RU2598265C2

RU2598265C2 - Polyepitope immunogenic polypeptides and methods of application thereof

Info

Publication number: RU2598265C2
Application number: RU2013135148/10A
Authority: RU
Inventors: Амир Закиевич Максютов; Елена Васильевна Гаврилова; Ринат Амирович Максютов; Сергей Витальевич Сенников; Юлия Александровна Шевченко; Василий Васильевич Курилин; Юлия Анатольевна Лопатникова
Original assignee: Амир Закиевич Максютов; Елена Васильевна Гаврилова; Ринат Амирович Максютов; Сергей Витальевич Сенников; Юлия Александровна Шевченко; Василий Васильевич Курилин; Юлия Анатольевна Лопатникова
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2016-09-20
Also published as: RU2013135148A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology, specifically to obtaining immunogenic polypeptides against breast cancer, and can be used in medicine. Genetic engineering techniques are used to produce polypeptides with an amino acid sequence SEQ ID NO:105 and 106.

EFFECT: invention enables to stimulate antitumour immune response in patients with breast cancer.

2 cl, 1 dwg

Description

Изобретение относится к области биохимии и иммунологии и может быть применено в медико-биологической промышленности при производстве препаратов для профилактики и лечения раковых заболеваний. В частности, для лечения больных раком молочной железы (РМЖ) и другими видами рака (колоректальный рак, рак яичника, рак пищевода, рак простаты, другие виды рака) за счет индукции антиген-специфического иммунного ответа с применением аутологичных дендритных клеток, трансфецированных ДНК-вакцинными конструкциями, кодирующими полиэпитопные иммуногены, содержащие антигенные детерминанты, специфичные для белков HER-2/neu, маммаглобина-А (mammaglobin-A), NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, теломераза (telomerase), сурвивин (survivin), р53.The invention relates to the field of biochemistry and immunology and can be used in the biomedical industry in the manufacture of drugs for the prevention and treatment of cancer. In particular, for the treatment of patients with breast cancer (breast cancer) and other cancers (colorectal cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, prostate cancer, other cancers) by inducing an antigen-specific immune response using autologous dendritic cells transfected with DNA vaccine constructs encoding polyepitope immunogens containing antigenic determinants specific for HER-2 / neu, mammaglobin-A (mammaglobin-A), NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase (telomerase), survivin (survivin ), p53.

Злокачественные новообразования являются второй по значимости в мире причиной смерти после сердечно-сосудистой патологии. Среди женского населения ведущей онкологической патологией является рак молочной железы.Malignant neoplasms are the second leading cause of death in the world after cardiovascular disease. Among the female population, the leading oncological pathology is breast cancer.

Перспективным подходом к лечению рака молочной железы является активная иммунотерапия, которая в настоящее время представляется неотъемлемой частью современной клинической практики. Поскольку главная цель иммунотерапии при онкологии заключается в обеспечении сильного и устойчивого опухолеспецифического иммунного ответа, достижение подобных результатов возможно через стимуляцию CD4+ и CD8+ Т-клеток [Pardoll and Topalian, 1998; Hung et al., 1998; Marzo et al., 2000; Qin and Blankenstein, 2000]. CD8(+) цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) являются главными эффекторными клетками противоракового иммунного ответа, образование которых зависит от подходящего антигена-мишени и эффективной презентации данного антигена иммунной системе пациента с участием антиген-презентирующих клеток (АПК). Дендритные клетки являются наиболее эффективными АПК и единственными клетками, способными представлять новые антигены неактивированным Т-клеткам. Поэтому применение аутологичных дендритных клеток, трансфецированных уникальными ДНК-вакцинными конструкциями, представляет собой хороший инструмент для презентации АГ иммунной системе пациента.A promising approach to the treatment of breast cancer is active immunotherapy, which at present is an integral part of modern clinical practice. Since the main goal of immunotherapy in oncology is to provide a strong and stable tumor-specific immune response, such results can be achieved through stimulation of CD4 + and CD8 + T cells [Pardoll and Topalian, 1998; Hung et al., 1998; Marzo et al., 2000; Qin and Blankenstein, 2000]. CD8 (+) cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) are the main effector cells of the anti-cancer immune response, the formation of which depends on the appropriate target antigen and the effective presentation of this antigen to the patient’s immune system with antigen-presenting cells (APCs). Dendritic cells are the most effective APCs and the only cells capable of presenting new antigens to inactive T cells. Therefore, the use of autologous dendritic cells transfected with unique DNA vaccine constructs is a good tool for presenting AH to the patient’s immune system.

В практике лечения онкозаболеваний введен препарат против рака простаты, основанный на описанном выше подходе. Это - первая в истории медицины лечебная аутологичная противораковая вакцина Provenge компании Dendreon, одобренная Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (Food and Drug Administration, FDA) в марте 2010 г. Вакцина Provenge основана на использовании одного конкретного белка, гиперэкспрессирующегося в клетках опухоли. Фактически, любой белок, гиперэкспрессирующийся в раковой клетке, может служить подходящей мишенью. Сейчас множество групп исследователей занимаются разработкой терапевтических противораковых вакцин на базе различных ассоциированных с РМЖ антигенов, например такого, как белок HER-2/neu. В качестве антигенов в них используются фрагменты как внеклеточной, так и внутриклеточной частей белка. В состав некоторых вакцин входил единственный пептид Е75 (369-377) (Mittendorf et al., 2008), другие содержали различные пептиды из HER-2/neu (Li Y et all, 2009). Клинические испытания различных конструкций для индукции CTL-ответа на базе HER-2/neu показали их низкую токсичность и отсутствие аутоиммунных реакций, при этом в ряде случаев развивались НЕР2-специфичные клеточный и гуморальный ответы (Disis ML et al., 1998, Salazar LG et al., 2003; Disis ML et al., 2004). ДНК-вакцинные конструкции, содержащие эпитопы других АГ, также проходят стадии доклинических и клинических испытаний. Однеко, несмотря на некоторые успехи, описанные выше, до сих пор не существует одобренной для применения вакцины против РМЖ и большинства других видов рака. Таким образом, актуальной задачей является разработка высокоспецифичного противоопухолевого иммуногена и вакцины на его основе, способной эффективно индуцировать цитотоксические лимфоциты (CTL) и таким образом обеспечивать эффективный противоопухолевый иммунный ответ.In the practice of treating cancer, a drug has been introduced against prostate cancer, based on the approach described above. This is Dendreon’s first ever autologous anti-cancer Provenge cancer vaccine in the history of medicine, approved by the Food and Drug Administration (FDA) in March 2010. The Provenge vaccine is based on one specific protein that is overexpressed in tumor cells. In fact, any protein overexpressed in a cancer cell can serve as a suitable target. Many research groups are currently developing therapeutic cancer vaccines based on various antigens associated with breast cancer, such as the HER-2 / neu protein. Fragments of both the extracellular and intracellular parts of the protein are used as antigens in them. Some vaccines included the only peptide E75 (369-377) (Mittendorf et al., 2008), while others contained various peptides from HER-2 / neu (Li Y et all, 2009). Clinical trials of various constructs for the induction of a HER-2 / neu-based CTL response have shown their low toxicity and lack of autoimmune reactions, in some cases HEP2-specific cellular and humoral responses have developed (Disis ML et al., 1998, Salazar LG et al., 2003; Disis ML et al., 2004). DNA vaccine constructs containing epitopes of other hypertension also undergo preclinical and clinical trials. However, despite some of the successes described above, there is still no approved vaccine for breast cancer and most other types of cancer. Thus, the urgent task is to develop a highly specific antitumor immunogen and a vaccine based on it, capable of effectively inducing cytotoxic lymphocytes (CTL) and thus provide an effective antitumor immune response.

Соответственно, задачей настоящего изобретения является создание ДНК-вакцинных конструкций, эффективно стимулирующих Т-клеточный ответ пациента. Данная задача решена за счет применения поли-CTL-эпитопов сразу нескольких АГ, гиперэкспрессирующихся в опухолевых клетках при РМЖ на основании данных о процессинге и презентации АГ совместно с молекулами ГКГС класса I CD8+цитотоксичсским Т-лимфоцитам. Рациональность применения таких конструкций основана на том, что в отличие от полиэпитопных вакцин, содержащих в своем составе один АГ, применение полиэпитопных вакцин на основе нескольких АГ позволяет преодолеть влзможное отсутствие гиперэкспрессии выбранного АГ в раковых клетках, а также преодолеть гетерогенность экспрессии АГ различными раковыми клетками внутри одной опухоли.Accordingly, it is an object of the present invention to provide DNA vaccine constructs that effectively stimulate a patient's T cell response. This problem was solved by the use of poly-CTL epitopes of several hypertension at once, which are overexpressed in tumor cells in breast cancer based on data on the processing and presentation of hypertension together with HCGC class I molecules CD8 + to cytotoxic T-lymphocytes. The rationality of the use of such constructs is based on the fact that, unlike polyepitope vaccines containing one AH, the use of polyepitope vaccines based on several AH allows to overcome the possible lack of overexpression of the chosen AH in cancer cells, as well as to overcome the heterogeneity of AH expression by various cancer cells inside single tumor.

Поставленная задача решается путем выбора наилучших АГ с наибольшей иммунотерапевтической эффективностью, на основе отбора CTL-эпитопов, специфичных для гаплотипа HLA-A*0201 и затем, объединение CTL-эпитопов в единую последовательность с учетом данных о процессинге и презентации АГ.The problem is solved by selecting the best AH with the highest immunotherapeutic efficiency, based on the selection of CTL epitopes specific for the HLA-A * 0201 haplotype and then combining CTL epitopes in a single sequence taking into account data on the processing and presentation of AH.

На основе опубликованных литературных данных по клиническим испытаниям противораковых вакцин были определены АГ с наибольшей иммунотерапевтической эффективностью: HER-2/neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53.Based on published literature on clinical trials of anti-cancer vaccines, AHs with the highest immunotherapeutic efficacy were determined: HER-2 / neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53.

HER-2/neu - это член семейства рецепторов эпидермальных факторов роста, регулирующих клеточную пролиферацию, дифференцировку, миграцию и адгезию. Увеличение экспрессии HER-2/neu приводит к супрессии апоптоза и активации пролиферации, что может приводить к опухолевому процессу [Harariand & Yarden, 2000]. От 20 до 35% РМЖ у женщин характеризуются увеличенной экспрессией белка HER-2/neu, также ассоциированного с более агрессивным течением процесса и плохим прогнозом [Benavides et al., 2009; Ross et al., 2009]. Сверхэкспрессия HER-2/neu обнаруживается и при других онкологических заболеваниях, например рак яичника, колоректальный рак, рак матки и др. [Bernhard et al., 2002].HER-2 / neu is a member of the epidermal growth factor receptor family that regulates cell proliferation, differentiation, migration, and adhesion. An increase in HER-2 / neu expression leads to suppression of apoptosis and activation of proliferation, which can lead to a tumor process [Harariand & Yarden, 2000]. From 20 to 35% of breast cancer in women are characterized by increased expression of the HER-2 / neu protein, also associated with a more aggressive course of the process and poor prognosis [Benavides et al., 2009; Ross et al., 2009]. Overexpression of HER-2 / neu is also found in other oncological diseases, such as ovarian cancer, colorectal cancer, uterine cancer, etc. [Bernhard et al., 2002].

Mammaglobin-A (MGBA) - гликопротеин, экспрессия которого, в норме, ограничена молочными железами (Watson & Fleming, 1996). Повышенная экспрессия MGBA (как минимум в 10 раз, по сравнению с нормальной тканью) наблюдается в 80% при первичном и метастазирующем раке молочной железы, при этом уровень экспрессии MGBA сравним среди хорошо, средне и слабо дифференцированной первичной опухоли молочной железы (Watson et al., 1999). Известно, что у пациенток, больных РМЖ, наблюдается высокая частота встречаемости CD8(+) цитотоксических Т лимфоцитов (CTL) к MGBA (Narayanan et al, 2004; Basha et al., 2011).Mammaglobin-A (MGBA) is a glycoprotein whose expression is normally limited to the mammary glands (Watson & Fleming, 1996). Increased expression of MGBA (at least 10 times compared with normal tissue) is observed in 80% of primary and metastatic breast cancer, while the level of expression of MGBA is comparable among well, medium and weakly differentiated primary breast tumors (Watson et al. , 1999). It is known that patients with breast cancer have a high incidence of CD8 (+) cytotoxic T lymphocytes (CTL) to MGBA (Narayanan et al, 2004; Basha et al., 2011).

NY-BR-1 - трансмембранный белок, потенциальный транскрипционный фактор, который в норме экспрессируется в нормальных эпителиальный клетках молочных желез, и в >70% гиперэкспрессируется в первичных опухолях молочных желез. Было показано, что пептиды NY-BR-1 рестриктированные HLA-A*0201 узнаются CD8(+) цитотоксическими Т лимфоцитами (Karbach et al., 2005; Sell et al., 2007). Уровень экспрессии NY-BR-1 прямо пропорционален экспрессии HER-2/neu и EGRF у больных РМЖ (Theurillat et al., 2007).NY-BR-1 is a transmembrane protein, a potential transcription factor that is normally expressed in normal mammary epithelial cells, and is> 70% overexpressed in primary mammary tumors. It has been shown that peptides NY-BR-1 restricted by HLA-A * 0201 are recognized by CD8 (+) cytotoxic T lymphocytes (Karbach et al., 2005; Sell et al., 2007). The expression level of NY-BR-1 is directly proportional to the expression of HER-2 / neu and EGRF in breast cancer patients (Theurillat et al., 2007).

hMena (ENAH) - белок, ортолог мышинного белка Mena, который экспрессируется в более 70% первичных РМЖ. Mena принадлежит к семейству белков Ena/VASP, которые контролируют организацию актиновых филаментов клетки и являются ключевыми регуляторными факторами клеточной миграции и определение формы в большинстве различных типах клеток и организмов. Мышинный Mena гиперэкспрессируется в раковых клетках груди с высокими инвазивными способностями (Di Modugno et al., 2006). В исследовании с NRG1 and Herceptin была показана прямая зависимость гиперсэксрессии hMena и HER-2/neu, что ассоциируется с повышенным уровнем трансформации опухоли и плохим прогнозом (Di Modugno et al., 2010).hMena (ENAH) is a protein ortholog of the murine Mena protein, which is expressed in more than 70% of primary breast cancer. Mena belongs to the Ena / VASP family of proteins that control the organization of cell actin filaments and are key regulatory factors in cell migration and shape determination in most different types of cells and organisms. Mouse Mena is overexpressed in breast cancer cells with high invasive abilities (Di Modugno et al., 2006). A study with NRG1 and Herceptin showed a direct relationship between hMena and HER-2 / neu hypersexpression, which is associated with increased tumor transformation and poor prognosis (Di Modugno et al., 2010).

p53 - многофункциональный белок, транскрипционный фактор, участвует в широком спектре клеточных процессов, в том числе в индукции апоптоза, стимуляции процессов репарации ДНК, остановке клеточного цикла и регуляции основного метаболизма. Нарушения в функционировании р53 обнаруживаются более чем в 50% случаев рака. Известно, что в обычных условиях в нетрансформированных клетках р53 нестабилен и достаточно быстро деградирует. Под воздействием стресса в клетках наблюдается усиление синтеза и стабилизация р53 (Vazquez et al., 2008).p53 - a multifunctional protein, a transcription factor, is involved in a wide range of cellular processes, including the induction of apoptosis, stimulation of DNA repair processes, cell cycle arrest and regulation of basic metabolism. Abnormalities in the functioning of p53 are found in more than 50% of cancers. It is known that under ordinary conditions in non-transformed p53 cells it is unstable and degrades rather quickly. Under the influence of stress in cells, increased synthesis and stabilization of p53 is observed (Vazquez et al., 2008).

Survivin (BIRC5) - эндогенный белок, относящийся к семейству белков ингибиторов апоптоза (ТАР, Inhibitor of Apoptosis Protein). Помимо ингибирования апоптоза survivin участвует в митотическом делении клетки и процессе ангиогенеза. В норме присутствует преимущественно в эмбриональных клетках и в нормальных соматических клетках в течение краткого периода митоза (Fukuda & Pelus, 2006). Его повышенная экспрессия наблюдается практически во всех типах злокачественных опухолей (Altier, 2008). Показано, что вакцинация тремя пептидами, рестриктированными по HLA A1, A2 и B35, приводила к формированию специфичных CD8+Т cells у 50% пациентов (Becker JC et al., 2008).Survivin (BIRC5) is an endogenous protein belonging to the family of proteins of apoptosis inhibitors (TAP, Inhibitor of Apoptosis Protein). In addition to inhibiting apoptosis, survivin is involved in mitotic cell division and angiogenesis. Normally present primarily in embryonic cells and in normal somatic cells during a brief period of mitosis (Fukuda & Pelus, 2006). Its increased expression is observed in almost all types of malignant tumors (Altier, 2008). Vaccination with three peptides restricted by HLA A1, A2 and B35 was shown to lead to the formation of specific CD8 + T cells in 50% of patients (Becker JC et al., 2008).

WT1 - ядерный белок, транскрипционный фактор, экспрессия которого повышена во многих типах злокачественных опухолей. Продукт гена WT1 в цитоплазме клетки подвергается протеасомальному процессингу до пептидов. Было показано, что цитотоксические лимфоциты, специфичные к WT1, индуцируются в результате узнавания TCR на клетках-предшественниках CTL молекулярных комплексов МНС класса I с пептидом WT1 (Sugiyama, 2010).WT1 is a nuclear protein, a transcription factor, the expression of which is increased in many types of malignant tumors. The product of the WT1 gene in the cell cytoplasm is subjected to proteasomal processing to peptides. It was shown that cytotoxic lymphocytes specific for WT1 are induced by recognition of TCR on CTL progenitor cells of molecular complexes of MHC class I with the WT1 peptide (Sugiyama, 2010).

Теломераза представляет собой рибонуклеопротеидный комплекс. Известно, что теломераза активна в 85% типов раковых опухолей, а в остальных 15% случаев действуют другие механизмы поддержания длины теломер, основанные на рекомбинации. Следует отметить, что теломеразная активность не обнаруживается в обычных соматических тканях. Следовательно, теломеразу можно использовать как унивесальную мишень при разработке антираковой терапии. Так, вакцинация пептидом GV1001 (611-626 hTERT) вызывала Th ответ более чем у 80% пациентов (Inderberg-Suso ЕМ, et al., 2012).Telomerase is a ribonucleoprotein complex. It is known that telomerase is active in 85% of types of cancerous tumors, and in the remaining 15% of cases other mechanisms of maintaining the length of telomeres based on recombination act. It should be noted that telomerase activity is not detected in ordinary somatic tissues. Therefore, telomerase can be used as a universal target in the development of anticancer therapy. Thus, vaccination with the GV1001 peptide (611-626 hTERT) elicited a Th response in more than 80% of patients (Inderberg-Suso EM, et al., 2012).

Для дизайна полиэпитопного иммуногена, нами были предсказаны CTL-эпитопы белков HER-2/neu, mammaglobin-A, NY-BR-1. hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53, специфичных для гаплотипа HLA-A*0201.For the design of a polyepitope immunogen, we predicted CTL epitopes of the HER-2 / neu, mammaglobin-A, NY-BR-1 proteins. hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53, specific for the HLA-A * 0201 haplotype.

Предсказание CTL-эпитопов проводилось на сервере IEDB Analysis Resource с помощью ГКГС Class I Prediction - ANN method (метод, основанный на нейронных сетях, который уже доказал свою применимость для поиска новых эпитопов и дизайна вакцинных конструкций (Nielsen et al., 2003).Prediction of CTL epitopes was performed on the IEDB Analysis Resource server using the Class I Prediction - ANN method (a method based on neural networks that has already proved its applicability for the search for new epitopes and the design of vaccine constructs (Nielsen et al., 2003).

Одним из механизмов формирования эффективного иммунного ответа на опухоль является индукция CD8+CTL. Индукция происходит за счет распознавания CD8+CTL процесированных антигенных пептидных фрагментов в ассоциации с молекулами ГКГС класса I на поверхности АПК. Антигенные пептиды образуются в цитоплазме клетки в результате расщепления антигенов протеасомами. Протеасомы представляют собой комплекс из 12-15 различных регуляторных и протеолитических белковых субъединиц (Rock KL and Goldberg AL, 1999, Annu. Rev. Immunol, 17:739-779; Niedermann G et al., 1999. Immimol. Rev, 172:29-48). Помимо констутивной протеасомы, существует иммунопротеасома, сборка которой в клетке начинается после стимуляции ее γ-интерфероном. Считается, что в отличие от констутивной, иммунопротеасома генерирует пептиды, которые в последующем используются в презентации антигена в комплексах с молекулами ГКГС класса I, так как пептиды, генерируемые иммунопротеасомой, не подвергаются дальнейшей деградации клеточными пептидазами, а используются в презентации антигена.One of the mechanisms for the formation of an effective immune response to a tumor is the induction of CD8 + CTL. Induction occurs due to recognition of the CD8 + CTL of the processed antigenic peptide fragments in association with MHC class I molecules on the surface of the APC. Antigenic peptides are formed in the cytoplasm of a cell as a result of the cleavage of antigens by proteasomes. Proteasomes are a complex of 12-15 different regulatory and proteolytic protein subunits (Rock KL and Goldberg AL, 1999, Annu. Rev. Immunol, 17: 739-779; Niedermann G et al., 1999. Immimol. Rev, 172: 29 -48). In addition to the constitutive proteasome, there is an immunoproteasome, the assembly of which in the cell begins after its stimulation with γ-interferon. It is believed that, unlike constituent, the immunoproteasome generates peptides, which are subsequently used in the presentation of the antigen in complexes with MHC class I molecules, since the peptides generated by the immunoproteasome are not further degraded by cellular peptidases, but are used in the presentation of the antigen.

Образование комплексов антигенных пептидов с молекулами ГКГС класса I происходит в эндоплазматическом ретикулуме, куда пептиды попадают с участием гетеродимерных транспортных белков, кодируемых двумя генами TAP1 и TAP2. Наиболее эффективный перенос происходит в том случае, если пептиды содержат 8-15 аминокислотных остатков. После образования комплекса антигенный пептид - молекула ГКГС класса I, готовый комплекс переносится на поверхность АПК.The formation of complexes of antigenic peptides with MHC class I molecules occurs in the endoplasmic reticulum, where the peptides enter with the participation of heterodimeric transport proteins encoded by the two genes TAP1 and TAP2. The most effective transfer occurs if the peptides contain 8-15 amino acid residues. After the formation of the complex, the antigenic peptide is a MHC class I molecule, the finished complex is transferred to the surface of the APC.

Согласно приведенным выше данным, отобранные нами CTL-эпитопы, были предсказаны с учетом протеасомного процессинга. Для этого использовали программу NetChop (IEDB Analysis Resource), основанную на нейронных сетях. А также, с учетом TAP-процессинга, для предсказания которого использовалась функция, предложенная Peters et al., 2003. Функция Peters добавляет к N-концу пептида A либо AY. Для объединения в единую конструкцию использовали случайное перемешивание эпитопов. При этом в составе полиэпитопного иммуногена эпитопы могут перекрываться между собой как минимум одним аминокислотным остатком. Два, три и более эпитопов могут последовательно (стык в стык) располагаться внутри полипептида. Альтернативно, любые два эпитопа могут разделяться спейсерами A, AA, AAA. Выбор типа объединения эпитопов определяется теоретическим предсказанием процессинга полиэпитопной конструкции согласно условиям описанным выше. При этом эпитопы внутри полипептидного иммуногена могут располагаться в произвольном порядке. Длина каждого эпитопа от 8 до 10 аминокислотных остатков, а суммарная полиэпитопная конструкция, ограничивается 1000 ак.According to the above data, the CTL epitopes selected by us were predicted taking into account proteasome processing. For this, we used the NetChop (IEDB Analysis Resource) program based on neural networks. And also, taking into account TAP processing, which was predicted using the function proposed by Peters et al., 2003. The Peters function adds peptide A or AY to the N-terminus. To combine into a single design used random mixing of epitopes. Moreover, in the composition of a polyepitope immunogen, epitopes can overlap with at least one amino acid residue. Two, three or more epitopes can be sequentially (joint to joint) located within the polypeptide. Alternatively, any two epitopes may be separated by spacers A, AA, AAA. The choice of the type of association of epitopes is determined by the theoretical prediction of the processing of the polyepitope construct according to the conditions described above. In this case, the epitopes inside the polypeptide immunogen can be arranged in random order. The length of each epitope is from 8 to 10 amino acid residues, and the total polyepitope construction is limited to 1000 ac.

Соответственно, различные аспекты настоящего изобретения относятся к следующим изобретениям:Accordingly, various aspects of the present invention relate to the following inventions:

1. Иммуногенный полипептид для лечения или профилактики рака, содержащий по меньшей два пептида, каждый из которых содержит 9 последовательных аминокислот, представляющих участки последовательностей белков HER-2/neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53, где указанные последовательности выбраны с учетом эффективности протеасомного/иммунопротеасомного процессинга, взаимодействия антигенных пептидов с TAP1/TAP2.1. An immunogenic polypeptide for the treatment or prevention of cancer, containing at least two peptides, each of which contains 9 consecutive amino acids representing portions of the sequences of the proteins HER-2 / neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1 , telomerase, survivin, p53, where these sequences are selected taking into account the effectiveness of proteasome / immunoproteasome processing, the interaction of antigenic peptides with TAP1 / TAP2.

2. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит по меньшей мере по одному пептиду каждого из белков: HER-2/neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53.2. The immunogenic polypeptide according to claim 1, characterized in that said polypeptide contains at least one peptide of each of the proteins: HER-2 / neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase , survivin, p53.

3. Иммуногенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанные пептиды выбраны из группы, состоящей из пептидов SEQ ID NO: 1-9 белка HER-2/neu, SEQ ID NO: 10-16 белка mammaglobin-A, SEQ ID NO: 17-46 белка NY-BR-1, SEQ ID NO: 47-58 белка hMena (ENAH), SEQ ID NO: 59-68 белка WT1, SEQ ID NO: 69-92 белка telomerase, SEQ ID NO: 93 белка survivin, SEQ ID NO: 94-104 белка p53.3. The immunogenic polypeptide according to claim 1, characterized in that said peptides are selected from the group consisting of peptides SEQ ID NO: 1-9 of HER-2 / neu protein, SEQ ID NO: 10-16 of mammaglobin-A protein, SEQ ID NO: 17-46 protein NY-BR-1, SEQ ID NO: 47-58 protein hMena (ENAH), SEQ ID NO: 59-68 protein WT1, SEQ ID NO: 69-92 protein telomerase, SEQ ID NO: 93 survivin protein, SEQ ID NO: 94-104 of p53 protein.

4. Рекомбинантный белок по п.1, представляющий собой белок SEQ ID NO: 105 или SEQ ID NO: 106.4. The recombinant protein according to claim 1, which is a protein of SEQ ID NO: 105 or SEQ ID NO: 106.

5. Молекула ДНК, кодирующая иммуногенный полипептид согласно любому из пп.1-3.5. A DNA molecule encoding an immunogenic polypeptide according to any one of claims 1 to 3.

6. Экспрессионная плазмида, содержащая молекулу ДНК по п.5.6. The expression plasmid containing the DNA molecule according to claim 5.

7. Экспрессионная плазмида по п.6, отличающийся тем, что указанная плазмида выбрана из группы состоящей из плазмид pDNA5-BCA020-v.1 и pDNA5-BCA020-v.2.7. The expression plasmid according to claim 6, characterized in that said plasmid is selected from the group consisting of plasmids pDNA5-BCA020-v.1 and pDNA5-BCA020-v.2.

8. Антигенпрезентирующая клетка, презентирующая пептиды HER-2/neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53, трансфицированная экспрессионной плазмидой по любому из пп.6-7.8. Antigen-presenting cell presenting the peptides HER-2 / neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53, transfected with the expression plasmid according to any one of claims 6 to 7.

9. Антигенпрезентирующая клетка по п.8, представляющая собой дендритную клетку человека.9. The antigen-presenting cell of claim 8, which is a human dendritic cell.

10. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая дендритные клетки человека по п.8 и фармацевтически приемлемый носитель.10. A pharmaceutical composition for treating or preventing cancer, comprising the human dendritic cells of claim 8 and a pharmaceutically acceptable carrier.

11. Антигенпрезентирующая клетка, презентирующая пептиды HER-2/neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53, полученная путем приведения Т-клеток в контакт с полипептидом по п.(1);11. Antigen-presenting cell presenting the peptides HER-2 / neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53, obtained by contacting T cells with the polypeptide according to ( one);

12. Способ индукции эффекторных Т-клеток, специфичных к опухолевым клеткам с гаплотипом HLA-A*0201, включающий введение в контакт Т-клеток с клетками по п.8 или 9 или с полипептидом по п.1.12. A method of inducing effector T cells specific for tumor cells with the HLA-A * 0201 haplotype, comprising contacting the T cells with cells of claim 8 or 9 or with the polypeptide of claim 1.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что контактирование Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками проводят in vitro или ex vivo.13. The method according to p. 12, characterized in that the contacting of T cells with antigen-presenting cells is carried out in vitro or ex vivo.

14. Эффекторная Т-клетка, полученная способом по п.12 или 13.14. Effector T cell obtained by the method according to item 12 or 13.

15. Способ лечения или профилактики рака у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества антигенпрезентирующих клеток по п.11 или эффекторных Т-клеток по п.14.15. A method of treating or preventing cancer in a subject, comprising administering to the subject an effective amount of antigen-presenting cells according to claim 11 or effector T cells according to 14.

16. Способ лечения по п.15, отличающийся тем, что указанный субъект имеет гаплотип HLA-A*0201.16. The treatment method according to p. 15, characterized in that said subject has an HLA-A * 0201 haplotype.

17. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики рака, содержащая эффективное количество полипептида по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.17. A pharmaceutical composition for treating or preventing cancer, comprising an effective amount of a polypeptide according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

18. Способ лечения или профилактики рака у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по п.17.18. A method for treating or preventing cancer in a subject, comprising administering to the subject a pharmaceutical composition according to claim 17.

19. Способ лечения или профилактики рака у субъекта, в котором введение осуществляют путем инъекции.19. A method of treating or preventing cancer in a subject in which administration is by injection.

Таким образом, разработана стратегия создания ДНК-вакцинных конструкций, содержащих полиэпитопные иммуногены для индукции антиген-специфического иммунного ответа у больных раком молочной железы. Одним из примеров полиэпитопных иммуногенов, содержащих антигенные детерминанты, специфичные белкам HER-2/neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53 с учетом эффективности протеасомного/иммунопротеасомного процессинга, взаимодействия антигенных пептидов с TAP1/TAP2 с целью увеличения эффективности презентации эпитопов на поверхности АПК по сравнению с использованием нативных АГ, является:Thus, a strategy has been developed to create DNA vaccine constructs containing polyepitope immunogens to induce an antigen-specific immune response in patients with breast cancer. One example of polyepitope immunogens containing antigenic determinants specific for HER-2 / neu, mammaglobin-A, NY-BR-1, hMena (ENAH), WT1, telomerase, survivin, p53 proteins, taking into account the effectiveness of proteasome / immunoproteasome processing, antigenic interaction peptides with TAP1 / TAP2 in order to increase the efficiency of the presentation of epitopes on the surface of the APC compared with the use of native AG, is:

Полиэпитопный иммуноген 1:Polyepitopic immunogen 1:

Полиэпитопный иммуноген 2:Polyepitope immunogen 2:

Специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение, ясно, что данное изобретение может быть воплощено в иных формах, нежели изложенные выше, не отступая при этом от сущности и основных характеристик изобретения. Следовательно, изложенные выше конкретные варианты изобретения следует рассматривать как иллюстрирующие, но не ограничивающие. Кроме того, следует понимать, что процедуры и материалы, не описанные конкретно в данной заявки являются стандартными процедурами и материалами, известными специалисту. Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления. Следует понимать, что указанные примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не предполагают какого-либо ограничения объема предложенного изобретения.Specialists in the field of technology to which the present invention relates, it is clear that this invention can be embodied in other forms than those described above, without departing from the essence and main characteristics of the invention. Therefore, the above specific embodiments of the invention should be considered as illustrative, but not limiting. In addition, it should be understood that the procedures and materials not specifically described in this application are standard procedures and materials known to the person skilled in the art. For a better understanding of the invention, the following are examples of its implementation. It should be understood that these examples are provided for illustrative purposes only and do not imply any limitation on the scope of the proposed invention.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

В данной работе использовали протокол получения активированных ДНК-вакцинами, содержащими полиэпитопные иммуногены, дендритных клеток (ДК) и пула обученных и размноженных ex vivo цитотоксических Т-лимфоцитов, с целью формирования полноценного противоракового иммунного ответа in vivo.In this work, we used the protocol for obtaining activated DNA vaccines containing polyepitope immunogens, dendritic cells (DC) and a pool of trained and expanded ex vivo cytotoxic T lymphocytes in order to formulate a full-fledged anti-cancer immune response in vivo.

Для полученных полиэпитопных иммуногенов были созданы соответствующие искусственные гены. Полинуклеотидные последовательности были оптимизированы для экспрессии в клетках человека, для чего из искусственных генов были исключены редко используемые кодоны. Дизайн нуклеотидных последовательностей проводили с таким расчетом, чтобы минимизировать сложность вторичной структуры матричной РНК.For the obtained polyepitope immunogens, corresponding artificial genes were created. Polynucleotide sequences were optimized for expression in human cells, for which rarely used codons were excluded from artificial genes. The design of nucleotide sequences was carried out in such a way as to minimize the complexity of the secondary structure of messenger RNA.

Для создания ДНК-вакцинных конструкций с использованием полученных искусственных генов была выбрана плазмида pDNAVACC-Ultra (pDNAVACC5, NBC, USA, http://www.natx.com/). Также была создана контрольная конструкция pDNAVACC-ErbB2, содержащая последовательность, кодирующую цельный белок ErbB2 (положительный контроль). В качестве отрицательного контроля также использовалась плазмида pDNAVACC5.To create DNA vaccine constructs using the obtained artificial genes, the plasmid pDNAVACC-Ultra (pDNAVACC5, NBC, USA, http://www.natx.com/) was selected. A pDNAVACC-ErbB2 control construct was also created containing a sequence encoding the whole ErbB2 protein (positive control). Plasmid pDNAVACC5 was also used as a negative control.

Были созданы три конструкции:Three designs were created:

1) pDNA5-BCA020-v.1 - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей полиэпитопный иммуноген 1;1) pDNA5-BCA020-v.1 - plasmid pDNAVACC with an integrated sequence encoding a polyepitope immunogen 1;

2) pDNA5-BCA0201-v.2 - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей иммуноген 2;2) pDNA5-BCA0201-v.2 - plasmid pDNAVACC with a built-in sequence encoding immunogen 2;

3) pDNA5-HER2 - плазмида pDNAVACC со встроенной последовательностью, кодирующей белок ErbB2.3) pDNA5-HER2 - plasmid pDNAVACC with an integrated sequence encoding an ErbB2 protein.

Далее проводилась оценка эффективности индукции T-клеточного ответа in vitro с помощью полученных полиэпитопных конструкций.Next, we evaluated the effectiveness of the induction of the T-cell response in vitro using the obtained polyepitope constructs.

ДК получали из адгезирующей фракции мононуклеаров периферической крови условно-здоровых доноров с подтвержденным наличием аллеля HLA-A0201 [Jarnjak-Jankovic et al., 2007; Tanaka et al., 2006; Obermaier et al., 2003]. Для введения генетических конструкций, кодирующих специфичные для гаплотипа HLA-A0201 полиэпитопные иммуногены, мы использовали метод магнитной трансфекции, основанный на проникновении магнитных наночастиц со связанной плазмидной ДНК в клетки под воздействием магнитного поля.DK was obtained from the adhesion fraction of peripheral blood mononuclear cells of conditionally healthy donors with the confirmed presence of the HLA-A0201 allele [Jarnjak-Jankovic et al., 2007; Tanaka et al., 2006; Obermaier et al., 2003]. To introduce genetic constructs encoding HLA-A0201 haplotype-specific polyepitope immunogens, we used a magnetic transfection method based on the penetration of magnetic nanoparticles with bound plasmid DNA into cells under the influence of a magnetic field.

Цитотоксический потенциал Т-лимфоцитов культивируемых совместно с фракциями активированных ДК оценивали в неспецифическом тесте по стимуляции продукции перфориновых гранул в мононуклеарных клетках, а также по специфическому цитотоксическому ответу против опухолевой клеточной линии MCF-7, несущей на своей поверхности маркеры, которые должны распознаваться обученными цитотоксическими Т-лимфоцитами. В результате было установлено достоверное увеличение количества клеток, несущих перфориновые гранулы, для групп с ДК, трансфецированными плазмидными ДНК pDNA5-BCA020-v.1, pDNA5-BCA020-v.2, pDNA5-HER-2. При добавлении в совместную культуру цитокинов ИЛ-12 и ИЛ-18 отмечалось повышение содержания перфорина, для групп с трансфекцией плазмидами pDNA5-BCA020-v.1, pDNA5-BCA020-v.2, кодирующими специфичные для HLA-A0201 полиэпитопные иммуногены, были получены достоверные различия по сравнению с контрольными группами. Результаты представлены на Фиг.1.The cytotoxic potential of T-lymphocytes cultivated together with activated DC fractions was evaluated in a non-specific test to stimulate the production of perforin granules in mononuclear cells, as well as by the specific cytotoxic response against the tumor cell line MCF-7, which carries markers on its surface that must be recognized by trained cytotoxic T lymphocytes. As a result, a significant increase in the number of cells carrying perforin granules was found for groups with DC transfected with plasmid DNA pDNA5-BCA020-v.1, pDNA5-BCA020-v.2, pDNA5-HER-2. When cytokines IL-12 and IL-18 were added to the joint culture, an increase in perforin content was noted, for groups with transfection with plasmids pDNA5-BCA020-v.1, pDNA5-BCA020-v.2 encoding HLA-A0201 specific polyepitope immunogens, we obtained significant differences compared with control groups. The results are presented in figure 1.

В качестве специфического теста использовали анализ содержания ЛДГ, высвобождаемой в среду при гибели опухолевых клеток, после совместного культивирования совместной фракции ДК и Т-лимфоцитов с культурой опухолевых клеток.As a specific test, an analysis of the content of LDH released into the medium upon the death of tumor cells was used after co-cultivation of a joint fraction of DC and T-lymphocytes with a tumor cell culture.

Проведенные эксперименты показали достоверное повышение цитотоксического индекса в отношении клеточной линии MCF-7 в группах с ДК трансфецированными pDNA5-BCA020-v.1, pDNA5-BCA020-v.2, специфичные для HLA-A0201 полиэпитопные иммуногены, по сравнению с контрольными группами. Кроме того, в группах pDNA5-BCA020-v.1, pDNA5-BCA020-v.2 было отмечено достоверное повышение цитотоксического ответа при добавлении в совместную культуру Т-лимфоцитов и ДК иммунорегуляторных цитокинов ИЛ-12 и ИЛ-18.The experiments showed a significant increase in the cytotoxic index in relation to the MCF-7 cell line in groups with DC transfected with pDNA5-BCA020-v.1, pDNA5-BCA020-v.2, specific for HLA-A0201 polyepitope immunogens, compared to control groups. In addition, in the groups pDNA5-BCA020-v.1, pDNA5-BCA020-v.2, a significant increase in the cytotoxic response was noted when T-lymphocytes and DCs of immunoregulatory cytokines IL-12 and IL-18 were added to the joint culture.

Таким образом, в ходе проведения исследования показано, что полученные по протоколу из моноцитов трансфецированные ДК способны презентировать антигены аутологичным мононуклеарным клеткам, после чего последние приобретают повышенный цитотоксический потенциал за счет накопления в цитоплазме гранул перфорина и непосредственно оказывают специфический цитотоксический эффект на клеточную линию, несущую на своей поверхности молекулы мишени. Использование трансфекции плазмидой, кодирующей цельный белок Her-2/neu, оказалось менее эффективным, поскольку в тестах по оценке содержания перфорина при добавлении цитокинов данная группа не отличалась от групп контроля, а в эксперименте с клеточной линией MCF-7 оказалась неэффективна. Таким образом, еще раз подтверждается эффективность использования уникальных полиэпитопных конструкций, содержащих набор специфических полиэпитопных иммуногенов.Thus, during the study, it was shown that transfected DCs obtained according to the protocol from monocytes are capable of presenting antigens to autologous mononuclear cells, after which the latter acquire an increased cytotoxic potential due to the accumulation of perforin granules in the cytoplasm and directly have a specific cytotoxic effect on the cell line carrying its surface target molecules. The use of transfection with a plasmid encoding the whole Her-2 / neu protein turned out to be less effective, since this group did not differ from the control groups in tests for assessing the perforin content when cytokines were added, and in the experiment with the MCF-7 cell line was ineffective. Thus, the effectiveness of using unique polyepitope constructs containing a set of specific polyepitope immunogens is once again confirmed.

ЛитератураLiterature

1. Basha HI, Tiriveedhi V, Fleming ТР., Gillanders WE & Mohanakumar T. Identification of immunodominant HLA-B7-restricted CD8⁺ cytotoxic T cell epitopes derived from mammaglobin-A expressed on human breast cancers. Breast Cancer Research And Treatment 2011. 127, 1, 81-89.1. Basha HI, Tiriveedhi V, Fleming TR., Gillanders WE & Mohanakumar T. Identification of immunodominant HLA-B7-restricted CD8 ⁺ cytotoxic T cell epitopes derived from mammaglobin-A expressed on human breast cancers. Breast Cancer Research And Treatment 2011. 127, 1, 81-89.

2. Becker JC, Wobser M, Hofmeister V, Bauer В, Broecker ЕВ, thor Straten P, Andersen MH. Safety, immunogenicity, and clinical response of a survivin-based peptide vaccine in therapy-resistant advanced cancer: Results from a phase I/II trial. J Clin Oncol. 2008, 26:3046.2. Becker JC, Wobser M, Hofmeister V, Bauer B, Broecker EB, thor Straten P, Andersen MH. Safety, immunogenicity, and clinical response of a survivin-based peptide vaccine in therapy-resistant advanced cancer: Results from a phase I / II trial. J Clin Oncol. 2008, 26: 3046.

3. Benavides LC, Gates JD, Carmichael MG, Patil R, Patel R, Holmes JP, Hueman MT, Mittendorf Ea, Craig D, Stojadinovic A, Ponniah S & Peoples GE The impact of HER2/neu expression level on response to the E75 vaccine: from U.S. Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 2009; 15:2895-904.3. Benavides LC, Gates JD, Carmichael MG, Patil R, Patel R, Holmes JP, Hueman MT, Mittendorf Ea, Craig D, Stojadinovic A, Ponniah S & Peoples GE The impact of HER2 / neu expression level on response to the E75 vaccine: from US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research 2009; 15: 2895-904.

4. Bernhard H, Salazar L, Schiffman K, Smorlesi a, Schmidt B, Knutson KL & Disis ML Vaccination against the HER-2/neu oncogenic protein. Endocrine-related Cancer 2002; 9:33-44.4. Bernhard H, Salazar L, Schiffman K, Smorlesi a, Schmidt B, Knutson KL & Disis ML Vaccination against the HER-2 / neu oncogenic protein. Endocrine-related Cancer 2002; 9: 33-44.

5. Dario С.Altier. Survivin, cancer networks and pathway-directed drug discovery. Nat Rev Cancer. 2008. 8(1):61-70.5. Dario C. Altier. Survivin, cancer networks and pathway-directed drug discovery. Nat Rev Cancer. 2008.8 (1): 61-70.

6. Di Modugno F, Mottolese M, Benedetto AD, Conidi A, Novelli F, Perracchio L, Venturo I, Botti C, Jager E, Santoni A, Natali PG & Nistico P. The cytoskeleton regulatory protein hMena (ENAH) is overexpressed in human benign breast lesions with high risk of transformation and human Epidermal Growth factor receptor-2-positive/hormonal receptor -negative tumors. Clin Cancer Res 2006. 12(5): 1470-8.6. Di Modugno F, Mottolese M, Benedetto AD, Conidi A, Novelli F, Perracchio L, Venturo I, Botti C, Jager E, Santoni A, Natali PG & Nistico P. The cytoskeleton regulatory protein hMena (ENAH) is overexpressed in human benign breast lesions with high risk of transformation and human Epidermal Growth factor receptor-2-positive / hormonal receptor -negative tumors. Clin Cancer Res 2006.12 (5): 1470-8.

7. Di Modugno F, Mottolese M, DeMonte L, Trono P, Balsamo M, Conidi A, Melucci E, Terrenato I, Belleudi F, Torrisi MR, Alessio M, Santoni A, Nisticò P. The cooperation between hMena overexpression and HER2 signalling in breast cancer. PLoS One. 2010 5(12):e15852.7. Di Modugno F, Mottolese M, DeMonte L, Trono P, Balsamo M, Conidi A, Melucci E, Terrenato I, Belleudi F, Torrisi MR, Alessio M, Santoni A, Nisticò P. The cooperation between hMena overexpression and HER2 signalling in breast cancer. Plos one. 2010 5 (12): e15852.

8. Disis ML, Goodell V, Schiffman K, Knutson KL. Humoral epitope-spreading following immunization with a HER-2/neu peptide based vaccine in cancer patients. J Clin Immunol. 2004 24(5):571-8.8. Disis ML, Goodell V, Schiffman K, Knutson KL. Humoral epitope-spreading following immunization with a HER-2 / neu peptide based vaccine in cancer patients. J Clin Immunol. 2004 24 (5): 571-8.

9. Disis ML, Shiota FM, Cheever MA. Human HER-2/neu protein immunization circumvents tolerance to rat neu: a vaccine strategy for 'self' tumour antigens. Immunology. 1998 93(2); 192-9.9. Disis ML, Shiota FM, Cheever MA. Human HER-2 / neu protein immunization circumvents tolerance to rat neu: a vaccine strategy for 'self' tumor antigens. Immunology 1998 93 (2); 192-9.

10. Disis, M.L., and M.A. Cheever. HER-2/neu protein: a target for antigen specific immunotherapy of human cancer. Adv. Cancer Res. 1997; 71:343.10. Disis, M.L., and M.A. Cheever. HER-2 / neu protein: a target for antigen specific immunotherapy of human cancer. Adv. Cancer Res. 1997; 71: 343.

11. Harari D & Yarden Y Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer. Oncogene 2000; 19:6102-14,11. Harari D & Yarden Y Molecular mechanisms underlying ErbB2 / HER2 action in breast cancer. Oncogene 2000; 19: 6102-14,

12. Hung, K., R. Hayashi, A. Lafond-Walker, C. Lowenstein, D. Pardoll, and H. Levitsky. The central role of CD4+Т cells in the antitumor immune response. J. Exp. Med. 1998; 188:2357.12. Hung, K., R. Hayashi, A. Lafond-Walker, C. Lowenstein, D. Pardoll, and H. Levitsky. The central role of CD4 + T cells in the antitumor immune response. J. Exp. Med. 1998; 188: 2357.

13. Inderberg-Suso EM, Trachsel S, Lislerud K, Rasmussen AM, Gaudemack G. Widespread CD4+T-cell reactivity to novel hTERT epitopes following vaccination of cancer patients with a single hTERT peptide GV1001. Oncoimmunology. 2012 1(5): 670-686.13. Inderberg-Suso EM, Trachsel S, Lislerud K, Rasmussen AM, Gaudemack G. Widespread CD4 + T-cell reactivity to novel hTERT epitopes following vaccination of cancer patients with a single hTERT peptide GV1001. Oncoimmunology. 2012 1 (5): 670-686.

14. Jäger D, Karbach J, Pauligk C. Seil. Frei C, Chen YT, Old LJ, Knuth A, Jäger E. Humoral and cellular immune responses against the breast cancer antigen NY-BR-1: definition of two HLA-A2 restricted peptide epitopes. Cancer Immun. 2005. 12; 5:11.14. Jäger D, Karbach J, Pauligk C. Seil. Frei C, Chen YT, Old LJ, Knuth A, Jäger E. Humoral and cellular immune responses against the breast cancer antigen NY-BR-1: definition of two HLA-A2 restricted peptide epitopes. Cancer Immun. 2005.12; 5:11.

15. Li Y, Matsueda S, Efferson CL, Tsuda N, Kawano K, Gao H, Peoples GE, Ioannides CG. Distinct patient responses to activation of T-cells by free HER-2, G89 (777-789) and protected LRMK-linked HER-2, {AE-39 [p776 (Ava-774-788)], AE-47 [(Ava-776-788)] and AE-37 [p776 (774-788)]} peptides could lead to development of personalized cancer vaccines. Anticancer Res. 2009 Jan; 29(1):41-58.15. Li Y, Matsueda S, Efferson CL, Tsuda N, Kawano K, Gao H, Peoples GE, Ioannides CG. Distinct patient responses to activation of T-cells by free HER-2, G89 (777-789) and protected LRMK-linked HER-2, {AE-39 [p776 (Ava-774-788)], AE-47 [( Ava-776-788)] and AE-37 [p776 (774-788)]} peptides could lead to development of personalized cancer vaccines. Anticancer Res. 2009 Jan; 29 (1): 41-58.

16. Marzo, A.L., B.F. Kinnear, R.A. Lake, J.J. Frelinger, E.J. Collins, B.W. Robinson, and B. Scott. Tumor-specific CD4+Т cells have a major "post-licensing" role in CTL mediated anti-tumor immunity J. Immunol 2000; 165:60.16. Marzo, A.L., B.F. Kinnear, R.A. Lake, J.J. Frelinger, E.J. Collins, B.W. Robinson, and B. Scott. Tumor-specific CD4 + T cells have a major "post-licensing" role in CTL mediated anti-tumor immunity J. Immunol 2000; 165: 60.

17. Mittendorf E.A., Holmes J.P., Ponniah S., Peoples G.E. The E75 HER2/neu peptide vaccine. Cancer Immunol Immunother. 2008; 57(10):1511-21.17. Mittendorf E.A., Holmes J.P., Ponniah S., Peoples G.E. The E75 HER2 / neu peptide vaccine. Cancer Immunol Immunother. 2008; 57 (10): 1511-21.

18. Narayanan K, Jaramillo A, Benshoff ND, Campbell LG., Fleming ТР., Dietz JR., Mohanakumar T. Response of established human breast tumors to vaccination with mammaglobin-a cDNA. Journal of the National Cancer Institute, 2004. 96, 18.18. Narayanan K, Jaramillo A, Benshoff ND, Campbell LG., Fleming TR., Dietz JR., Mohanakumar T. Response of established human breast tumors to vaccination with mammaglobin-a cDNA. Journal of the National Cancer Institute, 2004. 96, 18.

19. Pardoll, D. M., and S. L. Topalian The role of CD4+T cell responses in antitumor immunity. Curr. Opin. Immunol. 1998; 10:588.19. Pardoll, D. M., and S. L. Topalian The role of CD4 + T cell responses in antitumor immunity. Curr. Opin. Immunol. 1998; 10: 588.

20. Peters В, Bulik S, Tampe R. Van Endert PM & Holzhutter Ню Identifying ГКГС class I epitopes by predicting the TAP transport efficiency of epitope precursors. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 2003. 171, 1741-9.20. Peters B, Bulik S, Tampe R. Van Endert PM & Holzhutter Nude Identifying HCHS class I epitopes by predicting the TAP transport efficiency of epitope precursors. Journal of immunology (Baltimore, Md .: 1950). 2003.171, 1741-9.

21. Qin, Z., and T. Blankenstein. CD4+Т cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN_ receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity 2000; 12:677.21. Qin, Z., and T. Blankenstein. CD4 + T cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN_ receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity 2000; 12: 677.

22. Ross JS, Slodkowska Ea, Symmans WF, Pusztai L, Ravdin PM & Hortobagyi GN The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. The Oncologist 2009; 14:320-68.22. Ross JS, Slodkowska Ea, Symmans WF, Pusztai L, Ravdin PM & Hortobagyi GN The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. The Oncologist 2009; 14: 320-68.

23. Salazar LG, Fikes J, Southwood S, Ishioka G, Knutson KL, Gooley ТА, Schiffman K, Disis ML. Immunization of cancer patients with HER-2/neu-derived peptides demonstrating high-affinity binding to multiple class II alleles. Clin Cancer Res. 2003 15; 9(15):5559-65.23. Salazar LG, Fikes J, Southwood S, Ishioka G, Knutson KL, Gooley TA, Schiffman K, Disis ML. Immunization of cancer patients with HER-2 / neu-derived peptides demonstrating high-affinity binding to multiple class II alleles. Clin Cancer Res. 2003 15; 9 (15): 5559-65.

24. Seiji Fukuda & Louis M. Pelus. Survivin, a cancer target with an emerging role in normal adult tissues. Mol Cancer Ther. 2006.5(5): 1087-98.24. Seiji Fukuda & Louis M. Pelus. Survivin, a cancer target with an emerging role in normal adult tissues. Mol Cancer Ther. 2006.5 (5): 1087-98.

25. Seil I, Frei C, Sultmann H, Knauer SK, Engels K, Jager E, Zatloukal K. Pfreundschuh M, Knuth A, Tseng-Chen Y, Jungbluth AA, Stauber RH & Jager D. The differentiation antigen NY-BR-1 is a potential target for antibody-based therapies in breast cancer. Int. J. Cancer. 2007. 120, 2635-2642.25. Seil I, Frei C, Sultmann H, Knauer SK, Engels K, Jager E, Zatloukal K. Pfreundschuh M, Knuth A, Tseng-Chen Y, Jungbluth AA, Stauber RH & Jager D. The differentiation antigen NY-BR- 1 is a potential target for antibody-based therapies in breast cancer. Int. J. Cancer. 2007.120, 2635-2642.

26. Sugiyama W. WT1 (Wilms' Tumor Gene 1): Biology and Cancer Immunotherapy. Jpn J Clin Oncol. 2010. 40(5)377-387.26. Sugiyama W. WT1 (Wilms' Tumor Gene 1): Biology and Cancer Immunotherapy. Jpn J Clin Oncol. 2010.40 (5) 377-387.

27. Theurillat JP, Zürrer-Härdi U, Varga Z, Storz M, Probst-Hensch NM, Seifert B, Fehr MK, Fink D, Fen-one S, Pestalozzi B, Jungbluth AA, Chen YT, Jäger D. Knuth A, Moch H. NY-BR-1 protein expression in breast carcinoma: a mammary gland differentiation antigen as target for cancer immunotherapy. Cancer Immunol Immunother. 2007. 56(11); 1723-31.27. Theurillat JP, Zürrer-Härdi U, Varga Z, Storz M, Probst-Hensch NM, Seifert B, Fehr MK, Fink D, Fen-one S, Pestalozzi B, Jungbluth AA, Chen YT, Jäger D. Knuth A, Moch H. NY-BR-1 protein expression in breast carcinoma: a mammary gland differentiation antigen as target for cancer immunotherapy. Cancer Immunol Immunother. 2007.56 (11); 1723-31.

28. Vazquez A, Bond ЕЕ, Levine AJ, Bond GL. The genetics of the p53 pathway, apoptosis and cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2008. 7(12):979-87.28. Vazquez A, Bond EE, Levine AJ, Bond GL. The genetics of the p53 pathway, apoptosis and cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2008.7 (12): 979-87.

29. Watson MA & Fleming TP Mammaglobin, a mammary-specific member of the uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer. Cancer Research 1996. 56, 860-865.29. Watson MA & Fleming TP Mammaglobin, a mammary-specific member of the uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer. Cancer Research 1996.56, 860-865.

30. Watson MA, Dintzis S, Darrow CM, Voss LE, DiPersio J, Jensen R, &and Fleming TP Mammaglobin expression in primary, metastatic, and occult breast cancer. Cancer Research 1999. 59, 3028-3031.30. Watson MA, Dintzis S, Darrow CM, Voss LE, DiPersio J, Jensen R, & and Fleming TP Mammaglobin expression in primary, metastatic, and occult breast cancer. Cancer Research 1999.59, 3028-3031.

Claims

1. An immunogenic polypeptide for stimulating an antitumor immune response in patients with breast cancer, containing SEQ ID NO: 105 or SEQ ID NO: 106.

2. A DNA molecule encoding an immunogenic polypeptide according to claim 1.