламы отбирали кровь для получения преиммунной сыворотки, которая впоследствии использовалась в качестве негативного контроля. Пятикратную иммунизацию проводили путем подкожных инъекций рекомбинантного белка ИЛ-6 человека, смешанного в равных пропорциях с адъювантом. Вторую иммунизацию проводили через 4 недели после первой, а последующие 3 с интервалом 10 дней. Заключительное взятие крови проводили через 5 дней после последней иммунизации. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли 50 мл стандартного фосфатно-солевого раствора (PBS), содержащего гепарин (50 ед./мл) и ЭДТА (2 мМ).As an antigen for immunization, a recombinant protein IL-6, specially synthesized for this purpose, was expressed, which was expressed in the prokaryotic system. The preparation of recombinant protein IL-6 was divided into 6 equal parts of 0.5 mg (the first 5 parts for 5 consecutive injections, and also left an aliquot for the subsequent stages of selection and analysis of the specified nanoantibodies). All aliquots were frozen for storage at -70 ° C. Before each immunization step, one of the aliquots of the preparation stored at -70 ° C was thawed and immediately before injection, they were mixed in equal proportions with LQ adjuvant (Gerbu, Heidelberg, Germany). Before the 1st immunization, blood was taken from the llama to obtain preimmune serum, which was subsequently used as a negative control. Five-fold immunization was carried out by subcutaneous injection of a recombinant human protein IL-6, mixed in equal proportions with adjuvant. The second immunization was carried out 4 weeks after the first, and the next 3 with an interval of 10 days. Final blood sampling was performed 5 days after the last immunization. To prevent coagulation of the taken blood, 50 ml of standard phosphate-saline solution (PBS) containing heparin (50 units / ml) and EDTA (2 mM) was added.

Кровь разводили в 2 раза раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА. 35 мл разбавленного раствора крови наслаивали на ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл объемом 15 мл и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800×g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.Blood was diluted 2 times with a PBS solution containing 1 mM EDTA. 35 ml of a diluted blood solution was layered on a step of a special medium (Histopaque-1077, Sigma) with a density of 1.077 g / ml and a volume of 15 ml and centrifugation was performed for 20 min at 800 × g. Mononuclear cells (lymphocytes and monocytes) were selected from the plasma / Histopaque interphase, and then washed with a PBS solution containing 1 mM EDTA.

Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем на колонке с олиго(dT)-целлюлозой из тотальной РНК очищали поли(А)-содержащую РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и проверяли качество выделенной РНК с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.Total RNA from B lymphocytes was isolated using TRIzol reagent (Invitrogen). Then, a poly (A) -containing RNA was purified on a column of oligo (dT) cellulose from total RNA. RNA concentration was determined using a biophotometer (Eppendorf) and the quality of the isolated RNA was checked by electrophoresis in 1.5% formaldehyde agarose gel.

Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу [Sambrook et al., 1989] с использованием обратной транскриптазы HM-MuLV и праймера олиго(dT)15 в качестве затравки.The reverse transcription reaction was performed according to the standard protocol [Sambrook et al., 1989] using reverse transcriptase HM-MuLV and oligo primer (dT) 15 as a seed.

Продукты обратной транскрипции использовали в качестве матрицы в двухступенчатой полимеразной цепной реакции и полученные продукты амплификации клонировали по сайтам Ncol(Pstl) и NotI в плазмидный вектор pHEN4, как описано ранее [Hamers-Casterman С. et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 1993; 363: 446-448. - Существующие в природе антитела без легких цепей. Nguyen V.K. et al. Functional heavy-chain antibodies in camelidae. Adv. Immunol., 2001, 79, 261-296. - Функциональные антитела, состоящие только из тяжелых цепей, у Верблюдовых. Saerens D. et al. Single domain antibodies derived from dromedary lymph node and peripheral blood lymphocytes sensing conformational variants of prostate-specific antigen. J. Biol. Chem., 2004, 279, 51965-51972. - Однодоменные антитела, полученные из лимфатического узла или лимфоцитов периферической крови верблюда, распознают конформационные варианты простата-специфического антигена. Rothbauer U. et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods., 2006, 3, 887-889. - Таргетирование и наблюдение антигенов в живых клетках с помощью флуоресцентных нанотел].Reverse transcription products were used as templates in a two-step polymerase chain reaction, and the resulting amplification products were cloned at the Ncol (Pstl) and NotI sites into the pHEN4 plasmid vector, as previously described [Hamers-Casterman C. et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 1993; 363: 446-448. - Existing naturally occurring antibodies without light chains. Nguyen V.K. et al. Functional heavy-chain antibodies in camelidae. Adv. Immunol., 2001, 79, 261-296. - Functional antibodies, consisting only of heavy chains, in Camelids. Saerens D. et al. Single domain antibodies derived from dromedary lymph node and peripheral blood lymphocytes sensing conformational variants of prostate-specific antigen. J. Biol. Chem., 2004, 279, 51965-51972. - Single-domain antibodies derived from a lymph node or camel's peripheral blood lymphocytes recognize conformational variants of a prostate-specific antigen. Rothbauer U. et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods., 2006, 3, 887-889. - Targeting and observation of antigens in living cells using fluorescent nanobodies].

Пример 2. Селекция однодоменных антител, специфически узнающих ИЛ-6. Селекцию однодоменных антител проводили методом фагового дисплея с использованием рекомбинантного белка ИЛ-6, иммобилизованного на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические плашки с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1% БСА (Sigma-Aldrich, США) и/или 1% обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц повторяли последовательно три раза. Все манипуляции проводили, как описано в публикациях [Тиллиб C.B. и др. Фингерпринтный анализ селекции «наноантител» методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. Acta Natura, 2010, 2 (3), 100-108. Hamers-Casterman С. et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 1993; 363, 446-448. - Существующие в природе антитела без легких цепей. Nguyen V.K. et al. Functional heavy-chain antibodies in camelidae. Adv. Immunol., 2001, 79, 261-296. - Функциональные антитела, состоящие только из тяжелых цепей, у Верблюдовых. Saerens D. et al. Single domain antibodies derived from dromedary lymph node and peripheral blood lymphocytes sensing conformational variants of prostate-specific antigen. J. Biol. Chem., 2004, 279, 51965-51972. - Однодоменные антитела, полученные из лимфатического узла или лимфоцитов периферической крови верблюда, распознают конформационные варианты простата-специфического антигена]. Последовательности клонов отобранных антител группировали по схожести их фингерпринтов, получаемых при электрофоретическом разделении продуктов гидролиза амплифицированных последовательностей однодоменных антител параллельно тремя частощепящими рестрикционными эндонуклеазами (Hinfl, Mspl, Rsal). Были определены последовательности кДНК однодоменных антител к ИЛ-6. Из них были выведены соответствующие аминокислотные последовательности 3 клонов антител к ИЛ-6: SEQ ID NO: 1 (VHH 44); SEQ ID NO: 2 (VHH 49) и SEQ ID NO: 3 (VHH 87).Example 2. Selection of single-domain antibodies that specifically recognize IL-6. Single domain antibodies were selected by phage display using a recombinant IL-6 protein immobilized on the bottom of the wells of a 96-well ELISA plate. Used polystyrene immunological plates with high sorption MICROLON 600 (Greiner Bio-One). For blocking, 1% BSA (Sigma-Aldrich, USA) and / or 1% skim milk (Bio-Rad, USA) in PBS were used. The selection procedure and the subsequent amplification of the selected phage particles was repeated successively three times. All manipulations were performed as described in publications [Tillib C.B. et al. Fingerprint analysis of the selection of “nanoantibodies” by the phage display method using two variants of assistant phages. Acta Natura, 2010, 2 (3), 100-108. Hamers-Casterman C. et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 1993; 363, 446-448. - Existing naturally occurring antibodies without light chains. Nguyen V.K. et al. Functional heavy-chain antibodies in camelidae. Adv. Immunol., 2001, 79, 261-296. - Functional antibodies, consisting only of heavy chains, in Camelids. Saerens D. et al. Single domain antibodies derived from dromedary lymph node and peripheral blood lymphocytes sensing conformational variants of prostate-specific antigen. J. Biol. Chem., 2004, 279, 51965-51972. - Single-domain antibodies obtained from the lymph node or lymphocytes of the peripheral blood of a camel recognize conformational variants of a prostate-specific antigen]. Clone sequences of the selected antibodies were grouped by the similarity of their fingerprints obtained by electrophoretic separation of the hydrolysis products of amplified single domain antibody sequences in parallel with three frequently digested restriction endonucleases (Hinfl, Mspl, Rsal). The cDNA sequences of single domain antibodies to IL-6 were determined. The corresponding amino acid sequences of 3 clones of antibodies to IL-6 were deduced from them: SEQ ID NO: 1 (VHH 44); SEQ ID NO: 2 (VHH 49) and SEQ ID NO: 3 (VHH 87).

Продукция наноантителNanoantibody Products

Последовательности кДНК 3 отобранных клонов наноантител переклонировали в экспрессионный модифицированный плазмидный вектор pHEN6 [Conrath K.Е. et al. Betalactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. Antimicrob Agents Chemother., 2001, 45, 2807-2812. - Ингибиторы бета-лактамазы, выделенные из однодоменных фрагментов антител Верблюдовых], позволяющий присоединение к С-концу однодоменного нано-антитела (His)6-эпитопа. Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (peIB) нарабатываемый рекомбинантный белок (однодоменное наноантитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию однодоменных антител проводили в Е.coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-О-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°С или в течение ночи при 29°С. Однодоменное антитело выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США).The cDNA sequences of the 3 selected nanoantibody clones were cloned into the expression modified plasmid vector pHEN6 [Conrath K.E. et al. Betalactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. Antimicrob Agents Chemother., 2001, 45, 2807-2812. - Beta-lactamase inhibitors isolated from single-domain camelid antibody fragments], allowing the addition of a single-domain nano-antibody (His) 6-epitope to the C-terminus. Due to the presence of the signal peptide sequence (peIB) at the N-terminus of the expressed sequence, the produced recombinant protein (single-domain nanoantibody) accumulates in the periplasm of bacteria, which allows it to be efficiently isolated by the osmotic shock method without destroying the bacterial cells themselves. The production of single domain antibodies was carried out in E. coli (strain BL21). Expression was induced by adding 1 mM indolyl beta-O-galactopyranoside and the cells were incubated with vigorous stirring for 7 hours at 37 ° C or overnight at 29 ° C. A single domain antibody was isolated from the periplasmic extract using affinity chromatography on Ni-NTA agarose using the QIAExpressionist purification system (QIAGEN, USA).

На ФИГ. 1 представлена электрофореграмма полиакриламидного геля с наработанными и очищенными однодоменными антителами (одАТ), специфически узнающими ИЛ-6 человека.In FIG. Figure 1 shows the electrophoregram of a polyacrylamide gel with accumulated and purified single domain antibodies (odAT) that specifically recognize human IL-6.

Структура трех однодоменных антител к ИЛ-6 приведена в разделе «Перечень последовательностей». В указанных последовательностях выделены и подчеркнуты гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 (соответственно, слева направо, от N- к С-концу).The structure of three single-domain antibodies to IL-6 is given in the section "List of sequences". In the indicated sequences, the hypervariable regions of CDR1, CDR2 and CDR3 are highlighted and underlined (respectively, from left to right, from N- to C-terminus).

Пример 3. Детекция рекомбинантного белка ИЛ-6 с помощью отобранных клонов однодоменных антителExample 3. Detection of recombinant protein IL-6 using selected clones of single domain antibodies

Полученный в результате описанной процедуры периплазматический экстракт, содержащий мини-антитело с НА-тагом, использовали для оценки специфичности и эффективности связывания соответствующего мини-антитела с препаратом рекомбинантного белка-антигена с помощью метода иммунофлуоресцентного анализа.The periplasmic extract containing the mini-antibody with the HA tag obtained as a result of the described procedure was used to assess the specificity and binding efficiency of the corresponding mini-antibody with the preparation of the recombinant protein antigen using the immunofluorescence analysis method.

В ячейки стандартной 96-луночной иммунологической плашки (из полистирола, Microlon 600 hi-binding, фирмы Greiner bio-one) наносили в объеме 50 мкл разбавленный (в PBS) до концентрации примерно 2 мкг/мл рекомбинантный белок ИЛ-6. Иммобилизацию проводили в течение ночи при +4°С. Затем ячейки отмывали (в PBS) от несвязавшегося антигена и блокировали лунки раствором 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS в течение 2 часов при комнатной температуре. Ячейки отмывали в PBS и PBS с 0.05% Твеен-20, после чего добавляли проверяемые однодоменные форматированные антитела, содержащие НА-таг на С-конце, в количестве примерно 500 нг в 50 мкл PBS, содержащим 0,1% БСА. После инкубации (при перемешивании) в течение 2 часов при комнатной температуре ячейки вновь отмывали, как описано выше, и затем инкубировали с разведенными в 2000 раз (в PBS с 0.1% БСА) вторичными антителами цыпленка к НА-тагу, конъюгированными с пероксидазой хрена (CHGT-45P-Z, ICL, Inc., USA). Инкубацию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. После тщательной отмывки проводили детекцию активности фермента пероксидазы хрена, используя в качестве хромогенного субстрата ABTS (2,2′-азино-бис 3-этилбензотиазолин-6-сульфонат). Оптическую плотность измеряли при длине волны 405 нм с помощью планшетного флюориметра. Контрольные лунки не содержали антиген, но далее были блокированы и процессированы параллельно с экспериментальными ячейками (с антигеном).Recombinant IL-6 recombinant protein was applied in a volume of 50 μl in a volume of 50 μl into a standard 96-well immunological plate (from polystyrene, Microlon 600 hi-binding, Greiner bio-one) in a volume of about 2 μg / ml. Immobilization was carried out overnight at + 4 ° C. Then the cells were washed (in PBS) from unbound antigen and the wells were blocked with a solution of 1% bovine serum albumin (BSA) in PBS for 2 hours at room temperature. Cells were washed in PBS and PBS with 0.05% Tween-20, after which verified single-domain formatted antibodies containing the HA tag at the C-terminus were added in an amount of about 500 ng in 50 μl of PBS containing 0.1% BSA. After incubation (with stirring) for 2 hours at room temperature, the cells were washed again, as described above, and then incubated with 2000-fold diluted PBS (0.1% BSA) secondary anti-HA antibody conjugated to horseradish peroxidase ( CHGT-45P-Z, ICL, Inc., USA). Incubation was carried out for 1 hour at room temperature. After thorough washing, the activity of the horseradish peroxidase enzyme was detected using ABTS (2,2′-azino-bis 3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonate) as a chromogenic substrate. The optical density was measured at a wavelength of 405 nm using a flatbed fluorimeter. Control wells did not contain antigen, but were then blocked and processed in parallel with experimental cells (with antigen).

На ФИГ. 2 представлены результаты иммуноферментного анализа, из которых следует, что все изучаемые клоны однодоменных антител специфически связываются с рекомбинантным белком ИЛ-6. Величина столбцов на рисунке соответствует относительным величинам поглощения при длине волны 405 нм, количественно отражающим эффективность связывания наноантитела с ИЛ-6.In FIG. 2 presents the results of an enzyme immunoassay, from which it follows that all the studied single-domain antibody clones specifically bind to the recombinant protein IL-6. The size of the columns in the figure corresponds to the relative values of absorption at a wavelength of 405 nm, quantitatively reflecting the efficiency of binding of nanoantibodies to IL-6.

Пример 4. Измерение константы связывания и диссоциации однодоменных антител против ИЛ-6 с рекомбинантным белком ИЛ-6 методом поверхностного-плазмонного резонанса.Example 4. Measurement of the binding and dissociation constants of single domain antibodies against IL-6 with recombinant protein IL-6 by surface plasmon resonance.

Измерения кинетики связывания: скорости ассоциации, скорости диссоциации и константы диссоциации однодоменных антител с рекомбинантным белком ИЛ-6 проводились с помощью прибора поверхностного плазмонного резонанса Proteon XPR36 (Bio-Rad). Измерения проводились при 20°С в качестве буфера использовался фосфатно-солевой буфер рН 7.4, 0.005% Tween 20.Binding kinetics were measured: association rates, dissociation rates, and dissociation constants of single-domain antibodies with the recombinant protein IL-6 were carried out using a Proteon XPR36 surface plasmon resonance device (Bio-Rad). The measurements were carried out at 20 ° С. A phosphate-saline buffer pH 7.4, 0.005% Tween 20 was used as a buffer.

Для этого препарат рекомбинантного ИЛ-6 человека в ацетатном буфере (рН=5.0) был иммобилизован на GLM-чипе (Bio-Rad) (на этом чипе поверх слоя золота, в котором происходит эффект поверхностного плазмонного резонанса, нанесен слой полимера альгиновой кислоты, содержащий свободные карбоксильные группы) в концентрации 1 мкг/мл. Перед иммобилизацией поверхность чипа была активирована смесью 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в концентрации 6.66 мМ и N-Гидроксисукцинимида в концентрации 1.33 мМ в течение 30 с при скорости потока 30 мкл/мин. Препарат рекомбинантного ИЛ-6 человека наносился в вертикальной ориентации в два этапа 100 с и 300 с при скорости 30 мкл/мин. Оставшиеся свободными карбоксильные группы были инактивированы этаноламином. Суммарный уровень иммобилизации составил 800 RU. После промывки фосфатно-солевым буфером, содержащим 0.005% Tween (100 мкл/мин, 660 с) ориентация была изменена на горизонтальную. Затем была проведена дополнительная промывка фосфатно-солевым буфером (100 мкл/мин, объем 100 мкл, диссоциация 600 с), после чего установилась базовая линия. Затем также в горизонтальной ориентации был нанесен препарат однодоменных антител против IL-6 в фосфатно-солевом буфере в двукратно убывающих концентрациях 200 - 12.5 нМ в течение 245 с при скорости 100 мкл/мин. Диссоциация измерялась в течение 2000 с. Сенсограммы, полученные в результате 5 взаимодействий для каждого из антитела, анализировались с помощью ProteOn Manager Software (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра.For this, the recombinant human IL-6 preparation in acetate buffer (pH = 5.0) was immobilized on a GLM chip (Bio-Rad) (on this chip, a layer of alginic acid containing a polymer of alginic acid was deposited on top of the gold layer in which the effect of surface plasmon resonance occurs) free carboxyl groups) at a concentration of 1 μg / ml. Before immobilization, the surface of the chip was activated with a mixture of 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide at a concentration of 6.66 mM and N-Hydroxysuccinimide at a concentration of 1.33 mM for 30 s at a flow rate of 30 μl / min. The recombinant human IL-6 preparation was applied in a vertical orientation in two stages of 100 s and 300 s at a speed of 30 μl / min. The remaining free carboxyl groups were inactivated by ethanolamine. The total level of immobilization amounted to 800 RU. After washing with phosphate-buffered saline containing 0.005% Tween (100 μl / min, 660 s), the orientation was changed to horizontal. Then, an additional washing with phosphate-buffered saline was carried out (100 μl / min, volume 100 μl, dissociation 600 s), after which a baseline was established. Then, in a horizontal orientation, a preparation of single domain antibodies against IL-6 was also applied in phosphate-buffered saline in twice decreasing concentrations of 200 - 12.5 nM for 245 s at a speed of 100 μl / min. Dissociation was measured for 2000 s. Sensograms resulting from 5 interactions for each of the antibodies were analyzed using ProteOn Manager Software (Bio-Rad) using the Langmuir model.

На ФИГ. 3 представлены кривые взаимодействия (сенсограммы), полученные в результате 5 взаимодействий с рекомбинантным ИЛ-6 для каждого из антител.In FIG. Figure 3 shows the interaction curves (sensograms) obtained as a result of 5 interactions with recombinant IL-6 for each of the antibodies.

Представленные данные демонстрируют, что константы связывания и диссоциации у однодоменных антител VHH 49 и VHH 87 заметно отличаются от VHH 44, что возможно, обусловлено узнаванием этими антителами менее доступного (при используемом способе иммобилизации антигена) эпитопа ИЛ-6. Однако опыты по сравнительному параллельному связыванию всех трех антител с иммобилизованным антигеном в ИФА указывают на сравнимую силу связывания антигена для всех трех вариантов антител.The data presented demonstrate that the binding and dissociation constants of single domain antibodies VHH 49 and VHH 87 are markedly different from VHH 44, which is possibly due to the recognition by these antibodies of the less available (using the antigen immobilization method) epitope IL-6. However, experiments on the comparative parallel binding of all three antibodies to an immobilized antigen in ELISA indicate a comparable strength of antigen binding for all three antibody variants.

Пример 5. Определение способности однодоменных антител нейтрализовать биологическую активность ИЛ-6 человека.Example 5. Determination of the ability of single-domain antibodies to neutralize the biological activity of IL-6 person.

Анализ возможной нейтрализующей активности полученных антител определяли по блокировке клеточной пролиферации на ИЛ-6-зависимой клеточной линии Ba/F3-gp130-hIL-6R в присутствии 10 нг/мл рекомбинатного ИЛ-6 человека. В результате проведенных исследований было установлено, что однодоменные антитела VHH 44, VHH 49, VHH 87 не блокируют биологическую активность IL-6 человека (ФИГ.4). Данный факт свидетельствует о способности однодоменных антител узнавать «скрытые» для классических антител эпитопы белка.An analysis of the possible neutralizing activity of the obtained antibodies was determined by blocking cell proliferation on an IL-6-dependent Ba / F3-gp130-hIL-6R cell line in the presence of 10 ng / ml recombinant human IL-6. As a result of the studies, it was found that single-domain antibodies VHH 44, VHH 49, VHH 87 do not block the biological activity of human IL-6 (FIG. 4). This fact testifies to the ability of single-domain antibodies to recognize protein epitopes “hidden” for classical antibodies.

Приведенные примеры с фигурами доказывают выполнение поставленной данным изобретением задачи, а именно создание новых однодоменных антител, способных эффективно связывать ИЛ-6 человека. Эти антитела обладают следующими преимуществами по отношению к прототипу (моноклональные гуманизированные антитела против ИЛ-6 человека): их получение, производство и хранение более экономично, эффективно и относительно просто; их получение включает стадию иммунизации и аффинного дозревания in vivo, что обычно способствует более высокой аффинности и существенному повышению эффективности селекции заданных однодоменных антител, они хорошо растворимы, обладают новыми структурными особенностями, позволяющими им потенциально узнавать некоторые «скрытые» для обычных антител эпитопы. Поскольку эти антитела не нейтрализуют биологическую активность ИЛ-6 человека, при их использовании не будет искажаться баланс, связанный с эффектами этого цитокина. Антитела VHH44, VHH49, VHH87 представляют собой антиген-связывающие модули, подходящие для создания молекулярных сенсоров ИЛ-6, что в будущем позволит проводить системный и локальный мониторинг уровня ИЛ-6 in vivo.The above examples with figures prove the fulfillment of the task posed by this invention, namely the creation of new single-domain antibodies capable of efficiently binding human IL-6. These antibodies have the following advantages relative to the prototype (monoclonal humanized antibodies against human IL-6): their preparation, production and storage are more economical, efficient and relatively simple; their preparation includes the stage of immunization and affinity maturation in vivo, which usually contributes to higher affinity and a significant increase in the efficiency of selection of given single-domain antibodies, they are highly soluble, have new structural features that allow them to potentially recognize some of the epitopes that are “hidden” for ordinary antibodies. Since these antibodies do not neutralize the biological activity of human IL-6, the balance associated with the effects of this cytokine will not be distorted when used. Antibodies VHH44, VHH49, VHH87 are antigen-binding modules suitable for the creation of molecular sensors IL-6, which in the future will allow for systemic and local monitoring of the level of IL-6 in vivo.

Таким образом, задача, поставленная в данном изобретении, решена.Thus, the problem posed in this invention is solved.

Перечень последовательностейSequence listing

Аминокислотные последовательности трёх отобранных однодоменных антител (наноантител), способных специфически связывать белок IL-6 человека. В указанных последовательностях выделены и подчеркнуты гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 (соответственно, слева направо, от N- к С-концу). Ниже указана дополнительная последовательность (*), содержащая линейный линкерный участок, а также последовательности НА-тага и His-тага, добавляемая (в результате «форматирования») на С-конец кодирующей последовательности исходно отбираемого клона антитела с целью его более эффективной очистки и детекции.Amino acid sequences of three selected single domain antibodies (nanoantibodies) capable of specifically binding to human IL-6 protein. In the indicated sequences, the hypervariable regions of CDR1, CDR2 and CDR3 are highlighted and underlined (respectively, from left to right, from N- to C-terminus). The following is an additional sequence (*) containing a linear linker region, as well as the sequences of the HA tag and His tag added (as a result of “formatting”) to the C-terminus of the coding sequence of the originally selected antibody clone for its more efficient purification and detection .

SEQ ID NO: 1SEQ ID NO: 1

Malqevqlvesggglvqpggslrlscaas gniariavmg wyrqapgkqrelva hifsggntiyvdsvkg Malqevqlvesggglvqpggslrlscaas gniariavmg wyrqapgkqrelva hifsggntiyvdsvkg

rftisranaqntvylqmnslkpedtavyyc narvvtsgtyny wgqgtqvtvssrftisranaqntvylqmnslkpedtavyyc narvvtsgtyny wgqgtqvtvss

SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 2

Malqevqlvesggglvqaggslrlscaas gsirsiirma wyrqapgkrrelva hiisggstnvadsvkg Malqevqlvesggglvqaggslrlscaas gsirsiirma wyrqapgkrrelva hiisggstnvadsvkg

rftisrdgakntvhlqmnslkpedtaiyyc nvrdlysttyey wgqgtqvtvssrftisrdgakntvhlqmnslkpedtaiyyc nvrdlysttyey wgqgtqvtvss

SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 3

Malqevqlvesggglvqaggslrlscaas gtirsiirva wyrqapgkqrelva hiisggstgyadsvkg Malqevqlvesggglvqaggslrlscaas gtirsiirva wyrqapgkqrelva hiisggstgyadsvkg

rftisrdgakntvylqmnslkpedtaiyyc nvrdlystsyey wgrgtqvtvssrftisrdgakntvylqmnslkpedtaiyyc nvrdlystsyey wgrgtqvtvss

*epkipqpqpkpqpqpqpqpkpqpkpepesgrypydvpdyasgrgshhhhhh* epkipqpqpkpqpqpqpqpkpqpkpepesgrypydvpdyasgrgshhhhhh

Claims (3)

1. Рекомбинантное однодоменное антитело, специфически связывающее ИЛ-6 человека и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.1. Recombinant single-domain antibody specifically binding to human IL-6 and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 2. Рекомбинантное однодоменное антитело, специфически связывающее ИЛ-6 человека и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.2. Recombinant single domain antibody specifically binding to human IL-6 and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 3. Рекомбинантное однодоменное антитело, специфически связывающее ИЛ-6 человека и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. 3. Recombinant single domain antibody specifically binding to human IL-6 and having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
RU2015145831/10A 2015-10-26 2015-10-26 Recombinant single-domain antibodies specifically binding human interleukin-6, method for their preparing and using for detection of this protein RU2603269C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015145831/10A RU2603269C1 (en) 2015-10-26 2015-10-26 Recombinant single-domain antibodies specifically binding human interleukin-6, method for their preparing and using for detection of this protein

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015145831/10A RU2603269C1 (en) 2015-10-26 2015-10-26 Recombinant single-domain antibodies specifically binding human interleukin-6, method for their preparing and using for detection of this protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2603269C1 true RU2603269C1 (en) 2016-11-27

Family

ID=57774523

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015145831/10A RU2603269C1 (en) 2015-10-26 2015-10-26 Recombinant single-domain antibodies specifically binding human interleukin-6, method for their preparing and using for detection of this protein

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2603269C1 (en)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111856041A (en) * 2020-07-17 2020-10-30 陈元超 PCT/IL-6 fluorescent quantitative rapid detection test strip and preparation method and application thereof
CN112778416A (en) * 2020-12-30 2021-05-11 康元医疗科技(大连)有限公司 Nano antibody, polypeptide related to nano antibody and application of polypeptide
CN117304315A (en) * 2023-11-29 2023-12-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 anti-IL-6 nanobody and application thereof in IL-6 related diseases
WO2024093652A1 (en) * 2022-10-31 2024-05-10 Institute of Health and Medicine, Hefei Comprehensive National Science Center APPLICATION OF NANOBODY TARGETING ON IL-6Rα

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ДЕЕВ С. М., ЛЕБЕДЕНКО Е. Н. "Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения." Acta Naturae (русскоязычная версия), 2009, 1:32-50. KLARENBEEK A. et al. "Camelid Ig V genes reveal significant human homology not seen in therapeutic target genes, providing for a powerful therapeutic antibody platform." MAbs., 2015 (Published online: 27 May 2015), 7(4): 693-706. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111856041A (en) * 2020-07-17 2020-10-30 陈元超 PCT/IL-6 fluorescent quantitative rapid detection test strip and preparation method and application thereof
CN112778416A (en) * 2020-12-30 2021-05-11 康元医疗科技(大连)有限公司 Nano antibody, polypeptide related to nano antibody and application of polypeptide
WO2024093652A1 (en) * 2022-10-31 2024-05-10 Institute of Health and Medicine, Hefei Comprehensive National Science Center APPLICATION OF NANOBODY TARGETING ON IL-6Rα
CN117304315A (en) * 2023-11-29 2023-12-29 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 anti-IL-6 nanobody and application thereof in IL-6 related diseases
CN117304315B (en) * 2023-11-29 2024-02-09 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 anti-IL-6 nanobody and application thereof in IL-6 related diseases

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112321715B (en) anti-TROP 2 nano antibody and preparation method and application thereof
CN109937212B (en) B7-H3 antibody, antigen binding fragment thereof and medical application thereof
CN112601762A (en) anti-CD 47 antibodies and uses thereof
TWI701259B (en) 4-1BB antibody and its preparation method and application
RU2603269C1 (en) Recombinant single-domain antibodies specifically binding human interleukin-6, method for their preparing and using for detection of this protein
CN111533805B (en) High-affinity nano antibody for resisting carcinoembryonic antigen and application thereof
MX2010011184A (en) Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly.
WO2022127844A1 (en) Cd5 antibody and use thereof
CN110372793B (en) Nano antibody of PD-L1 and clinical application thereof
US20240124563A1 (en) Anti-Human MSLN Antibody And Application Thereof
US20200369774A1 (en) Il-6r antibody and antigen binding fragment thereof and medical use
CN110903393B (en) Polypeptide capable of binding IL6R alpha and application thereof
US20240052055A1 (en) Gpc3 antibody and application thereof
WO2022037528A1 (en) Single variable domain and antigen binding molecule binding bcma
RU2530553C2 (en) Recombinant single-domain antibody able to bind human tumour necrosis factor specifically and its derivatives
Sotoudeh et al. Developing and characterizing a single-domain antibody (nanobody) against human cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (hCTLA-4)
CN116023495B (en) anti-CD40 nano antibody and preparation method and application thereof
Ghaderi et al. Recombinant antibody fragment therapeutics: Current status and future prospects of scFv, nanobody, and mimotopes
WO2022037527A1 (en) Bcma-binding single variable structural domain and antigen-binding molecule
RU2599423C1 (en) Recombinant single-domain antibodies specifically binding f4/80 protein, method for production thereof and use for detection of said protein
TW202330626A (en) Bispecific antibody and uses thereof
CN112851815A (en) anti-BCMA antibody or antigen binding fragment thereof, and preparation method and application thereof
CN115536746A (en) anti-CRTAM antibodies and uses thereof
TW202340240A (en) Multi-specific antibody and its pharmaceutical uses
RU2484096C1 (en) SINGLE-DOMAIN ANTIBODY aMts1 SPECIFICALLY BINDING PROTEIN S100A4/Mts1, METHOD FOR PREPARING AND USING FOR DETECTION OF THIS PROTEIN