RU2580612C2

RU2580612C2 - Method for emergency fluorescent differential immunocytochemical diagnosis of cancer metastases in lymph nodes and non-hodgkin lymphoma

Info

Publication number: RU2580612C2
Application number: RU2015114343/15A
Authority: RU
Inventors: Андрей Дмитриевич Каприн; Елена Николаевна Славнова; Надежда Николаевна Волченко; Виктор Викторович Соколов; Сергей Александрович Соколов; Виктор Ильич Казакевич
Priority date: 2015-04-17
Filing date: 2015-04-17
Publication date: 2016-04-10
Also published as: RU2015114343A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, specifically to oncology, and can be used for differential diagnostics of cancer metastases and non-Hodgkin lymphomas. Cellular material from lymph nodes samples is placed in a storage medium consisting of Hank's solution, rheopolyglucin and albumin, mixed in equal volumes. Cell suspension is added in amount of 100 ml each to bottom of two test tubes, followed by adding 5 mcl of a monoclonal antibody Ber EP4 FITC to one test tube and 5 mcl of a monoclonal antibody CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC to another test tube, mixing with material 5, incubating for 20 min at t° 2-8 °C. Cell suspension is then distributed at 50-100 mcl and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, preparation is prepared from sediment, which is coloured by nuclear fluorescent dye Dapi and fluorescent microscopy. For positive expression on cell membranes of epithelial marker Ber EP4 FITC - diagnose cancer metastasis, and in case of positive expression in membranes common leukocyte antigen CD45 cells, Leucocyte Common Antigen/FITC and absence of expression on cell membranes of epithelial marker Ber EP4 FITC - diagnose non-Hodgkin's lymphoma.

EFFECT: use of present method enables to quickly make a differential diagnosis of cancer metastasis and lymphoma of lymph nodes in order to determine prevalence of cancer.

1 cl, 2 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к срочному исследованию опухолевых клеток в измененных лимфатических узлах для дифференциальной диагностики метастазов рака и неходжкинских лимфом с использованием двух флуоресцентных иммуноцитохимических маркеров (эпителиального маркера Ber-EP4 FITC и CD45, общего лейкоцитарного маркера Leucocyte Common Antigen/FITC) во время эндоскопического исследования или операции.The invention relates to laboratory diagnostics, namely, an urgent study of tumor cells in altered lymph nodes for the differential diagnosis of cancer metastases and non-Hodgkin's lymphomas using two fluorescent immunocytochemical markers (Berit-EP4 FITC and CD45 epithelial marker, Leucocyte Common Antigen / Leukocyte common antigen / common leukocyte marker) during endoscopic examination or surgery.

Срочная дифференциальная флуоресцентная иммунопатологическая диагностика (ФИЦХ) во время операции или эндоскопического исследования между метастатическим поражением лимфатических узлов и неходжкинскими лимфомами позволяет принять правильное решение в отношении лечения больного, получить адекватный материал для планового морфологического, иммуноморфологического исследования.An urgent differential fluorescence immunopathological diagnosis (FIC) during an operation or endoscopic examination between a metastatic lesion of the lymph nodes and non-Hodgkin lymphomas allows you to make the right decision regarding the treatment of the patient, to obtain adequate material for a planned morphological, immunomorphological study.

Известен способ мультиплексной детекции опухолевых клеток с использованием панели агентов, связывающихся с внеклеточными маркерами. К образцу добавляют панель меченых агентов, которые связываются с двумя или более маркерами, экспрессируемыми на поверхности клетки, где, по меньшей мере, один из агентов является специфичным к раку и где панель содержит: один или нескольких агентов, связывающихся с рак специфичными маркерами, экспрессируемыми на поверхности раковой клетки толстой кишки, где один агент или один из агентов является агентом, связывающимся с СА 19-9, и один или нескольких агентов, связывающихся с тканеспецифичными маркерами, которые являются эпителиальными и/или мезенхимальными экспрессируемыми на поверхности клетки, где один агент или один из агентов является агентом, связывающимся с Ер-САМ. Набор, содержащий один или несколько агентов, связывающийся с внеклеточными рак специфичными маркерами, где один агент или один из агентов является антителом или фрагментом антитела, связывающимся с СА 19-9, и один или нескольких агентов, связывающихся с внеклеточными тканеспецифичными маркерами, которые являются эпителиальными маркерами и/или мезенхимальными маркерами, где один агент или один из агентов является антителом или фрагментом антитела, связывающимся с Ер-САМ (RU 2489720 С2).A known method of multiplex detection of tumor cells using a panel of agents that bind to extracellular markers. A panel of labeled agents is added to the sample that binds to two or more markers expressed on the cell surface, where at least one of the agents is specific for cancer and where the panel contains: one or more agents that bind to cancer with specific markers expressed on the surface of colon cancer cells, where one agent or one of the agents is an agent that binds to CA 19-9, and one or more agents that bind to tissue-specific markers that are epithelial and / whether mesenchymal expressed on the cell surface, wherein one agent or one of the agents is an agent which binds to Ep-CAM. A kit containing one or more agents that bind to extracellular cancer with specific markers, where one agent or one of the agents is an antibody or antibody fragment that binds to CA 19-9, and one or more agents that bind to extracellular tissue-specific markers that are epithelial markers and / or mesenchymal markers, where one agent or one of the agents is an antibody or antibody fragment that binds to Ep-CAM (RU 2489720 C2).

Однако известный способ диагностики занимает много времени и является дорогостоящим, т.к. для исследования используют несколько традиционных нефлуоресцентных маркеров.However, the known diagnostic method takes a lot of time and is expensive, because For research, several traditional non-fluorescent markers are used.

Самым близким к заявляемому является способ диагностики рака, в частности для идентификации и обнаружения метастазов, таких как рак молочной железы, яичника, матки, толстой кишки, легких. Исследование проводят с помощью иммунофлуоресцентного анализа по биологическим образцам крови, лимфы или лимфатических узлов и костного мозга (AU 2012201538). Используется ASC-зонд, являющееся моноклональным антителом, против антигенов рака. Данный маркер выявляется с помощью иммунофлуоресцентного анализа, поскольку может быть помечен флуоресцентной меткой. Для очистки антигена рака используют аффинную хроматографию.Closest to the claimed is a method for diagnosing cancer, in particular for the identification and detection of metastases, such as cancer of the breast, ovary, uterus, colon, lung. The study is carried out using immunofluorescence analysis of biological samples of blood, lymph or lymph nodes and bone marrow (AU 2012201538). An ASC probe, a monoclonal antibody, is used against cancer antigens. This marker is detected by immunofluorescence analysis, as it can be labeled with a fluorescent label. Affinity chromatography is used to purify cancer antigen.

Однако известный способ диагностики является весьма трудоемким и долгим по времени, поскольку предполагает самостоятельное получение антител к клеткам рака, использование аффинной хроматографии для выявления ракового антигена, присутствующего в смеси раковых клеток, что невозможно применить в условиях срочного исследования при проведении бронхоскопии или операции. Кроме того, данный способ диагностики не предусматривает использование двух антигенов для срочной дифференциальной диагностики метастазов рака и неходжкинских лимфом.However, the known diagnostic method is very time-consuming and time-consuming, since it involves the independent production of antibodies to cancer cells, the use of affinity chromatography to detect cancer antigen present in a mixture of cancer cells, which cannot be applied under urgent conditions during bronchoscopy or surgery. In addition, this diagnostic method does not provide for the use of two antigens for urgent differential diagnosis of cancer metastases and non-Hodgkin's lymphomas.

Задачей изобретения является разработка надежного и быстрого метода диагностики метастатического поражения лимфатических узлов и неходжкинских лимфом.The objective of the invention is to develop a reliable and quick method for the diagnosis of metastatic lesions of the lymph nodes and non-Hodgkin's lymphomas.

Указанная задача достигается тем, что для получения клеточной суспензии, клеточный материал помещают в питательную среду накопления, состоящую из раствора Хенкса, реоплиглюкина и альбумина, смешанных в равных объемах, клеточную суспензию вносят по 100 мл на дно двух пробирок, добавляют 5 мкл моноклонального антитела Ber ЕР4 FITC в одну пробирку и 5 мкл моноклонального антитела CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC в другую пробирку, материал 5 с перемешивают, инкубируют 20 мин при t° 2-8°C, затем взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, из осадка готовят препарат, которые окрашивают ядерным флюоресцентным красителем Dapi и осуществляют их флуоресцентную микроскопию, при положительной экспрессии на мембранах клеток эпителиального маркера Ber ЕР4 FITC - диагностируют метастазы рака, а в случае положительной экспрессии на мембранах клеток общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC и отсутствия экспрессии на мембранах клеток эпителиального маркера Ber ЕР4 FITC - диагностируют неходжкинскую лимфому.This task is achieved in that in order to obtain a cell suspension, the cellular material is placed in a growth medium consisting of Hanks solution, reopgligukin and albumin mixed in equal volumes, the cell suspension is added 100 ml to the bottom of two tubes, 5 μl of Ber monoclonal antibody is added EP4 FITC in one tube and 5 μl of monoclonal antibody CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC in another tube, mix 5 s, incubate for 20 min at t ° 2-8 ° C, then the cell suspension is dispensed in 50-100 μl and centrifuged at 1000 rpm in those 5 min, a preparation is prepared from the precipitate, which is stained with Dapi nuclear fluorescent dye and their fluorescence microscopy is performed, with positive expression on the cell membranes of the epithelial marker Ber EP4 FITC - cancer metastases are diagnosed, and in the case of positive expression on the cell membranes of the general leukocyte antigen CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC and the lack of expression on the cell membranes of the epithelial marker Ber EP4 FITC - diagnose non-Hodgkin's lymphoma.

Изобретение поясняется подробным описанием, клиническими примерами и иллюстрацией, на которой изображено:The invention is illustrated by a detailed description, clinical examples and illustration, which depicts:

Фиг. 1 - Положительная экспрессия общего лейкоцитарного антитела Leucocyte Common Antigen/FITC клетками неходжкинской лимфомы, видно зеленое свечение мембран лимфоидных клеток при флуоресцентной микроскопии.FIG. 1 - Positive expression of the total leukocyte antibody Leucocyte Common Antigen / FITC by non-Hodgkin lymphoma cells, green fluorescence of lymphoid cell membranes is visible under fluorescence microscopy.

Фиг. 2 - Положительная экспрессия моноклонального антитела Ber ЕР4 FITC клетками рака при метастатическом поражении лимфатического узла, видно зеленое свечение мембран клеток рака при флуоресцентной микроскопии.FIG. 2 - Positive expression of the monoclonal antibody Ber EP4 FITC by cancer cells with metastatic damage to the lymph node, a green glow of cancer cell membranes is seen under fluorescence microscopy.

Объектом цитологического исследования служат интраоперационные соскобы с поверхности разреза лимфатического узла, либо тонкоигольные аспирационные биоптаты лимфатических узлов. Обязательными условиями адекватного исследования лимфатических узлов являются продольные многоступенчатые разрезы и соскоб со всей поверхности лимфатического узла. Пункцию лимфатических узлов осуществляет хирург под контролем эндоУЗИ при срочном эндоскопическом исследовании.The object of the cytological study is intraoperative scrapings from the surface of the incision of the lymph node, or fine-needle aspiration biopsy specimens of the lymph nodes. Mandatory conditions for an adequate examination of the lymph nodes are longitudinal multi-stage incisions and scraping from the entire surface of the lymph node. Puncture of the lymph nodes is carried out by the surgeon under the control of endo-ultrasound during urgent endoscopic examination.

Соскобы получают с лимфатического узла скальпелем или ребром, либо углом предметного стекла с последующим равномерным распределением полученного материала на втором предметном стекле.Scrapes are obtained from the lymph node with a scalpel or rib, or the angle of a glass slide, followed by a uniform distribution of the material obtained on the second glass slide.

Часть мазков, приготовленных из лимфатических узлов, окрашивают азур-эозиновыми смесями методом срочной интраоперационной окраски для рутинного цитологического исследования.Some smears prepared from lymph nodes are stained with azure-eosin mixtures by urgent intraoperative staining for routine cytological examination.

Для успешного применения ФИЦХ необходимо соблюдение нескольких условий: полнота клинических сведений и достаточное количество опухолевых клеток - оптимально не менее 200 клеток в одном препарате.For the successful use of FICA, several conditions must be met: completeness of clinical information and a sufficient number of tumor cells — optimally at least 200 cells in one preparation.

С целью дифференциальной диагностики между метастазами рака в лимфатический узел и лимфомой применяют два флуоресцентных маркера: эпителиальный антиген Ber-EP4 FITC и общий лейкоцитарный антиген CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC. Эпителиальный антиген Ber-EP4 FITC представляет молекулу адгезии эпителиальных клеток и состоит из двух гликопротеинов молекулярной массой 34 и 39 кД, которые находятся преимущественно на поверхности клеточной мембраны почти всех эпителиальных клеток, за исключением некоторых видов плоского эпителия, гепатоцитов, проксимальных отделов эпителия почечных канальцев, желудочных париетальных и миоэпителиальных клеток. Элементы лимфатического узла и лимфомы Ber-ЕР4 - отрицательны. Ber-ЕР4 является маркером клеток эпителиальной природы, его экспрессия отмечается в клетках широкого спектра новообразований эпителиального происхождения, включая аденогенные, мелкоклеточные, недифференцированные раки и нейроэндокринные опухоли. Элементы лимфатического узла и лимфомы экспрессируют общий лейкоцитарный антиген CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC, представляющий поверхностный гликопротеид.For the purpose of differential diagnosis between cancer metastases in the lymph node and lymphoma, two fluorescent markers are used: the epithelial antigen Ber-EP4 FITC and the general leukocyte antigen CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC. The Ber-EP4 FITC epithelial antigen is an adhesion molecule of epithelial cells and consists of two glycoproteins with a molecular weight of 34 and 39 kD, which are located mainly on the surface of the cell membrane of almost all epithelial cells, with the exception of some types of squamous epithelium, hepatocytes, proximal renal tubule epithelium, gastric parietal and myoepithelial cells. The elements of the lymph node and Ber-EP4 lymphoma are negative. Ber-EP4 is a marker of cells of epithelial nature, its expression is observed in cells of a wide range of neoplasms of epithelial origin, including adenogenic, small cell, undifferentiated cancers and neuroendocrine tumors. Lymph node elements and lymphomas express the CD45 common leukocyte antigen, Leucocyte Common Antigen / FITC, which is a surface glycoprotein.

Для ФИЦХ исследования используют жидкостные препараты, приготовленные с помощью центрифуги Cytospin 3. Это позволяет получить монослой клеток и обеспечить сохранность клеточных структур, что снижает содержание в препарате элементов воспаления, концентрирует клеточные элементы на ограниченном участке и экономит дорогостоящие реактивы.For FICA studies, liquid preparations prepared using a Cytospin 3 centrifuge are used. This allows obtaining a monolayer of cells and ensuring the preservation of cellular structures, which reduces the content of inflammatory elements in the preparation, concentrates cellular elements in a limited area and saves expensive reagents.

Для ФИЦХ в случае исследования лимфатических узлов взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги Cytospin 3 и центрифугируют при 1000 об./мин в течение 5 мин. Контроль качества проводят окрашиванием двух цитоспиновых препаратов методом срочной интраоперационной цитологической окраски. При наличии в мазках достаточного количества клеточного материала (200-300 клеток), проводят ФИЦХ-исследование оставшихся неокрашенных цитопрепаратов.For FIC, in the case of a lymph node study, the cell suspension is dispensed in 50-100 μl into Cytospin 3 centrifuge containers and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. Quality control is carried out by staining two cytospin preparations by the method of urgent intraoperative cytological staining. If there is a sufficient amount of cellular material in the smears (200-300 cells), a FITS study of the remaining unpainted cytopreparations is carried out.

Способ срочной дифференциальной флуоресцентной иммуноцитохимической диагностики метастазов рака в лимфатические узлы и неходжкинской лимфомы выполняют следующим образом.The method of urgent differential fluorescence immunocytochemical diagnosis of cancer metastases to the lymph nodes and non-Hodgkin lymphoma is performed as follows.

Клеточный материал после пункции или соскоба лимфатических узлов и неходжкинских лимфом помещают в специальную питательную среду (раствор Хенкса, реоплиглюкин и альбумин, смешанных в равных количествах) накопления, находящуюся в микропробирке (800 мкл), для получения клеточной суспензии. Хорошо перемешанную клеточную суспензию вносят по 100 мл на дно двух пробирок, добавляют 5 мкл моноклонального антитела Ber ЕР4 FITC (эпителиального маркера) в одну пробирку и 5 мкл моноклонального антитела CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC в другую пробирку, затем перемешивают 5 с на вортексе. Материал инкубируют 20 мин в темном холодном месте при t° 2-8°C. В процессе инкубации происходит реакция взаимодействия поверхностных антигенов со специфическими антителами Ber-EP4 FITC и CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC, меченными флуорохромным красителем, с образованием комплексов антиген + антитело. Затем взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги Cytospin 3 и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Полученные препараты окрашивают ядерным флуоресцентным красителем Dapi, после чего осуществляют микроскопию полученных препаратов.The cell material after puncture or scraping of the lymph nodes and non-Hodgkin lymphomas is placed in a special nutrient medium (Hanks solution, reopgligukin and albumin, mixed in equal amounts) accumulation, located in a microtube (800 μl), to obtain a cell suspension. A well-mixed cell suspension is added 100 ml to the bottom of two tubes, 5 μl of Ber EP4 FITC monoclonal antibody (epithelial marker) is added to one tube and 5 μl of CD45 monoclonal antibody, Leucocyte Common Antigen / FITC, is added to another tube, then mixed for 5 seconds on a vortex . The material is incubated for 20 min in a dark, cold place at t ° 2-8 ° C. During the incubation, a reaction of surface antigens with specific antibodies Ber-EP4 FITC and CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC labeled with fluorochrome dye, with the formation of antigen + antibody complexes. Then the cell suspension is dispensed in 50-100 μl into Cytospin 3 centrifuge containers and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The resulting preparations are stained with Dapi nuclear fluorescent dye, after which microscopy of the obtained preparations is carried out.

Оценку полученных результатов осуществляют следующим образом. При добавлении к клеточной суспензии моноклональных антител Ber-ЕР4 FITC, либо CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC, коньюгированных с флуорохромами, происходит связывание их с поверхностными антигенами клеток, возбуждение флуоресценции и последующая ее регистрация при длине волны 488 нм (в спектре Green). ФИЦХ-реакция оценивается качественно. Мембранное окрашивание клеток рака наблюдается при проведении реакции с эпителиальным антигеном Ber-EP4 FITC. Мембранное окрашивание лимфоидных элементов наблюдается и при проведении реакции с общим лейкоцитарным антигеном CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC. При оценке ФИЦХ реакция принимают во внимание интенсивность и полноту окрашивания. Были отмечены некоторые особенности экспрессии эпителиального маркера Ber-EP4 FITS, выявляемые при флуоресцентной микроскопии. Характерной особенностью является хорошо выраженная четкая мембранная реакция в виде секреторных вакуолей, которые располагаются на поверхности клетки иногда в виде своеобразного кружева. Иногда наблюдается отрыв цитоплазмы в виде секреторных вакуолей. Такой характер экспрессии характерен для клеток аденогенного рака. Наличие таких клеток не вызывает сомнений в их эпителиальной природе. Для предотвращения гипердиагностики метастазов рака в лимфатических узлах следует учитывать, что макрофагальные элементы, присутствующие в лимфатических узлах или экссудате, захватывают частицы красителя и выглядят как светящиеся включения в цитоплазме.Evaluation of the results is as follows. When Ber-EP4 FITC or CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC monoclonal antibodies are added to the cell suspension conjugated with fluorochromes, they bind to cell surface antigens, excite fluorescence and then register it at a wavelength of 488 nm (in the Green spectrum). FITSH-reaction is evaluated qualitatively. Membrane staining of cancer cells is observed during the reaction with the epithelial antigen Ber-EP4 FITC. Membrane staining of lymphoid elements is also observed during the reaction with the common leukocyte antigen CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC. When evaluating the FPIC, the reaction takes into account the intensity and completeness of staining. Some features of the expression of the epithelial marker Ber-EP4 FITS, detected by fluorescence microscopy, were noted. A characteristic feature is a well-defined clear membrane reaction in the form of secretory vacuoles, which are sometimes located on the cell surface in the form of a kind of lace. Sometimes there is a separation of the cytoplasm in the form of secretory vacuoles. This expression pattern is characteristic of adenogenic cancer cells. The presence of such cells is not in doubt in their epithelial nature. To prevent overdiagnosis of cancer metastases in the lymph nodes, it should be borne in mind that macrophage elements present in the lymph nodes or exudate capture dye particles and look like luminous inclusions in the cytoplasm.

При осуществлении флуоресцентной микроскопии полученных препаратов, в случае положительной экспрессии на мембранах клеток эпителиального маркера Ber ЕР4 FITC диагностируют метастазы рака, а в случае положительной экспрессии на мембранах клеток общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC и отсутствии экспрессии на мембранах клеток эпителиального маркера Ber ЕР4 FITC диагностируют неходжкинскую лимфому.When performing fluorescence microscopy of the preparations obtained, in case of positive expression on the cell membranes of the epithelial marker Ber EP4 FITC, cancer metastases are diagnosed, and in the case of positive expression on the cell membranes of the common leukocyte antigen CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC and the absence of expression on the cell membranes of the epithelial marker Ber EP4 FITC diagnoses non-Hodgkin's lymphoma.

В отделении МНИОИ им. П.А. Герцена методом ФИЦХ срочно исследовано 30 лимфатических узлов с целью дифференциальной диагностики метастазов рака и неходжкинской лимфомы. Во всех наблюдениях при рутинном цитологическом исследовании возникли сложности в установлении характера поражения лимфатических узлов.In the department of Moscow P.A. Herzen using the FITS method urgently examined 30 lymph nodes for the differential diagnosis of cancer metastases and non-Hodgkin lymphoma. In all the observations during routine cytological examination, difficulties arose in establishing the nature of the damage to the lymph nodes.

Положительная экспрессия эпителиального маркера Ber-ЕР4 отмечена в 12 наблюдениях при метастазах мелкоклеточного рака легкого, в 1 наблюдении при метастазе недифференцированного рака легкого в лимфатический узел. В 18 случаях был установлен диагноз неходжкинской лимфомы при этом опухолевые клетки не экспрессировали эпителиальный маркер Ber-ЕР4 и были положительными по экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC.Positive expression of the epithelial marker Ber-EP4 was observed in 12 cases with metastases of small cell lung cancer, in 1 case with metastasis of undifferentiated lung cancer to the lymph node. In 18 cases, a diagnosis of non-Hodgkin's lymphoma was established, while the tumor cells did not express the Ber-EP4 epithelial marker and were positive for the expression of the CD45 common leukocyte antigen, Leucocyte Common Antigen / FITC.

Достоверность срочной дифференциальной диагностики метастазов рака и лимфом с использованием ФИТЦ-исследования лимфатических узлов составляет 100%.Reliability of urgent differential diagnosis of cancer and lymphoma metastases using the FITC study of lymph nodes is 100%.

Клинические примерыClinical examples

Клинический пример 1. Больной М. 53 года. У больного поражение легкого, измененные лимфатические узлы в корне легкого, средостении. Клинический диагноз - лимфома? рак легкого?Clinical example 1. Patient M. 53 years. The patient has a lung lesion, altered lymph nodes in the root of the lung, mediastinum. Clinical diagnosis - lymphoma? lung cancer?

Проведено эндоскопическое исследование. Произвели пункцию лимфатических узлов в корне легкого. При цитологическом исследовании методами световой микроскопии был установлен диагноз злокачественного круглоклеточного мелкоклеточного новообразования, дифференциальный диагноз провели между неходжкинской лимфомой и мелкоклеточным раком легкого.An endoscopic examination was performed. Lymph nodes were punctured in the root of the lung. During a cytological study using light microscopy, a diagnosis of malignant squamous small cell neoplasms was established, a differential diagnosis was made between non-Hodgkin's lymphoma and small cell lung cancer.

Часть полученного при пункции клеточного материала поместили в специальную, питательную среду накопления, в две микропробирки, содержащие по 800 мкл питательной среды. К взвеси клеток в одну микропробирку добавляли эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS, а во вторую общий лейкоцитарный антиген CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC и оставляли на 20 мин в темном месте для прохождения флюоресцентной иммуноцитохимической реакции. Затем взвесь клеток распределяли по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin (Shandon, UK) и центрифугировали в режиме 1000 об./мин в течение 5 мин. Изготовили жидкостные цитологические препараты. Для визуализации ядер клеток препараты окрашивали DAPI. Микроскопию осуществляли на флуоресцентном микроскопе Imager M1 фирмы «Karl Zeiss». Флуоресцентная иммуноцитохимическое исследование заняло 25 минут. При проведении срочной флуоресцентной иммуноцитохимии с эпителиальным маркером Ber-ЕР4 и общим лейкоцитарным антигеном CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC был установлен диагноз неходжкинской лимфомы. В лимфатическом узле были обнаружена неходжкинская лимфома, поскольку опухолевые клетки экспрессировали общий лейкоцитарный антиген CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC и не экспрессировали эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS, что было определено при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа. В лимфатических узлах в спектре эмиссии FITC (520-524 нм) хорошо была видна мембранная экспрессия общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC на клетках опухоли (Фиг. 1). Установлен диагноз - неходжкинская лимфома, что было подтверждено последующим гистологическим исследованием.A part of the cell material obtained by puncture was placed in a special nutrient accumulation medium in two microtubes containing 800 μl of culture medium. The Ber-EP4 FITS epithelial marker was added to a suspension of cells in one microtube, and the second common leukocyte antigen CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC was added to the second suspension and left for 20 min in a dark place to undergo a fluorescence immunocytochemical reaction. Then, the cell suspension was distributed 50-100 μl into the containers of the Cytospin centrifuge system (Shandon, UK) and centrifuged at 1000 rpm for 5 min. Liquid cytological preparations were made. To visualize cell nuclei, preparations were stained with DAPI. Microscopy was carried out on a Karl Zeiss Imager M1 fluorescence microscope. A fluorescence immunocytochemical study took 25 minutes. When conducting urgent fluorescence immunocytochemistry with the epithelial marker Ber-EP4 and the common leukocyte antigen CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC, a diagnosis of non-Hodgkin's lymphoma was established. Non-Hodgkin’s lymphoma was detected in the lymph node, since the tumor cells expressed the CD45 common leukocyte antigen, Leucocyte Common Antigen / FITC and did not express the Ber-EP4 FITS epithelial marker, which was determined by fluorescence microscopy. In the lymph nodes in the emission spectrum of the FITC (520-524 nm), membrane expression of the common leukocyte antigen CD45, Leucocyte Common Antigen / FITC on tumor cells was clearly visible (Fig. 1). The diagnosis of non-Hodgkin's lymphoma was established, which was confirmed by subsequent histological examination.

Клинический пример 2. Больная Ж. 51 год. В правой околоушной слюнной железе выявлено узловое образование, также определялось поражение лимфатических узлов в проекции правой околоушной слюнной железы.Clinical example 2. Patient J. 51 years. Nodular formation was detected in the right parotid salivary gland; lymph node lesions were also determined in the projection of the right parotid salivary gland.

Под контролем УЗИ была проведена пункция образования околоушной слюнной железы и лимфатических узлов. При цитологическом исследовании методами световой микроскопии материала тонкоигольной аспирационной биопсии был установлен диагноз злокачественного круглоклеточного мелкоклеточного новообразования, дифференциальный диагноз проводили между неходжкинской лимфомой и недифференцированным раком слюнной железы.Under the control of ultrasound, a puncture of the formation of the parotid gland and lymph nodes was performed. A cytological study using light microscopy of a fine-needle aspiration biopsy revealed a diagnosis of malignant squamous small cell neoplasms, a differential diagnosis was made between non-Hodgkin's lymphoma and undifferentiated salivary gland cancer.

Часть полученного при пункции клеточного материала поместили в специальную, питательную среду накопления в микропробирку, содержащую 800 мкл питательной среды. К взвеси клеток в микропробирку добавляли эпителиальный маркер Ber-EP4 FITS и оставляли на 20 мин в темном месте для прохождения флуоресцентной иммуноцитохимической реакции. Затем взвесь клеток распределяли по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin (Shandon, UK) и центрифугировали в режиме 1000 об./мин в течение 5 мин. Изготовили жидкостные цитологические препараты. Для визуализации ядер клеток препараты окрашивали DAPI. Микроскопию осуществляли на флуоресцентном микроскопе Imager M1 фирмы «Karl Zeiss», исследование заняло 25 минут. При проведении интраоперационной флуоресцентной иммуноцитохимии с эпителиальным маркером Ber-ЕР4 в этом же лимфатическом узле были обнаружены клетки рака с положительной экспрессией эпителиального маркера, что определили при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа. В метастатических лимфатических узлах и слюнной железе в спектре эмиссии FITC (520-524 нм) хорошо была видна мембранная экспрессия эпителиального маркера Ber-ЕР4 на клетках рака. Отмечалась четкая выраженная мембранная реакция, характеризующая экспрессию эпителиального маркера Ber-EP4 FITS, выявляемая при флуоресцентной микроскопии на клетках рака слюнной железы и его метастазах (Фиг. 2). Диагноз - недифференцированный рак слюнной железы с метастазами в лимфатические узы в проекции правой околоушной слюнной железы.A portion of the cell material obtained by puncture was placed in a special, nutrient accumulation medium in a microtube containing 800 μl of culture medium. The Ber-EP4 FITS epithelial marker was added to the suspension of cells in a microtube and left for 20 min in a dark place to undergo a fluorescent immunocytochemical reaction. Then, the cell suspension was distributed 50-100 μl into the containers of the Cytospin centrifuge system (Shandon, UK) and centrifuged at 1000 rpm for 5 min. Liquid cytological preparations were made. To visualize cell nuclei, preparations were stained with DAPI. Microscopy was carried out on a Karl Zeiss Imager M1 fluorescence microscope, the study took 25 minutes. When conducting intraoperative fluorescence immunocytochemistry with the epithelial marker Ber-EP4, cancer cells with positive expression of the epithelial marker were detected in the same lymph node, which was determined using a fluorescence microscope. In the metastatic lymph nodes and salivary gland, the membrane expression of the Ber-EP4 epithelial marker on cancer cells was clearly visible in the FITC emission spectrum (520-524 nm). There was a clear marked membrane reaction characterizing the expression of the epithelial marker Ber-EP4 FITS, detected by fluorescence microscopy on salivary gland cancer cells and its metastases (Fig. 2). The diagnosis is undifferentiated salivary gland cancer with lymph node metastases in the projection of the right parotid gland.

Проведенные исследования показали, что ФИЦХ является новым надежным и быстрым методом дифференциальной диагностики метастатического поражения лимфатических узлов и неходжкинских лимфом. Особенно перспективно применение этого метода при срочных исследованиях лимфатических узлов, так как не требует сложной предподготовки материала и значительных временных затрат: исследование занимает 20-25 минут. Эпителиальный маркер Ber-ЕР4 является гликопротеином и находится на поверхности клеточной мембраны. Общий лейкоцитарный антиген также является гликопротеином и находится на поверхности клеточной мембраны. ИЦХ реакция прямая: флуорохром непосредственно коньюгирован с антителом. Все это способствует сокращению времени инкубации антитела с антигеном и применению эпителиального маркера Ber-ЕР4 и общего лейкоцитарного антигена CD45, Leucocyte Common Antigen/FITC в срочной дифференциальной диагностике метастазов рака в лимфатические узлы и лимфом.Studies have shown that FICA is a new reliable and fast method for differential diagnosis of metastatic lesions of the lymph nodes and non-Hodgkin lymphomas. Particularly promising is the use of this method in urgent studies of the lymph nodes, since it does not require complicated material preparation and significant time-consuming: the study takes 20-25 minutes. The epithelial marker Ber-EP4 is a glycoprotein and is located on the surface of the cell membrane. The total leukocyte antigen is also a glycoprotein and is located on the surface of the cell membrane. The ICC reaction is direct: the fluorochrome is directly conjugated to the antibody. All this helps to reduce the time of incubation of the antibody with the antigen and the use of the Ber-EP4 epithelial marker and the CD45 common leukocyte antigen, Leucocyte Common Antigen / FITC in the urgent differential diagnosis of cancer metastases to the lymph nodes and lymphomas.

Таким образом, была показана высокая эффективность и быстрота ФИЦХ при срочной дифференциальной диагностике в исследованиях лимфатических узлов с целью установления распространенности опухолевого процесса и дифференциальной диагностики метастазов рака и лимфом.Thus, the high efficiency and speed of the FICA was shown in urgent differential diagnosis in the study of lymph nodes in order to establish the prevalence of the tumor process and differential diagnosis of cancer metastases and lymphomas.

Claims

A method for urgent differential fluorescence immunocytochemical diagnosis of cancer metastases to the lymph nodes and non-Hodgkin’s lymphoma, including immunofluorescence analysis of biological samples of lymph nodes using monoclonal antibodies, characterized in that the cell material is placed in an accumulation medium consisting of red Xenol solution to obtain a cell suspension and albumin mixed in equal volumes, the cell suspension is added 100 ml to the bottom of two tubes, add 5 μl of Ber EP4 FITC monoclonal antibody in one tube and 5 μl of CD45 monoclonal antibody, Leucocyte Common Antigen / FITC in another tube, mix material for 5 s, incubate for 20 min at t ° 2-8 ° C, then distribute cell suspension 50-100 μl and centrifuged at 1000 rpm for 5 min, a preparation is prepared from the precipitate, which is stained with nuclear fluorescent dye Dapi and their fluorescence microscopy is performed, with positive expression on Ber EP4 FITC epithelial marker cell membranes, cancer metastases are diagnosed, and in case of positive e SPRESSO on the membranes common leukocyte antigen CD45 cells, Leucocyte Common Antigen / FITC and no expression on the cell membranes of epithelial marker Ber EP4 FITC - diagnosed with non-Hodgkin's lymphoma.