RU2599545C1

RU2599545C1 - Method of tumour growth inhibition based on in vitro reprogramming macrophages on m1 phenotype with high ability of nitric oxide production in experiment

Info

Publication number: RU2599545C1
Application number: RU2015147552/10A
Authority: RU
Inventors: Игорь Юрьевич Малышев; Светлана Владимировна Лямина; Сергей Валерьевич Калиш
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2016-10-10

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely to immunology, cell biotechnologies, and can be used for recovery of anti-tumour immunity and tumour growth inhibition with further application in the clinical practice. Disclosed is a method of tumour growth inhibition based on in vitro reprogramming macrophages on M1 phenotype with high ability of nitric oxide production in experiment, when cultivating macrophages in the serum-free medium, wherein the IFN-γ 20 ng/ml is being added to the serum-free medium.

EFFECT: technical result is producing the M1 macrophage phenotype with effective anti-tumour mechanisms, characterized by high NO production, that provides higher stability of formed phenotype to reprogramming tumour effect.

1 cl, 3 dwg, 3 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, клеточным биотехнологиям, и может быть использовано для восстановления противоопухолевого иммунитета и подавления роста опухоли с последующим применением в клинической практике.The invention relates to medicine, namely to immunology, cellular biotechnology, and can be used to restore antitumor immunity and suppress tumor growth with subsequent use in clinical practice.

Известно, что одна из важнейших функций иммунной системы заключается в удалении опухолевых клеток. Несмотря на то что каждый тип опухолей имеет свои существенные особенности развития, в патогенезе многих, особенно злокачественных, видов опухолей, несомненно, отмечены и общие механизмы, прежде всего, - это подавление антиопухолевой активности иммунной системы, т.е. проопухолевая трансформация иммунного ответа. Несмотря на тот факт, что первая линия противоопухолевой защиты реализуется при непосредственном участии клеток системы врожденного иммунитета - макрофагов и данные клетки призваны уничтожать опухоль, в результате проопухолевой трансформации иммунного ответа клетки иммунной системы и в том числе макрофаги теряют способность уничтожать опухолевые клетки, и даже начинают способствовать росту и метастазированию опухоли [Condeelis, J., Pollard, J.W. Macrophages: obligate partners for tumor cellmigration, invasion, and metastasis Cell 2006; 124:263-266; Lewis, С.E., Pollard, J.W. Distinct role of macrophages in different tumormicr oenvironments Cancer Res. 2006; 66: 605-12; Sica, Α., Schioppa, T., Mantovani, Α., Allavena, P. Tumor-associated macrophages are adistinct M2 polarized population promoting tumor progr ession: potential targets of anti-cancer therapy Eur. J. Cancer.2006; 42:717-27]. Макрофаги в зоне опухоли (опухоле-ассоциированные макрофаги, tumor associated macrophages, ТАМ) под действием опухолевого микроокружения приобретают, преимущественно проопухолевый, проангиогенный фенотип и состоят, предпочтительно, из популяции поляризованных макрофагов М2 (CD206+, F4/80+) с низкой цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам из-за ограниченного продуцирования ими провоспалительных цитокинов, оксида азота [Mills et al. 2000 J. Immunol. 164:6166-6173], характеризуются низкой антиген-презентирующей способностью и эффективно подавляют активацию Т-клеток. Фактически, эти макрофаги фенотипа М2 действительно способствуют пролиферации опухолевых клеток и метастазированию, секретируя широкий спектр факторов роста и проангиогенных факторов, а также металлопротеиназ, с вовлечением в сигнальную циркуляцию, что регулирует функцию фибробластов опухолевой стромы [Mantovani et al. 2004, Novartis. Found. Symp.256:137-145].It is known that one of the most important functions of the immune system is to remove tumor cells. Despite the fact that each type of tumor has its own essential developmental features, the pathogenesis of many, especially malignant, types of tumors has undoubtedly noted common mechanisms, first of all, it is suppression of the antitumor activity of the immune system, i.e. pro-tumor transformation of the immune response. Despite the fact that the first line of antitumor protection is realized with the direct participation of cells of the innate immunity system - macrophages and these cells are designed to destroy the tumor, as a result of pro-tumor transformation of the immune response, cells of the immune system, including macrophages, lose the ability to destroy tumor cells, and even begin to promote tumor growth and metastasis [Condeelis, J., Pollard, JW Macrophages: obligate partners for tumor cellmigration, invasion, and metastasis Cell 2006; 124: 263-266; Lewis, C.E., Pollard, J.W. Distinct role of macrophages in different tumormicr oenvironments Cancer Res. 2006; 66: 605-12; Sica, Α., Schioppa, T., Mantovani, Α., Allavena, P. Tumor-associated macrophages are adistinct M2 polarized population promoting tumor progression: potential targets of anti-cancer therapy Eur. J. Cancer. 2006; 42: 717-27]. The macrophages in the tumor area (tumor-associated macrophages, tumor associated macrophages, TAM), under the influence of the tumor microenvironment, acquire a predominantly pro-tumor, pro-angiogenic phenotype and preferably consist of a population of polarized M2 macrophages (CD206 +, F4 / 80 +) with low cytotoxicity in relation to tumor cells due to their limited production of pro-inflammatory cytokines, nitric oxide [Mills et al. 2000 J. Immunol. 164: 6166-6173], are characterized by low antigen-presenting ability and effectively suppress T-cell activation. In fact, these macrophages of the M2 phenotype really promote tumor cell proliferation and metastasis, secreting a wide range of growth factors and pro-angiogenic factors, as well as metalloproteinases, with involvement in signaling circulation, which regulates the function of tumor stroma fibroblasts [Mantovani et al. 2004, Novartis. Found. Symp. 256: 137-145].

Рассматривая ТАМ в качестве терапевтической «мишени» в разработке новой противоопухолевой стратегии и создании новой клеточной биотехнологии, целесообразно обеспечить возможность эффективного репрограммирования ТАМ в сторону антиопухолевого M1 фенотипа, способного к ограничению роста опухолевых клеток не только за счет таких механизмов, как увеличение продукции провоспалительных цитокинов [Lum HD, Buhtoiarov IN, Schmidt BE, Berke G, Paulnock DM, Sondel PM, Rakhmilevich AL. Tumoristatic effects of anti-CD40 mAb-activated macrophages involve nitric oxide and tumour necrosis factor-α. Immunology, 2006;118(2):261-70], свободных радикалов [Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010;140(6):883-99] или презентации опухолевых антигенов и формирования Th1 и цитотоксических лимфоцитов [Backer R, Schwandt Τ, Greuter M, Oosting M, Jngerkes F, Tting Τ et al. Effective collaboration between marginal metallophilic macrophages and CD8+ dendritic cells in the generation of cytotoxic Τ cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2010; 107(1):216-21; Barrio MM, Abes R, Colombo M, Pizzurro G, Boix C, Roberti MP et al. Human macrophages and dendritic cells can equally present MART-1 antigen to CD8(+) Τ cells after phagocytosis of gamma-irradiated melanoma cells. PLoS One, 2012; 7(7):e40311], но и повышенной продукции оксида азота (nitric oxide, NO) [Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010; 140(6):883-99; Lum HD, Buhtoiarov IN, Schmidt BE, Berke G, Paulnock DM, Sondel PM, Rakhmilevich AL. Tumoristatic effects of anti-CD40 mAb-activated macrophages involve nitric oxide and tumour necrosis factor-α. Immunology, 2006; 118(2):261-70].Considering TAM as a therapeutic “target” in the development of a new antitumor strategy and the creation of new cell biotechnology, it is advisable to ensure the possibility of effective reprogramming of TAM towards the anti-tumor M1 phenotype, capable of limiting the growth of tumor cells not only due to mechanisms such as increased production of pro-inflammatory cytokines [ Lum HD, Buhtoiarov IN, Schmidt BE, Berke G, Paulnock DM, Sondel PM, Rakhmilevich AL. Tumoristatic effects of anti-CD40 mAb-activated macrophages involve nitric oxide and tumor necrosis factor-α. Immunology, 2006; 118 (2): 261-70], free radicals [Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010; 140 (6): 883-99] or the presentation of tumor antigens and the formation of Th1 and cytotoxic lymphocytes [Backer R, Schwandt Τ, Greuter M, Oosting M, Jngerkes F, Tting Τ et al. Effective collaboration between marginal metallophilic macrophages and CD8 + dendritic cells in the generation of cytotoxic Τ cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2010; 107 (1): 216-21; Barrio MM, Abes R, Colombo M, Pizzurro G, Boix C, Roberti MP et al. Human macrophages and dendritic cells can equally present MART-1 antigen to CD8 (+) Τ cells after phagocytosis of gamma-irradiated melanoma cells. PLoS One, 2012; 7 (7): e40311], but also increased production of nitric oxide (nitric oxide, NO) [Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010; 140 (6): 883-99; Lum HD, Buhtoiarov IN, Schmidt BE, Berke G, Paulnock DM, Sondel PM, Rakhmilevich AL. Tumoristatic effects of anti-CD40 mAb-activated macrophages involve nitric oxide and tumor necrosis factor-α. Immunology, 2006; 118 (2): 261-70].

Известны подходы и способы подавления роста опухоли, основанные на перепрограммировании М2 фенотипа на антиопухолевый M1 фенотип, которые заключаются в проведении селективной стимуляции Toll-like рецепторов и ингибировании рецепторов трансформирующего фактора роста (TGF)-бета (β) [Peng J, Tsang JY, Li D et. al. Inhibition of TGF-β signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett. 2013 Mayl; 331(2):239-49], что обеспечивает репрограммирование ТАМ в сторону M1 фенотипа, снижение продукции ангиогенных факторов, увеличение апоптоза опухолевых клеток и увеличение лимфоцитов и нейтрофилов в опухоли. Существенным недостатком данного подхода является то, что перепрограммирование макрофагов на провоспалительный M1 фенотип или стимулирование их провоспалительных функций может замедлить рост опухоли, однако провоспалительные цитокины могут также активировать Τ регуляторные (Treg) клетки и миелоидные Τ супрессорные лимфоциты (MDSC). Эти клетки могут подавить антиопухолевую активность M1 макрофагов, Тh1 и Τ клеток. Кроме того, показано, что взаимодействие Toll-likе рецепторов со своими лигандами может также оказывать влияние на апоптоз, индуцированный химиопрепаратом, и формирование резистентности как к киллерному действию эффекторных клеток, так и непосредственно химиопрепаратам [Szajnik M, Szczepanski MJ, Whiteside TL, et al. TLR4 signaling induced by lipopolysaccharide or paclitaxel regulates tumor survival and chemoresistance in ovarian cancer. Oncogene 2009; 28 (49): 4353-63; H.M. Бережная. Toll-like рецепторы и онкогенез. Онкология, Т.15, №2, 2013, С. 76-87]. Таким образом, антиопухолевый эффект M1 макрофагов через активацию Treg клетки и MDSC, напротив, может трансформироваться в проопухолевый эффект.Known approaches and methods for suppressing tumor growth based on reprogramming the M2 phenotype to the anti-tumor M1 phenotype, which include selective stimulation of Toll-like receptors and inhibition of transforming growth factor (TGF) -beta (β) receptors [Peng J, Tsang JY, Li D et. al. Inhibition of TGF-β signaling in combination with TLR7 ligation re-programs a tumoricidal phenotype in tumor-associated macrophages. Cancer Lett. 2013 Mayl; 331 (2): 239-49], which provides reprogramming of TAM towards the M1 phenotype, a decrease in the production of angiogenic factors, an increase in apoptosis of tumor cells and an increase in lymphocytes and neutrophils in the tumor. A significant drawback of this approach is that reprogramming macrophages to a pro-inflammatory M1 phenotype or stimulating their pro-inflammatory functions can slow down tumor growth, however, pro-inflammatory cytokines can also activate Τ regulatory (Treg) cells and myeloid Τ suppressor lymphocytes (MDSC). These cells can suppress the antitumor activity of M1 macrophages, Th1 and Τ cells. In addition, it was shown that the interaction of Toll-like receptors with their ligands can also affect the chemopreparation induced apoptosis and the formation of resistance both to the killer action of effector cells and directly to chemotherapy [Szajnik M, Szczepanski MJ, Whiteside TL, et al . TLR4 signaling induced by lipopolysaccharide or paclitaxel regulates tumor survival and chemoresistance in ovarian cancer. Oncogene 2009; 28 (49): 4353-63; H.M. Berezhnaya. Toll-like receptors and oncogenesis. Oncology, T.15, No. 2, 2013, S. 76-87]. Thus, the antitumor effect of M1 macrophages through the activation of Treg cells and MDSC, in contrast, can be transformed into a pro-tumor effect.

Предложен способ репрограммирования макрофагов в сторону антиопухолевого M1 фенотипа и усиления продукции провоспалительных цитокинов и усиления антиопухолевой активности макрофагов соответственно при культивировании моноцитов/макрофагов в среде без сыворотки [Rey-Giraud F, Hafner M, Ries CH. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 2012; 7(8):e42656].A method is proposed for reprogramming macrophages towards the anti-tumor M1 phenotype and enhancing the production of pro-inflammatory cytokines and enhancing the anti-tumor activity of macrophages, respectively, when monocytes / macrophages are cultured in serum-free medium [Rey-Giraud F, Hafner M, Ries CH. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos one. 2012; 7 (8): e42656].

Предлагаемые способы первоначально действительно могут замедлить рост опухоли за счет доказанного усиления продукции провоспалительных цитокинов. Однако эти же цитокины могут активировать Τ регуляторные (Treg) клетки и Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC) [Ostrand-Rosenberg S, Sinha P. Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer. J Immunol 2009; 182(8):4499-506]. Дальше активированные Treg клетки и MDSC могут подавить антиопухолевую активность не только M1 макрофагов, но и антигенпрезентирующих клеток, Th1 и Τ клеток [Ostrand-Rosenberg S, Sinha P. Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer. J Immunol 2009; 182(8):4499-506; Tiemessen et al. 2007; Pittet M., Mempel T. Regulation of T-cell migration and effector functions: insights from in vivo imaging studies. Immunol Rev 2008; 221:107-129]. Таким образом, достигаемый через активацию Treg клеток и MDSC антиопухолевый эффект M1 макрофагов может трансформироваться в проопухолевые последствия. В связи с этим, несомненно, обосновано формирование фенотипа макрофагов, достаточно провоспалительного, чтобы ограничивать рост опухоли, но при этом не вызывать избыточного воспаления, которое могло бы активировать Treg клетки и MDSC.The proposed methods initially can actually slow down tumor growth due to a proven increase in the production of pro-inflammatory cytokines. However, these same cytokines can activate Τ regulatory (Treg) cells and Myeloid-Derived Suppressor Cells (MDSC) [Ostrand-Rosenberg S, Sinha P. Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer. J Immunol 2009; 182 (8): 4499-506]. Further activated Treg cells and MDSC can suppress the antitumor activity of not only M1 macrophages, but also antigen-presenting cells, Th1 and Τ cells [Ostrand-Rosenberg S, Sinha P. Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer. J Immunol 2009; 182 (8): 4499-506; Tiemessen et al. 2007; Pittet M., Mempel T. Regulation of T-cell migration and effector functions: insights from in vivo imaging studies. Immunol Rev 2008; 221: 107-129]. Thus, the antitumor effect of M1 macrophages achieved through the activation of Treg cells and MDSC can be transformed into pro-tumor effects. In this regard, the formation of a macrophage phenotype that is proinflammatory enough to limit tumor growth, but not cause excessive inflammation that could activate Treg cells and MDSC, is undoubtedly justified.

Известны подходы к подавлению роста опухоли, основанные на блокировании рецепторов, через которые опухоль перепрограммирует макрофаги на М2 фенотип.Known approaches to suppressing tumor growth based on blocking receptors through which the tumor reprograms macrophages to the M2 phenotype.

Предлагается блокирование рецепторов для TGF-β, IL-10, IL-4, IL-13 и др., выделяемых опухолью [Sica A, Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest 2012; 122(3):787-95], что предупреждает трансформацию M1 макрофагов в проопухолевый М2 фенотип и сохранение антиопухолевой активности макрофагов. Недостатком данного подхода является то, что заблокировать все рецепторы одномоментно к указанным продуктам очень сложно. Формирующаяся в области опухоли гипоксия также способствует перепрограммированию макрофага. В этот процесс вовлечен HIF-1. Однако блокирование HIF-1 в макрофагах может привести к их гибели.It is proposed to block receptors for TGF-β, IL-10, IL-4, IL-13, etc., secreted by the tumor [Sica A, Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J Clin Invest 2012; 122 (3): 787-95], which prevents the transformation of M1 macrophages into a pro-tumor M2 phenotype and the preservation of antitumor activity of macrophages. The disadvantage of this approach is that it is very difficult to block all receptors simultaneously to these products. Hypoxia that forms in the tumor area also contributes to macrophage reprogramming. HIF-1 is involved in this process. However, blocking HIF-1 in macrophages can lead to their death.

Известен способ подавления роста опухоли, основанный на селективном усилении антиопухолевых свойств макрофагов в зоне опухоли (опухоле-ассоциированные макрофаги, Tumor-Associated Macrophages, ТАМ): а именно предлагается воздействовать на IFN-γ ген, IL-12 гены [Burke е.а. 2002, Andrews К et. al. Adenovirus-interleukin-12-mediated tumor regression in a murine hepatocellular carcinoma model is not dependent on CD1-restricted natural killer Τ cells. Cancer Res. 2000 Nov 15; 60(22):6457-64; Nasu Y et al. Adenovirus-mediated interleukin-12 gene therapy for prostate cancer: suppression of orthotopic tumor growth and pre-established lung metastases in an orthotopic model. Gene Ther. 1999 Mar; 6(3):338-49; Satoh T, Saika T, Ebara S, Kusaka N, Timme TL, Yang G, Wang J, Mouraviev V, Cao G, Fattah el MA, Thompson TC. Macrophages transduced with an adenoviral vector expressing interleukin 12 suppress tumor growth and metastasis in a preclinical metastatic prostate cancer model. Cancer Res 2003; 63(22):7853-60], что обеспечивает использование ТАМ для доставки гена и ингибирования роста опухоли.A known method of suppressing tumor growth, based on the selective enhancement of the antitumor properties of macrophages in the tumor area (tumor-associated macrophages, Tumor-Associated Macrophages, TAM): namely, it is proposed to influence the IFN-γ gene, IL-12 genes [Burke EA 2002, Andrews K et. al. Adenovirus-interleukin-12-mediated tumor regression in a murine hepatocellular carcinoma model is not dependent on CD1-restricted natural killer Τ cells. Cancer Res. 2000 Nov 15; 60 (22): 6457-64; Nasu Y et al. Adenovirus-mediated interleukin-12 gene therapy for prostate cancer: suppression of orthotopic tumor growth and pre-established lung metastases in an orthotopic model. Gene Ther. 1999 Mar; 6 (3): 338-49; Satoh T, Saika T, Ebara S, Kusaka N, Timme TL, Yang G, Wang J, Mouraviev V, Cao G, Fattah el MA, Thompson TC. Macrophages transduced with an adenoviral vector expressing interleukin 12 suppress tumor growth and metastasis in a preclinical metastatic prostate cancer model. Cancer Res 2003; 63 (22): 7853-60], which allows the use of TAM for gene delivery and inhibition of tumor growth.

Перепрограммирование макрофагов на провоспалительный M1 фенотип или стимулирование их провоспалительных функций может замедлить рост опухоли, однако провоспалительные цитокины могут также активировать Treg клетки и MDSC. Эти клетки могут подавить антиопухолевую активность M1 макрофагов, Тh1 и Τ клеток. Таким образом антиопухолевый эффект M1 макрофагов через активацию Treg клетки и MDSC может трансформироваться в проопухолевый эффект.Reprogramming macrophages to a pro-inflammatory M1 phenotype or stimulating their pro-inflammatory functions can slow tumor growth, however, pro-inflammatory cytokines can also activate Treg cells and MDSC. These cells can suppress the antitumor activity of M1 macrophages, Th1 and Τ cells. Thus, the anti-tumor effect of M1 macrophages through the activation of Treg cells and MDSC can be transformed into a pro-tumor effect.

Известны способы подавления роста опухоли, основанные на селективном угнетении проопухолевых свойств ТАМ:Known methods of suppressing tumor growth based on selective inhibition of the pro-tumor properties of TAM:

1. Предлагается использование CSF-1 антисенс олигонуклеотидов [Aharinejad S, et al. Colony-stimulating factor-1 antisense treatment suppresses growth of human tumor xenografts in mice. Cancer Res 2002; 62: 5317-5324], что способствует замедлению деградации матрикса и подавлению роста опухоли и метастазирования.1. The use of CSF-1 antisense oligonucleotides is proposed [Aharinejad S, et al. Colony-stimulating factor-1 antisense treatment suppresses growth of human tumor xenografts in mice. Cancer Res 2002; 62: 5317-5324], which helps to slow down matrix degradation and suppress tumor growth and metastasis.

2. Предлагается использование малой молекулы Bindarit [Gazzaniga S, Bravo AI, Guglielmotti A et al. Targeting tumor-associated macrophages and inhibition of CCL2 reduce angiogenesis and tumor growth in a human melanoma xenograft. J Invest Dermatol 2007; 127: 2031-2041], которая модулирует активность NFκB, что способствует ингибированию продукции CCL2, M-CSF и снижению плотности микрососудов в опухоли.2. The use of the small Bindarit molecule [Gazzaniga S, Bravo AI, Guglielmotti A et al. Targeting tumor-associated macrophages and inhibition of CCL2 reduce angiogenesis and tumor growth in a human melanoma xenograft. J Invest Dermatol 2007; 127: 2031-2041], which modulates the activity of NFκB, which contributes to the inhibition of the production of CCL2, M-CSF and a decrease in the density of microvessels in the tumor.

3. Известно применение HRG [Rolny С, Mazzone M, Tugues S. et al. HRG inhibits tumor growth and metastasis by inducing macrophage polarization and vessel normalization through downregulation of P1GF. Cancer Cell 2011; 19: 31-44], что обеспечивает снижение продукции PDGF и усиление антиопухолевого иммунитета.3. The use of HRG is known [Rolny C, Mazzone M, Tugues S. et al. HRG inhibits tumor growth and metastasis by inducing macrophage polarization and vessel normalization through downregulation of P1GF. Cancer Cell 2011; 19: 31-44], which reduces the production of PDGF and enhances anti-tumor immunity.

4. Известно использование Silibinin [

Ribes M, Allen Ε, Hudock J, Takeda Τ, Okuyama Η,

F, et al. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell 2009; 15: 220-231], что способствует подавлению фосфорилирования NF-κΒ и STAT3 и ингибированию ангиогенеза.4. The use of Silibinin [

Ribes M, Allen Ε, Hudock J, Takeda Τ, Okuyama Η,

F, et al. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell 2009; 15: 220-231], which contributes to the suppression of phosphorylation of NF-κΒ and STAT3 and the inhibition of angiogenesis.

5. Предложено применение LCL-PLP [Banciu M е.а. Antiangiogenic effects of liposomal prednisolone phosphate on B16 melanoma in mice. J Control Release 2006; 113: 1-8], что обеспечивает снижение продукции проангиогенных факторов и ингибирование ангиогенеза в зоне опухоли. Общим недостатком данного подхода является то, что цитокины М2 фенотипа макрофагов, которые способствуют росту опухоли, также участвуют в репарации тканей и формировании гуморального ответа. Поэтому угнетение продукции этих цитокинов может привести к снижению активности систем репарации ткани и снижению активности гуморального ответа.5. The use of LCL-PLP [Banciu M e.a. Antiangiogenic effects of liposomal prednisolone phosphate on B16 melanoma in mice. J Control Release 2006; 113: 1-8], which ensures a decrease in the production of pro-angiogenic factors and inhibition of angiogenesis in the tumor zone. A common drawback of this approach is that macrophage phenotype M2 cytokines that contribute to tumor growth also participate in tissue repair and the formation of a humoral response. Therefore, the inhibition of the production of these cytokines can lead to a decrease in the activity of tissue repair systems and a decrease in the activity of the humoral response.

Известен способ подавления роста опухоли, основанный на блокировании секреторных проопухолевых продуктов опухолеассоциированных макрофагов с помощью антител [Ваау M, Brouwer A, Pauwels Ρ, Peeters M, Lardon F. Tumor cells and tumor-associated macrophages: secreted proteins as potential targets for therapy. Clin Dev Immunol. 2011; 2011:565187], что обеспечивает снижение концентрации проопухолевых медиаторов в микроокружении растущей опухоли и ограничивает подавление иммунитета, ангиогенеза, деградации матрикса и метастазирования.A known method of suppressing tumor growth, based on blocking the secretory pro-tumor products of tumor-associated macrophages using antibodies [Wow M, Brouwer A, Pauwels Ρ, Peeters M, Lardon F. Tumor cells and tumor-associated macrophages: secreted proteins as potential targets for therapy. Clin Dev Immunol. 2011; 2011: 565187], which reduces the concentration of pro-tumor mediators in the microenvironment of a growing tumor and limits the suppression of immunity, angiogenesis, matrix degradation and metastasis.

Наиболее близким к заявляемому является способ, основанный на использовании подхода перепрограммирования макрофагов на M1 фенотип при культивировании макрофагов в бессывороточной среде [Rey-Giraud F, Hafner M, Ries CH. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 2012; 7(8):e42656]. Недостатком данного подхода является его применение для культивирования макрофагов, полученных из моноцитов, а также использование только одного фактора влияния на изменение фенотипа макрофагов - снижения концентрации сыворотки в культуральной среде, что приводит только к удалению TGF-β из микроокружения макрофагов (вместе с сывороткой) [см. FloraRey-Giraud Mathias Hafner, Carola H. Ries. In Vitro Generation of Monocyte-Derived Macrophages under Serum-Free Conditions Improves Their Tumor Promoting Functions. PLoS ONE | www.plosone.org, August 2012, Volume 7, Issue 8, e42656; Mills CD., Kincaid K., Jennifer M., et al. M-1/M-2 and the Th1/Th2 Paradigm. The Journal of Immunology, 2000, Vol.164 - pp. 6166-6173], но не приведет к должному вовлечению в процессе формирования M1 фенотипа дополнительных сигнальных путей, таких как, например, SMAD7, препятствующий фосфорилированию SMAD2/3 и приводящий на этапе репрограммирования на M1 фенотип к дополнительному ингибированию TGF-β/SMAD-(M2-) зависимого сигнального пути.Closest to the claimed is a method based on the approach of reprogramming macrophages to the M1 phenotype in the cultivation of macrophages in serum-free medium [Rey-Giraud F, Hafner M, Ries CH. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. Plos one. 2012; 7 (8): e42656]. The disadvantage of this approach is its use for the cultivation of macrophages derived from monocytes, as well as the use of only one factor influencing the change in the phenotype of macrophages - reducing the concentration of serum in the culture medium, which only leads to the removal of TGF-β from the microenvironment of macrophages (together with serum) [ cm. FloraRey-Giraud Mathias Hafner, Carola H. Ries. In Vitro Generation of Monocyte-Derived Macrophages under Serum-Free Conditions Improves Their Tumor Promoting Functions. PLoS ONE | www.plosone.org, August 2012, Volume 7, Issue 8, e42656; Mills CD., Kincaid K., Jennifer M., et al. M-1 / M-2 and the Th1 / Th2 Paradigm. The Journal of Immunology, 2000, Vol. 164 - pp. 6166-6173], but will not lead to the proper involvement of additional signaling pathways in the process of M1 phenotype formation, such as, for example, SMAD7, which prevents SMAD2 / 3 phosphorylation and leads to additional inhibition of TGF-β / SMAD- at the reprogramming stage on M1 ( M2-) dependent signaling path.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описаны способ или клеточная биотехнология репрограммирования фенотипа макрофага на M1 фенотип, характеризующегося повышенной способностью к продукции NO, в отличие от прототипа с использованием комбинации факторов репрограммирования макрофагов, позволяющей достичь наиболее оптимального результата.The sources of patent and scientific and technical information known to the authors do not describe a method or cell biotechnology for reprogramming the macrophage phenotype onto the M1 phenotype, which is characterized by increased ability to produce NO, in contrast to the prototype using a combination of macrophage reprogramming factors, which allows to achieve the most optimal result.

Задачей изобретения является повышение эффективности способа подавления роста опухоли.The objective of the invention is to increase the efficiency of the method of suppressing tumor growth.

Технический результат заключается в получении M1 фенотипа макрофага с эффективными антиопухолевыми механизмами, характеризующегося высокой продукцией NO, что позволит обеспечить более высокую устойчивость формирующегося фенотипа к репрограммирующему действию самой опухоли.The technical result consists in obtaining the M1 macrophage phenotype with effective antitumor mechanisms, characterized by high NO production, which will provide higher resistance of the emerging phenotype to the reprogramming effect of the tumor itself.

Это достигается за счет того, что к бессывороточной среде добавляют IFN-γ 20 нг/мл.This is achieved by adding IFN-γ of 20 ng / ml to serum-free medium.

Известно, что в зоне опухоли основная продукция NO осуществляется макрофагами, что существенным образом способствует опухолевой регрессии [Shang ZJ, Li JR, Li ZB: Effects of exogenous nitric oxide on oral squamous cell carcinoma: an in vitro study. J Oral Maxillofac Surg 2002, 60(8):905-910; Li LM, Kibourn RG, Adams J, Filder IJ: Role of NO in lysis of tumor cells by cytokine activated endothelial cells. Cancer Res 1991, 51:2531-2535; Shang ZJ, Li JR: Expression of endothelial nitric oxide synthase and vascular endothelial growth factor in oral squamous cell carcinoma: its correlation with angiogenesis and disease progression. J Oral Pathol Med 2005, 4:134-139], поскольку доказано, что продуцируемый макрофагами NO активно участвует в уничтожении клеток опухолей различного типа [Li LM, Kibourn RG, Adams J, Filder IJ: Role of NO in lysis of tumor cells by cytokine activated endothelial cells. Cancer Res 1991, 51:2531-2535; Lechner M, Lirk P, Rieder J: Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: the two sides of the same coin. Semin Cancer Biol 2005, 15:277-289]. Так, с одной стороны, показано, что NO может индуцировать апоптоз опухолевых клеток благодаря подавлению синтеза антиапоптотического Всl-2 и увеличению экспрессии проапоптотического Вах и р53 [см. Zeini M,

PG,

R, Pantoja C, Matheu A, Serrano M,

L, Hortelano S. Specific contribution of p19(ARF) to nitric oxide-dependent apoptosis. J Immunol. 2006; 177(5):3327-36], и таким образом, обладать антиопухолевым действием действием [Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010; 140(6):883-99; Lum HD, Buhtoiarov IN, Schmidt BE, Berke G, Paulnock DM, Sondel PM, Rakhmilevich AL. Tumoristatic effects of anti-CD40 mAb-activated macrophages involve nitric oxide and tumour necrosis factor-α. Immunology, 2006; 118(2):261-270]. Однако, с другой стороны, NO благодаря, например, нитрозилированию каспаз [Maejima Y, Adachi S, Morikawa К, Ito H, Isobe M. Nitric oxide inhibits myocardial apoptosis by preventing caspase-3 activity via S-nitrosylation. J Mol Cell Cardiol. 2005 Jan; 38(1):163-74;

NJ, Higuchi H, Bronk S, Gores GJ. Nitric oxide inhibits apoptosis downstream of cytochrome С release by nitrosylating caspase 9. Cancer Res. 2002; 62(6): 1648-53] и/или активации синтеза HSP70 [Malyshev IYu, Malugin AV, Golubeva LYu, Zenina TA, Manukhina EB, Mikoyan VD, Vanin AF. Nitric oxide donor induces HSP70 accumulation in the heart and in cultured cells. FEBS Lett. 1996; 391(1-2):21 3] может ограничивать развитие апоптоза в опухолевых клетках [Murphy ME. The HSP70 family and cancer. Carcinogenesis. 2013; 34(6): 1181-8] и, соответственно, обладать проопухолевым действием. Также высокий уровень NO подавляет метастазирование [Aranda Ε,

С, De La

JR,

A: Nitric oxide and cancer: the emerging role of S nitrosylation. Curr Mol Med 2012, 12:50-67]. Локальная концентрация NO и свободных радикалов в зоне опухоли определяет, каким образом NO и его метаболиты будут взаимодействовать с ДНК, с системами репарации ДНК, опухолевым супрессором р53, другими активаторами и ингибиторами апоптоза опухолевых клеток. Эти взаимодействия, в свою очередь, будут формировать про- или антиопухолевые эффекты NO [Engin АВ. Dual function of nitric oxide in carcinogenesis, reappraisal. Curr Drug Metab. 2011 Nov; 12(9):891-9]. Изменение фенотипа опухолеассоциированных макрофагов в сторону M1, несомненно, будет способствовать ограничению роста опухолевых клеток не только за счет продукции NO, но также и за счет других механизмов, таких как увеличение продукции провоспалительных цитокинов Lum HD, Buhtoiarov IN, Schmidt BE, Berke G, Paulnock DM, Sondel PM, Rakhmilevich AL. Tumoristatic effects of anti-CD40 mAb-activated macrophages involve nitric oxide and tumour necrosis factor-α. Immunology, 2006; 118(2):261-70; Tsung, K., Dolan, J.P., Tsung, Y.L., Norton, J.A. Macrophages as effector cells in interleukin 12-induced Τ cell-dependent tumor rejection. Cancer Res.2002; 62:5069-75], увеличение продукции свободных радикалов [Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010; 140(6):883-99], активация природных киллеров, которые могут эффективно уничтожать опухолевые клетки [Smyth, M.J., Thia, К.Y., Street, S.E., MacGregor, D., Godfrey, D.I., Trapani, J.A. Perforin-mediated cytotoxicity is critical for surveillance of spontaneous lymphoma J. Exp. Med. 2000; 192:755-60; Street, S.E., Cretney, E., Smyth, M.J. Perforin and interferon- activities independently control tumor initiation, growth, and metastasis. Blood. 2001; 97:192-97]; презентация опухолевых антигенов и формирование Тh1 и цитотоксических лимфоцитов [Backer R, Schwandt Τ, Greuter M, Oosting M, Jngerkes F, Tting Τ et al. Effective collaboration between marginal metallophilic macrophages and CD8+ dendritic cells in the generation of cytotoxic Τ cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2010; 107(1):216-21; Barrio MM, Abes R, Colombo M, Pizzurro G, Boix C, Roberti MP et al. Human macrophages and dendritic cells can equally present MART-1 antigen to CD8(+) Τ cells after phagocytosis of gamma-irradiated melanoma cells. PLoS One, 2012; 7(7):e40311], которые инфильтрируют опухоль и убивают опухолевые клетки [Dunn, G.P., Old, L.J., Schreiber, R.D. The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting Immunity. 2004; 21:137-148].It is known that in the tumor zone, the main production of NO is carried out by macrophages, which significantly contributes to tumor regression [Shang ZJ, Li JR, Li ZB: Effects of exogenous nitric oxide on oral squamous cell carcinoma: an in vitro study. J Oral Maxillofac Surg 2002, 60 (8): 905-910; Li LM, Kibourn RG, Adams J, Filder IJ: Role of NO in lysis of tumor cells by cytokine activated endothelial cells. Cancer Res 1991, 51: 2531-2535; Shang ZJ, Li JR: Expression of endothelial nitric oxide synthase and vascular endothelial growth factor in oral squamous cell carcinoma: its correlation with angiogenesis and disease progression. J Oral Pathol Med 2005, 4: 134-139], since it has been shown that macrophage-produced NO is actively involved in the destruction of various types of tumor cells [Li LM, Kibourn RG, Adams J, Filder IJ: Role of NO in lysis of tumor cells by cytokine activated endothelial cells. Cancer Res 1991, 51: 2531-2535; Lechner M, Lirk P, Rieder J: Inducible nitric oxide synthase (iNOS) in tumor biology: the two sides of the same coin. Semin Cancer Biol 2005, 15: 277-289]. So, on the one hand, it was shown that NO can induce apoptosis of tumor cells due to suppression of the synthesis of anti-apoptotic Bcl-2 and increased expression of proapoptotic Bax and p53 [see Zeini M,

PG

R, Pantoja C, Matheu A, Serrano M,

L, Hortelano S. Specific contribution of p19 (ARF) to nitric oxide-dependent apoptosis. J Immunol. 2006; 177 (5): 3327-36], and thus have an antitumor effect [Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010; 140 (6): 883-99; Lum HD, Buhtoiarov IN, Schmidt BE, Berke G, Paulnock DM, Sondel PM, Rakhmilevich AL. Tumoristatic effects of anti-CD40 mAb-activated macrophages involve nitric oxide and tumor necrosis factor-α. Immunology, 2006; 118 (2): 261-270]. However, on the other hand, NO is due, for example, to the nitrosylation of caspases [Maejima Y, Adachi S, Morikawa K, Ito H, Isobe M. Nitric oxide inhibits myocardial apoptosis by preventing caspase-3 activity via S-nitrosylation. J Mol Cell Cardiol. 2005 Jan; 38 (1): 163-74;

NJ, Higuchi H, Bronk S, Gores GJ. Nitric oxide inhibits apoptosis downstream of cytochrome C release by nitrosylating caspase 9. Cancer Res. 2002; 62 (6): 1648-53] and / or activation of HSP70 synthesis [Malyshev IYu, Malugin AV, Golubeva LYu, Zenina TA, Manukhina EB, Mikoyan VD, Vanin AF. Nitric oxide donor induces HSP70 accumulation in the heart and in cultured cells. FEBS Lett. 1996; 391 (1-2): 21 3] may limit the development of apoptosis in tumor cells [Murphy ME. The HSP70 family and cancer. Carcinogenesis. 2013; 34 (6): 1181-8] and, accordingly, have a pro-tumor effect. High NO levels also inhibit metastasis [Aranda Ε,

C, De La

JR,

A: Nitric oxide and cancer: the emerging role of S nitrosylation. Curr Mol Med 2012, 12: 50-67]. The local concentration of NO and free radicals in the tumor zone determines how NO and its metabolites will interact with DNA, with DNA repair systems, p53 tumor suppressor, and other activators and inhibitors of tumor cell apoptosis. These interactions, in turn, will form the pro- or anti-tumor effects of NO [Engin AB. Dual function of nitric oxide in carcinogenesis, reappraisal. Curr Drug Metab. 2011 Nov; 12 (9): 891-9]. Changing the phenotype of tumor-associated macrophages towards M1 will undoubtedly contribute to limiting the growth of tumor cells not only due to NO production, but also due to other mechanisms, such as an increase in the production of pro-inflammatory cytokines Lum HD, Buhtoiarov IN, Schmidt BE, Berke G, Paulnock DM, Sondel PM, Rakhmilevich AL. Tumoristatic effects of anti-CD40 mAb-activated macrophages involve nitric oxide and tumor necrosis factor-α. Immunology, 2006; 118 (2): 261-70; Tsung, K., Dolan, JP, Tsung, YL, Norton, JA Macrophages as effector cells in interleukin 12-induced Τ cell-dependent tumor rejection. Cancer Res. 2002; 62: 5069-75], increased production of free radicals [Grivennikov SI, Greten FR, Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell, 2010; 140 (6): 883-99], activation of natural killers that can efficiently kill tumor cells [Smyth, MJ, Thia, K.Y., Street, SE, MacGregor, D., Godfrey, DI, Trapani, JA Perforin- mediated cytotoxicity is critical for surveillance of spontaneous lymphoma J. Exp. Med. 2000; 192: 755-60; Street, SE, Cretney, E., Smyth, MJ Perforin and interferon-activities independently control tumor initiation, growth, and metastasis. Blood 2001; 97: 192-97]; presentation of tumor antigens and the formation of Th1 and cytotoxic lymphocytes [Backer R, Schwandt Τ, Greuter M, Oosting M, Jngerkes F, Tting Τ et al. Effective collaboration between marginal metallophilic macrophages and CD8 + dendritic cells in the generation of cytotoxic Τ cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2010; 107 (1): 216-21; Barrio MM, Abes R, Colombo M, Pizzurro G, Boix C, Roberti MP et al. Human macrophages and dendritic cells can equally present MART-1 antigen to CD8 (+) Τ cells after phagocytosis of gamma-irradiated melanoma cells. PLoS One, 2012; 7 (7): e40311] that infiltrate a tumor and kill tumor cells [Dunn, GP, Old, LJ, Schreiber, RD The immunobiology of cancer immunosurveillance and immunoediting Immunity. 2004; 21: 137-148].

Для решения поставленной задачи впервые в способе иммунного подавления роста опухоли на основе репрограммирования макрофагов на M1 фенотип с повышенной способностью к продукции оксида азота используется комбинация факторов для репрограммирования макрофагов на M1 фенотип - бессывороточная среда и добавление IFN-γ 20 нг/мл. В предлагаемой комбинации используется сочетание нескольких факторов репрограммирования макрофагов (цитокиновая и сывороточная модели), поскольку добавление цитокина IFN-γ (цитокиновая модель) к пониженным (0%) концентрациям сыворотки (сывороточная модель) во время репрограммирования на M1 фенотип приводит к активации IFN-γ-зависимого сигнального пути и увеличивает экспрессию ингибиторного SMAD7 (только лишь пониженные концентрации сыворотки таким эффектом не обладают). SMAD7 препятствует фосфорилированию SMAD2/3. Таким образом, накопление SMAD7 на этапе репрограммирования на M1 фенотип будет способствовать ингибированию TGF-β/SMAD-(M2-) зависимого сигнального пути. Целесообразность использования пониженных концентраций сыворотки (сывороточная модель) в комбинированной модели репрограммирования обусловлена тем, что в сыворотке содержится TGF-β и его удаление (вместе с сывороткой) облегчит не только формирование M1 фенотипа, но и будет способствовать более эффективному блокированию TGF-β/SMAD-(M2) зависимого сигнального пути с помощью SMAD7.To solve this problem, for the first time in a method of immune suppression of tumor growth based on the reprogramming of macrophages on the M1 phenotype with increased ability to produce nitric oxide, a combination of factors is used to reprogram the macrophages on the M1 phenotype - serum-free medium and the addition of IFN-γ of 20 ng / ml. In the proposed combination, a combination of several macrophage reprogramming factors (cytokine and serum models) is used, since the addition of the IFN-γ cytokine (cytokine model) to lower (0%) serum concentrations (serum model) during reprogramming onto the M1 phenotype leads to IFN-γ activation -dependent signaling pathway and increases the expression of inhibitory SMAD7 (only lower serum concentrations do not have this effect). SMAD7 inhibits phosphorylation of SMAD2 / 3. Thus, the accumulation of SMAD7 during the reprogramming step on the M1 phenotype will contribute to the inhibition of the TGF-β / SMAD- (M2-) dependent signaling pathway. The feasibility of using lower serum concentrations (serum model) in a combined reprogramming model is due to the fact that serum contains TGF-β and its removal (together with serum) will facilitate not only the formation of the M1 phenotype, but will also contribute to more efficient blocking of TGF-β / SMAD - (M2) dependent signaling path using SMAD7.

В ходе экспериментов проанализировано влияние репрограммированных in vitro на M1 фенотип опухолеассоциированных макрофагов на продолжительность жизни мышей с АКЭ, что позволяет судить о возможности подавления опухолевого роста.In the course of the experiments, the influence of tumor-associated macrophages phenotype reprogrammed in vitro on M1 on the lifespan of mice with AKE was analyzed, which makes it possible to judge the possibility of suppressing tumor growth.

Графические материалы, поясняющие сущность изобретения:Graphic materials explaining the invention:

фиг. 1 - репрограммирование опухолеассоциированных макрофагов на M1 фенотип с помощью комбинированной модели. Достоверность отличий: * - р<0.05; ** - р0.01;FIG. 1 - reprogramming of tumor-associated macrophages to the M1 phenotype using a combined model. Significance of differences: * - p <0.05; ** - p0.01;

фиг. 2 - внешний вид мышей с АКЭ, которым вводили (слева, А) и не вводили (справа, Б) репрограммированные на M1 фенотип опухолеассоциированные макрофаги.FIG. 2 - the appearance of mice with AKE, which were introduced (left, A) and not introduced (right, B) tumor-associated macrophages reprogrammed on the M1 phenotype.

Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.

Эксперименты проводились на культуре перитонеальных макрофагов мышей (n=) генетической линии C57/BL6J. Мыши были получены в питомнике животных «Андреевка» (http://andreevka.msk.ru/index.htm) и содержались в аккредитованном виварии в стандартных условиях, не допускающих попадания патогенных микроорганизмов при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище [Приказ №63 МЗ СССР от 10.03.1966; «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» за №1045-73, утвержденные Главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.1973. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с положениями приказа №755 МЗ СССР от 12.08.1977, а также с соблюдением правил Надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice, РФ ГОСТ Р-53434-2009) и в соответствии с руководством ВОЗ для биомедицинских исследований (http://www.cioms.ch/publications/guidelines/1985_texts_of_guidelines.htm).The experiments were conducted on a culture of mouse peritoneal macrophages (n =) of the C57 / BL6J genetic line. The mice were obtained in the Andreevka animal nursery (http://andreevka.msk.ru/index.htm) and were kept in an accredited vivarium under standard conditions that prevent pathogens from entering in natural light and free access to water and food [Order No. 63 of the Ministry of Health of the USSR dated 03/10/1966; "Sanitary rules for the design, equipment and maintenance of experimental biological clinics (vivariums)" No. 1045-73 approved by the Chief State Sanitary Doctor of the USSR dated 04/06/1973. All animal experiments were carried out in accordance with the provisions of Order No. 755 of the Ministry of Health of the USSR dated 08/12/1977, as well as in compliance with the rules of Good Laboratory Practice (Good Laboratory Practice, RF GOST R-53434-2009) and in accordance with the WHO guidelines for biomedical research ( http://www.cioms.ch/publications/guidelines/1985_texts_of_guidelines.htm).

Опухолевый рост у мышей инициировали с помощью внутрибрюшинного введения клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). Клетки опухоли были получены в «Российском онкологическом научном центре им. H.Н. Блохина». Мышам внутрибрюшинно вводили по 250 тысяч опухолевых клеток, разведенных в 0,2 мл физиологического раствора. Устойчивость мышей к АКЭ и способность репрограммированных in vitro опухолеассоциированных макрофагов на M1 фенотип подавлять опухолевый рост оценивали по продолжительности жизни после введения опухолевых клеток и по изменению веса животных, отражавшему накопление асцита в брюшной полости.Tumor growth in mice was initiated by intraperitoneal injection of Erlich ascites carcinoma (AKE) cells. Tumor cells were obtained at the Russian Cancer Research Center. H.N. Blokhin. " Mice were injected intraperitoneally with 250 thousand tumor cells diluted in 0.2 ml of physiological saline. The resistance of mice to AKE and the ability of reprogrammed in vitro tumor-associated macrophages to the M1 phenotype to suppress tumor growth were assessed by life expectancy after the introduction of tumor cells and by the change in animal weight, which reflected the accumulation of ascites in the abdominal cavity.

Макрофаги репрограммировали на M1 фенотип с помощью комбинированной модели с использованием двух факторов: 0% FBS [Mills CD, Kincaid К, Alt JM, Heilman MJ, Hill AM. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 2000; 164(12):6166-73] и 20 нг/мл IFN-γ [см. Martinez F.O., Sica Α., Mantovani Α., Locati M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci.2008; 1(13): 453- 61].Macrophages were reprogrammed onto the M1 phenotype using a combined model using two factors: 0% FBS [Mills CD, Kincaid K, Alt JM, Heilman MJ, Hill AM. M-1 / M-2 macrophages and the Th1 / Th2 paradigm. J Immunol. 2000; 164 (12): 6166-73] and 20 ng / ml IFN-γ [see Martinez F.O., Sica Α., Mantovani Α., Locati M. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 2008; 1 (13): 453-61].

Макрофаги выделяли из здоровых мышей и формировали 4 группы. Группа 1 или «Контроль» - макрофаги, которые культивировались в стандартных условиях с 10% FBS в течение 36 часов. Макрофаги этой группы использовали для внутрибрюшинного введения мышам без опухоли и мышам с АЭК в качестве контроля. Группа 2 или «ЛПС» - макрофаги, которые культивировались в течение 12 часов в стандартных условиях с 10% FBS, а затем стимулировались ЛПС (500 нг/мл) в течение 24 часов. Группа 3 или «Репрограммирование без стимуляции ЛПС» - макрофаги, которые культивировались в течение 36 часов без FBS с добавлением IFN-γ в концентрации 20 нг/мл. Группа 4 «Репрограммирование и стимуляция ЛПС» - макрофаги, которые инкубировались в течение 12 часов без FBS с добавлением IFN-γ в концентрации 20 нг/мл, а затем стимулировались ЛПС (500 нг/мл) в течение 24 часов. Макрофаги этой группы использовали для внутрибрюшинного введения нормальным мышам и мышам с АКЭ.Macrophages were isolated from healthy mice and 4 groups were formed. Group 1 or “Control” - macrophages that were cultured under standard conditions with 10% FBS for 36 hours. Macrophages of this group were used for intraperitoneal administration to mice without a tumor and to mice with AEC as a control. Group 2 or “LPS” - macrophages that were cultured for 12 hours under standard conditions with 10% FBS, and then stimulated with LPS (500 ng / ml) for 24 hours. Group 3 or “Reprogramming without LPS stimulation” - macrophages that were cultured for 36 hours without FBS with the addition of IFN-γ at a concentration of 20 ng / ml. Group 4 “Reprogramming and stimulation of LPS” - macrophages that were incubated for 12 hours without FBS with the addition of IFN-γ at a concentration of 20 ng / ml, and then stimulated with LPS (500 ng / ml) for 24 hours. Macrophages of this group were used for intraperitoneal administration to normal and AKE mice.

Репрограммированные in vitro на M1 фенотип опухолеассоциированные макрофаги и контрольные макрофаги из Группы 1 снимали со дна культуральной лунки и вводили внутрибрюшинно нормальным мышам и мышам с опухолью. Для снятия макрофагов с дна лунки использовали трипсин [Rey-Giraud F., Hafner M., Ries C.H. In Vitro Generation of Monocyte-Derived Macrophages under Serum-Free Conditionslmproves Their Tumor Promoting Functions. PLOSone. 2012; 7(8): е42656]. Из лунок удаляли среду и затем добавляли по 1 мл 0,25% раствора трипсина с 0,03% ЭДТА. Плашки инкубировали при 37°С в течение 3 мин. Затем плашки встряхивали. Дальше в каждую лунку добавляли по 1 мл среды и плашку встряхивали. Далее жидкость из лунки переносили в пробирку и добавляли в лунку 1 мл среды, еще раз встряхивали и сливали жидкость в ту же пробирку. Пробирки центрифугировали в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту. После этого надосадочную жидкость удаляли из пробирки, а к осадку макрофагов добавляли 1 мл среды и пипетировали до получения суспензии макрофагов. С помощью среды RPMI-1640 доводили концентрацию макрофагов до 1 млн клеток/1 мл среды (Раствор А).Tumor-associated macrophages and control macrophages from Group 1 reprogrammed in vitro on the M1 phenotype were removed from the bottom of the culture well and intraperitoneally administered to normal and tumor mice. Trypsin was used to remove macrophages from the bottom of the well [Rey-Giraud F., Hafner M., Ries C.H. In Vitro Generation of Monocyte-Derived Macrophages under Serum-Free Conditionslmproves Their Tumor Promoting Functions. PLOSone. 2012; 7 (8): e42656]. Medium was removed from the wells and then 1 ml of a 0.25% trypsin solution with 0.03% EDTA was added. The plates were incubated at 37 ° C for 3 minutes. Then the dice were shaken. Then, 1 ml of medium was added to each well and the plate was shaken. Next, the liquid from the well was transferred to a test tube and 1 ml of medium was added to the well, shaken again and the liquid was poured into the same test tube. The tubes were centrifuged for 5 min at 1000 rpm. After this, the supernatant was removed from the tube, and 1 ml of medium was added to the macrophage pellet and pipetted to obtain a macrophage suspension. Using the medium RPMI-1640 brought the concentration of macrophages to 1 million cells / 1 ml of medium (Solution A).

Из раствора А готовили суспензию 4000 макрофагов в 0,5 мл PBS (Раствор Б). Каждой мыши вводили внутрибрюшинно раствор Б на 3, 7 и 11 дни после введения опухолевых клеток. Были сформированы 5 групп по 16 мышей в каждой: 1. «Опухоль» - мыши, которым вводили опухолевые клетки; 2. «Опухоль + PBS» - мыши, которым вводили опухолевые клетки и на 3, 7 и 11 дни по 0,5 мл PBS; 3. «Опухоль + М1» - мыши, которым вводили опухолевые клетки и на 3, 7 и 11 дни суспензию 4000 макрофагов M1 фенотипа в 0,5 мл PBS; 4. «Опухоль + М0» - мыши, которым вводили опухолевые клетки и на 3, 7 и 11 дни суспензию 4000 перепрограммированных макрофагов в 0,5 мл PBS; 5. «Опухоль + цисплатин» - мыши, которым вводили опухолевые клетки и на 3, 7 и 11 дни антиопухолевый препарат 0,05 мл раствора цисплатин в концентрации 0.5 мг/мл [Zhao Nan, Li YH, Wu XK, Wang GY, Cai DY, Han FJ. Effect of Brucea javanica fruit oil emulsion combined cisplatin on the growth inhibition of transplanted tumor in human ovarian cancer SKOV3 nude mice: an experimental study. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2015 Jan; 35(l):57-62]. Цисплатин - препарат с хорошо известным антиопухолевым действием [Roco A,

J, Contreras S, Stojanova J,

L. Can pharmacogenetics explain efficacy and safety of cisplatin pharmacotherapy? Front Genet. 2014; 5:391]. Его использовали в качестве препарата сравнения. Эффект введенных макрофагов и цисплатина оценивали по изменению веса и продолжительности жизни животных с опухолью.A suspension of 4000 macrophages in 0.5 ml of PBS (Solution B) was prepared from solution A. Each mouse was injected intraperitoneally with solution B on days 3, 7, and 11 after the introduction of tumor cells. 5 groups of 16 mice each were formed: 1. “Tumor” - mice that were injected with tumor cells; 2. "Tumor + PBS" - mice that were injected with tumor cells and on days 3, 7 and 11, 0.5 ml of PBS each; 3. "Tumor + M1" - mice that were injected with tumor cells and on days 3, 7 and 11 a suspension of 4000 macrophages of the M1 phenotype in 0.5 ml of PBS; 4. "Tumor + M0" - mice that were injected with tumor cells and on 3, 7 and 11 days a suspension of 4000 reprogrammed macrophages in 0.5 ml of PBS; 5. “Tumor + cisplatin” - mice injected with tumor cells and on days 3, 7 and 11, an antitumor preparation of 0.05 ml of a solution of cisplatin at a concentration of 0.5 mg / ml [Zhao Nan, Li YH, Wu XK, Wang GY, Cai DY, Han FJ. Effect of Brucea javanica fruit oil emulsion combined cisplatin on the growth inhibition of transplanted tumor in human ovarian cancer SKOV3 nude mice: an experimental study. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2015 Jan; 35 (l): 57-62]. Cisplatin is a drug with a well-known anti-tumor effect [Roco A,

J, Contreras S, Stojanova J,

L. Can pharmacogenetics explain efficacy and safety of cisplatin pharmacotherapy? Front Genet 2014; 5: 391]. It was used as a comparison drug. The effect of introduced macrophages and cisplatin was evaluated by the change in weight and life expectancy of animals with a tumor.

Для подтверждения эффективности репрограммирования макрофагов на M1 фенотип оценивали продукцию NO (спектрофотометрически), продукцию про- и антивоспалительных цитокинов и CD-маркеров фенотипа (проточная цитофлуориметрия). Содержание провоспалительных M1 цитокинов IL-2, IL-6, IFNγ и TNF-α и антивоспалительных М2 цитокинов IL-5 и IL-10 [Diehl S.,

M. The two faces of IL-6 on Th1/Th2 differentiation. Mol Immunol 2002; 39(9): 531-536; Liao W., Lin J.X., Leonard W.J. IL-2 family cytokines: new insights into the complex roles of IL-2 as a broad regulator of Τ helper cell differentiation. Curr Opin Immunol 2011; 23(5): 598-604; Mosser D.M., Edwards J.P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology 2008; 8(12): 958-69] определяли методом проточной цитофлуориметрии (Beckman Coulter FC500, США) с помощью набора для определения цитокинов (BMS810FF, BenderMedSystems, США) по инструкции производителя.To confirm the efficiency of macrophage reprogramming on the M1 phenotype, the production of NO (spectrophotometrically), the production of pro- and anti-inflammatory cytokines, and phenotype CD-markers (flow cytometry) were evaluated. The content of pro-inflammatory M1 cytokines IL-2, IL-6, IFNγ and TNF-α and anti-inflammatory M2 cytokines IL-5 and IL-10 [Diehl S.,

M. The two faces of IL-6 on Th1 / Th2 differentiation. Mol Immunol 2002; 39 (9): 531-536; Liao W., Lin JX, Leonard WJ IL-2 family cytokines: new insights into the complex roles of IL-2 as a broad regulator of Τ helper cell differentiation. Curr Opin Immunol 2011; 23 (5): 598-604; Mosser DM, Edwards JP Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology 2008; 8 (12): 958-69] was determined by flow cytometry (Beckman Coulter FC500, USA) using a kit for determining cytokines (BMS810FF, BenderMedSystems, USA) according to the manufacturer's instructions.

После репрограммирования макрофагов на M1 фенотип в условиях in vitro выявлено значимое изменение NO-генерирующей активности макрофагов. Так, культивирование макрофагов в среде, не содержащей FBS с добавленным IFN-γ, приводило к увеличению базальной нестимулированной продукции NO (фиг. 1), а также существенно увеличивало генерацию NO макрофагами в ответ на ЛПС (фиг. 1). Эти изменения указывают на процесс формирования M1 фенотипа с высокой NO-генерирующей активностью.After reprogramming macrophages to the M1 phenotype in vitro, a significant change in the NO-generating activity of macrophages was detected. Thus, the cultivation of macrophages in a medium containing no FBS with added IFN-γ led to an increase in basal unstimulated NO production (Fig. 1), and also significantly increased NO generation by macrophages in response to LPS (Fig. 1). These changes indicate the process of formation of the M1 phenotype with high NO-generating activity.

Таким образом, с помощью удаления FBS и добавления IFN-γ нам удалось репрограммировать функциональный фенотип макрофагов мышей в сторону M1 фенотипа.Thus, by removing FBS and adding IFN-γ, we were able to reprogram the functional macrophage phenotype of mice towards the M1 phenotype.

Для подтверждения эффективности комбинированного репрограммирования макрофагов была также проанализирована секреторная активность ЛПС-индуцированных макрофагов по продукции цитокинов. Выявлено, что репрограммирование макрофагов на M1 фенотип приводило к снижению продукции антивоспалительных цитокинов IL-5 и IL-10 и повышению продукции провоспалительных цитокинов IL-2, IL-6, TNF-α и INF-γ по сравнению с продукцией перепрограммированными макрофагами (Табл. 1). Для всех указанных цитокинов изменения были достоверны (р<0,001). Наиболее заметно при комбинированном репрограммировании изменялся уровень провоспалительного цитокина IL-2 - его продукция возросла практически в 3,5 раза и уровень антивоспалительного цитокина IL-5 - его продукция снизилась в 1,9 раза (Табл. 1). Такое изменение в продукции цитокинов является характерной чертой репрограммирования макрофагов на M1 фенотип [Sica A, Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo Veritas. J Clin Invest. 2012; 122(3):787-95].To confirm the effectiveness of combined macrophage reprogramming, the secretory activity of LPS-induced macrophages for cytokine production was also analyzed. It was revealed that the reprogramming of macrophages to the M1 phenotype led to a decrease in the production of anti-inflammatory cytokines IL-5 and IL-10 and an increase in the production of pro-inflammatory cytokines IL-2, IL-6, TNF-α, and INF-γ in comparison with the production of reprogrammed macrophages (Table. one). For all these cytokines, the changes were significant (p <0.001). During combined reprogramming, the level of pro-inflammatory cytokine IL-2 was most noticeable - its production increased almost 3.5 times and the level of anti-inflammatory cytokine IL-5 - its production decreased 1.9 times (Table 1). This change in cytokine production is a characteristic feature of macrophage reprogramming to the M1 phenotype [Sica A, Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo Veritas. J Clin Invest. 2012; 122 (3): 787-95].

Достоверность отличий от контроля (10% концентрации FBS в питательной среде): *р<0,001 для одноименного цитокина; **р<0,001 для одноименного CD маркера. Фенотипический сдвиг в сторону M1 подтверждают CD маркеры фенотипа макрофагов. После репрограммирования макрофаги имели на своей поверхности больше маркеров M1 фенотипа, CD25 и CD80, и меньше маркеров М2 фенотипа, CD 163 и CD206, по сравнению с макрофагами до репрограммирования (Табл. 1). Таким образом, проведенный анализ маркеров фенотипа макрофагов, таких как продукция NO и цитокинов, а также содержание CD маркеров фенотипа позволяет обоснованно рассматривать предлагаемую комбинированную модель как эффективную для in vitro репрограммирования опухолеассоциированных макрофагов на M1 фенотип.Significance of differences from control (10% concentration of FBS in the nutrient medium): * p <0.001 for the cytokine of the same name; ** p <0.001 for the same name CD marker. Phenotypic shift towards M1 is confirmed by macrophage phenotype CD markers. After reprogramming, macrophages had on their surface more M1 phenotype markers, CD25 and CD80, and fewer M2 phenotype markers, CD 163 and CD206, compared to macrophages before reprogramming (Table 1). Thus, the analysis of macrophage phenotype markers, such as the production of NO and cytokines, as well as the content of CD phenotype markers, allows us to reasonably consider the proposed combined model as effective for in vitro reprogramming of tumor-associated macrophages to the M1 phenotype.

Анализ данных продолжительности жизни мышей с АКЭ и мышей с АКЭ, которым вводили репрограммированные с помощью комбинированной модели макрофаги, показал, что после введения опухолевых клеток продолжительность жизни мышей составляла 13,6±0,2 дней (Группа 1), тогда как мыши после введения репрограммированных M1 макрофагов (Группа 3) прожили 22,8±0,8 дней (р<0,01), то есть продолжительность жизни возрастала на 68%. Увеличение продолжительности жизни при введении репрограммированных M1 макрофагов было существенно больше, чем при использовании известного антиопухолевого препарата цисплатин (Группа 5). Введение PBS (Группа 2) или перепрограммированных макрофагов (Группа 4) достоверно не повлияло на продолжительность жизни мышей с опухолью (табл. 2).Analysis of the life expectancy data of mice with AKE and mice with AKE injected with macrophages reprogrammed using the combined model showed that after the introduction of tumor cells, the life expectancy of mice was 13.6 ± 0.2 days (Group 1), whereas mice after administration reprogrammed M1 macrophages (Group 3) lived 22.8 ± 0.8 days (p <0.01), that is, life expectancy increased by 68%. The increase in life expectancy with the introduction of reprogrammed M1 macrophages was significantly greater than with the well-known anti-tumor drug cisplatin (Group 5). The introduction of PBS (Group 2) or reprogrammed macrophages (Group 4) did not significantly affect the life expectancy of mice with the tumor (Table 2).

Достоверность отличий от Группы 1 «Опухоль»: * - р<0,05, ** - р<0,01. Во все группах токсическое действие АКЭ проявлялось увеличением асцита в брюшной полости и соответственно увеличением веса животных. Однако у мышей, которым вводили M1 макрофаги (Группа 3), увеличение веса к 11 дню развития опухоли по сравнению с первым днем составило 6,5±1,1%, тогда как у мышей, которым не вводили макрофаги (Группа 1) - 12,7±1,8% (р<0,01), то есть было в два раза больше. На фиг. 2 представлена репрезентативная фотография мышей на 11 день после введения опухолевых клеток из группы 3, получавшей макрофаги M1 фенотипа (слева, А) и группы 1, не получавшей макрофаги (справа, Б). Видно, что у мышей, получавших M1 макрофаги накопление асцита в брюшной полости было существенно меньше, чем у мышей, не получавших такие макрофаги. Введение PBS (Группа 2) или перепрограммированных макрофагов (Группа 4) никак не повлияло на увеличение веса животных с АКЭ. Таким образом, введение репрограммированных in vitro на M1 опухолеассоциированных макрофагов достоверно повысило устойчивость мышей к развитию АКЭ по параметрам продолжительности жизни и накопления асцитической жидкости в брюшной полости, что свидетельствует о высокой перспективности предлагаемой разработки новой биотехнологии ограничения роста опухоли с помощью репрограммированных in vitro макрофагов.Significance of differences from Group 1 “Tumor”: * - p <0.05, ** - p <0.01. In all groups, the toxic effect of AKE was manifested by an increase in ascites in the abdominal cavity and, accordingly, an increase in the weight of animals. However, in mice that were injected with M1 macrophages (Group 3), the weight gain by day 11 of tumor development compared to the first day was 6.5 ± 1.1%, while in mice that were not injected with macrophages (Group 1) - 12 , 7 ± 1.8% (p <0.01), that is, it was twice as much. In FIG. Figure 2 shows a representative photograph of mice on day 11 after the administration of tumor cells from group 3 receiving macrophages of the M1 phenotype (left, A) and group 1 not receiving macrophages (right, B). It is seen that in mice treated with M1 macrophages, the accumulation of ascites in the abdominal cavity was significantly less than in mice that did not receive such macrophages. The introduction of PBS (Group 2) or reprogrammed macrophages (Group 4) did not affect the weight gain of animals with AKE. Thus, the introduction of tumor-associated macrophages reprogrammed in vitro on M1 significantly increased the resistance of mice to the development of AKE in terms of life expectancy and ascitic fluid accumulation in the abdominal cavity, which indicates the high potential of the proposed development of new biotechnology for limiting tumor growth using reprogrammed in vitro macrophages.

Пример. При воздействии на макрофаги бессывороточной средой в сочетании с 20 нг/мл INF-γ достигалось увеличение продукции NO (таблица 3), о чем позволяет судить увеличение содержания нитритов в среде и содержание iNOS в макрофагах мышей генетических линий C57BL/6 (таблица 3, фиг. 3, вставка А) и BALB/c (таблица 3, фиг. 3, вставка Б). Фиг. 3. Содержание нитритов в культуральной среде и содержание iNOS в макрофагах мышей генетических линий C57BL/6 (вставка А) и BALB/c (вставка Б) при in vitro репрограммировании макрофагов на M1 фенотип.Example. When macrophages were exposed to serum-free medium in combination with 20 ng / ml INF-γ, an increase in NO production was achieved (Table 3), which can be judged by the increase in nitrite content in the medium and the iNOS content in macrophages of mice of the C57BL / 6 genetic lines (table 3, FIG. 3, Box A) and BALB / c (Table 3, FIG. 3, Box B). FIG. 3. The nitrite content in the culture medium and the iNOS content in macrophages of mice of the genetic lines C57BL / 6 (Box A) and BALB / c (Box B) upon in vitro reprogramming of macrophages to the M1 phenotype.

Полученные значения продукции нитритов макрофагами при воздействии на них бессывороточной среды в сочетании с INF-γ 20 нг/мл при стимуляции ЛПС по сравнению с контролем (РФМ0) свидетельствовали о существенном сдвиге фенотипа в сторону M1. В верхней части каждой вставки фиг. 3 приведены изменения содержания нитритов в культуральной среде. В нижней части каждой вставки фиг. 3 представлены оригинальные иммунноблоты. Интенсивность окрашивания и толщина черных полос отражает содержание белка iNOS в макрофагах.The obtained values of nitrite production by macrophages when exposed to serum-free medium in combination with INF-γ of 20 ng / ml during LPS stimulation compared to control (RFM0) indicated a significant shift of the phenotype towards M1. At the top of each insert of FIG. Figure 3 shows the changes in the nitrite content in the culture medium. At the bottom of each insert of FIG. 3 presents the original immunoblots. The staining intensity and thickness of the black bars reflect the iNOS protein content in macrophages.

Claims

A method of suppressing tumor growth based on in vitro macrophage reprogramming on the M1 phenotype with increased ability to produce nitric oxide in an experiment when macrophages are cultured in serum-free medium, characterized in that IFN-γ of 20 ng / ml is added to serum-free medium.