RU2584584C2

RU2584584C2 - System and device (versions) for cryopreservation of group oocytes and embryos of mammals by vitrification when used as hollow fibre

Info

Publication number: RU2584584C2
Application number: RU2014143797/10A
Authority: RU
Inventors: Галина Петровна Маленко; Екатерина Валерьевна Корниенко; Глеб Юрьевич Косовский
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2016-05-20
Also published as: RU2014143797A

Abstract

FIELD: instrumentation; animal breeding.

SUBSTANCE: group of inventions relates to cryopreservation of biological objects. Device for loading, vitrification and warming up of mammal embryos group when using as hollow fibre carrier consists of piece of hollow fibre with diameter of 180-200 mcm and capillary with diameter of 1.00-1.50 mm, length of 7.00-10.00 cm, with cone-shaped tip, which outer diameter does not exceed inner diameter of fibres. At that, section of hollow fibre is attached directly to disposable capillary by putting on of hollow fibre section on cone-shaped tip. System for cryopreservation group oocytes and embryos mammals consists of device for loading, vitrification and warming up of embryos group and container. At that, said container represents cylindrical thin-wall tube with length of 12.50-13.50 cm with diameter not exceeding 3 diameters of cover made from plastic mass, closed on one side, to which it is placed.

EFFECT: use of system for cryopreservation group oocytes and embryos mammals increases their yield after warming up.

9 cl, 7 dwg, 3 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области криоконсервации биологических объектов, то есть низкотемпературному, как правило, в условиях жидкого азота при - 196°C, хранению живых биологических объектов с возможностью восстановления их биологических функций после размораживания-отогревания. При этом для криоконсервации ооцитов, яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих наиболее предпочтительным оказывается метод витрификации, когда при охлаждении объекта вода, как внутриклеточная, так и в окружающей объект среде, минуя процесс кристаллизации, переходит из жидкого в стеклообразное состояние. Таким образом, изобретение может найти применение для криоконсервации ооцитов, яйцеклеток и находящихся на ранних стадиях развития эмбрионов млекопитающих при проведении фундаментальных научно-исследовательских работ, для сохранения генетического фонда редких и исчезающих видов животных, в технологии трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных, в области медицинских исследований.The technical field to which the invention relates. The invention relates to the field of cryopreservation of biological objects, that is, low-temperature, as a rule, in liquid nitrogen at -196 ° C, storage of living biological objects with the possibility of restoring their biological functions after thawing-warming. Moreover, for cryopreservation of oocytes, eggs and mammalian embryos, the vitrification method is most preferable when, when the object is cooled, water, both intracellular and in the environment surrounding the object, bypassing the crystallization process, passes from a liquid to a glassy state. Thus, the invention can be used for cryopreservation of oocytes, eggs and early stages of mammalian embryo development during basic research work, for conservation of the genetic stock of rare and endangered animal species, in technology for transplanting embryos of farm animals, in the field of medical research.

Часть 1. Устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна (УЗВО)Part 1. Device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber (UZVO)

Уровень техники. Витрификация осуществляется путем сверхбыстрого охлаждения объекта (порядка 15000-30000°C/мин), предварительно обработанного в растворах с высокой концентрацией веществ-криопротекторов, таких как, например, диметилсульфоксид (ДМСО), этиленгликоль (ЭГ), сахароза. Технически сверхвысокая скорость охлаждения достигается при прямом погружении в жидкий азот витрифицируемого объекта, общий объем которого не превышает 0,10 мкл. Этот прием называют метод охлаждения минимального объема (ОМО). В настоящее время разработано несколько моделей носителей, которые позволяют использовать этот метод при витрификации 1 или 2 эмбрионов. К ним относятся такие носители открытого типа, как Cryotop, Cryoloop, Cryoleaf, сеточки для электронной микроскопии, полусоломинки (1). Для одновременной витрификации нескольких эмбрионов было предложено использовать в качестве носителя кусочек бумаги (2). Однако при этом эмбрионы в растворах в процессе витрификации и отогревания обрабатываются индивидуально. Известен один метод, который позволяет проводить как обработку, так и витрификацию эмбрионов группой, основанный на использовании в качестве носителя полых волокон - the hollow fiber vitrification method (HFV method; 3, 4, 5, 6). В тексте описания метод витрификации в полых волокнах обозначен как метод ВПВ.The level of technology. Vitrification is carried out by ultra-fast cooling of the object (about 15000-30000 ° C / min), pre-treated in solutions with a high concentration of cryoprotectants, such as, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), sucrose. Technically, an ultra-high cooling rate is achieved by direct immersion in a liquid nitrogen of a vitrified object, the total volume of which does not exceed 0.10 μl. This technique is called the minimum volume cooling method (OMO). Currently, several carrier models have been developed that allow using this method for vitrification of 1 or 2 embryos. These include open-type carriers such as Cryotop, Cryoloop, Cryoleaf, nets for electron microscopy, half straws (1). For the simultaneous vitrification of several embryos, it was proposed to use a piece of paper as a carrier (2). However, in this case, embryos in solutions are individually processed during vitrification and heating. One method is known that allows both processing and vitrification of embryos by a group, based on the use of hollow fibers as the carrier — the hollow fiber vitrification method (HFV method; 3, 4, 5, 6). In the text of the description, the method of vitrification in hollow fibers is designated as the method of ERW.

При использовании метода ВПВ группа подлежащих витрификации эмбрионов помещается в просвет полого волокна и обрабатывается последовательно в ряде растворов как единое целое простым перемещением полого волокна из одной чашки Петри в другую при помощи пинцета. При этом расчетный объем, занимаемый, например, 10 эмбрионами свиньи в растворе эквилибрации внутри полого волокна, составляет 0,07 мкл, а затем в процессе обработки эмбрионов в растворе витрификации уменьшается примерно до 0,03 мкл, что позволяет при витрификации группы эмбрионов соблюдать требования метода ОМО. Описаны два устройства для витрификации группы эмбрионов по методу ВПВ: the hollow fiber vitrification device (HFV device) и the modified HFV device (3). HFV device, состоящее из отрезка полого волокна и инъекционной иглы, в тексте заявки обозначено как устройство для витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна, УВПВ. The modified HFV device, состоящее из отрезка полого волокна, канюли для периферических вен, защитного чехла и криопробирки, в тексте описания обозначено как модифицированное устройство для витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна, МУВПВ. Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является УВПВ.When using the ERW method, the group of embryos to be vitrified is placed in the lumen of the hollow fiber and processed sequentially in a number of solutions as a whole by simply moving the hollow fiber from one Petri dish to another with tweezers. In this case, the calculated volume occupied, for example, by 10 pig embryos in the equilibration solution inside the hollow fiber is 0.07 μl, and then during processing of the embryos in the vitrification solution it decreases to approximately 0.03 μl, which allows for the vitrification of the group of embryos to comply with OMO method. Two devices for the vitrification of a group of embryos by the ERW method are described: the hollow fiber vitrification device (HFV device) and the modified HFV device (3). The HFV device, consisting of a segment of a hollow fiber and an injection needle, is indicated in the application text as a device for vitrification when used as a carrier of a hollow fiber, UVPV. The modified HFV device, consisting of a segment of a hollow fiber, a cannula for peripheral veins, a protective cover and a cryovial, is indicated in the description as a modified device for vitrification when used as a carrier of a hollow fiber, MUVPV. The closest analogue of the claimed invention is UVPV.

Прототип устройства для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна (УЗВО).A prototype device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber (UZVO).

Прототипом предлагаемого устройства для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна является конструкция, состоящая из отрезка полого волокна и инъекционной иглы - УВПВ. В этом устройстве в качестве носителя использовались полые волокна из триацетата целлюлозы (cellulose triacetate hollow fiber; FP-150FH, Nipro Corporation, Osaka, Japan). Внутренний диаметр волокна составлял 185 мкм, толщина стенок волокна 15 мкм, величина пор 7,5 нм. Инъекционные иглы имели длину 5,00 мм, наружный диаметр 0,15 мм, внутренний диаметр 0,10 мм (Medical Planning, Miyagi, Japan).The prototype of the proposed device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a hollow fiber carrier is a structure consisting of a segment of a hollow fiber and an injection needle - UVPV. In this device, hollow fibers of cellulose triacetate (cellulose triacetate hollow fiber; FP-150FH, Nipro Corporation, Osaka, Japan) were used as a carrier. The inner diameter of the fiber was 185 μm, the wall thickness of the fiber was 15 μm, and the pore size was 7.5 nm. The injection needles had a length of 5.00 mm, an outer diameter of 0.15 mm, an inner diameter of 0.10 mm (Medical Planning, Miyagi, Japan).

Отрезок полого волокна длиной около 2,5 см надевали на инъекционную иглу. Затем на канюлю иглы надевали шприц емкостью 1 мл, к которому присоединяли аспирационную трубку (3). Группу эмбрионов помещали в чашку Петри с раствором эквилибрации. Используя аспирационную трубку эмбрионы аспирировали в просвет полого волокна, после чего полое волокно отсоединяли от иглы. Полое волокно с размещенными в его просвете эмбрионами при помощи пинцета переносили в чашку Петри с раствором витрификации. Затем полое волокно, удерживаемое пинцетом в вертикальном положении, погружали в жидкий азот, в котором выдерживали его около 2 минут. После этого полое волокно извлекали из жидкого азота, незамедлительно помещали в чашку Петри с раствором отогревания эмбрионов. Затем полое волокно переносили в чашку Петри с раствором разведения и последовательно в две чашки Петри с раствором отмывания эмбрионов. Во второй чашке Петри с раствором отмывания эмбрионы высвобождали из просвета полого волокна.A piece of hollow fiber about 2.5 cm long was put on an injection needle. Then, a 1 ml syringe was inserted onto the needle cannula, to which an aspiration tube (3) was attached. A group of embryos were placed in a Petri dish with an equilibrium solution. Using an aspiration tube, the embryos were aspirated into the lumen of the hollow fiber, after which the hollow fiber was disconnected from the needle. The hollow fiber with embryos placed in its lumen was transferred using tweezers to a Petri dish with a vitrification solution. Then, the hollow fiber held by the tweezers in an upright position was immersed in liquid nitrogen, in which it was held for about 2 minutes. After this, the hollow fiber was removed from liquid nitrogen, immediately placed in a Petri dish with a solution of heating the embryos. Then the hollow fiber was transferred to a Petri dish with a dilution solution and sequentially in two Petri dishes with an embryo wash solution. In the second Petri dish with the washing solution, the embryos were released from the lumen of the hollow fiber.

Данное УВПВ было применено для витрификации эмбрионов мыши и свиньи. Не зависимо от исходной стадии развития, все витрифицированные эмбрионы мыши после отогревания были жизнеспособны. По дальнейшему развитию при культивировании и при трансплантации реципиентам эти эмбрионы не отличались от контрольной группы эмбрионов, не подвергавшихся витрификации. Кроме того, трансплантация витрифицированных при использовании УВПВ эмбрионов свиньи обеспечила рождение молодняка (3, 4). При витрификации эмбрионов крупного рогатого скота на стадии бластоцисты, через 48 часов после отогревания восстановили свой объем 86% эмбрионов (5). 80% эмбрионов крупного рогатого скота, витрифицированных на стадии морулы, после отогревания достигли стадии бластоцисты (6). Таким образом, было показано, что УВПВ пригодно для загрузки группы эмбрионов в отрезок полого волокна, проведения этапа витрификации и последующего их отогревания.This UVPV was used to vitrify mouse and pig embryos. Regardless of the initial stage of development, all vitrified mouse embryos after heating were viable. According to their further development during cultivation and transplantation to recipients, these embryos did not differ from the control group of embryos that did not undergo vitrification. In addition, transplantation of pig embryos vitrified with the use of UVVP ensured the birth of young animals (3, 4). During vitrification of cattle embryos at the blastocyst stage, 86% of embryos restored their volume 48 hours after warming (5). 80% of cattle embryos vitrified at the morula stage, after warming, reached the blastocyst stage (6). Thus, it was shown that UVPV is suitable for loading a group of embryos into a segment of a hollow fiber, conducting the stage of vitrification and their subsequent heating.

Недостатком УВПВ является использование инъекционной иглы в качестве переходного элемента между отрезком полого волокна и шприцом для присоединения аспирационной трубки. Были использованы инъекционные иглы длиной 5,00 мм, имеющие наружный диаметр 0,15 мм, внутренний диаметр 0,10 мм (Medical Planning, Miyagi, Japan). Инъекционные иглы с такими характеристиками мало распространены. Эти иглы дорогие, поэтому используются многократно. В процессе использования УВПВ инъекционные иглы контактируют с раствором эквилибрации, вследствие чего они требуют отмывания.The disadvantage of UVPV is the use of an injection needle as a transition element between the length of the hollow fiber and the syringe for attaching the suction tube. 5.00 mm long injection needles having an outer diameter of 0.15 mm and an inner diameter of 0.10 mm were used (Medical Planning, Miyagi, Japan). Injection needles with such characteristics are not common. These needles are expensive, so they are used repeatedly. In the process of using UVPV, injection needles are in contact with an equilibrium solution, as a result of which they require washing.

Задачей изобретения являлось создание устройства для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов, исключающего необходимость применения инъекционной иглы, в котором переходный элемент для соединения полого волокна с аспирационной трубкой представляет собой одну деталь, доступную, не дорогую, удобную при использовании, одноразовую.The objective of the invention was to provide a device for loading, vitrifying and heating a group of embryos, eliminating the need for an injection needle, in which the transition element for connecting the hollow fiber to the suction tube is one part, accessible, not expensive, convenient to use, disposable.

Сущность изобретения - устройство (УЗВО), в котором отрезок полого волокна крепится непосредственно на конусообразный кончик тонкостенной трубки, наружный диаметр которого сопоставим с внутренним диаметром полого волокна, в то же время тонкостенная трубка (капилляр) представляет собой единственную деталь в качестве переходного элемента для соединения полого волокна с аспирационной трубкой (Фигура 1. Схема устройства для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна).The inventive device (UZVO), in which a segment of a hollow fiber is attached directly to the conical tip of a thin-walled tube, the outer diameter of which is comparable to the inner diameter of the hollow fiber, at the same time, a thin-walled tube (capillary) is the only part as a transition element for connection hollow fiber with an aspiration tube (Figure 1. Scheme of a device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber).

Для решения поставленной задачи был предложен вариант УЗВО, состоящий из стеклянного капилляра и отрезка полого волокна. В качестве носителя использовали полые волокна из триацетата целлюлозы, внутренний диаметр которых составлял 180-200 мкм, а длина отрезка около 2,0 см. В качестве переходного элемента использовали стеклянные капилляры диаметром 1,00-1,50 мм, длиной 7,00-10,00 см, имеющие конусообразный кончик с наружным диаметром 0,15-0,18 мм. Кончик стеклянного капилляра вводили в просвет полого волокна, которое удерживали при помощи пинцета. При дальнейшем продвижении стеклянного капилляра отрезок полого волокна фиксировался на нем за счет конусообразной формы кончика. При необходимости полое волокно отсоединяли от УЗВО путем обламывания кончика стеклянного капилляра при помощи пинцета.To solve this problem, a UZVO option was proposed, consisting of a glass capillary and a segment of a hollow fiber. As the carrier, hollow fibers of cellulose triacetate were used, the inner diameter of which was 180-200 μm, and the length of the cut was about 2.0 cm. Glass capillaries with a diameter of 1.00-1.50 mm, length 7.00- were used as a transition element. 10.00 cm having a tapered tip with an outer diameter of 0.15-0.18 mm. The tip of the glass capillary was inserted into the lumen of the hollow fiber, which was held with tweezers. With further advancement of the glass capillary, a segment of the hollow fiber was fixed on it due to the conical shape of the tip. If necessary, the hollow fiber was disconnected from the UZVO by breaking off the tip of the glass capillary using tweezers.

Пример использования УЗВО. В качестве носителя использовали полые волокна из триацетата целлюлозы, внутренний диаметр которых составлял 200 мкм, толщина мембраны 15 мкм, размер пор 7 нм (Sureflux®, Nipro Corporation, Japan). Для работы готовили отрезки волокон длиной около 2,0 см. В качестве переходного элемента использовали стеклянные капилляры диаметром 1,20 мм, длиной 10,00 см. Кончик стеклянного капилляра вытягивали вручную при помощи пламени спиртовки таким образом, чтобы он имел наружный диаметр 0,15-0,18 мм. Кончик стеклянного капилляра вводили в просвет полого волокна, которое удерживали при помощи пинцета. При дальнейшем продвижении стеклянного капилляра отрезок полого волокна фиксировался на нем за счет конусообразной формы кончика капилляра капилляра (Фигура 2. Место соединения отрезка полого волокна и стеклянного капилляра). Эта конструкция, сохраняющая проходимость на всем ее протяжении, образовала УЗВО. Для загрузки эмбрионов в просвет полого волокна к свободному концу стеклянного капилляра подсоединяли аспирационную трубку.An example of the use of UZVO. As the carrier, hollow fibers of cellulose triacetate were used, the inner diameter of which was 200 μm, the membrane thickness was 15 μm, and the pore size was 7 nm (Sureflux®, Nipro Corporation, Japan). For operation, pieces of fibers were prepared with a length of about 2.0 cm. Glass transition capillaries with a diameter of 1.20 mm and a length of 10.00 cm were used as a transition element. The tip of the glass capillary was manually pulled with the help of an alcohol lamp so that it had an outer diameter of 0, 15-0.18 mm. The tip of the glass capillary was inserted into the lumen of the hollow fiber, which was held with tweezers. With further advancement of the glass capillary, the segment of the hollow fiber was fixed on it due to the conical shape of the tip of the capillary of the capillary (Figure 2. The junction of the segment of the hollow fiber and the glass capillary). This design, which maintains patency throughout its length, formed the UZVO. An aspiration tube was connected to the free end of the glass capillary to load embryos into the lumen of the hollow fiber.

Растворы, использованные для витрификации и отогревания эмбрионов. Состав растворов и протоколы витрификации и отогревания эмбрионов соответствовали изложенным в работе Масашиге Куваяма (7). Базовым раствором для проведения витрификации и отогревания эмбрионов являлась среда Тироде с добавлением 20,0% сыворотки крови. Раствор эквилибрации содержал 7,5% ЭГ и 7,5% ДМСО, раствор витрификации 15,0% ЭГ, 15,0% ДМСО и 0,5 М сахарозы. Раствор отогревания содержал 1,0 М сахарозы, а разбавления 0,5 М сахарозы. В качестве раствора отмывания использовался базовый раствор. Каждый из этих растворов наливали по 3,0 мл в чашки Петри диаметром 40 мм (Биомедикал, Россия). Все растворы имели комнатную температуру 23-25°C.Solutions used for vitrification and warming of embryos. The composition of the solutions and protocols for vitrification and heating of the embryos were consistent with those described by Masashige Kuwayama (7). The base solution for vitrification and heating of the embryos was Tyrode's medium with the addition of 20.0% of blood serum. The equilibration solution contained 7.5% EG and 7.5% DMSO, a vitrification solution of 15.0% EG, 15.0% DMSO and 0.5 M sucrose. The warming solution contained 1.0 M sucrose, and a dilution of 0.5 M sucrose. A stock solution was used as a washing solution. Each of these solutions was poured into 3.0 ml into Petri dishes with a diameter of 40 mm (Biomedical, Russia). All solutions had room temperature 23-25 ° C.

Вблизи стереомикроскопа ставили емкость с жидким азотом. Полученные in vitro эмбрионы крупного рогатого скота в возрасте 7 дней на стадии бластоцисты и расширенной бластоцисты по 5-10 штук помещали в базовый раствор на 10 минут, а затем переносили в раствор эквилибрации. На свободный конец стеклянного капилляра, входящего в состав УЗВО, надевали аспирационную трубку. Находящиеся в растворе эквилибрации эмбрионы аспирировали в полое волокно таким образом, чтобы столбик раствора с эмбрионами с каждой стороны отделялся от остального раствора в полом волокне двумя небольшими столбиками воздуха (Фигура 3. Эмбрионы крупного рогатого скота, загруженные в отрезок полого волокна в растворе для эквилибрации). При помощи пинцета обламывали кончик капилляра, оставляя полое волокно с загруженными эмбрионами в растворе эквилибрации, выдерживая в нем в общей сложности в течение 5 минут. При помощи пинцета полое волокно переносили в чашку Петри с раствором витрификации и выдерживали в нем 1 минуту. Удерживая полое волокно пинцетом в вертикальном положении, погружали его в жидкий азот примерно на 1 минуту. Извлекали полое волокно из жидкого азота и немедленно помещали в чашку Петри с раствором отогревания. Через 1 минуту полое волокно переносили на 5 минут в чашку с раствором разбавления, а затем помещали в первую чашку с раствором отмывания. Через 5 минут полое волокно с эмбрионами переносили во вторую чашку с раствором отмывания, в котором высвобождали эмбрионы из просвета полого волокна. Для этого при помощи пинцета удерживали полое волокно за один конец и проводили плоским шпателем вдоль полого волокна, прижимая его к дну чашки Петри. Затем эмбрионы размещали на культивирование in vitro. Оценку жизнеспособности и развития эмбрионов проводили через 24 и 72 часа после отогревания.A container with liquid nitrogen was placed near the stereo microscope. The in vitro obtained cattle embryos at the age of 7 days at the blastocyst and expanded blastocyst stages of 5-10 pieces were placed in the stock solution for 10 minutes, and then transferred to the equilibration solution. An aspiration tube was put on the free end of the glass capillary, which is part of the UZVO. The embryos in the equilibration solution were aspirated into the hollow fiber so that the column of the solution with embryos on each side was separated from the rest of the solution in the hollow fiber with two small columns of air (Figure 3. Cattle embryos loaded into the length of the hollow fiber in the equilibration solution) . With the help of tweezers, the tip of the capillary was broken off, leaving a hollow fiber with loaded embryos in the equilibrium solution, keeping in it for a total of 5 minutes. Using tweezers, the hollow fiber was transferred to a Petri dish with a vitrification solution and held there for 1 minute. Holding the hollow fiber with tweezers in an upright position, immersed it in liquid nitrogen for about 1 minute. The hollow fiber was removed from liquid nitrogen and immediately placed in a Petri dish with a heating solution. After 1 minute, the hollow fiber was transferred for 5 minutes into a cup with a dilution solution, and then placed in the first cup with a washing solution. After 5 minutes, the hollow fiber with embryos was transferred to a second dishwashing solution cup in which the embryos were released from the hollow fiber lumen. To do this, with the help of tweezers, the hollow fiber was held at one end and held with a flat spatula along the hollow fiber, pressing it to the bottom of the Petri dish. Then the embryos were placed for cultivation in vitro. Assessment of the viability and development of the embryos was carried out 24 and 72 hours after warming.

Результаты. В процессе использования УЗВО отрезок полого волокна надежно удерживался на конусообразном кончике стеклянного капилляра, а при необходимости легко отсоединялся путем обламывания кончика стеклянного капилляра при помощи пинцета. Через 24 часа после витрификации и отогревания смешанной группы 7-дневных эмбрионов, находящихся на стадии бластоцисты или расширенной бластоцисты, восстановили объем 89% эмбрионов (130/146, 9 повторов). Через 72 часа после отогревания в возрасте 10 суток из блестящей оболочки вышло 64% витрифицированных бластоцист (103/146). Эти результаты сопоставимы с показателями развития контрольных не подвергавшихся витрификации эмбрионов, у которых в возрасте 10 суток из блестящей оболочки вышло 70% бластоцист (94/135, 8 повторов). При отборе для витрификации только тех эмбрионов крупного рогатого скота, которые в возрасте 7 дней уже достигли стадии расширенной бластоцисты, через 24 часа после отогревания восстановили объем 96% эмбрионов (50/52, 5 повторов), через 72 часа после отогревания в возрасте 10 суток из блестящей оболочки вышло 95% бластоцист (37/40, 3 повтора).Results. In the process of using the ultrasonic ultrasonic testing, a segment of the hollow fiber was firmly held on the conical tip of the glass capillary, and, if necessary, was easily disconnected by breaking off the tip of the glass capillary with tweezers. 24 hours after vitrification and heating of a mixed group of 7-day-old embryos at the blastocyst or enlarged blastocyst stage, the volume of 89% of the embryos was restored (130/146, 9 repetitions). 72 hours after warming at the age of 10 days, 64% of the vitrified blastocysts emerged from the shiny membrane (103/146). These results are comparable with the developmental indices of control of non-vitrified embryos, in which 70% of blastocysts emerged from the shiny membrane at the age of 10 days (94/135, 8 repetitions). When only cattle embryos that reached the stage of expanded blastocyst at the age of 7 days were selected for vitrification, 96% of the embryos were restored 24 hours after warming (50/52, 5 repetitions), 72 hours after warming at the age of 10 days 95% of blastocysts (37/40, 3 repetitions) emerged from the shiny membrane.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемое устройство УЗВО пригодно для осуществления загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов.Thus, the results obtained indicate that the proposed device UZVO suitable for loading, vitrification and heating of a group of embryos.

Тонкостенная трубка (капилляр) нужной конфигурации может быть изготовлена промышленным способом. При использовании стеклянного капилляра кончик нужного диаметра может быть вытянут как в лабораторных условиях вручную, так и промышленным способом. Отрезок полого волокна надевается на кончик капилляра и при дальнейшем продвижении надежно фиксируется за счет конусообразной формы этого кончика. Отсоединяется полое волокно от стеклянного капилляра путем обламывания кончика капилляра при помощи пинцета. Стеклянные капилляры не дороги, поэтому используются однократно и не требуют отмывания. Отломанный кончик стеклянного капилляра длиной 3,0-5,0 мм, остающийся в просвете полого волокна на одном его конце, служит удобным местом для захвата пинцетом при переносе отрезка полого волокна с эмбрионами из одной чашки Петри в другую.A thin-walled tube (capillary) of the desired configuration can be manufactured industrially. When using a glass capillary, the tip of the desired diameter can be stretched both in the laboratory by hand or industrially. A piece of hollow fiber is put on the tip of the capillary and, with further advancement, is reliably fixed due to the conical shape of this tip. The hollow fiber is disconnected from the glass capillary by breaking off the tip of the capillary with tweezers. Glass capillaries are not expensive, therefore they are used once and do not require washing. The broken off tip of a glass capillary 3.0–5.0 mm long, remaining in the lumen of the hollow fiber at one end, is a convenient place for picking with forceps when transferring a piece of hollow fiber with embryos from one Petri dish to another.

Использование капилляра в качестве единственной детали для соединения отрезка полого волокна с аспирационной трубкой является существенным признаком, характеризующим изобретение, и является отличительным признаком от прототипа.The use of a capillary as the only part for connecting a segment of a hollow fiber with an aspiration tube is an essential feature that characterizes the invention and is a hallmark of the prototype.

Часть 2. Система для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна (СКВПВ)Part 2. System for cryopreservation of a group of mammalian oocytes and embryos by the method of vitrification when used as a carrier of hollow fiber (SCWPV)

Уровень техники. В части 1 описания приведены данные, свидетельствующие о том, что при использовании в качестве носителя полых волокон из триацетата целлюлозы были успешно витрифицированы и отогреты группы эмбрионов нескольких видов млекопитающих. Однако при криоконсервации эмбрионы должны размещаться в криохранилище, а также при необходимости подвергаться транспортировке в условиях жидкого азота. Известны данные, что для продолжительного хранения в жидком азоте полые волокна с витрифицированными эмбрионами помещали в криопробирки (3, 4). Однако авторы указали, что полые волокна из триацетата целлюлозы в жидком азоте становятся очень хрупкими и при помещении в пробирку могут обламываться от соприкосновения с ее стенками (3). Вследствие этого очень велика опасность безвозвратной утраты витрифицированных эмбрионов. Поэтому для криоконсервации витрифицированных по методу ВПВ эмбрионов, при размещении на хранение в жидком азоте полые волокна должны быть защищены от возможных механических повреждений. Известна одна система для витрификации и последующего хранения группы эмбрионов в жидком азоте при использовании в качестве носителя полых волокон - the modified HFV device (3). The modified HFV device, состоящее из отрезка полого волокна, канюли для периферических вен, защитного чехла и криопробирки, в тексте заявки обозначено как модифицированное устройство для витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна, МУВПВ. Это устройство выступает в качестве прототипа нашего изобретения - Системы для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна-СКВПВ.The level of technology. Part 1 of the description provides evidence that when using hollow fibers from cellulose triacetate as a carrier, groups of embryos of several species of mammals were successfully vitrified and warmed. However, during cryopreservation, embryos should be placed in a cryogenic storage and, if necessary, transported under liquid nitrogen conditions. Data are known that for long-term storage in liquid nitrogen, hollow fibers with vitrified embryos were placed in cryovials (3, 4). However, the authors indicated that the hollow fibers from cellulose triacetate in liquid nitrogen become very brittle and, when placed in a test tube, can break off from contact with its walls (3). As a result of this, the danger of the irretrievable loss of vitrified embryos is very great. Therefore, for cryopreservation of embryos vitrified by the method of ERW, when placed in liquid nitrogen for storage, the hollow fibers must be protected from possible mechanical damage. There is one known system for vitrification and subsequent storage of a group of embryos in liquid nitrogen when hollow fibers are used as a carrier - the modified HFV device (3). The modified HFV device, consisting of a segment of a hollow fiber, a cannula for peripheral veins, a protective cover and a cryovial, is indicated in the application text as a modified device for vitrification when used as a hollow fiber carrier, МУВПВ. This device acts as a prototype of our invention - a System for cryopreservation of a group of oocytes and mammalian embryos by the method of vitrification when used as a carrier of hollow fiber-SCRW.

Итак, прототип предлагаемой СКВПВ состоял из отрезка полого волокна, канюли для периферических вен, защитного чехла и криопробирки. В качестве носителя использовались полые волокна из триацетата целлюлозы (cellulose triacetate hollow fiber; FP-150FH, Nipro Corporation, Osaka, Japan). Внутренний диаметр волокна составлял 185 мкм, толщина стенок волокна 15 мкм, величина пор 7,5 нм. Отрезок полого волокна длиной около 2,5 см приклеивали к кончику канюли для периферических вен (an ethylene-tetrafluoroethylene peripheral cannula of an indwelling needle; SR-OT1852C Surflow^® I.V. catheter 18Gx2, Terumo, Tokyo, Japan) эпоксидным клеем (epoxy adhesive; 16051, Konishi, Osaka, Japan). Чехол, способный удлиняться за счет смещения одной его части относительно другой, был изготовлен из телескопических соломинок для сока (Telescopic Straw, Nippon Straw, Tokyo, Japan). Чехол крепили непосредственно на канюле для периферических вен. Затем на канюлю для периферических вен надевали шприц емкостью 1 мл, к которому для загрузки эмбрионов в полое волокно присоединяли аспирационную трубку. После загрузки эмбрионов в полое волокно аспирационную трубку отсоединяли от устройства, оставляя шприц в качестве ручки. В процессе загрузки эмбрионов в полое волокно, при проводке их через растворы эквилибрации, витрификации, а также при погружении в жидкий азот, наружная подвижная часть чехла находилась в поднятом положении, вследствие чего полое волокно находилось за пределами чехла. Затем подвижный расширенный участок чехла опускали вниз для того, чтобы закрыть с боков полое волокно, уже находящееся в жидком азоте. После этого шприц отсоединяли, а устройство, включающее отрезок полого волокна с эмбрионами, канюлю для периферических вен и защитный чехол, не вынимая из жидкого азота, помещали в криопробирку (CryoTube^знак 337516, 4.5 ml, Thermo Fisher Scientific, MA, USA), после чего размещали в криохранилище.So, the prototype of the proposed SKVPV consisted of a segment of a hollow fiber, a cannula for peripheral veins, a protective cover and a cryovial. As the carrier, hollow fibers from cellulose triacetate (cellulose triacetate hollow fiber; FP-150FH, Nipro Corporation, Osaka, Japan) were used. The inner diameter of the fiber was 185 μm, the wall thickness of the fiber was 15 μm, and the pore size was 7.5 nm. A piece of hollow fiber about 2.5 cm long was glued to the tip of a peripheral vein cannula (an ethylene-tetrafluoroethylene peripheral cannula of an indwelling needle; SR-OT1852C Surflow ^® IV catheter 18Gx2, Terumo, Tokyo, Japan) with epoxy adhesive (epoxy adhesive; 16051 , Konishi, Osaka, Japan). The cover, which can be extended by displacing one part of it relative to another, was made of telescopic straws for juice (Telescopic Straw, Nippon Straw, Tokyo, Japan). The case was attached directly to the cannula for peripheral veins. Then, a 1 ml syringe was inserted into the peripheral vein cannula, to which an aspiration tube was attached to load the embryos into the hollow fiber. After loading the embryos into the hollow fiber, the suction tube was disconnected from the device, leaving the syringe as a pen. In the process of loading embryos into the hollow fiber, when passing them through solutions of balancing, vitrification, and also when immersed in liquid nitrogen, the outer movable part of the cover was in a raised position, as a result of which the hollow fiber was outside the cover. Then the movable expanded portion of the cover was lowered down to cover laterally a hollow fiber already in liquid nitrogen. After that, the syringe was disconnected, and the device, including a segment of a hollow fiber with embryos, a cannula for peripheral veins, and a protective cover, not removed from liquid nitrogen, was placed in a cryovial (CryoTube ^mark 337516, 4.5 ml, Thermo Fisher Scientific, MA, USA), after which was placed in the cryogenic storage.

Для отогревания эмбрионов криопробирку, содержащую устройство, извлекали из криохранилища и в переносном сосуде Дьюара доставляли к месту назначения. Устройство непосредственно в жидком азоте извлекали из криопробирки и вновь подсоединяли к нему шприц емкостью 1 мл, который использовался в качестве ручки. Подвижный расширенный участок чехла поднимали таким образом, чтобы полое волокно оказалось за пределами чехла, оставаясь в то же время в жидком азоте. После этого устройство полностью извлекали из жидкого азота, полое волокно немедленно помещали в чашку Петри в раствор отогревания и при помощи ножниц отрезали его от устройства. Дальнейшая обработка эмбрионов в полом волокне осуществлялась точно так же, как и при отогревании эмбрионов, витрифицированных с использованием УВПВ.To warm the embryos, a cryovial containing the device was removed from the cryostorage and delivered to the destination in a Dewar portable vessel. The device directly in liquid nitrogen was removed from the cryovial and again connected to it a 1 ml syringe, which was used as a pen. The movable expanded portion of the sheath was lifted so that the hollow fiber was outside the sheath, while remaining in liquid nitrogen. After that, the device was completely removed from liquid nitrogen, the hollow fiber was immediately placed in a Petri dish in the heating solution, and it was cut from the device using scissors. Further processing of the embryos in the hollow fiber was carried out in exactly the same way as during the heating of embryos vitrified using UVPV.

При использовании МУВПВ были витрифицированы и помещены в криохранилище эмбрионы мыши на стадии 2-х бластомеров и эмбрионы свиньи на стадии морулы. На целостность полых волокон и сохранность эмбрионов, витрифицированных с использованием МУВПВ, не влияли такие внешние факторы, как транспортировка в сосудах Дьюара или случившиеся в период хранения землетрясения. 95-96% эмбрионов мыши, витрифицированных на стадии 2-х клеток и хранившихся в жидком азоте в течение 6 или 12 месяцев, после отогревания и культивирования развивались до стадии бластоцисты. Эмбрионы свиньи, витрифицированные на стадии морулы, хранили в жидком азоте от 52 до 313 дней. После отогревания и культивирования в течение 24 часов стадии бластоцисты достигло 99% эмбрионов (72/73). В результате трансплантации этих эмбрионов, все 4 реципиента оказались супоросными и принесли потомство. До рождения молодняка развивалось в среднем 40% трансплантированных эмбрионов (3).When using MUVV, mouse embryos at the stage of 2 blastomeres and pig embryos at the morula stage were vitrified and placed in the cryo-storage. The integrity of the hollow fibers and the safety of the embryos vitrified with the use of MUVPV were not affected by such external factors as transport in Dewar vessels or earthquakes that occurred during storage. 95-96% of mouse embryos vitrified at the 2-cell stage and stored in liquid nitrogen for 6 or 12 months, after heating and culturing, developed to the blastocyst stage. Pig embryos vitrified at the morula stage were stored in liquid nitrogen for 52 to 313 days. After warming and culturing for 24 hours, the blastocyst stage reached 99% of the embryos (72/73). As a result of transplantation of these embryos, all 4 recipients were pregnant and brought offspring. Before birth, an average of 40% of transplanted embryos developed (3).

Недостатком технического решения МУВПВ является сложность соединения отрезка полого волокна с переходным элементом для подсоединения к шприцу. Технически трудно приклеить эпоксидным клеем (ероху adhesive; 16051, Konishi, Osaka, Japan) к кончику канюли для периферических вен (to the tip of an ethylene-tetrafluoroethylene peripheral cannula of an indwelling needle; SR-OT1852C Surflow^® I.V. catheter 18Gx2, Terumo, Tokyo, Japan) отрезок полого волокна из триацетата целлюлозы диаметром 185 мкм, сохранив при этом внутренний просвет как полого волокна, так и кончика канюли для периферических вен. Использование эпоксидного клея также является недостатком, в связи с его возможными пирогенными и/или эмбриотоксическими свойствами. В то же время, именно эта конструкция использовалась для крепления защитного чехла, который служил для предотвращения возможных механических повреждений полого волокна в условиях жидкого азота.The disadvantage of the technical solution MUVPV is the difficulty of connecting a segment of a hollow fiber with a transition element for connecting to a syringe. It is technically difficult to glue with epoxy glue (Epoxy adhesive; 16051, Konishi, Osaka, Japan) to the tip of the cannula for peripheral veins (to the tip of an ethylene-tetrafluoroethylene peripheral cannula of an indwelling needle; SR-OT1852C Surflow ^® IV catheter 18Gx2, Terumo, Tokyo, Japan) a segment of a hollow fiber from cellulose triacetate with a diameter of 185 μm, while maintaining the internal lumen of both the hollow fiber and the tip of the cannula for peripheral veins. The use of epoxy glue is also a disadvantage, due to its possible pyrogenic and / or embryotoxic properties. At the same time, it was this design that was used to fasten the protective cover, which served to prevent possible mechanical damage to the hollow fiber under liquid nitrogen conditions.

При использовании МУВПВ детали чехла должны сдвигаться относительно друг друга в условиях жидкого азота, что также является недостатком конструкции: возможно заклинивание деталей, изготовленных из функционально непригодного материала. Авторы признают, что недостатками МУВПВ является его сложная структура, что затрудняет создание и использование устройства (3).When using MUVPV, the details of the cover should shift relative to each other under liquid nitrogen conditions, which is also a design flaw: it is possible to jam parts made of functionally unsuitable material. The authors acknowledge that the disadvantages of the MUVPV are its complex structure, which complicates the creation and use of the device (3).

Использование криопробирок (CryoTube^знак 337516, 4.5 ml, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) является также недостатком технического решения МУВПВ. Наличие жидкого азота внутри криопробирки вызывает угрозу ее взрыва при извлечении из жидкого азота, так как криопробирка, по определению, закрывается герметично, и размещение жидкого азота в ней не предусмотрено производителем. Криопробирки очень дороги. Они достаточно громоздки, поэтому занимают много места в криохранилище.The use of cryovials (CryoTube ^mark 337516, 4.5 ml, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) is also a drawback of the technical solution of the MUVVV. The presence of liquid nitrogen inside the cryovial causes a risk of its explosion when removed from liquid nitrogen, since the cryovial, by definition, closes tightly, and the placement of liquid nitrogen in it is not provided by the manufacturer. Cryovials are very expensive. They are cumbersome enough, so they take up a lot of space in the cryogenic storage.

Целью изобретения являлось создание Системы для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна, в которой используются заявляемое УЗВО, чехол для предотвращения повреждений полого волокна из триацетата целлюлозы в условиях жидкого азота и контейнер, занимающий минимальный объем в криохранилище и обеспечивающий пребывание полого волокна в жидком азоте при необходимых перемещениях УЗВО с чехлом. При этом чехол должен представлять собой конструкцию из неподвижных в процессе эксплуатации друг относительно друга частей и быть совместимым с заявляемым УЗВО. Контейнер должен представлять конструкцию открытого типа, изготовленную из доступных недорогих материалов, быть компактным.The aim of the invention was the creation of a system for cryopreservation of a group of mammalian oocytes and embryos by the method of vitrification when using a hollow fiber, which uses the claimed UZVO, a cover to prevent damage to the hollow fiber from cellulose triacetate in liquid nitrogen and a container that occupies a minimum volume in the cryogenic storage and ensuring the stay of the hollow fiber in liquid nitrogen with the necessary movements of the ultrasonic protection with a cover. In this case, the cover should be a structure of stationary during operation relative to each other parts and be compatible with the claimed UZVO. The container should be an open-type structure made of affordable, affordable materials, and be compact.

Сущность изобретения. Для решения поставленной задачи была предложена СКВПВ, состоящая из УЗВО, чехла и контейнера. Конструкция УЗВО, представляющего собой отрезок полого волокна, соединенного со стеклянным капилляром, его изготовление и использование, были изложены в части 1 заявки.SUMMARY OF THE INVENTION To solve the problem was proposed SKVPV, consisting of UZVO, cover and container. The design of the UZVO, which is a segment of a hollow fiber connected to a glass capillary, its manufacture and use, were described in part 1 of the application.

В качестве чехла была предложена тонкостенная цилиндрическая конструкция с открытыми концами длиной 5,5-6,5 см, имеющая переменный диаметр. Одна часть конструкции длиной около 2,5-3,0 см имеет внутренний диаметр 0,25-0,30 см, другая часть имеет внутренний диаметр 0,11-0,17 см. Обе части конструкции неподвижны относительно друг друга, их граница маркирована. На внешнем крае части чехла меньшего диаметра имеется суженный участок, протяженностью около 0,20 см, который обладает необходимой пластичностью для изменения величины внутреннего просвета в небольших пределах, служащий для крепления на капилляре УЗВО, при этом чехол и капилляр УЗВО сохраняют способность перемещаться друг относительно друга при сохранении взаимной ориентации, обеспечивая возможность проведения необходимых этапов витрификации и отогревания на открытом волокне и защиту отрезка полого волокна от повреждений в криохранилище.A thin-walled cylindrical structure with open ends 5.5-6.5 cm long, having a variable diameter, was proposed as a cover. One part of the structure with a length of about 2.5-3.0 cm has an internal diameter of 0.25-0.30 cm, the other part has an internal diameter of 0.11-0.17 cm. Both parts of the structure are stationary relative to each other, their border is marked . On the outer edge of the part of the case of a smaller diameter there is a narrowed section with a length of about 0.20 cm, which has the necessary plasticity to change the internal clearance in small limits, which is used for fastening on the capillary of the ultrasonic protection device, while the cover and capillary of the ultrasonic protection device are able to move relative to each other while maintaining mutual orientation, providing the ability to carry out the necessary stages of vitrification and heating on an open fiber and protect the length of the hollow fiber from damage in the cryogenic storage leaf.

Конструкция, состоящая из УЗВО и чехла, являющаяся частью СКВПВ, представляет собой модифицированное устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна, МУЗВО.The design, consisting of UZVO and a cover, which is part of SKVPV, is a modified device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of a hollow fiber, MUZVO.

Контейнер представляет собой цилиндрическую тонкостенную трубку длиной 12,5-13,5 см, имеющую диаметр, не превышающий 3-кратный диаметр чехла, выполненную из окрашенной пластической массы, замкнутую с одной стороны, имеющую косой срез длиной 3,0-4,0 см на другом конце, в которую помещается МУЗВО. При этом контейнер обеспечивает компактное размещение МУЗВО в криохранилище; при перемещении Системы между сосудами с жидким азотом обеспечивает постоянное нахождение отрезка полого волокна с витрифицированными эмбрионами в пределах жидкого азота, исключает возможность взрывоопасного скопления паров азота.The container is a cylindrical thin-walled tube 12.5-13.5 cm long, having a diameter not exceeding 3 times the diameter of the cover, made of painted plastic, closed on one side, and having an oblique slice 3.0-4.0 cm long at the other end, into which the muso is placed. In this case, the container provides compact placement of the MUZVO in the cryogenic storage; when moving the System between vessels with liquid nitrogen, it ensures that the length of the hollow fiber with vitrified embryos is constantly within the limits of liquid nitrogen, eliminates the possibility of explosive accumulation of nitrogen vapor.

Комплекс МУЗВО с контейнером образуют Систему для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна (СКВПВ).The MUZVO complex with a container form a System for cryopreservation of a group of mammalian oocytes and embryos by the method of vitrification when used as a carrier of hollow fiber (SCWPW).

Пример реализации изобретения. Конструкция УЗВО, представляющего собой отрезок полого волокна, соединенного со стеклянным капилляром, и ее использование, были изложены в части 1 заявки.An example implementation of the invention. The design of the UZVO, which is a segment of a hollow fiber connected to a glass capillary, and its use, were described in part 1 of the application.

Были предложены два варианта чехла для предохранения полого волокна от механических повреждений в условиях жидкого азота, изготовленные в лабораторных условиях: чехол 1 и чехол 2.Two variants of the cover were proposed for the protection of the hollow fiber from mechanical damage in liquid nitrogen conditions, made in laboratory conditions: cover 1 and cover 2.

Материалом для изготовления чехла 1 являлись криосоломинки, которые используются для криоконсервации биологических материалов (Minitube, Германия). Криосоломинки объемом 0,25 мл (mini straw) имеют наружный диаметр 0,20 см, внутренний диаметр 0,17 см. Наружный диаметр криосоломинок объемом 0,50 мл (medium straw) составляет 0,30 см, внутренний диаметр 0,25 см. Кроме того, использовались серологические пипетки объемом 2,50 мл (LDPE Serum Pipette, Low Density Polyethylene; Greiner bio-one), толщина стенок груши которых составляет около 0,05 см. Готовили отрезок длиной 5,50 см криосоломинки объемом 0,50 мл, отрезок длиной 3,50 см криосоломинки объемом 0,25 мл и полиэтиленовую полоску длиной около 2,8 см и шириной 0,20 см из груши пипетки. Отрезок криосоломинки объемом 0,25 мл вставляли внутрь отрезка криосоломинки объемом 0,50 мл на глубину 2,50 см, размещая между их стенками полиэтиленовую полоску из груши пипетки. В результате полиэтиленовая полоска надежно фиксировала отрезки криосоломинок разного диаметра относительно друг друга. На наружную стенку отрезка криосоломинки объемом 0,50 мл наносили метку, обозначающую положение конца криосоломинки объемом 0,25 мл в ее просвете. Конец выступающего наружу отрезка криосоломинки объемом 0,25 мл расплющивали в поперечном направлении при помощи запаивателя пакетов Impulse Sealer AVT200, CAS Corporation, Korea, в режиме 0,5.The material for the manufacture of the cover 1 was cryosolomins, which are used for cryopreservation of biological materials (Minitube, Germany). Cryosolomins with a volume of 0.25 ml (mini straw) have an outer diameter of 0.20 cm, an inner diameter of 0.17 cm. The outer diameter of the cryosolomines with a volume of 0.50 ml (medium straw) is 0.30 cm, the inner diameter is 0.25 cm. In addition, we used 2.50 ml serological pipettes (LDPE Serum Pipette, Low Density Polyethylene; Greiner bio-one), the thickness of the pear walls of which was about 0.05 cm. A section of 5.50 cm length of 0.50 ml cryo straw was prepared. , a length of 3.50 cm in length of a 0.25 ml cryosolina and a polyethylene strip about 2.8 cm long and 0.20 cm wide from a pipette pear. A 0.25 ml cryosolina segment was inserted inside a 0.50 ml cryosolina segment to a depth of 2.50 cm, placing a polyethylene strip from a pipette pear between their walls. As a result, the polyethylene strip reliably fixed the segments of cryosolines of different diameters relative to each other. A mark indicating the position of the end of the 0.25 ml cryo-straw in its lumen was applied to the outer wall of a 0.50 ml cryosulphine segment. The end of the protruding 0.25 ml cryosalom segment was flattened in the transverse direction using Impulse Sealer AVT200 packet sealer, CAS Corporation, Korea, in 0.5 mode.

Свободный конец стеклянного капилляра, входящего в состав УЗВО, вставляли в чехол со стороны отрезка криосоломинки объемом 0,50.мл и продвигали далее в просвет отрезка криосоломинки объемом 0,25 мл до выхода его с другой стороны чехла. Стеклянный капилляр протягивали дальше таким образом, чтобы надетый на него отрезок полого волокна полностью скрылся в просвете чехла. После этого на стеклянном капилляре делали метку в месте его выхода наружу из чехла. Эта конструкция представляет собой модифицированное устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна, МУЗВО. Для обработки эмбрионов на стадии витрификации и отогревания эмбрионов стеклянный капилляр вдвигали внутрь чехла таким образом, чтобы полое волокно оказалось за пределами чехла (Фигура 4. Модифицированное устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна, на основе чехла 1).The free end of the glass capillary, which is part of the UZVO, was inserted into the cover from the side of the 0.50 ml volume of cryosolina and further advanced into the lumen of the 0.25 ml volume of the cryo straw until it exited from the other side of the cover. The glass capillary was pulled further so that the length of the hollow fiber worn on it completely disappeared into the lumen of the cover. After that, a mark was made on the glass capillary at the place of its exit out of the cover. This design is a modified device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a hollow fiber carrier, MUZVO. To process the embryos at the stage of vitrification and heating of the embryos, the glass capillary was pushed inside the cover so that the hollow fiber was outside the cover (Figure 4. Modified device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber, based on the cover 1 )

Контейнер изготовляли из соломки питьевой разного цвета диаметром 0,5 см (ParStar, Германия). Один конец отрезка соломки длиной 13,0 см запаивали при помощи запаивателя пакетов Impulse Sealer AVT200, CAS Corporation, Korea, в режиме 8. На другом конце отрезка соломки делали косой срез длиной 3,0-4,0 см. МУЗВО помещали в подготовленный контейнер. В результате получали Систему для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна, СКВПВ (Фигура 5. Система для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна).The container was made from drinking straws of different colors with a diameter of 0.5 cm (ParStar, Germany). One end of a 13.0 cm length of straw was sealed with Impulse Sealer AVT200, CAS Corporation, Korea, bag sealer in mode 8. At the other end of the straw segment, an oblique section of 3.0-4.0 cm was made. The mucos was placed in a prepared container . The result was a System for cryopreservation of a group of mammalian oocytes and embryos according to the method of vitrification when using a hollow fiber, SCWPV (Figure 5. System for cryopreservation of a group of oocytes and mammalian embryos according to the method of vitrification when using a hollow fiber).

Материалом для изготовления чехла 2 являлись криосоломинки объемом 0,25 мл (mini straw; наружный диаметр 2,0 мм, внутренний диаметр 1,7 мм; Minitube, Германия) и Transfer pipette 3,5 ml (Sarstedt). Вытянутая часть Transfer pipette состояла из трех переходящих друг в друга цилиндрических участков. Первый участок (кончик пипетки) длиной около 1,5 см имел внутренний диаметр 1,5 мм, второй участок длиной около 1,0 см имел внутренний диаметр около 2,0 мм, третий участок длиной около 8,0 см имел внутренний диаметр около 3,7 мм. Готовили отрезок пипетки длиной 4,5 см, состоящий из второго участка пипетки (1,0 см) и примыкающей к нему части третьего участка (3,5 см). Отрезок криосоломинки длиной 3,0 см вставляли в просвет отрезка пипетки со стороны, имеющей внутренний диаметр около 2,0 мм, и продвигали внутрь на глубину 1,5 см. Выступающий наружу участок стенки криосоломинки расплющивали в поперечном направлении при помощи запаивателя пакетов Impulse Sealer AVT200, CAS Corporation, Korea, в режиме 0,5. Полученная конструкция представляла собой чехол 2.The material for the manufacture of the case 2 was 0.25 ml cryosulphins (mini straw; outer diameter 2.0 mm, inner diameter 1.7 mm; Minitube, Germany) and Transfer pipette 3.5 ml (Sarstedt). The elongated part of the Transfer pipette consisted of three cylindrical sections turning into each other. The first section (pipette tip) with a length of about 1.5 cm had an internal diameter of 1.5 mm, the second section with a length of about 1.0 cm had an internal diameter of about 2.0 mm, the third section with a length of about 8.0 cm had an internal diameter of about 3 , 7 mm. A 4.5 cm pipette segment was prepared, consisting of a second pipette section (1.0 cm) and an adjacent portion of the third section (3.5 cm). A 3.0 cm length of cryo straw was inserted into the lumen of a pipette segment from a side having an internal diameter of about 2.0 mm and moved inward to a depth of 1.5 cm. The protruding portion of the cryo straw wall was flattened in the transverse direction using Impulse Sealer AVT200 packet sealer , CAS Corporation, Korea, in 0.5 mode. The resulting design was a cover 2.

Свободный конец стеклянного капилляра, входящего в состав УЗВО, вставляли в чехол 2 со стороны участка большего диаметра, продвигали в просвет отрезка соломинки и далее до выхода его с другой стороны чехла. Удерживая за свободный конец, стеклянный капилляр протягивали дальше таким образом, чтобы надетый на него с другой стороны отрезок полого волокна полностью скрылся в просвете отрезка пипетки. После этого на стеклянном капилляре делали метку в месте его выхода наружу из чехла. Для обработки эмбрионов на стадии витрификации и отогревания, стеклянный капилляр вдвигали внутрь чехла таким образом, чтобы полое волокно оказалось за пределами чехла (Фигура 6. Модифицированное устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна, на основе чехла 2). Контейнер для устройства, включающего чехол 2, может быть изготовлен из соломки питьевой диаметром 0,7-0,8 см.The free end of the glass capillary, which is part of the UZVO, was inserted into the cover 2 from the side of the larger diameter section, advanced into the lumen of the straw segment and then until it exited from the other side of the cover. Holding the free end, the glass capillary was pulled further so that the length of the hollow fiber worn on it from the other side completely disappeared into the lumen of the pipette segment. After that, a mark was made on the glass capillary at the place of its exit out of the cover. To process the embryos at the stage of vitrification and heating, the glass capillary was pushed inside the cover so that the hollow fiber was outside the cover (Figure 6. Modified device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber, based on the cover 2 ) The container for the device, including the cover 2, can be made of drinking straw with a diameter of 0.7-0.8 cm

Пример использования СКВПВ.An example of using SCVPV.

Этап витрификации. Состав растворов для витрификации и отогревания полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота изложен в части 1 заявки при описании примера использования УЗВО.Stage vitrification. The composition of the solutions for vitrification and warming obtained in vitro cattle embryos is described in part 1 of the application when describing an example of the use of UZVO.

Вблизи стереомикроскопа ставили емкость с жидким азотом, в которую помещали контейнер для МУЗВО. Стеклянный капилляр в составе МУЗВО вдвигали внутрь чехла таким образом, чтобы волокно и кончик капилляра вышли с другой стороны за пределы чехла. К свободному концу стеклянного капилляра подсоединяли аспирационную трубку. Эмбрионы крупного рогатого скота в возрасте 7 дней, достигшие стадии бластоцисты или расширенной бластоцисты, помещали в раствор эквилибрации по 5-10 штук и загружали в полое волокно, после чего аспирационную трубку отсоединяли. Находящееся в составе МУЗВО полое волокно с эмбрионами выдерживали в растворе эквилибрации в течение 5 минут, а затем переносили в чашку Петри с раствором витрификации и выдерживали в нем 1 минуту. Удерживая МУЗВО рукой за стеклянный капилляр, полое волокно погружали в вертикальном положении в жидкий азот, а затем продолжали погружать устройство в жидкий азот до уровня метки на чехле. В этом положении МУЗВО полое волокно и широкая часть чехла оказываются ниже уровня жидкого азота. Удерживая МУЗВО пинцетом за расплющенный участок криосоломинки, перемещали стеклянный капилляр вверх до появления из чехла метки, имеющейся на капилляре. В результате полое волокно, оставаясь погруженным в жидкий азот, оказывается полностью скрытым в просвете широкого участка чехла. В таком состоянии МУЗВО с витрифицированными эмбрионами помещали в контейнер, предварительно помещенный в сосуд с жидким азотом. СКВПВ размещали в криохранилище.A container with liquid nitrogen was placed near the stereomicroscope into which a container for the MUZVO was placed. The glass capillary as part of the MUZVO was pushed inside the cover so that the fiber and the tip of the capillary extend on the other side outside the cover. An aspiration tube was connected to the free end of the glass capillary. Cattle embryos at the age of 7 days, having reached the stage of a blastocyst or expanded blastocyst, were placed in an equilibration solution of 5-10 pieces and loaded into a hollow fiber, after which the suction tube was disconnected. The hollow fiber with embryos contained in the MUZVO was kept in an equilibration solution for 5 minutes, and then transferred to a Petri dish with a vitrification solution and kept there for 1 minute. Holding the MUZVO by the glass capillary with his hand, the hollow fiber was immersed vertically in liquid nitrogen, and then continued to immerse the device in liquid nitrogen to the level of the mark on the case. In this position MUZVO hollow fiber and a wide part of the cover are below the level of liquid nitrogen. Holding the MUZVO with tweezers by the flattened section of the cryosolina, the glass capillary was moved up until the mark on the capillary appeared from the cover. As a result, the hollow fiber, remaining immersed in liquid nitrogen, is completely hidden in the lumen of a wide area of the cover. In this state, the MUZVO with vitrified embryos was placed in a container previously placed in a vessel with liquid nitrogen. SCVPV were placed in a cryogenic storage.

Этап отогревания эмбрионов Из криохранилища СКВПВ в переносном сосуде Дьюара доставляли в емкость с жидким азотом, находящуюся вблизи стереомикроскопа. Пинцетом удерживали МУЗВО за стеклянный капилляр и извлекали его из контейнера, сохраняя при этом МУЗВО ниже уровня жидкого азота. Удерживая стеклянный капилляр пинцетом, МУЗВО поднимали в вертикальном положении таким образом, чтобы над уровнем жидкого азота показалась метка на стенке чехла. В этом положении нижняя широкая часть устройства вместе с расположенным в его просвете полым волокном оставались в толще жидкого азота. Удерживая МУЗВО за расплющенный участок соломинки, смещали стеклянный капилляр вниз вглубь чехла на 2,0-3,0 см. В результате полое волокно оказывалось за пределами чехла, еще глубже погружаясь в жидкий азот. Не торопясь поднимали МУЗВО таким образом, чтобы чехол полностью вышел из жидкого азота, а конец стеклянного капилляра с отрезком полого волокна оставался ниже уровня жидкого азота. В это время чехол освобождался от жидкого азота. Полностью вынимали МУЗВО из жидкого азота, и полое волокно немедленно помещали в чашку Петри с раствором отогревания. Отделяли полое волокно от устройства, обламывая кончик стеклянного капилляра при помощи пинцета. Дальнейшая процедура этапа отогревания эмбрионов изложена в части 1 заявки. Эмбрионы размещали на культивирование in vitro. Оценку жизнеспособности и развития эмбрионов проводили через 24 и 72 часа после отогревания.The stage of embryo warming From the cryogenic storage facility, SCWPV in a portable Dewar vessel was delivered to a container with liquid nitrogen located near the stereo microscope. The MUZVO was held by tweezers by the glass capillary and removed from the container, while keeping the MUZVO below the level of liquid nitrogen. Holding the glass capillary with tweezers, the MUZVO was raised in a vertical position so that a mark appeared on the wall of the cover above the level of liquid nitrogen. In this position, the lower wide part of the device, together with the hollow fiber located in its lumen, remained in the bulk of liquid nitrogen. Holding the MUZVO by the flattened portion of the straw, the glass capillary was displaced down into the cover by 2.0-3.0 cm. As a result, the hollow fiber appeared outside the cover, immersed even more deeply in liquid nitrogen. Slowly they raised the MUZVO so that the cover completely came out of liquid nitrogen, and the end of the glass capillary with a length of hollow fiber remained below the level of liquid nitrogen. At this time, the cover was released from liquid nitrogen. The MUZVO was completely removed from liquid nitrogen, and the hollow fiber was immediately placed in a Petri dish with a heating solution. The hollow fiber was separated from the device by breaking off the tip of the glass capillary with tweezers. The further procedure for the embryo warming step is described in part 1 of the application. Embryos were placed for in vitro cultivation. Assessment of the viability and development of the embryos was carried out 24 and 72 hours after warming.

Эмбрионы крупного рогатого скота, витрифицированные при использовании СКВПВ, помещали в криохранилище и хранили в жидком азоте в течение 1-2 месяцев. За этот период СКВПВ переносили из одного сосуда с жидким азотом в другой, некоторые СКВПВ доставляли в жидком азоте в переносном сосуде Дьюара на животноводческую ферму. При этом полые волокна в составе СКВПВ оставались целыми, эмбрионы не были утрачены.Cattle embryos vitrified using SCRW were placed in a cryogenic storage and stored in liquid nitrogen for 1-2 months. During this period, SKVPV was transferred from one vessel with liquid nitrogen to another, some SKVPV were delivered in liquid nitrogen in a portable dewar vessel to a livestock farm. At the same time, the hollow fibers in the composition of SCWPW remained intact, the embryos were not lost.

Пример 1. После отогревания эмбрионов, хранившихся в жидком азоте в течение 52 дней, через 24 часа восстановили свой объем 93% бластоцист (14/15), через 72 часа культивирования в возрасте 10 суток из блестящей оболочки вышло 60% бластоцист (9/15).Example 1. After warming the embryos stored in liquid nitrogen for 52 days, after 24 hours, 93% of blastocysts regained their volume (14/15), after 72 hours of cultivation at the age of 10 days, 60% of blastocysts emerged from the glossy membrane (9/15 )

Пример 2. При отогревании эмбрионов после 61 дня хранения в условиях жидкого азота через 24 часа культивирования восстановили свой объем 86% бластоцист (36/42), через 72 часа в возрасте 10 суток из блестящей оболочки вышло 79% бластоцист (33/42).Example 2. When embryos were heated after 61 days of storage under liquid nitrogen, after 24 hours of cultivation, 86% of blastocysts (36/42) regained their volume, after 72 hours at the age of 10 days, 79% of blastocysts emerged from the glossy membrane (33/42).

Пример 3. СКВПВ, находившаяся в криохранилище в течение 53 дней, была помещена в переносной сосуд Дьюара и доставлена на животноводческую ферму. После отогревания эмбрионов в условиях фермы и доставки их в лабораторию в течение 3 часов при температуре около 25°C, все 4 расширенные бластоцисты через 24 часа культивирования восстановили свой объем (100%), а через 72 часа в возрасте 10 суток вышли из блестящей оболочки (100%).Example 3. SKVPV, located in the cryostorage for 53 days, was placed in a portable Dewar vessel and delivered to a livestock farm. After warming the embryos in the farm and delivering them to the laboratory for 3 hours at a temperature of about 25 ° C, all 4 expanded blastocysts regained their volume (100%) after 24 hours of cultivation, and after 72 hours at the age of 10 days they left the shiny coat (one hundred%).

Таким образом, конструкция чехла позволяет использовать заявляемое УЗВО для образования МУЗВО, а при добавлении контейнера образовывать СКВПВ. Использованные для изготовления чехла криосоломинки широко распространены, не дороги, не токсичны и рассчитаны на использование в условиях жидкого азота, пипетки по своему назначению также готовятся из не токсичных материалов. Используется чехол однократно. Все части чехла при его использовании остаются неподвижными относительно друг друга. Это делает конструкцию простой и надежной в эксплуатации, исключая заклинивание. Расплющенный участок отрезка криосоломинки объемом 0,25 мл, входящего в состав обоих вариантов чехла, достаточно прочно удерживает стеклянный капилляр, не позволяя ему двигаться произвольно. В то же время при приложении небольшого усилия рук стеклянный капилляр может передвигаться в обоих направлениях, перемещая соединенный с ним отрезок полого волокна внутрь чехла или за его пределы. Благодаря сопоставимым величинам внутреннего диаметра криосоломинки объемом 0,25 мл и наружного диаметра стеклянного капилляра, стеклянный капилляр находится в чехле в близком к осевому положении. В результате этого отрезок полого волокна располагается примерно по оси цилиндрического чехла и оказывается закрытым с боковых сторон стенками соломинки объемом 0,50 мл, но не соприкасается с ними. При этом между стеклянным капилляром и внутренними стенками отрезка криосоломинки объемом 0,25 мл остаются зазоры на всем его протяжении, в том числе и в расплющенном участке. Это позволяет воздуху выходить из чехла, а жидкому азоту беспрепятственно заполнять чехол при вертикальном погружении МУЗВО в жидкий азот на этапе витрификации. На этапе отогревания при подъеме МУЗВО из жидкого азота благодаря этим зазорам воздух поступает в чехол, вследствие чего жидкий азот полностью и без турбулентности выходит из чехла. Полное, при отсутствии турбулентных потоков, заполнение чехла жидким азотом на этапе витрификации крайне необходимо для предотвращения повреждения полого волокна и возникновения «плавучести» МУЗВО при его размещении в жидком азоте. Полное освобождение чехла от жидкого азота на этапе отогревания также очень важно, так как после извлечения МУЗВО из жидкого азота полое волокно незамедлительно помещается в раствор отогревания эмбрионов, куда абсолютно не должны попадать даже следовые количества жидкого азота.Thus, the design of the cover allows you to use the claimed UZVO for the formation of MUZVO, and when adding the container to form SKVPV. The cryosomolins used for the manufacture of the cover are widespread, non-expensive, non-toxic and designed for use in liquid nitrogen; pipettes for their intended purpose are also prepared from non-toxic materials. The case is used once. All parts of the cover during its use remain motionless relative to each other. This makes the design simple and reliable in operation, eliminating jamming. The flattened portion of the 0.25 ml cryosomine segment, which is part of both cover options, holds the glass capillary quite firmly, preventing it from moving arbitrarily. At the same time, with a small amount of hand effort, the glass capillary can move in both directions, moving a piece of hollow fiber connected to it inside or outside the sheath. Due to the comparable values of the inner diameter of the cryosalomain with a volume of 0.25 ml and the outer diameter of the glass capillary, the glass capillary is in the case in a close to axial position. As a result of this, a segment of a hollow fiber is located approximately along the axis of the cylindrical cover and is closed on the sides by the walls of a straw with a volume of 0.50 ml, but does not come into contact with them. At the same time, between the glass capillary and the inner walls of the 0.25 ml cryosalom segment, gaps remain along its entire length, including in the flattened area. This allows air to exit the case, and liquid nitrogen to freely fill the case when the MUZVO is vertically immersed in liquid nitrogen at the stage of vitrification. At the heating stage, when the MUZVO is lifted from liquid nitrogen, due to these gaps, air enters the cover, as a result of which liquid nitrogen completely and without turbulence leaves the cover. Full, in the absence of turbulent flows, filling the cover with liquid nitrogen at the stage of vitrification is extremely necessary to prevent damage to the hollow fiber and the occurrence of "buoyancy" MUZVO when it is placed in liquid nitrogen. The complete release of the case from liquid nitrogen at the stage of heating is also very important, since after removing the MUZVO from liquid nitrogen, the hollow fiber is immediately placed in the solution of heating the embryos, which even trace amounts of liquid nitrogen should not get into.

В промышленных масштабах чехол может быть изготовлен как цельная структура соответствующей конфигурации из пластикового материала подобно криосоломинкам для криоконсервации биологического материала.On an industrial scale, a cover can be made as a one-piece structure of the corresponding configuration from plastic material, like cryosolines for cryopreservation of biological material.

Контейнер, изготовленный в лабораторных условиях из отрезка питьевой соломки диаметром 0,5 см (ParStar, Германия), стоит дешево. Предлагаемая конструкция позволяет при переносе контейнера из одного сосуда Дьюара в другой, с одной стороны, сохранить жидкий азот внутри контейнера, а с другой стороны избежать скопления паров азота и, следовательно, угрозы взрыва. Поэтому, при переносе СКВПВ из одной емкости с жидким азотом в другую, например, для размещения эмбрионов в криохранилище или в переносном сосуде Дьюара для доставки к месту использования, полое волокно не выходит за пределы жидкого азота, благодаря чему не нарушаются температурные условия хранения витрифицированных эмбрионов. Косой срез на открытом конце контейнера позволяет взять пинцетом конец стеклянного капилляра для извлечения МУЗВО из контейнера на этапе отогревания эмбрионов. Благодаря сопоставимым диаметрам чехла и контейнера цилиндрической формы, СКВПВ занимает минимальный объем в криохранилище. Например, в гоблете диаметром 1,3 см, то есть сопоставимом по величине диаметра с использованной в прототипе криопробиркой, одновременно может быть размещено 4 СКВПВ (Фигура 7. Размещение в гоблете Системы для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна). При помощи пинцета СКВПВ легко извлекалось из гоблета, имеющего стандартную длину 12 см. Применение контейнеров и гоблетов разного цвета служило дополнительной маркировкой группы витрифицированных эмбрионов. В промышленных масштабах контейнер может быть изготовлен как структура соответствующей конфигурации из пластикового материала разного цвета, используемого при криоконсервации биологического материала. Использование предлагаемого контейнера позволяет значительно снизить затраты на криоконсервацию.A container made in laboratory conditions from a piece of drinking straw with a diameter of 0.5 cm (ParStar, Germany) is cheap. The proposed design allows the transfer of the container from one Dewar vessel to another, on the one hand, to preserve liquid nitrogen inside the container, and on the other hand to avoid the accumulation of nitrogen vapor and, therefore, the threat of explosion. Therefore, when transferring SCRWS from one container with liquid nitrogen to another, for example, to place embryos in a cryostorage or in a Dewar portable vessel for delivery to the place of use, the hollow fiber does not extend beyond the limits of liquid nitrogen, due to which the storage conditions of vitrified embryos are not violated . An oblique slice at the open end of the container allows you to take the end of the glass capillary with tweezers to extract the MUZVO from the container at the stage of embryo heating. Due to the comparable diameters of the case and the container of cylindrical shape, SCVPV occupies a minimum volume in the cryogenic storage. For example, in a goblet with a diameter of 1.3 cm, that is, comparable in diameter to the cryovial used in the prototype, 4 SKVPV can be placed at the same time (Figure 7. Placement in a goblet of a System for cryopreservation of a group of mammalian oocytes and embryos according to the vitrification method when used as hollow fiber carrier). With the help of tweezers, SKVPV was easily removed from the goblet, which has a standard length of 12 cm. The use of containers and goblets of different colors served as an additional marking of the group of vitrified embryos. On an industrial scale, the container can be made as a structure of the corresponding configuration from plastic material of different colors used in the cryopreservation of biological material. Using the proposed container can significantly reduce the cost of cryopreservation.

Таким образом, примеры использования СКВПВ свидетельствуют о том, что предлагаемое изобретение пригодно для осуществления криоконсервации группы эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна и обладает целым рядом преимуществ по сравнению с прототипом.Thus, examples of the use of SQWS indicate that the present invention is suitable for cryopreservation of a group of mammalian embryos by the method of vitrification when used as a hollow fiber carrier and has a number of advantages compared to the prototype.

Описание чертежейDescription of drawings

Фигура 1. Схема устройства для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна. 1 - стеклянный капилляр, 2 - отрезок полого волокна, 3 - место соединения отрезка полого волокна и стеклянного капилляра.Figure 1. Scheme of a device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber. 1 - a glass capillary, 2 - a segment of a hollow fiber, 3 - the junction of a segment of a hollow fiber and a glass capillary.

Фигура 2. Место соединения отрезка полого волокна и стеклянного капилляра. 1 - стеклянный капилляр, 2 - полое волокно, 3 - место соединения отрезка полого волокна и стеклянного капилляра. Фото под стереомикроскопом, длина шкалы 200 мкм.Figure 2. The junction of a segment of a hollow fiber and a glass capillary. 1 - a glass capillary, 2 - a hollow fiber, 3 - the junction of a segment of a hollow fiber and a glass capillary. Photo under a stereo microscope, scale length 200 microns.

Фигура 3. Эмбрионы крупного рогатого скота, загруженные в отрезок полого волокна в растворе для эквилибрации. 2 - полое волокно, 4 - эмбрионы, 5 - пузырьки воздуха, 6 - раствор для эквилибрации. Фото под стереомикроскопом, длина шкалы 200 мкм.Figure 3. Cattle embryos loaded into a length of a hollow fiber in an equilibration solution. 2 - hollow fiber, 4 - embryos, 5 - air bubbles, 6 - solution for balancing. Photo under a stereo microscope, scale length 200 microns.

Фигура 4. Модифицированное устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна, на основе чехла 1. А) Материалы для изготовления чехла: 7 - криосоломинка объемом 0,25 мл, 8 - криосоломинка объемом 0,5 мл, 9 - серологическая пипетка. Б) Детали чехла: 10 - отрезок криосоломинки объемом 0,5 мл, 11 - отрезок криосоломинки объемом 0,25 мл, 12 - полоска, вырезанная из груши серологической пипетки. В) Чехол в собранном виде: 12 - полиэтиленовая полоска, находящаяся между отрезками криосоломинок, 13 - расплющенный участок отрезка криосоломинки объемом 0,25 мл, 14 - место соединения отрезков криосоломинок, 15 - метка на чехле. Г) Положение устройства на этапах хранения и транспортировки в жидком азоте витрифицированных эмбрионов млекопитающих: 1 - стеклянный капилляр, 16 - метка на стеклянном капилляре, 17а - чехол 1. Д) Положение устройства на этапах витрификации и отогревания эмбрионов: 1 - стеклянный капилляр, 2 - отрезок полого волокна, 17а - чехол 1.Figure 4. A modified device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber, based on cover 1. A) Materials for the manufacture of cover: 7 - cryosulphine with a volume of 0.25 ml, 8 - cryosulphine with a volume of 0.5 ml , 9 - serological pipette. B) Details of the case: 10 - a segment of a cryosulphine with a volume of 0.5 ml, 11 - a segment of a cryosomine with a volume of 0.25 ml, 12 - a strip cut from a pear of a serological pipette. C) The case in assembled form: 12 - a polyethylene strip located between the segments of cryosolines, 13 - a flattened section of the segment of cryosolines with a volume of 0.25 ml, 14 - the junction of the segments of cryosolines, 15 - the mark on the cover. D) The position of the device at the stages of storage and transportation of vitrified mammalian embryos in liquid nitrogen: 1 - glass capillary, 16 - mark on the glass capillary, 17a - cover 1. E) The position of the device at the stages of vitrification and heating of embryos: 1 - glass capillary, 2 - a segment of a hollow fiber, 17a - cover 1.

Фигура 5. Система для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна. А) Составляющие части Системы. 18 - модифицированное устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна, 19 - контейнер. Б) Система для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна в собранном виде. 1 - стеклянный капилляр, 19 - контейнер. В) Верхняя часть Системы для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна, в увеличенном виде: 1 - стеклянный капилляр, 19 - контейнер.Figure 5. The system for cryopreservation of a group of oocytes and mammalian embryos by the method of vitrification when used as a carrier of hollow fiber. A) The constituent parts of the System. 18 is a modified device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber, 19 is a container. B) A system for cryopreservation of a group of oocytes and mammalian embryos by the method of vitrification when used as a carrier of the hollow fiber in assembled form. 1 - glass capillary, 19 - container. C) The upper part of the System for cryopreservation of a group of mammalian oocytes and embryos by the method of vitrification when using hollow fiber as a carrier, in an enlarged form: 1 - glass capillary, 19 - container.

Фигура 6. Модифицированное устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна, на основе чехла 2. А) Материалы для изготовления чехла: 7 - криосоломинка объемом 0,25 мл, 20 - пластиковая пипетка. Б) Детали чехла: 11 - отрезок криосоломинки, 13 - расплющенный участок отрезка криосоломинки, 21 - отрезок пипетки. В) Чехол в собранном виде: 13 - расплющенный участок отрезка криосоломинки, 22 - место соединения отрезков криосоломинки и пипетки. Г) Положение устройства на этапах хранения и транспортировки в жидком азоте витрифицированных эмбрионов: 1 -стеклянный капилляр, 16 - метка на стеклянном капилляре, 176 - чехол 2. Д) Положение устройства на этапах витрификации и отогревания эмбрионов: 1 - стеклянный капилляр, 2 - отрезок полого волокна, 176 - чехол 2.Figure 6. Modified device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when using hollow fiber as a carrier, based on a cover 2. A) Materials for making a cover: 7 - cryosulphine with a volume of 0.25 ml, 20 - plastic pipette. B) Details of the cover: 11 - a segment of a cryosulphine, 13 - a flattened section of a segment of a cryosomine, 21 - a segment of a pipette. C) The case in assembled form: 13 - a flattened section of a segment of a cryosolina, 22 - a junction of segments of a cryosolina and a pipette. D) The position of the device at the stages of storage and transportation of vitrified embryos in liquid nitrogen: 1 - glass capillary, 16 - mark on the glass capillary, 176 - cover 2. E) The position of the device at the stages of vitrification and heating of embryos: 1 - glass capillary, 2 - piece of hollow fiber, 176 - cover 2.

Фигура 7. Размещение в гоблете Системы для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна. Длина гоблета - 12 см, диаметр - 1,3 см. А) Вид сбоку. Б) Вид сверху. 23 - гоблет, 24 - выступающий из гоблета кончик Системы для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна. В одном гоблете может быть размещено одновременно 4 контейнера разного цвета с МУЗВО.Figure 7. Placement in goblet Systems for cryopreservation of a group of oocytes and mammalian embryos by the method of vitrification when used as a carrier of hollow fiber. Goblet length - 12 cm, diameter - 1.3 cm. A) Side view. B) Top view. 23 — goblet, 24 — tip of the goblet protruding from the goblet. Systems for cryopreservation of a group of mammalian oocytes and embryos by the method of vitrification when using hollow fiber as a carrier. In one goblet, 4 containers of different colors with MUZVO can be placed simultaneously.

Список условных обозначений:List of conventions:

1 - стеклянный капилляр1 - glass capillary

2 - отрезок полого волокна2 - a segment of a hollow fiber

3 - место соединения отрезка полого волокна и стеклянного капилляра3 - junction of a segment of a hollow fiber and a glass capillary

4 - эмбрионы4 - embryos

5 - пузырьки воздуха5 - air bubbles

6 - раствор для эквилибрации6 - solution for balancing

7 - криосоломинка объемом 0,25 мл7 - cryosolina with a volume of 0.25 ml

8 - криосоломинка объемом 0,5 мл8 - cryosolina with a volume of 0.5 ml

9 - серологическая пипетка9 - serological pipette

10 - отрезок криосоломинки объемом 0,5 мл10 - a piece of cryosolina with a volume of 0.5 ml

11 - отрезок криосоломинки объемом 0,25 мл11 - a piece of cryosolina with a volume of 0.25 ml

12 - полоска, вырезанная из груши серологической пипетки12 - a strip cut from a pear of a serological pipette

13 - расплющенный участок отрезка криосоломинки объемом 0,25 мл13 is a flattened section of a segment of cryosolines with a volume of 0.25 ml

14 - место соединения отрезков криосоломинок14 - the junction of the segments of cryosolines

15 - метка на чехле15 - label on the cover

16 - метка на стеклянном капилляре16 - mark on a glass capillary

17а - чехол 117a - case 1

17б - чехол 217b - case 2

18 - модифицированное устройство для загрузки, витрификации и отогревания группы эмбрионов при использовании в качестве носителя полого волокна18 is a modified device for loading, vitrifying and heating a group of embryos when used as a carrier of hollow fiber

19 - контейнер19 - container

20 - пластиковая пипетка20 - plastic pipette

21 - отрезок пипетки21 - pipette section

22 - место соединения отрезков криосоломинки и пипетки22 - the junction of the segments of cryosolines and pipettes

23 - гоблет23 - goblet

24 - выступающий из гоблета кончик Системы для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна.24 — tip of the system protruding from the goblet; Cryopreservation of a group of mammalian oocytes and embryos by the method of vitrification when using hollow fiber as a carrier.

Список литературыBibliography

1. Saragusty J., Arav A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 2011; 141: 1-19.1. Saragusty J., Arav A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 2011; 141: 1-19.

2. Kim et al. Successful vitrification of bovine blastocysts on paper container. Theriogenology. 2012; 78: 1085-10931.2. Kim et al. Successful vitrification of bovine blastocysts on paper container. Theriogenology. 2012; 78: 1085-10931.

3. Matsunari et al. Hollow fiber vitrification: A novel method for vitrifying multiple embryos in a single device. J. Reprod. Dev. 2012; 58: 599-608.3. Matsunari et al. Hollow fiber vitrification: A novel method for vitrifying multiple embryos in a single device. J. Reprod. Dev. 2012; 58: 599-608.

4. Maehara et al. Hollow fiber vitrification provides a novel method for cryopreserving in vitro maturation/fertilization-derived porcine embryos. Biol. Reprod. 2012; 87: 133, 1-8.4. Maehara et al. Hollow fiber vitrification provides a novel method for cryopreserving in vitro maturation / fertilization-derived porcine embryos. Biol. Reprod. 2012; 87: 133, 1-8.

5. Beck et al. Hollow fiber vitrification of biopsied in vitro produced bovine blastocysts. Reproductive Biology. 2013; 13S: 57.5. Beck et al. Hollow fiber vitrification of biopsied in vitro produced bovine blastocysts. Reproductive Biology. 2013; 13S: 57.

6. Wakayama et al. Practical application of the hollow fiber vitrification method for cryopreservation of mammalian embryos. Reprod. Fertil. Dev. 2013; 26: 138-139.6. Wakayama et al. Practical application of the hollow fiber vitrification method for cryopreservation of mammalian embryos. Reprod. Fertil. Dev. 2013; 26: 138-139.

7. Kuwayama et al. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod. Biomed. Online. 2005; 11: 300-308.7. Kuwayama et al. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod. Biomed. Online 2005; 11: 300-308.

Claims

1. A device for loading, vitrifying and warming a group of mammalian embryos when used as a carrier of hollow fiber, consisting of a piece of hollow fiber with a diameter of 180-200 microns and a capillary with a diameter of 1.00-1.50 mm, length 7.00-10.00 see, with a cone-shaped tip, the outer diameter of which does not exceed the inner diameter of the fiber used, characterized in that the length of the hollow fiber is attached directly to the disposable capillary by putting the length of the hollow fiber on the conical tip.

2. The device according to claim 1, characterized in that the capillary with a conical tip is made of glass.

3. The device according to any one of paragraphs. 1, 2, characterized in that the forced separation of the segment of the hollow fiber is achieved by breaking off the tip of the capillary remaining in the segment of the hollow fiber, while the place of introduction of the conical tip of the capillary serves as a convenient place to capture a segment of the hollow fiber with tweezers during vitrification-heating of a group of embryos.

4. A device for cryopreservation of a group of mammalian embryos when used as a hollow fiber carrier, which is a modified device for loading, vitrification and heating of a group of mammalian embryos when used as a hollow fiber carrier, consisting of the Device according to any one of claims. 1-3 and a cover, characterized in that the cover, made mainly of plastic materials suitable for use in liquid nitrogen, is a thin-walled cylindrical tube, length 5.50-6.50 cm, having a variable diameter: part of the tube about 2.50-3.00 cm has an inner diameter of 0.25-0.30 cm, the other part has an inner diameter of 0.11-0.17 cm, both parts of the tube are stationary relative to each other, excluding jamming of parts during operation, their the border is marked, on the outer edge of the cover part of a smaller diameter There is a narrowed section with a length of about 0.20 cm that is used for fastening on the capillary, while the cover and capillary retain the ability to move relative to each other while maintaining mutual orientation, providing the required position of the length of the hollow fiber relative to the cover.

5. The device according to p. 4, characterized in that the cover is made as follows: a length of 3.50 cm cryosulphins with a volume of 0.25 ml is inserted inside a length of 5.50 cm cryosulphins with a volume of 0.50 ml to a depth of 2.50 cm, place a polyethylene strip between their walls, receiving a design whose details are fixed relative to each other, a mark is applied to the outer wall of the 0.50 ml cryosulphon segment, the position indicating the position of the end of the 0.25 ml cryosulphine in its lumen, the end of the 0-protruding cryosun segment , 25 ml rasp flax crosswise with Impulse Sealer AVT200, CAS Corporation, Korea, bag sealer in 0.5 mode.

6. The device according to p. 4, characterized in that the case is made as follows: from the elongated part of the Transfer pipette, consisting of three cylindrical sections converging into each other: the tip of the pipette is about 1.5 cm long (inner diameter is about 1.5 mm ), a second section with a length of about 1.0 cm (inner diameter of about 2.0 mm), a third section with a length of about 8.0 cm (inner diameter of about 3.7 mm), a pipette section of 4.50 cm long was prepared, consisting of a second section (1.00 cm) and the adjacent portion of the third section (3.50 cm) yayut pipet into the lumen of the segment from the smaller diameter portion is advanced inwardly to a depth of 1.50 cm, an outwardly projecting wall portion kriosolominki flattened in the transverse direction using the welder packets Impulse Sealer AVT200, CAS Corporation, Korea, in 0.5 mode.

7. A system for cryopreservation of a group of oocytes and mammalian embryos by the method of vitrification when used as a carrier of a hollow fiber, consisting of a Device according to any one of paragraphs. 4-6 and the container, characterized in that the container is a cylindrical thin-walled tube with a length of 12.50-13.50 cm, having a diameter not exceeding 3 times the diameter of the cover, made of plastic material, closed on one side, which is placed The device according to any one of paragraphs. 4-6, providing compact placement of the Device according to any one of paragraphs. 4-6 in the cryogenic storage, the constant location of the length of the hollow fiber Device according to any one of paragraphs. 1-3 with verified embryos within liquid nitrogen, excluding the possibility of explosive accumulation of nitrogen vapor.

8. The system according to p. 7, characterized in that the container at the open end has an oblique slice 3.0-4.0 cm long.

9. The system according to p. 7, characterized in that the container is made of painted plastic mass.