RU2581794C1

RU2581794C1 - Method of improving efficiency of baculovirus drugs

Info

Publication number: RU2581794C1
Application number: RU2015117874/10A
Authority: RU
Inventors: Владимир Владимирович Оберемок
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2016-04-20

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention relates to protection of plants. Disclosed is method of increasing efficiency of baculovirus preparations. Method involves infecting insects with nuclear polyhedral disease virus, for this purpose worms of I-III ages are fed during 2 days with nutrient medium containing 10³-10⁴ polyhedron per 1 mg of medium. In 2-5 days after infection external treatment of insect is performed using spray gun with aqueous solution of conservative short 18 nucleotides with length of gypsy moth nuclear polyhedral disease virus antisense fragment antiapoptotic gene of IAP-3 with sequence of 5′-CGACGTGGTGGCACGGCG-3′ in concentration of 10 pmol/mql.

EFFECT: invention provides faster action of baculovirus preparations.

1 cl

Description

Изобретение относится к области защиты растений, и может быть использовано в технологиях применения инсектицидных препаратов на основе бакуловирусов, повышая их эффективность.The invention relates to the field of plant protection, and can be used in technologies for the use of insecticidal preparations based on baculoviruses, increasing their effectiveness.

На сегодняшний день большинство бакуловирусных препаратов не находят широкого применения из-за медленного действия на целевых насекомых, а также дорогой технологии производства таких препаратов. Между тем именно бакуловирусы обладают высокой избирательностью в действии и являются природным регулятором численности многих серьезных насекомых-вредителей, таких как непарный шелкопряд, хлопковая совка, американская белая бабочка и др. Много исследований направлено на увеличение скорости действия бакуловирусных препаратов путем генетической модификации вирусов. Благодаря системе своих антиапоптозных генов бакуловирусы эффективно сдерживают апоптоз клеток хозяина, что дает им возможность выиграть время для репликации, и этот же факт снижает скорость действия бакуловирусных препаратов.Today, most baculovirus preparations are not widely used due to the slow action on target insects, as well as the expensive technology for the production of such drugs. Meanwhile, it is baculoviruses that have high selectivity in action and are a natural regulator of the number of many serious insect pests, such as unmatched silkworms, cotton scoops, American white butterflies, etc. Many studies have focused on increasing the speed of action of baculovirus drugs through genetic modification of viruses. Due to the system of their anti-apoptotic genes, baculoviruses effectively inhibit the apoptosis of host cells, which gives them the opportunity to gain time for replication, and this fact also reduces the speed of action of baculovirus drugs.

Известен способ повышения эффективности действия бакуловирусных препаратов [Gramkow A.W., Perecmanis S., Sousa R.L.B., Noronha E.F., Felix C. R., Nagata Т., Ribeiro B.M. (2010). Insecticidal activity of two proteases against Spodoptera frugiperda larvae infected with recombinant baculoviruses. Virol. J. 29(7):143], в котором используются рекомбинантные бакуловирусы, получаемые путем биотехнологических приемов, таких как амплификация необходимого гена и его встраивание в целевой бакуловирус.A known method of increasing the effectiveness of baculovirus drugs [Gramkow A.W., Perecmanis S., Sousa R.L. B., Noronha E.F., Felix C. R., Nagata T., Ribeiro B.M. (2010). Insecticidal activity of two proteases against Spodoptera frugiperda larvae infected with recombinant baculoviruses. Virol. J. 29 (7): 143], which uses recombinant baculoviruses obtained by biotechnological techniques, such as amplification of the desired gene and its integration into the target baculovirus.

Недостатками этого метода являются дороговизна предлагаемого подхода и возможные экологические риски, связанные с применением генетически модифицированных бакуловирусов.The disadvantages of this method are the high cost of the proposed approach and the possible environmental risks associated with the use of genetically modified baculoviruses.

Техническим результатом изобретения является увеличение скорости действия бакуловирусных препаратов. За счет изменения технологических приемов обеспечивается быстрая смертность целевого насекомого-вредителя - непарного шелкопряда.The technical result of the invention is to increase the rate of action of baculovirus preparations. Due to changes in technological methods, the fast mortality of the target insect pest - unpaired silkworms is ensured.

Поставленная задача решается таким образом, что способ повышения эффективности бакуловирусных препаратов включает предварительное заражение непарного шелкопряда вирусом ядерного полиэдроза, для чего в течение 2-х дней гусениц кормят питательной средой, содержащей 10³-10⁴ полиэдров на 1 мг среды, через 2-5 дней после этого пульверизатором осуществляют наружную обработку насекомого водным раствором короткого 18 нуклеотидов длиной консервативного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда с последовательностью 5′-CGACGTGGTGGCACGGCG-3′ в концентрации 10 пмоль/мкл таким образом, чтобы на гусеницу I-III возрастов попало не менее 0,1-0,3 мкл раствора.The problem is solved in such a way that a method of increasing the efficiency of baculovirus preparations involves pre-infection of unpaired silkworms with nuclear polyhedrosis virus, for which caterpillars are fed with nutrient medium containing 10 ³ -10 ⁴ polyhedra per 1 mg of medium for 2 days, after 2-5 days after this, the insect is external treated with an aqueous solution of a short 18 nucleotides long of a conservative antisense fragment of the antiapoptotic gene of the nuclear polyhedrosis virus of unpaired silkworm and with the sequence 5'-CGACGTGGTGGCACGGCG-3 'at a concentration of 10 pmol / l so as to hit at least at 0.1-0.3 l of a solution caterpillar I-III ages.

Причинно-следственная связь между отличительными признаками изобретения и достигаемым техническим результатом заключается в том, что антисмысловой фрагмент антиапоптозного гена бакуловируса смещает биохимические реакции зараженных клеток насекомого (в наших экспериментах - непарного шелкопряда) в сторону апоптоза, однако детали механизма смещения этих реакций в науке на данный момент окончательно не выяснены.The causal relationship between the distinguishing features of the invention and the technical result achieved is that the antisense fragment of the anti-apoptotic baculovirus gene shifts the biochemical reactions of infected insect cells (in our experiments, unpaired silkworms) towards apoptosis, however, the details of the mechanism of bias of these reactions in science to this moment is not finally clarified.

Автором заявляемого технического решения впервые выявлено достоверное инсектицидное влияние короткого антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза на зараженных этим вирусом гусениц его хозяина - непарного шелкопряда. И поскольку влияние этого фрагмента на зараженных гусениц непарного шелкопряда выявлено впервые, это доказывает существенность отличий.The author of the claimed technical solution for the first time revealed a reliable insecticidal effect of a short antisense fragment of the antiapoptotic gene IAP-3 of the nuclear polyhedrosis virus on the caterpillars infected by this virus of its host - unpaired silkworm. And since the effect of this fragment on infected caterpillars of unpaired silkworms was detected for the first time, this proves the significance of the differences.

Пример конкретного осуществления способаAn example of a specific implementation of the method

Для эксперимента на Южном берегу Крыма была собрана яйцекладка непарного шелкопряда Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae). Гусеницы до обработки фрагментами ДНК были заражены вирусом ядерного полиэдроза, для чего в течение 2-х дней гусениц кормили питательной средой, содержащей 10⁴ полиэдров на 1 мг среды. В среднем, для каждого варианта группы эксперимента было использовано 20-25 гусениц 1-го личиночного возраста. Через 2 дня на насекомых с помощью пульверизатора был нанесен водный раствор фрагментов ДНК в концентрации 10 пмоль/мкл в количестве не менее 0,1-0,3 мкл на гусеницу. Последовательность примененного антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 (Inhibitor of Apoptosis, ингибитор апоптоза) вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда была следующей: 5′-CGA CGT GGT GGC ACG GCG-3′. Гусеницы из контрольных групп были обработаны водой или олигонуклеотидами со следующими последовательностями: 5′-CG CG CG CG CG CG CG CG CG-3′, 5′-GCT GCA CCA CCG TGC CGC-3′. Фрагменты были синтезированы компанией Metabion international AG (Германия) с очисткой HPLC. Все насекомые выращивались на стандартной питательной среде, основанной на проростках пшеницы при температуре 25°С. Для заражения насекомых был использован бакуловирусный препарат "ВИРИН-НШ" (Россия). Для обнаружения эффективности заражения вирусом ядерного полиэдроза непарного шелкопряда была применена полимеразная цепная реакция и пара специфических праймеров: 5′-ACG ТТС TCG TTG AAC GTG CTG-3′ и 5′-CTG GTG AAC САС AAA АСС CTG-3′. Был использован χ²-критерий Пирсона с поправкой Йетса для оценивания инсектицидного действия фрагментов ДНК. Эксперимент повторили трижды.For the experiment on the southern coast of Crimea, the egg-laying of the unpaired silkworm Lymantria dispar (Lepidoptera: Erebidae) was collected. Before treatment with DNA fragments, the caterpillars were infected with the nuclear polyhedrosis virus, for which the caterpillars were fed a nutrient medium containing 10 ⁴ polyhedra per 1 mg of medium for 2 days. On average, 20-25 caterpillars of the 1st larval age were used for each variant of the experimental group. After 2 days, an aqueous solution of DNA fragments at a concentration of 10 pmol / μl in an amount of not less than 0.1-0.3 μl per track was applied to insects using a spray gun. The sequence of the antisense fragment of the antiapoptotic gene IAP-3 (Inhibitor of Apoptosis, apoptosis inhibitor) of the unpaired silkworm nuclear polyhedrosis virus was as follows: 5′-CGA CGT GGT GGC ACG GCG-3 ′. Caterpillars from the control groups were treated with water or oligonucleotides with the following sequences: 5′-CG CG CG CG CG CG CG CG CG-3 ′, 5′-GCT GCA CCA CCG TGC CGC-3 ′. Fragments were synthesized by Metabion international AG (Germany) with HPLC purification. All insects were grown on a standard nutrient medium based on wheat seedlings at a temperature of 25 ° C. To infect insects, the baculovirus preparation VIRIN-NSh (Russia) was used. A polymerase chain reaction and a pair of specific primers were used to detect the effectiveness of infection of the nuclear polyhedrosis virus of unpaired silkworm: 5′-ACG TTC TCG TTG AAC GTG CTG-3 ′ and 5′-CTG GTG AAC CAC AAA ACC CTG-3 ′. The Pearson χ ² test with Yates correction was used to evaluate the insecticidal effect of DNA fragments. The experiment was repeated three times.

Эксперимент впервые выявил достоверное инсектицидное влияние антисмыслового фрагмента антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза на зараженных этим бакуловирусом гусениц непарного шелкопряда по сравнению с контрольной группой, содержащей зараженных вирусом гусениц, обработанных водой. Наоборот, два контрольных олигонуклеотида не обнаружили достоверного инсектицидного действия на зараженных бакуловирусом гусениц непарного шелкопряда по сравнению с контролем в течение 14 дней исследования. Впервые достоверность в смертности по сравнению с контролем возникла на 7 день в группе зараженных бакуловирусом гусениц непарного шелкопряда и обработанных антисмысловым фрагментом антиапоптозного гена IAP-3 вируса и составила 74,1% против 53,3% в контроле (χ²=5,51; N=138; Р<0,05); в течение следующих 7 дней разница в смертности повысилась и составила 87,9% против 63,3% в контроле (χ²=9,62; N=138; Р<0,01). Таким образом, на фоне бакуловирусной инфекции антисмысловой фрагмент антиапоптозного гена IAP-3 вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда проявил достоверное инсектицидное действие на гусениц непарного шелкопряда.The experiment for the first time revealed a reliable insecticidal effect of the antisense fragment of the antiapoptotic gene IAP-3 of the nuclear polyhedrosis virus on unpaired silkworm caterpillars infected with this baculovirus compared to the control group containing virus-treated caterpillars treated with water. On the contrary, two control oligonucleotides did not show a significant insecticidal effect on baculovirus infected unpaired silkworm caterpillars compared with the control within 14 days of the study. Reliability in mortality for the first time as compared to control arose on day 7 in the group of baculovirus-infected unmatched silkworm caterpillars and treated with an antisense fragment of the anti-apoptotic gene IAP-3 virus and amounted to 74.1% versus 53.3% in the control (χ ² = 5.51; N = 138; P <0.05); over the next 7 days, the difference in mortality increased and amounted to 87.9% versus 63.3% in the control (χ ² = 9.62; N = 138; P <0.01). Thus, against the background of baculovirus infection, the antisense fragment of the antiapoptotic gene IAP-3 of the unpaired silkworm nuclear polyhedrosis virus showed a significant insecticidal effect on the unpaired silkworm caterpillars.

По сравнению с прототипом заявленный способ повышения эффективности бакуловирусных препаратов отличается большей доступностью и представляется экологически более безопасным.Compared with the prototype of the claimed method of increasing the effectiveness of baculovirus drugs is more accessible and seems environmentally safer.

Полученные результаты показывают возможность совместного применения бакуловирусных препаратов и антисмысловых фрагментов антиапоптозных генов бакуловирусов в практике сельского и лесного хозяйства с целью защиты растений.The results show the possibility of the joint use of baculovirus preparations and antisense fragments of antiapoptotic baculovirus genes in agricultural and forestry practice in order to protect plants.

Claims

A method of increasing the effectiveness of baculovirus preparations, including the use of polyhedra of the nuclear polyhedrosis virus, selectively acting on the gill silkworm caterpillars, characterized in that the insects are first infected with the nuclear polyhedrosis virus, for which they feed the caterpillars I-III ages for 2 days with a nutrient medium containing 10 ³ -10 ⁴ polyhedra per 1 mg of medium, 2-5 days after this, the insect is external treated with an aqueous solution of a conservative short 18 nucleotides for another antisense fragment of the antiapoptotic gene IAP-3 of the virus of unpaired silkworm with the sequence 5′-CGACGTGGTGGCACGGCG-3 ′ at a concentration of 10 pmol / μl.