RU2578160C1

RU2578160C1 - Immunobiological agent and method for use thereof to induce specific immunity against ebola virus (versions)

Info

Publication number: RU2578160C1
Application number: RU2015111368/10A
Authority: RU
Inventors: Денис Юрьевич Логунов; Максим Михайлович Шмаров; Ирина Леонидовна Тутыхина; Ольга Вадимовна Зубкова; Дмитрий Викторович Щебляков; Дмитрий Николаевич Щербинин; Инна Вадимовна Должикова; Алина Шахмировна Джаруллаева; Наталья Михайловна Артемичева; Амир Ильдарович Тухватулин; Владимир Борисович Пантюхов; Светлана Ивановна Сыромятникова; Ирина Викторовна Шатохина; Сергей Владимирович Борисевич; Борис Савельевич Народицкий; Александр Леонидович Гинцбург
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2016-03-20
Also published as: WO2016159823A1

Abstract

FIELD: immunology and virology.

SUBSTANCE: invention concerns immune-biological agent (versions) and method of its use (versions). Immune-biological agent can be obtained based on human adenovirus serotype 5 containing cassette with insertion of modified gene GP of virus Ebola /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (version 1). Also the immune-biological agent can be obtained on basis of vesicular stomatitis virus, containing a cassette with insertion of modified gene GP Ebola virus /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (version 2). Besides, immune-biological agent can be obtained based on two vesicular stomatitis virus, one of which contains a cartridge with insertion of unmodified gene GP Ebola virus /H.sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 with sequence SEQ ID NO 3, and other contains cartridge with insertion of modified gene GP Ebola virus /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with sequence selected from SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, wherein said structure are taken in effective ratios (version 3). Methods of using described immune-biological agents for inducing specific immunity to Ebola are realised by introducing into body in an effective amount once or series structures based on different vectors of every 1 week. Presented inventions more effectively induce immune response against Ebola virus in comparison with similar facilities due to introduction of structures based on two different vectors, which enables to obtain more powerful induction of immune response than immunisation same vector.

EFFECT: described solutions can be used as specific preventive agent for diseases caused by Ebola virus.

8 cl, 12 dwg, 5 tbl, 15 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к иммунологии и вирусологии и может быть использовано в качестве специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных вирусом Эбола.The invention relates to immunology and virology and can be used as a specific prophylactic against diseases caused by the Ebola virus.

Предшествующий уровень техники.The prior art.

Геморрагическая лихорадка Эбола - это острая вирусная высококонтагиозная болезнь, вызываемая вирусом Эбола, летальность от которой доходит до 90%. Вирус передается людям от диких животных и затем распространяется от человека к человеку. Впервые данное заболевание было зарегистрировано в 1976 году. С этого времени наблюдалось более 10 вспышек лихорадки Эбола, самая крупная из которых в 2014 году переросла в эпидемию, охватила крупные города и сельские районы 5 стран Западной и Центральной Африки и унесла жизни более девяти тысяч человек. При этом разрешенных к применению превентивных средств против данного заболевания пока не существует.Ebola hemorrhagic fever is an acute viral highly contagious disease caused by the Ebola virus, mortality from which reaches 90%. The virus is transmitted to humans from wild animals and then spreads from person to person. This disease was first reported in 1976. Since that time, more than 10 outbreaks of Ebola have been observed, the largest of which grew into an epidemic in 2014, spread to large cities and rural areas of 5 countries in West and Central Africa and claimed the lives of more than nine thousand people. At the same time, preventive measures against this disease are not yet approved.

Одной из наиболее перспективных разработок в данной области являются вакцины, основанные на вирусных системах доставки, которые содержат гены протективных антигенов вируса Эбола.One of the most promising developments in this area are vaccines based on viral delivery systems that contain genes for protective antigens of the Ebola virus.

Известно решение согласно патенту WO 2011130627 А2, в котором для индукции иммунного ответа к филовирусам (вирус Эбола, вирус Марбург) предполагается использование аденовирусов шимпанзе, которые содержат гены различных белков данных вирусов, в том числе белок GP вируса Эбола.A solution is known according to patent WO 2011130627 A2, in which for the induction of an immune response to filoviruses (Ebola virus, Marburg virus), it is proposed to use chimpanzee adenoviruses that contain genes of various proteins of these viruses, including the Ebola virus GP protein.

Существует решение по патенту СА 2821289 А1, согласно которому для индукции иммунного ответа против филовирусов используют рекомбинантный аденовирусный вектор на основе аденовирусов 26 и 35 серотипа, которые экспрессируют антигены данных вирусов.There is a solution according to CA 2821289 A1, according to which a recombinant adenovirus vector based on serotype adenoviruses 26 and 35 that express antigens of these viruses is used to induce an immune response against filoviruses.

Известно решение согласно патенту US 20100047282 А1, где в качестве вакцины против геморрагической лихорадки Эбола используют рекомбинантный аденовирус, содержащий ген гликопротеина вируса Эбола (GP).A solution is known according to patent US 20100047282 A1, where a recombinant adenovirus containing the Ebola virus glycoprotein gene (GP) is used as a vaccine against Ebola hemorrhagic fever.

Известно решение согласно патенту СА 2493142 С, в котором для стимуляции иммунного ответа к вирусу Эбола используют рекомбинантный вирус везикулярного стоматита (VSV), содержащий ген гликопротеина, выбранный из группы, состоящей из гликопротеина вируса лихорадки Ласса, гликопротеина вируса Марбург и гликопротеина вируса Эбола, вставленный в вирусный геном так, что данная последовательность заменила исходный ген гликопротеина VSV.A solution is known according to patent CA 2493142 C, in which a recombinant vesicular stomatitis virus (VSV) is used to stimulate the immune response to the Ebola virus. into the viral genome so that this sequence replaces the original VSV glycoprotein gene.

Технические решения согласно патентам US 20100047282 А1 и СА 2493142 С как наиболее близкие к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбраны авторами заявляемого изобретения за прототип. В связи с тем что на дату национального приоритета данных заявок 2 августа 2004 года и 26 июля 2002 года ничего не было известно о штамме вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, так как впервые данный возбудитель выделен и охарактеризован в июле 2014 года, нуклеотидная последовательность его генов не могла быть использована для конструирования рекомбинантных вирусов. Соответственно, заявители не имели возможности создать конструкцию с охарактеризованными культурально-морфологическими свойствами, уровнем экспрессии и иммуногенными свойствами. Это является существенным недостатком данных конструкций, так как не позволяет использовать их для получения специфического иммунитета к вирусу Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1.Technical solutions according to patents US 20100047282 A1 and CA 2493142 C as the closest to the claimed composition of the active substance and the method of its use are selected by the authors of the claimed invention for the prototype. Due to the fact that on the national priority date of these applications on August 2, 2004 and July 26, 2002, nothing was known about the Ebola / H virus strain. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, since this pathogen was first isolated and characterized in July 2014, the nucleotide sequence of its genes could not be used to construct recombinant viruses. Accordingly, the applicants were not able to create a construct with the characterized cultural and morphological properties, expression level and immunogenic properties. This is a significant drawback of these structures, since it does not allow them to be used to obtain specific immunity to the Ebola / H virus. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1.

Раскрытие настоящего изобретения.Disclosure of the present invention.

Задачей каждого из вариантов настоящего изобретения является создание иммунобиологического средства для эффективной индукции иммунного ответа против вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1.The objective of each of the variants of the present invention is the creation of an immunobiological agent for the effective induction of an immune response against the Ebola / H virus. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1.

Указанная задача решается за счет того, что создано иммунобиологическое средство, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный аденовирус, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 1).This problem is solved due to the fact that an immunobiological agent has been created, consisting in the fact that it includes a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (option 1).

Создано также иммунобиологическое средство, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 2).An immunobiological agent has also been created consisting in the fact that it contains a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (option 2).

Создано также иммунобиологическое средство, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3, и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятые в эффективных соотношениях (вариант 3).An immunobiological agent has also been created, consisting in the fact that it contains a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the unmodified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 with the sequence SEQ ID NO 3; and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, taken in effective ratios (option 3).

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 реализуется путем введения его в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.The method of using the immunobiological agent according to option 1 is implemented by introducing it into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus.

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 2 реализуется путем введения его в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.The method of using the immunobiological agent according to option 2 is implemented by introducing it into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus.

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 3 реализуется путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.The method of using the immunobiological agent according to option 3 is implemented by introducing into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus.

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 и варианту 2 заключается в их последовательном введении в организм млекопитающих с интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.The method of using the immunobiological agent according to option 1 and option 2 consists in their sequential administration in mammals with an interval of more than 1 week to induce specific immunity to the Ebola virus.

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 и варианту 3 заключается в их последовательном введении в организм млекопитающих с интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.The method of using the immunobiological agent according to option 1 and option 3 consists in their sequential administration in mammals with an interval of more than 1 week to induce specific immunity to the Ebola virus.

Краткое описание фигурBrief Description of the Figures

На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность гена GP1 (SEQ ID NO 1), которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем добавления в последовательность одного аденина (подробное описание модификации приводится в пункте «Реализация изобретения»).In FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the GP1 gene (SEQ ID NO 1), which is the Ebola / H virus GP gene sequence. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, modified by adding one adenine to the sequence (a detailed description of the modification is given in the paragraph "Implementation of the invention").

На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность GP2 (SEQ ID NO 2), которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем замены кодонов, которые редко встречаются у человека на более часто встречающиеся (подробное описание модификации приводится в пункте «Реализация изобретения»).In FIG. 2 shows the GP2 nucleotide sequence (SEQ ID NO 2), which is the Ebola / H virus GP gene sequence. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, modified by replacing codons that are rarely found in humans with more frequent ones (a detailed description of the modification is given in the paragraph "Implementation of the invention").

На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность GP3 (SEQ ID NO 3), которая представляет собой немодифицированную последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2.In FIG. 3 shows the GP3 nucleotide sequence (SEQ ID NO 3), which is an unmodified Ebola / H virus GP gene sequence. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2.

На фиг. 4 представлена немодифицированная нуклеотидная последовательность гена GP (SEQ ID NO 4) вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1.In FIG. 4 shows the unmodified nucleotide sequence of the GP gene (SEQ ID NO 4) of the Ebola / H virus. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1.

На фиг. 5 представлена нуклеотидная последовательность, которая представляет собой экспрессионную кассету (SEQ ID NO 5), содержащую последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем добавления в последовательность одного аденина.In FIG. 5 shows the nucleotide sequence, which is an expression cassette (SEQ ID NO 5) containing the sequence of the Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, modified by adding one adenine to the sequence.

На фиг. 6 представлена нуклеотидная последовательность, которая представляет собой экспрессионную кассету (SEQ ID NO 6), содержащую последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем замены кодонов, которые редко встречаются у человека на более часто встречающиеся.In FIG. 6 shows the nucleotide sequence, which is an expression cassette (SEQ ID NO 6) containing the sequence of the Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, modified by replacing codons that are rare in humans with more frequent ones.

На фиг. 7 представлены результаты проверки качества разработанного иммунологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках HEK293 после добавления к ним указанного иммунобиологического средства.In FIG. 7 presents the results of quality control of a developed immunological agent based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 by determining GP expression in HEK293 cells after adding the indicated immunobiological agent.

1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,1 - cell lysate to which phosphate-buffered saline was added,

2 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,2 - cell lysate, to which Ad-null was added,

3 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-wt,3 - cell lysate to which Ad-wt was added,

4 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP1,4 - cell lysate to which Ad-GP1 was added,

5 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP2.5 - cell lysate to which Ad-GP2 was added.

На фиг. 8 представлены результаты проверки качества разработанного иммунологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках HEK293 после добавления к ним указанного иммунобиологического средства.In FIG. 8 presents the results of quality control of the developed immunological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 by determining GP expression in HEK293 cells after adding the indicated immunobiological agent.

2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,2 - cell lysate to which VSV-null was added,

3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-wt,3 - cell lysate to which VSV-wt was added,

4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,4 - cell lysate to which VSV-GP1 was added,

5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2.5 - cell lysate to which VSV-GP2 was added.

На фиг. 9 представлены результаты проверки качества разработанного иммунологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках HEK293 после добавления к ним указанного иммунобиологического средства.In FIG. Figure 9 presents the results of quality control of a developed immunological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the unmodified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 by determining GP expression in HEK293 cells after adding the indicated immunobiological agent.

5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2,5 - cell lysate to which VSV-GP2 was added,

6 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP3.6 - cell lysate to which VSV-GP3 was added.

На фиг. 10 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по анализу лимфопролиферации.In FIG. 10 presents the results of evaluating the effectiveness of immunization with a developed immunological agent based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, according to the analysis of lymphoproliferation.

Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.The ordinate axis is the number of proliferating cells,%.

Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:The abscissa axis - various groups of animals that were injected:

1. фосфатный буфер (100 мкл)1. phosphate buffer (100 μl)

2. Ad-null 10⁸ БОЕ/мышь2. Ad-null 10 ⁸ PFU / mouse

3. Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь3. Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse

4. Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь4. Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse

На фиг. 11 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по анализу лимфопролиферации.In FIG. 11 shows the results of evaluating the effectiveness of immunization with a developed immunological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, according to the analysis of lymphoproliferation.

1. фосфатный буфер (100 мкл)1. phosphate buffer (100 μl)

2. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь2. VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

3. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь3. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse

4. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь4. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse

На фиг. 12 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по анализу лимфопролиферации.In FIG. 12 presents the results of evaluating the effectiveness of immunization with a developed immunological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an unmodified Ebola / H virus GP gene insert. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, according to the analysis of lymphoproliferation.

1. фосфатный буфер (100 мкл)1. phosphate buffer (100 μl)

2. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь2. VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

3. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь3. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse

4. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь4. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse

5. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь5. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse

6. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь6. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse

7. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь7. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse

8. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь8. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse

Реализация изобретения.The implementation of the invention.

Гликопротеин GP вируса Эбола является одним из наиболее перспективных вакцинных антигенов, индукция иммунных реакций к которому обеспечивает защиту от лихорадки Эбола. Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы модифицировали нуклеотидную последовательность GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1. Было получено два вида модифицированного гена: GP1 (SEQ ID NO 1) и GP2 (SEQ ID NO 2).The Ebola virus glycoprotein GP is one of the most promising vaccine antigens, the induction of immune responses to which provides protection against Ebola. To achieve the most effective induction of immune responses, the authors modified the nucleotide sequence of the GP Ebola / H virus. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1. Two types of the modified gene were obtained: GP1 (SEQ ID NO 1) and GP2 (SEQ ID NO 2).

GP1 (SEQ ID NO 1) был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ», которые отличаются на один нуклеотид (аденин). Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой. L-полимераза вируса Эбола в отличие от полимеразы эукариотических клеток в этом месте вставляет дополнительный нуклеотид, что сдвигает рамку считывания и изменяет аминокислотную последовательность белка. Следовательно, для того, чтобы получить полный вариант белка GP в эукариотических клетках, необходимо добавить один нуклеотид в указанную последовательность.GP1 (SEQ ID NO 1) was modified by replacing the sequence "ASTAAAAAAAACST" with "ASTAAAAAAAASCT", which differ by one nucleotide (adenine). The change in the sequence of the GP gene was performed in accordance with the literature data that a loop forms in this place, which is a complex structure for the enzyme to pass through the polymerase. Ebola virus L-polymerase, unlike eukaryotic cell polymerase, inserts an additional nucleotide at this point, which shifts the reading frame and changes the amino acid sequence of the protein. Therefore, in order to obtain the full version of the GP protein in eukaryotic cells, it is necessary to add one nucleotide to the indicated sequence.

GP2 (SEQ ID NO 2) был получен также, как и GP1 - путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ», и затем дополнительно оптимизирован для экспрессии в клетках человека. Оптимизация нуклеотидной последовательности - это процесс, при котором редко встречающиеся у человека кодоны заменяют на часто встречающиеся. Чем чаще встречается кодон, тем больше в клетках количество соответствующей ему тРНК и тем быстрее будут транспортироваться аминокислоты к месту синтеза белка. Поэтому оптимизация последовательности обеспечивает более высокую скорость синтеза белка.GP2 (SEQ ID NO 2) was obtained as well as GP1 by replacing the sequence "ASTAAAAAAACST" with "ASTAAAAAAAACST", and then further optimized for expression in human cells. Optimization of the nucleotide sequence is a process in which codons rarely found in humans are replaced by frequently found ones. The more often the codon is found, the greater the amount of tRNA corresponding to it in the cells and the faster amino acids will be transported to the site of protein synthesis. Therefore, sequence optimization provides a higher rate of protein synthesis.

Далее авторами было разработано несколько конструкций на основе аденовируса человека пятого серотипа и вируса везикулярного стоматита для эффективной доставки модифицированных генов GP в клетки млекопитающих.Further, the authors developed several constructs based on human adenovirus of the fifth serotype and vesicular stomatitis virus for efficient delivery of modified GP genes to mammalian cells.

Изобретение по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.The invention of Embodiment 1 is a recombinant adenovirus comprising a cassette with an insert of a modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.

Данный вирусный вектор является одним из наиболее безопасных для человека и вместе с тем эффективных векторов (Van Kampen K.R. et al., Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans, Vaccine, 2005, №23 (8), c. 1029-1036). Рекомбинантные аденовирусы обладают следующими преимуществами: не способны размножаться в клетках человека, способны проникать как в делящиеся, так и неделящиеся клетки, индуцируют как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ, обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого антигена.This viral vector is one of the safest for humans and at the same time effective vectors (Van Kampen KR et al., Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans, Vaccine, 2005, No. 23 (8), c . 1029-1036). Recombinant adenoviruses have the following advantages: they are not able to multiply in human cells, are able to penetrate both dividing and non-dividing cells, induce both a cellular and a humoral immune response, and provide a high level of expression of the target antigen.

Изобретение по варианту 2 представляет собой рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ 124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.The invention of Embodiment 2 is a recombinant vesicular stomatitis virus comprising a cassette with an insert of a modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM 124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.

В данном изобретении в геноме рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (VSV) ген собственного гликопротеина заменили на ген гликопротеина вируса Эбола. При сборке вируса VSV гликопротеин вируса Эбола включается в состав оболочки вирусной частицы и экспонируется на ее поверхности, а следовательно, эффективно распознается иммунной системой. Кроме того, при попадании вируса в клетку происходит экспрессия данного белка на ее мембране. Такие клетки воспринимаются иммунной системой как зараженные, и против белка GP развивается иммунный ответ.In the present invention, in the genome of a recombinant vesicular stomatitis virus (VSV), the native glycoprotein gene was replaced by the Ebola virus glycoprotein gene. During the assembly of the VSV virus, the Ebola virus glycoprotein is incorporated into the envelope of the viral particle and exposed on its surface, and therefore, is effectively recognized by the immune system. In addition, when a virus enters a cell, this protein is expressed on its membrane. Such cells are perceived by the immune system as infected, and an immune response develops against the GP protein.

В целом, можно сказать, что идеального вирусного вектора не существует и использование того или иного вектора зависит в первую очередь от целевой группы населения. Возможно проведение перед иммунизацией дополнительных тестов для определения титра антител к тому или иному вирусному вектору.In general, we can say that an ideal viral vector does not exist and the use of one or another vector depends primarily on the target population. It is possible to conduct additional tests before immunization to determine the titer of antibodies to a particular viral vector.

Изобретение по варианту 3 также основано на вирусе везикулярного стоматита и включает два вектора, один из которых содержит ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3, а другой - модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятых в эффективных соотношениях.The invention of option 3 is also based on the virus of vesicular stomatitis and includes two vectors, one of which contains the GP gene of the Ebola / H virus. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 with the sequence SEQ ID NO 3, and the other is a modified GP gene of the Ebola / H virus. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, taken in effective ratios.

Таким образом, данное иммунобиологическое средство обеспечивает одновременную экспрессию в организме млекопитающего сразу двух видов гликопротеина, полученного от разных штаммов вируса Эбола. Следовательно, оно является более универсальным и индуцирует развитие иммунных реакций против двух наиболее опасных штаммов вируса Эбола.Thus, this immunobiological agent provides the simultaneous expression in the body of a mammal of two types of glycoprotein obtained from different strains of the Ebola virus. Therefore, it is more universal and induces the development of immune responses against the two most dangerous strains of the Ebola virus.

Авторами разработано несколько способов использования данных иммунобиологических средств. Способы использования представлены далее в формуле изобретения по пп. 4-6 и предусматривают введение вышеописанных иммунобиологических средств по каждому из 3-х вариантов в организм млекопитающих по отдельности в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола. Данный способ подходит для индукции иммунного ответа у широких масс населения.The authors have developed several ways to use these immunobiological agents. Methods of use are presented below in the claims according to claims. 4-6 and provide for the introduction of the above immunobiological agents for each of the 3 options into the mammalian organism individually in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus. This method is suitable for inducing an immune response in a broad population.

Однако есть категории населения (работники сферы здравоохранения, люди, живущие в очаге эпидемии), для которых угроза заражения вирусом Эбола повышена. Для данной категории были разработаны способы по пп. 7, 8, которые включают последовательную иммунизацию (с интервалом более 1 недели) иммунобиологическими средствами по варианту 1 и варианту 2 (по пп. 1 и 2 формулы) или по варианту 1 и варианту 3 (по пп. 1 и 3 формулы). Данные способы является очень эффективными, поскольку при иммунизации различными вирусными векторами индуцируется мощный иммунный ответ. Однако, в свою очередь, использование данного способа может быть экономически нецелесообразно для иммунизации широких слоев населения.However, there are categories of the population (health workers, people living in the outbreak), for whom the risk of infection with the Ebola virus is increased. For this category, methods have been developed for PP. 7, 8, which include sequential immunization (with an interval of more than 1 week) by immunobiological agents according to option 1 and option 2 (according to claims 1 and 2 of the formula) or according to option 1 and option 3 (according to claims 1 and 3 of the formula). These methods are very effective, because when immunized with various viral vectors, a powerful immune response is induced. However, in turn, the use of this method may not be economically feasible for immunization of the general population.

ПримерыExamples

Пример 1. Получение различных нуклеотидных последовательностей гликопротеина вируса ЭболаExample 1. Obtaining different nucleotide sequences of the Ebola glycoprotein

GP является самым иммуногенным белком вируса Эбола и наиболее перспективным вакцинным антигеном. Авторами разработаны варианты иммунобиологического средства, которые включают модифицированную последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранную из SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), или немодифицированную последовательность /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 SEQ ID NO 3 (GP3).GP is the most immunogenic protein of the Ebola virus and the most promising vaccine antigen. The authors developed variants of an immunobiological agent that include a modified Ebola / H virus GP gene sequence. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 selected from SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), or the unmodified sequence / H. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 SEQ ID NO 3 (GP3).

Модификация последовательности была произведена, как описано в пункте «Реализация изобретения». Все нуклеотидные последовательности были получены методом синтеза.Modification of the sequence was carried out as described in the paragraph "Implementation of the invention." All nucleotide sequences were obtained by synthesis.

Пример 2. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 1)Example 2. Obtaining an immunobiological agent based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (option 1)

Для получения рекомбинантного аденовируса методами генной инженерии было сконструировано 2 плазмидных конструкции, которые включают различные варианты модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1: pShuttle-GP1 (содержит последовательность SEQ ID NO 1 (фиг. 1)), pShuttle-GP2 (содержит последовательность SEQ ID NO 2 (фиг. 2)), и 1 плазмидная конструкция, которая содержит контрольную исходную немодифицированную последовательность pShuttle-GPwt (SEQ ID NO 4 (фиг. 4)).To obtain a recombinant adenovirus by genetic engineering, 2 plasmid constructs were constructed that include various variants of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1: pShuttle-GP1 (contains the sequence of SEQ ID NO 1 (Fig. 1)), pShuttle-GP2 (contains the sequence of SEQ ID NO 2 (Fig. 2 )), and 1 plasmid construct that contains the control starting unmodified pShuttle-GPwt sequence (SEQ ID NO 4 (FIG. 4)).

Далее вышеописанные плазмидные конструкции были обработаны эндонуклеазами рестрикции PacI и BstII07l для извлечения экспрессионных кассет. Космида cAd5-EGFP также была обработана эндонуклеазами PacI и BstII07l. Продукты гидролиза лигировали. Полученную ДНК, содержащуюся в лигазной смеси, упаковывали в фаговые головки. Далее компетентные клетки DH5α трансдуцировали фаговыми головками. Трансформированные клетки отбирали по их росту на твердой среде LB с селективным антибиотиком. Из выросших клеток выделяли плазмидную ДНК. Таким образом, было получено 3 космиды. cAd5-GP1 содержит геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с экспрессионной кассетой (SEQ ID NO 5 (фиг. 5)), в состав которой входит модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 SEQ ID NO 1 (фиг. 1). cAd5-GP2 содержит геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с экспрессионной кассетой (SEQ ID NO 6 (фиг. 6), в состав которой входит модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 SEQ ID NO 2 (фиг. 2). cAd5-GPwt содержит геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с экспрессионной кассетой, в состав которой входит немодифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1.Further, the above plasmid constructs were treated with restriction endonucleases PacI and BstII07l to extract expression cassettes. The cAd5-EGFP cosmid was also treated with PacI and BstII07l endonucleases. The hydrolysis products were ligated. The resulting DNA contained in the ligase mixture was packaged in phage heads. Next, competent DH5α cells were transduced with phage heads. Transformed cells were selected according to their growth on solid LB medium with a selective antibiotic. Plasmid DNA was isolated from the grown cells. Thus, 3 cosmids were obtained. cAd5-GP1 contains the fifth serotype recombinant human adenovirus genome with an expression cassette (SEQ ID NO 5 (FIG. 5)), which contains the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 SEQ ID NO 1 (Fig. 1). cAd5-GP2 contains the fifth serotype recombinant human adenovirus genome with an expression cassette (SEQ ID NO 6 (FIG. 6), which contains the modified Ebola / H. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank GP gene ID KM233045.1 SEQ ID NO 2 (Fig. 2) cAd5-GPwt contains the genome of the recombinant human adenovirus of the fifth serotype with an expression cassette, which includes the unmodified GP gene of the Ebola virus / H. Sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona- EM124.1 GenBank ID KM233045.1.

На следующем этапе был проведен гидролиз полученных космид эндонуклеазами рестрикции PacI и SwaI для удаления плазмидной части и трансфекция в эукариотические клетки линии HEK293. Через 5 дней после трансфекции проводили слепые пассажи материала для размножения рекомбинантных аденовирусов. После наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования) клетки с культуральной средой трехкратно перемораживают для разрушения клеток и выхода вируса. В результате был материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.The next step was the hydrolysis of the cosmid restriction endonucleases PacI and SwaI to remove the plasmid part and transfection into eukaryotic cells of the HEK293 line. 5 days after transfection, blind passages of material were performed to propagate recombinant adenoviruses. After the onset of the cytopathic effect of the virus (microscopic data), cells with the culture medium are thawed three times to destroy the cells and exit the virus. The result was material that was then used to accumulate preparative amounts of recombinant adenoviruses.

Таким образом, в результате проведенной работы было получено 3 рекомбинантных аденовируса: Ad-GP1, Ad-GP2, Ad-GPwt.Thus, as a result of the work, 3 recombinant adenoviruses were obtained: Ad-GP1, Ad-GP2, Ad-GPwt.

Пример 3. Получение иммунобиологического средства на основе вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 2)Example 3. Obtaining an immunobiological agent based on a virus of vesicular stomatitis containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (option 2)

Для получения рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была использована плазмида VSV-deltaG-GFP, представляющая собой кДНК, комплементарную геномной РНК вируса везикулярного стоматита с удаленным геном гликопротеина. Методами генной инженерии из данной плазмиды было получено 2 плазмидных вектора, включающих последовательности модифицированного гена GP: pVSV-deltaG-GP1 (содержит последовательность SEQ ID NO 1 (фиг. 1)), pVSV-deltaG-GP2 (содержит последовательность SEQ ID NO 2 (фиг. 2)), и 1 плазмидная конструкция, которая содержит контрольную исходную немодифицированную последовательность: pVSV-deltaG-GPwt (содержит последовательность SEQ ID NO 4 (фиг. 4)).To obtain recombinant vesicular stomatitis viruses, the plasmid VSV-deltaG-GFP was used, which is a cDNA complementary to the genomic RNA of the vesicular stomatitis virus with the removed glycoprotein gene. Using genetic engineering methods, 2 plasmid vectors were obtained from this plasmid, including the sequences of the modified GP gene: pVSV-deltaG-GP1 (contains the sequence SEQ ID NO 1 (Fig. 1)), pVSV-deltaG-GP2 (contains the sequence SEQ ID NO 2 ( Fig. 2)), and 1 plasmid construct that contains the control initial unmodified sequence: pVSV-deltaG-GPwt (contains the sequence of SEQ ID NO 4 (Fig. 4)).

Для получения препаратов рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была проведена трансфекция клеток CV-1 четырьмя плазмидами: pVSV-N (содержит гены белков нуклеокапсида), VSV-P (содержит ген фосфопротеина), VSV-L (содержит ген большой субъединицы полимеразы) и векторной плазмидой, выбранной из pVSV-deltaG-GP1, pVSV-deltaG-GP2, pVSV-deltaG-GPwt. Трансфекцию проводили с помощью реагента Lipofectamine-2000 (Life Technologies) согласно инструкции производителя.To obtain preparations of recombinant vesicular stomatitis viruses, transfection of CV-1 cells with four plasmids was carried out: pVSV-N (contains the nucleocapsid protein genes), VSV-P (contains the phosphoprotein gene), VSV-L (contains the gene of the large polymerase subunit) and vector plasmid, selected from pVSV-deltaG-GP1, pVSV-deltaG-GP2, pVSV-deltaG-GPwt. Transfection was performed using Lipofectamine-2000 reagent (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions.

Таким образом, было получено три препарата рекомбинантного вируса везикулярного стоматита: VSV-GP1, VSV-GP2, VSV-GPwt.Thus, three preparations of the recombinant vesicular stomatitis virus were obtained: VSV-GP1, VSV-GP2, VSV-GPwt.

Пример 4. Получение иммунобиологического средства на основе вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 3)Example 4. Obtaining an immunobiological agent based on a virus of vesicular stomatitis containing a cassette with an insert of GP Ebola / H virus. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a vesicular stomatitis virus virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (option 3)

Для данного иммунобиологического средства были получены рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, содержащие кассеты со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 (VSV-deltaG-GP1, VSV-deltaG-GP2), и вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (VSV-deltaG-GP3). В качестве контроля был получен вирус, содержащий немодифицированную последовательность вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ 124.1 GenBank ID KM233045.1 (VSV-deltaG-GPwt). Все вирусы были получены по методике, описанной в примере 2. Для получения иммунобиологического средства смешивали:For this immunobiological agent, recombinant vesicular stomatitis viruses were obtained containing cassettes with the insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 (VSV-deltaG-GP1, VSV-deltaG-GP2), and a vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the unmodified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (VSV-deltaG-GP3). As a control, a virus was obtained containing an unmodified Ebola / H virus sequence. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM 124.1 GenBank ID KM233045.1 (VSV-deltaG-GPwt). All viruses were obtained according to the method described in example 2. To obtain an immunobiological agent were mixed:

рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2, и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранный из VSV-deltaG-GP1, VSV-deltaG-GP2, в соотношениях 1:1000, 1:100, 1:10, 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1.a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an unmodified Ebola / H virus GP gene insert. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2, and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, selected from VSV-deltaG-GP1, VSV-deltaG-GP2, in the ratios 1: 1000, 1: 100, 1:10, 1: 1 , 10: 1, 100: 1, 1000: 1.

В результате проведенной работы были получены различные варианты иммунобиологического средства по п. 3.As a result of the work, various variants of the immunobiological agent according to claim 3 were obtained.

Пример 5. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2Example 5. Verification of the expression of GP proteins in cells after adding an immunobiological agent based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2

Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO₂. Клетки помещали на 35 мм² культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты рекомбинантных аденовирусов (Ad-GP1, Ad-GP2) и контрольные препараты (Ad-null - рекомбинантный аденовирус, не содержащий вставок, Ad-GPwt - рекомбинантный аденовирус, содержащий неоптимизированную последовательность GP) из расчета 100 БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом иммуноблоттинга. Для этого был произведен отбор среды с клеток, клетки были промыты стерильным фосфатно-солевым буфером, а затем лизированы с помощью RIPA буфера (Pierce) по протоколу фирмы-производителя.HEK293 cells were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum in an incubator at 37 ° C and 5% CO ₂ . Cells were placed on 35 mm ² Petri dishes and incubated for one day until 70% confluency was achieved. Then, the studied preparations of recombinant adenoviruses (Ad-GP1, Ad-GP2) and control preparations (Ad-null - recombinant adenovirus containing no inserts, Ad-GPwt - recombinant adenovirus containing non-optimized GP sequence) were added to the cells at the rate of 100 PFU / cell or phosphate buffer as a negative control. After a day, the expression of Ebola antigens was checked by immunoblotting. For this, the medium was selected from the cells, the cells were washed with sterile phosphate-buffered saline, and then lysed using RIPA buffer (Pierce) according to the protocol of the manufacturer.

После лизиса клеток производили измерение концентрации тотального белка в пробах с помощью реактива Bradford (Sigma) согласно инструкции производителя. Аликвоту выровненных по содержанию белка образцов смешивали с Laemmli Sample Buffer (Sigma) и инкубировали в течение 5 минут при 95°С.After cell lysis, the concentration of total protein in the samples was measured using Bradford reagent (Sigma) according to the manufacturer's instructions. An aliquot of protein-aligned samples was mixed with Laemmli Sample Buffer (Sigma) and incubated for 5 minutes at 95 ° C.

Далее проводили электрофорез в денатурирующих условиях в 10% SDS-полиакриламидном геле SPRINT NEXT GEL® 10% (Amresco) в NEXT GEL® Running Buffer, 20X (Amresco) с помощью системы Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad) в течение 20 минут при 250 V. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Trans-Blot® Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs (Bio-Rad) в буфере Tris-CAPS (Bio-Rad) с помощью системы для переноса Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad) в течение 15 минут при 25 V. Затем проводили блокирование неспецифического сигнала. Для этого мембрану инкубировали в растворе 3% обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере с 0,05% Твин 20 (ТФСБ) в течение часа при комнатной температуре. После этого мембрану инкубировали 16 часов при 4°С с антителами к белку GP в растворе 3% обезжиренного молока в ТФСБ. Далее проводили отмывку мембраны раствором ТФСБ и обрабатывали мембрану раствором вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, в растворе 3% обезжиренного молока в ТФСБ при 37°С на шейкере в течение 1 часа. Затем мембрану тщательно отмывали раствором ТФСБ. Дальнейшую детекцию проводили с помощью набора Clarity™ Western ECL Substrate (Bio-Rad) и проявляли на пленку Hyperfilm® ECL™ (Amersham). По такому же протоколу проводили детекцию белка сравнения GAPDH с помощью антител Anti-GAPDH.Denaturing electrophoresis was then carried out on a 10% SDS-polyacrylamide gel SPRINT NEXT GEL® 10% (Amresco) in NEXT GEL® Running Buffer, 20X (Amresco) using the Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad) system for 20 minutes at 250 V. After electrophoresis, proteins were transferred onto a Trans-Blot® Turbo ™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs (Bio-Rad) nitrocellulose membrane in Tris-CAPS buffer (Bio-Rad) using a Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer System Transfer Cell (Bio-Rad) for 15 minutes at 25 V. Then a non-specific signal was blocked. For this, the membrane was incubated in a solution of 3% skim milk in phosphate-buffered saline with 0.05% Tween 20 (TFSB) for one hour at room temperature. After that, the membrane was incubated for 16 hours at 4 ° C with antibodies to the GP protein in a solution of 3% skim milk in TFSB. Next, the membrane was washed with a TFSB solution and the membrane was treated with a solution of secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase in a solution of 3% skim milk in TFSB at 37 ° C on a shaker for 1 hour. Then the membrane was thoroughly washed with a solution of TFSB. Further detection was performed using the Clarity ™ Western ECL Substrate kit (Bio-Rad) and developed on a Hyperfilm® ECL ™ film (Amersham). Using the same protocol, the GAPDH comparison protein was detected using Anti-GAPDH antibodies.

Результаты представлена на фиг. 7:The results are presented in FIG. 7:

Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами, содержащими как модифицированные, так и немодифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, наблюдалась экспрессия целевого белка GP. При этом в клетках, к которым добавляли рекомбинантные аденовирусы, которые содержат модифицированные гены GP (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2), наблюдались более высокие уровни экспрессии, чем в клетках, трансдуцированных аденовирусом, экспрессирующим немодифицированный ген GP (SEQ ID NO 4).As can be seen from the data obtained, in all cells transduced with recombinant adenoviruses containing both modified and unmodified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, expression of the target GP protein was observed. Moreover, in cells to which recombinant adenoviruses were added that contain modified GP genes (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2), higher levels of expression were observed than in cells transduced with an adenovirus expressing the unmodified GP gene (SEQ ID NO 4 )

Пример 6. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления иммунобиологического средства на основе вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2Example 6. Verification of the expression of GP proteins in cells after the addition of an immunobiological agent based on a vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2

Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO₂. Клетки помещали на 35 мм² культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита (VSV-GP1, VSV-GP2) и контрольные препараты (VSV-null - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, не содержащий вставок, VSV-GPwt - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий неоптимизированную последовательность GP) из расчета 10 БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом иммуноблоттинга аналогично протоколу, описанному в примере 4.HEK293 cells were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum in an incubator at 37 ° C and 5% CO ₂ . Cells were placed on 35 mm ² Petri dishes and incubated for one day until 70% confluency was achieved. Then, the studied preparations of recombinant vesicular stomatitis viruses (VSV-GP1, VSV-GP2) and control preparations (VSV-null - recombinant vesicular stomatitis virus containing no inserts, VSV-GPwt - recombinant vesicular stomatitis virus containing non-optimized GP sequence) were added to the cells. based on 10 PFU / cell or phosphate buffer as a negative control. After a day, the expression of Ebola antigens was checked by immunoblotting, similarly to the protocol described in example 4.

Результаты представлены на фиг. 8:The results are shown in FIG. 8:

3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GPwt,3 - cell lysate to which VSV-GPwt was added,

Результаты эксперимента показали, что во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными вирусами везикулярного стоматита, содержащими как модифицированные, так и немодифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, наблюдалась экспрессия GP. При этом в тех клетках, к которым добавляли рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, которые содержат модифицированные гены GP, наблюдались более высокие уровни экспрессии.The experimental results showed that in all cells transduced with recombinant vesicular stomatitis viruses containing both the modified and unmodified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, GP expression was observed. Moreover, in those cells to which recombinant vesicular stomatitis viruses were added that contain modified GP genes, higher levels of expression were observed.

Пример 7. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2Example 7. Verification of the expression of GP proteins in cells after the addition of an immunobiological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an unmodified GP / Hp gene gene insert. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2

Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO₂. Клетки помещали на 35 мм² культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита, которые входят в состав разработанного иммунобиологического средства (VSV-GP1, VSV-deltaG-GP2, VSV-deltaG-GP3, VSV-deltaG-GP4, VSV-deltaG-GP5), и контрольные препараты (VSV-deltaG-null - рекомбинантный аденовирус, не содержащий вставок, VSV-deltaG-GPwt - рекомбинантный аденовирус, содержащий неоптимизированную последовательность GP) из расчета 10 БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом иммуноблоттинга аналогично протоколу, описанному в примере 4.HEK293 cells were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum in an incubator at 37 ° C and 5% CO ₂ . Cells were placed on 35 mm ² Petri dishes and incubated for one day until 70% confluency was achieved. Then, the studied preparations of recombinant vesicular stomatitis viruses, which are part of the developed immunobiological agent (VSV-GP1, VSV-deltaG-GP2, VSV-deltaG-GP3, VSV-deltaG-GP4, VSV-deltaG-GP5), and control were added to the cells preparations (VSV-deltaG-null - recombinant adenovirus containing no inserts, VSV-deltaG-GPwt - recombinant adenovirus containing non-optimized GP sequence) at the rate of 10 PFU / cell or phosphate buffer as a negative control. After a day, the expression of Ebola antigens was checked by immunoblotting, similarly to the protocol described in example 4.

Результаты представлены на фиг. 9:The results are shown in FIG. 9:

Результаты эксперимента показали, что во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными вирусами везикулярного стоматита, содержащими ген GP, наблюдалась экспрессия гликопротеина вируса Эбола. Максимальная экспрессия была обнаружена в группах №4 и №5, где добавляли рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, несущие модифицированные гены GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2).The experimental results showed that in all cells transduced with recombinant vesicular stomatitis viruses containing the GP gene, Ebola virus glycoprotein expression was observed. The maximum expression was found in groups No. 4 and No. 5, where recombinant vesicular stomatitis viruses carrying modified Ebola / H virus GP genes were added. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2).

Пример 8. Способ использования иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу ЭболаExample 8. A method of using an immunobiological agent based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, by introducing into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus

Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально). При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку гликопротеина вируса Эбола.The developed immunobiological agent based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), is used by introducing into the body of a mammal any of the known for this viral vector of methods of administration (subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intranasally). In this case, the mammalian organism develops an immune response to the target Ebola virus glycoprotein protein.

Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гликопротеина вируса Эбола, после двукратной (с интервалом в 1 неделю) подкожной иммунизации животных иммунобиологическим средством, включающим рекомбинантный аденовирус, содержащий модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранный из GP1 (SEQ ID NO 1), GP2 (SEQ ID NO 2).One of the main characteristics of the effectiveness of immunization is the titer of antibodies. The example presents data on changes in the titer of antibodies against the Ebola virus glycoprotein after a double (with an interval of 1 week) subcutaneous immunization of animals with an immunobiological agent, including a recombinant adenovirus containing the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, selected from GP1 (SEQ ID NO 1), GP2 (SEQ ID NO 2).

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии Balb/c, самки 18 г. Все животные были разделены на 13 групп по 3 животных, которым внутримышечно вводили:In the experiment, mammals were used - mice of the Balb / c line, females of 18 g. All animals were divided into 13 groups of 3 animals, which were administered intramuscularly:

1) Ad-GP1 10⁷ БОЕ/мышь1) Ad-GP1 10 ⁷ PFU / mouse

2) Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь2) Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse

3) Ad-GP1 10⁹ БОЕ/мышь3) Ad-GP1 10 ⁹ PFU / mouse

4) Ad-GP1 10¹⁰ БОЕ/мышь4) Ad-GP1 10 ¹⁰ PFU / mouse

5) Ad-GP2 10⁷ БОЕ/мышь5) Ad-GP2 10 ⁷ PFU / mouse

6) Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь6) Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse

7) Ad-GP2 10⁹ БОЕ/мышь7) Ad-GP2 10 ⁹ PFU / mouse

8) Ad-GP2 10¹⁰ БОЕ/мышь8) Ad-GP2 10 ¹⁰ PFU / mouse

9) Ad-null 10⁷ БОЕ/мышь9) Ad-null 10 ⁷ PFU / mouse

10) Ad-null 10⁸ БОЕ/мышь10) Ad-null 10 ⁸ PFU / mouse

11) Ad-null 10⁹ БОЕ/мышь11) Ad-null 10 ⁹ PFU / mouse

12) Ad-null 10¹⁰ БОЕ/мышь12) Ad-null 10 ¹⁰ PFU / mouse

13) фосфатно-солевой буфер13) phosphate buffered saline

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа по следующему протоколу.Three weeks later, animals were sampled from the tail vein and blood serum was isolated. The antibody titer was determined by enzyme immunoassay according to the following protocol.

1) Белок (GP) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.1) Protein (GP) was adsorbed on the wells of a 96-well ELISA plate for 16 hours at + 4 ° C.

2) Методом 2-кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 8 разведений каждого образца.2) Serum samples of immunized mice were diluted using 2-fold dilutions. A total of 8 dilutions of each sample were prepared.

3) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.3) 50 μl of each diluted serum sample was added to the wells of the plate.

4) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.4) Next, incubation was carried out for 1 hour at 37 ° C.

5) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.5) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

6) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с биотином.6) Then, secondary antibodies against mouse immunoglobulins conjugated with biotin were added.

7) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.7) Next, incubation was carried out for 1 hour at 37 ° C.

8) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.8) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

9) Затем в каждую лунку добавили конъюгат стрептовидина и пероксидазы хрена.9) Then, a conjugate of streptovidin and horseradish peroxidase was added to each well.

10) Далее проводили инкубацию в течение 30 минут при 37°С.10) Next, incubation was carried out for 30 minutes at 37 ° C.

11) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.11) After incubation, the wells were washed three times with phosphate buffer.

12) Затем добавили раствор ТМВ, который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.12) Then a TMB solution was added, which is a horseradish peroxidase substrate and, as a result of the reaction, turns into a colored compound. The reaction was stopped after 15 minutes by the addition of sulfuric acid. Next, the optical density of the solution (OD) in each well was measured using a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm.

Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты представлены в таблице 1.Antibody titer was defined as the last dilution in which the optical density of the solution was significantly higher than in the negative control group. The results are presented in table 1.

Результаты эксперимента показали, что разработанное иммунобиологическое средство по п. 1, введенное в организм млекопитающего, индуцирует иммунный ответ к вирусу Эбола во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.The results of the experiment showed that the developed immunobiological agent according to claim 1, introduced into the body of a mammal, induces an immune response to the Ebola virus in the entire range of selected doses. It is obvious that an increase in doses will lead to an increase in the titer of antibodies in the blood of mammals before the onset of toxic effects.

Пример 9. Способ использования иммунобиологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу ЭболаExample 9. A method of using an immunobiological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, by introducing into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus

Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально). При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку гликопротеина вируса Эбола.The developed immunobiological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), is used by introducing into the body of a mammal any of the known for this viral vector of methods of administration (subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intranasally). In this case, the mammalian organism develops an immune response to the target Ebola virus glycoprotein protein.

На данном этапе работы оценивали эффективность иммунизации разработанным иммунобиологическим средством, определив титр антител против гликопротеина вируса Эбола, после двукратной (с интервалом в 1 неделю) подкожной иммунизации животных иммунобиологическим средством, включающим рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранный из GP1 (SEQ ID NO 1), GP2 (SEQ ID NO 2). Эксперимент был выполнен по схеме, аналогичной описанной в примере 8.At this stage, the effectiveness of immunization with the developed immunobiological agent was evaluated by determining the titer of antibodies against the Ebola virus glycoprotein after two (with an interval of 1 week) subcutaneous immunization of animals with an immunobiological agent including the recombinant vesicular stomatitis virus containing the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, selected from GP1 (SEQ ID NO 1), GP2 (SEQ ID NO 2). The experiment was performed according to a scheme similar to that described in example 8.

1) VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь1) VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse

2) VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь2) VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse

3) VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь3) VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse

4) VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь4) VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse

5) VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь5) VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse

6) VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь6) VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse

7) VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь7) VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse

8) VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь8) VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse

9) VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь9) VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

10) VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь10) VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

11) VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь11) VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

12) VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь12) VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

13) фосфатно-солевой буфер13) phosphate buffered saline

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа по протоколу, описанному в примере 8. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.Three weeks later, animals were sampled from the tail vein and blood serum was isolated. The antibody titer was determined by enzyme immunoassay according to the protocol described in example 8. The experimental results are presented in table 2.

Данные проведенных экспериментов показали, что разработанное иммунобиологическое средство по п. 2, введенное в организм млекопитающего, индуцирует иммунный ответ к вирусу Эбола во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.The data of the experiments showed that the developed immunobiological agent according to claim 2, introduced into the body of a mammal, induces an immune response to the Ebola virus in the entire range of selected doses. It is obvious that an increase in doses will lead to an increase in the titer of antibodies in the blood of mammals before the onset of toxic effects.

Пример 10. Способ использования иммунобиологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.Example 10. A method of using an immunobiological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the unmodified GP / virus GP gene. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, by introducing into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus.

Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально). При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку гликопротеина вируса Эбола. Удобным способом оценки эффективности иммунизации является определение титра антител против целевого белка (GP).The developed immunobiological agent based on the recombinant virus of vesicular stomatitis, containing a cassette with an insert of the unmodified GP gene of the virus / H. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with the sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 is used by introducing into the mammalian organism any of the methods of administration known for this viral vector (subcutaneously , intramuscularly, intravenously, intranasally). In this case, the mammalian organism develops an immune response to the target Ebola virus glycoprotein protein. A convenient way to evaluate the effectiveness of immunization is to determine the titer of antibodies against the target protein (GP).

Целью данного эксперимента являлось определение титра антител против гликопротеина вируса Эбола после двукратной (с интервалом в 1 неделю) иммунизации животных разработанным иммунобиологическим средством, включающим рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятых в эффективных соотношениях. Были взяты следующие соотношения вирусных векторов: 1:1000, 1:100, 1:10, 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1. Эксперимент был выполнен по схеме, аналогичной описанной в примере 8.The purpose of this experiment was to determine the titer of antibodies against the Ebola virus glycoprotein after double (with an interval of 1 week) immunization of animals with a developed immunobiological agent, including a recombinant vesicular stomatitis virus, containing a cassette with an insert of the unmodified GP / H virus gene. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, taken in effective ratios. The following ratios of viral vectors were taken: 1: 1000, 1: 100, 1:10, 1: 1, 10: 1, 100: 1, 1000: 1. The experiment was performed according to a scheme similar to that described in example 8.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии Balb/c, самки 18 г. Все животные были разделены на 97 групп по 3 животных, которым внутримышечно вводили:In the experiment, mammals were used - mice of the Balb / c line, females of 18 g. All animals were divided into 97 groups of 3 animals, which were administered intramuscularly:

1. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (1:1)1. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (1: 1)

2. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (1:10)2. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (1:10)

3. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь (1:100)3. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse (1: 100)

4. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:1000)4. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1: 1000)

5. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (10:1)5. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (10: 1)

6. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (1:1)6. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (1: 1)

7. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь (1:10)7. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse (1:10)

8. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:100)8. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1: 100)

9. VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (100:1)9. VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (100: 1)

10. VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (10:1)10. VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (10: 1)

11. VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (1:1)11. VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (1: 1)

12. VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:10)12. VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1:10)

13. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (1000:1)13. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (1000: 1)

14. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (100:1)14. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (100: 1)

15. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь (10:1)15. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse (10: 1)

16. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:1)16. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1: 1)

17. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь17. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

18. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь18. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

19. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь19. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

20. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь20. VSV-GP1 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

21. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь21. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

22. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь22. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

23. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь23. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

24. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь24. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

25. VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь25. VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

26. VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь26. VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

27. VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь27. VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

28. VSV-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь28. VSV-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

29. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь29. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

30. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь30. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

31. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь31. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

32. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь32. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

33. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (1:1)33. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (1: 1)

34. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (1:10)34. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (1:10)

35. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь (1:100)35. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse (1: 100)

36. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:1000)36. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1: 1000)

37. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (10:1)37. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (10: 1)

38. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (1:1)38. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (1: 1)

39. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь (1:10)39. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse (1:10)

40. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:100)40. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1: 100)

41. VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (100:1)41. VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (100: 1)

42. VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (10:1)42. VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (10: 1)

43. VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь (1:1)43. VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse (1: 1)

44. VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:10)44. VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1:10)

45. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (1000:1)45. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (1000: 1)

46. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (100:1)46. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (100: 1)

47. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь (10:1)47. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse (10: 1)

48. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:1)48. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1: 1)

49. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь49. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

50. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь50. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

51. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь51. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

52. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь52. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

53. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь53. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

54. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь54. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

55. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь55. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

56. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь56. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

57. VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь57. VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

58. VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь58. VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

59. VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь59. VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

60. VSV-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь60. VSV-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

61. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь61. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

62. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь62. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

63. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь63. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

64. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь64. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

65. VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь65. VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

66. VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь66. VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

67. VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь67. VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

68. VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь68. VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

69. VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь69. VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

70. VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь70. VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

71. VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь71. VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

72. VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь72. VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

73. VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь73. VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

74. VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь74. VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

75. VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь75. VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

76. VSV-GP3 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь76. VSV-GP3 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

77. VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь77. VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

78. VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь78. VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

79. VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь79. VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

80. VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь80. VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

81. VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь81. VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

82. VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь82. VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

83. VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь83. VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

84. VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь84. VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

85. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь85. VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

86. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь86. VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

87. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь87. VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

88. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь88. VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

89. VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь89. VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

90. VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь90. VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

91. VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь91. VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

92. VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь92. VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

93. VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁶ БОЕ/мышь93. VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁶ PFU / mouse

94. VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь94. VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

95. VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁸ БОЕ/мышь95. VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁸ PFU / mouse

96. VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-null 10⁹ БОЕ/мышь96. VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-null 10 ⁹ PFU / mouse

97. фосфатно-солевой буфер97. phosphate buffered saline

Результаты эксперимента представлены в таблице 3.The results of the experiment are presented in table 3.

Результаты эксперимента показали, что разработанное иммунобиологическое средство по п. 3, введенное в организм млекопитающего, индуцирует иммунный ответ к вирусу Эбола во всем диапазоне выбранных доз и выбранных соотношений.The results of the experiment showed that the developed immunobiological agent according to claim 3, introduced into the body of a mammal, induces an immune response to the Ebola virus in the entire range of selected doses and selected ratios.

Пример 11. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по оценке доли пролиферирующих лимфоцитовExample 11. Determining the effectiveness of immunization with a developed immunobiological agent based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, according to the proportion of proliferating lymphocytes

Пролиферативный анализ позволяет оценивать способность лимфоцитов усиленно делиться после встречи с антигеном. Для того чтобы оценить пролиферацию, авторы использовали окраску лимфоцитов флуоресцентным красителем CFSE. Данный краситель связывается с клеточными белками и сохраняется долгое время и при этом никогда не передается соседним клеткам в популяции. Однако флуоресцентная метка передается дочерним клеткам. Концентрация метки, а следовательно, и интенсивность флуоресценции снижаются ровно в 2 раза. Поэтому делящиеся клетки легко отслеживать по уменьшению их флуоресценции.Proliferative analysis allows you to evaluate the ability of lymphocytes to intensively divide after meeting with an antigen. In order to evaluate proliferation, the authors used the staining of lymphocytes with the fluorescent dye CFSE. This dye binds to cellular proteins and persists for a long time and is never transmitted to neighboring cells in the population. However, the fluorescent label is transmitted to daughter cells. The concentration of the label, and therefore the fluorescence intensity, decreases exactly 2 times. Therefore, dividing cells are easy to track by decreasing their fluorescence.

В эксперименте использовались мыши линии Balb/c. Все животные были разделены на 4 группы (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:In the experiment, Balb / c mice were used. All animals were divided into 4 groups (3 animals each), which were administered intramuscularly:

1) фосфатный буфер (100 мкл)1) phosphate buffer (100 μl)

2) Ad-null 10⁸ БОЕ/мышь2) Ad-null 10 ⁸ PFU / mouse

3) Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь3) Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse

4) Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь4) Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse

Дозы рекомбинантных аденовирусов были выбраны на основании данных, полученных при определении титра антител.Doses of recombinant adenoviruses were selected based on data obtained in determining the titer of antibodies.

Через две недели животных усыпляли. Из селезенки выделяли лимфоциты методом центрифугирования в градиенте фиколла-урографина. Затем выделенные клетки окрашивали CFSE по методике (Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester / Quah BJ, Warren HS, Parish CR Nat Protoc. 2007; 2(9), с. 2049-2056) и культивировали в присутствии антигена. Далее клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты представлены в виде гистограммы (фиг. 10).After two weeks, the animals were euthanized. Lymphocytes were isolated from the spleen by centrifugation in a ficoll-urographin gradient. Then, the isolated cells were stained with CFSE according to the procedure (Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester / Quah BJ, Warren HS, Parish CR Nat Protoc. 2007; 2 (9), p. 2049-2056) and cultured in the presence of antigen. Next, the cells were analyzed by flow cytometry. The results are presented in the form of a histogram (Fig. 10).

Как видно из результатов эксперимента, разработанное иммунобиологическое средство по п. 1 в данной дозе эффективно стимулирует пролиферацию лимфоцитов.As can be seen from the results of the experiment, the developed immunobiological agent according to claim 1 at this dose effectively stimulates the proliferation of lymphocytes.

Пример 12. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством на основе вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.Example 12. Determination of the effectiveness of immunization with the developed immunobiological agent based on the virus of vesicular stomatitis, containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, according to the proportion of proliferating lymphocytes.

Целью данного эксперимента была проверка пролиферативной способности лимфоцитов, выделенных из мышей C57/BI6 (18 г), которым вводили:The purpose of this experiment was to check the proliferative ability of lymphocytes isolated from C57 / BI6 mice (18 g), which were administered:

1. фосфатный буфер (100 мкл)1. phosphate buffer (100 μl)

2. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь2. VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

3. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь3. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse

4. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь4. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse

Дозы рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита были выбраны на основании данных, полученных при определении титра антител. Эксперимент был выполнен согласно протоколу, представленному в примере 11.Doses of recombinant vesicular stomatitis viruses were selected based on data obtained when determining the titer of antibodies. The experiment was performed according to the protocol presented in example 11.

Результаты эксперимента представлены на фиг. 11.The experimental results are shown in FIG. eleven.

Как видно из результатов эксперимента, разработанное иммунобиологическое средство по п. 2 в данной дозе эффективно стимулирует пролиферацию лимфоцитов.As can be seen from the experimental results, the developed immunobiological agent according to claim 2 at a given dose effectively stimulates the proliferation of lymphocytes.

Пример 13. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.Example 13. Determination of the effectiveness of immunization with the developed immunobiological agent based on a recombinant virus of vesicular stomatitis, containing a cassette with an insert of the unmodified GP gene of the virus / H. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola virus GP gene /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124 .1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, according to the proportion of proliferating lymphocytes.

В данном эксперименте был проведен пролиферативный анализ лимфоцитов, выделенных из мышей, которым вводили:In this experiment, a proliferative analysis of lymphocytes isolated from mice that were injected was performed:

1. фосфатный буфер (100 мкл)1. phosphate buffer (100 μl)

2. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь2. VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

3. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (1:1)3. VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (1: 1)

5. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь (1000:1)5. VSV-GP1 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (1000: 1)

6. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь (1:1)6. VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse (1: 1)

7. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь (1:1000)7. VSV-GP2 10 ⁶ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁹ PFU / mouse (1: 1000)

8. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь(1000:1)8. VSV-GP2 10 ⁹ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁶ PFU / mouse (1000: 1)

Результаты эксперимента представлены на фиг. 12.The experimental results are shown in FIG. 12.

Как видно из результатов эксперимента, разработанное иммунобиологическое средство по п. 3 в данной дозе эффективно стимулирует пролиферацию лимфоцитов.As can be seen from the results of the experiment, the developed immunobiological agent according to claim 3 at a given dose effectively stimulates the proliferation of lymphocytes.

Пример 14. Способ использования иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, и иммунобиологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, заключающийся в их последовательном введении в организм млекопитающих с интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу ЭболаExample 14. A method of using an immunobiological agent based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, and an immunobiological agent based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with the insertion of the modified GP gene Ebola virus / H. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, which consists in their sequential introduction into the body of mammals with an interval of more than 1 week for induction specific immunity to the Ebola virus

Как видно из результатов экспериментов, описанных в примерах 8-10, разработанные варианты иммунобиологического средства на основе аденовирусов и вирусов везикулярного стоматита приводят к высоким титрам антител в крови иммунизированных животных. Использование данных вариантов подойдет для индукции иммунного ответа против вируса Эбола у подавляющей части населения.As can be seen from the results of the experiments described in examples 8-10, the developed variants of the immunobiological agent based on adenoviruses and viruses of vesicular stomatitis lead to high titers of antibodies in the blood of immunized animals. The use of these options is suitable for the induction of an immune response against the Ebola virus in the vast majority of the population.

Однако есть категории населения (работники сферы здравоохранения, люди, живущие в очаге эпидемии), которые находятся в группе риска: это работники инфекционных отделений больниц; работники сферы здравоохранения, направляющиеся в зону эпидемии; люди, живущие в зоне эпидемии и др. Для данных категорий были разработаны способы по пп. 7 и 8, которые включают последовательную иммунизацию (с интервалом более 1 недели) иммунобиологическими средствами по пп. 1 и 2 или по пп. 1 и 3.However, there are categories of the population (health workers, people living in the focus of the epidemic) who are at risk: these are workers in the infectious diseases departments of hospitals; health workers heading to the epidemic area; people living in the epidemic zone, etc. For these categories, methods have been developed according to paragraphs. 7 and 8, which include sequential immunization (with an interval of more than 1 week) by immunobiological agents according to paragraphs. 1 and 2 or paragraphs. 1 and 3.

Способ индукции иммунного ответа, при котором вводят вначале один рекомбинантный вирусный вектор, а затем другой, будет более эффективным, чем если вводить одинаковые вирусные векторы. Это связано с тем, что после первой иммунизации антитела в организме вырабатываются не только к целевому антигену (GP вируса Эбола), но также и к белкам вектора. Поэтому при повторной иммунизации эти антитела препятствуют проникновению вирусного вектора в клетки. Следовательно, экспрессия целевого белка будет также снижаться и иммунный ответ будет более слабым.A method of inducing an immune response in which one recombinant viral vector is introduced first and then another is more effective than if the same viral vectors are introduced. This is due to the fact that after the first immunization, antibodies in the body are produced not only to the target antigen (Ebola virus GP), but also to the proteins of the vector. Therefore, with repeated immunization, these antibodies prevent the penetration of the viral vector into the cells. Therefore, the expression of the target protein will also decrease and the immune response will be weaker.

В данном примере приводятся экспериментальные данные, показывающие что последовательная иммунизация животных разными вирусными векторами: вначале иммунобиологическим средством по п. 1 (включающим рекомбинантный аденовирус, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1), а через неделю иммунобиологическим средством по п. 2 (включающим рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2) или наоборот приводит к более мощной индукции антител против целевого белка (GP), чем иммунизация, проведенная по той же схеме, но одним и тем же иммунобиологическим средством.In this example, experimental data are presented showing that sequential immunization of animals with different viral vectors: first, with the immunobiological agent according to claim 1 (comprising a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H. Sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona- GP gene EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1), and after a week with the immunobiological agent according to claim 2 (including a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified GP gene Ebola virus / H. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2) or vice versa leads to a more powerful induction of antibodies against the target protein ( GP) than immunization carried out according to the same scheme, but with the same immunobiological agent.

Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 8.The experiment was performed according to the protocol described in example 8.

Все животные были разделены на 11 групп (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:All animals were divided into 11 groups (3 animals each), which were administered intramuscularly:

1) Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь1) Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse

2) Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь2) Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse

3) Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь3) Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse

4) Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь4) Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse

5) Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь5) Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse

6) Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь6) Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse

7) VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь7) VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, and after a week VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse

8) VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь8) VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, and after a week VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse

9) Ad-null 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю Ad-null 10⁸ БОЕ/мышь9) Ad-null 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week Ad-null 10 ⁸ PFU / mouse

10) VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь10) VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse, and after a week VSV-null 10 ⁷ PFU / mouse

11) фосфатный буфер, а через неделю фосфатный буфер11) phosphate buffer, and after a week phosphate buffer

Результаты представлены в таблице 4.The results are presented in table 4.

При введении иммуностимулирующих средств по пп. 1 и 2 в обратном порядке (вначале средства по п. 2, а затем средства по п. 1) были получены идентичные результаты.With the introduction of immunostimulating agents according to paragraphs. 1 and 2 in the reverse order (first, the funds according to claim 2, and then the funds according to claim 1), identical results were obtained.

Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами по пп. 1 и 2, включающими различные вирусные векторы, вызовет более мощную индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же вектором.Thus, the results of the experiment fully confirmed that sequential immunization with the developed immunobiological agents according to paragraphs. 1 and 2, including various viral vectors, will cause a more powerful induction of the immune response than immunization according to a similar scheme with the same vector.

Пример 15. Способ использования иммунобиологического средства по п. 1 на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, и иммунобиологического средства по п. 3 на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, заключающийся в их последовательном введении в организм млекопитающих с интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу ЭболаExample 15. The method of using the immunobiological agent according to claim 1 based on a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, and an immunobiological agent according to claim 3 based on a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with the insertion of the unmodified gene of the GP virus / H. sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H virus GP gene. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, which consists in their sequential introduction into the body of mammals with an interval of more than 1 week for induction specific immunity to the Ebola virus

Целью данного эксперимента является проверка того, что иммунизация животных разными вирусными векторами:The purpose of this experiment is to verify that immunization of animals with different viral vectors:

1) вначале иммунобиологическим средством по п. 1 (включающим рекомбинантный аденовирус, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1),1) first, an immunobiological agent according to claim 1 (comprising a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H. Sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 GP gene with a sequence selected from SEQ ID NO 1),

2) а через неделю иммунобиологическим средством по п. 3 (включающим рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3, и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятые в эффективном соотношении)2) and after a week with the immunobiological agent according to claim 3 (including a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an unmodified GP gene of the Ebola / H. Sapiens-wt / 1976 / Mayinga / Zaire GenBank ID AF086833.2 sequence with the sequence SEQ ID NO 3 , and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola / H. sapiens-wt / SLE / 2014 / Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 GP gene with the sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 taken in effective ratio)

или наоборот приводит к более мощной индукции антител против целевого белка (GP), чем иммунизация, проведенная по той же схеме, но одним и тем же иммунобиологическим средством.or vice versa, leads to a more powerful induction of antibodies against the target protein (GP) than immunization carried out according to the same scheme, but with the same immunobiological agent.

1) Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь1) Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse

2) Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь2) Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse

3) Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь3) Ad-GP1 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse

4) Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь4) Ad-GP2 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse

7) VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь7) VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse, and after a week VSV-GP1 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse

8) VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь8) VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse, and after a week VSV-GP2 10 ⁷ PFU / mouse, VSV-GP3 10 ⁷ PFU / mouse

9) Ad -null 10⁸ БОЕ/мышь, а через неделю Ad-null 10⁸ БОЕ/мышь9) Ad-null 10 ⁸ PFU / mouse, and after a week Ad-null 10 ⁸ PFU / mouse

10) VSV-null 2*10⁷ БОЕ/мышь, а через неделю VSV-null 2*10⁷ БОЕ/мышь10) VSV-null 2 * 10 ⁷ PFU / mouse, and after a week VSV-null 2 * 10 ⁷ PFU / mouse

Результаты представлены в таблице 5.The results are presented in table 5.

При введении иммуностимулирующих средств по пп. 1 и 3 в обратном порядке (вначале средства по п. 3, а затем средства по п. 1) были получены идентичные результаты.With the introduction of immunostimulating agents according to paragraphs. 1 and 3 in the reverse order (first, the funds according to claim 3, and then the funds according to claim 1), identical results were obtained.

Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами по пп. 1 и 3, включающими различные вирусные векторы, вызовет более мощную индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же вектором.Thus, the results of the experiment fully confirmed that sequential immunization with the developed immunobiological agents according to paragraphs. 1 and 3, including various viral vectors, will cause a more powerful induction of the immune response than immunization according to a similar scheme with the same vector.

Промышленная применимостьIndustrial applicability

Все приведенные примеры подтверждают выполнение технической задачи, а также промышленную применимость созданного технического решения.All the above examples confirm the fulfillment of the technical task, as well as the industrial applicability of the created technical solution.

Claims

1. An immunobiological agent for the induction of specific immunity to the Ebola virus, which consists in the fact that it includes a recombinant adenovirus containing a cassette with an insert of the modified Ebola virus GP gene /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.

2. An immunobiological agent for the induction of specific immunity to the Ebola virus, which consists in the fact that it contains a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an insert of the modified Ebola virus GP gene /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.

3. An immunobiological agent for the induction of specific immunity to the Ebola virus, which consists in the fact that it contains a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with an unmodified GP gene of the Ebola virus /H.sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833. 2 with the sequence SEQ ID NO 3, and a recombinant vesicular stomatitis virus containing a cassette with the insert of the modified Ebola virus GP gene /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 with a sequence selected from SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, taken in effective ratios.

4. The method of using the immunobiological agent according to claim 1 by introducing into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus.

5. The method of using the immunobiological agent according to claim 2 by introducing into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus.

6. The method of using the immunobiological agent according to claim 3 by introducing into the body of a mammal in an effective amount to induce specific immunity to the Ebola virus.

7. The method of using the immunobiological agent according to claims. 1 and 2, which consists in their sequential introduction into the body of mammals with an interval of more than 1 week to induce specific immunity to the Ebola virus.

8. The method of using the immunobiological agent according to claims. 1 and 3, which consists in their sequential introduction into the body of mammals with an interval of more than 1 week to induce specific immunity to the Ebola virus.