RU2575607C2 - Method for reducing degree of protein glycosylation, methods and proteins - Google Patents
Method for reducing degree of protein glycosylation, methods and proteins Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575607C2 RU2575607C2 RU2012137953/10A RU2012137953A RU2575607C2 RU 2575607 C2 RU2575607 C2 RU 2575607C2 RU 2012137953/10 A RU2012137953/10 A RU 2012137953/10A RU 2012137953 A RU2012137953 A RU 2012137953A RU 2575607 C2 RU2575607 C2 RU 2575607C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- strain
- glycosylation
- precursor
- gene
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 69
- 230000013595 protein glycosylation Effects 0.000 title 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 137
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 66
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 claims abstract description 65
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 54
- 101700008471 OAC1 Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 101710013679 ogm1 Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 101710013677 At2g03480 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101710013676 At3g10200 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 claims abstract description 6
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 68
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 47
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 27
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 16
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 13
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- VBJHPXDIVMXHJU-UHFFFAOYSA-N Zeocin Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(=O)NCCCCN=C(N)N)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1[N]C=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C VBJHPXDIVMXHJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 claims description 9
- 101700087115 PMT4 Proteins 0.000 abstract description 27
- 101700049119 PMT2 Proteins 0.000 abstract description 25
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 abstract description 21
- 230000001131 transforming Effects 0.000 abstract description 8
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 64
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 43
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 10
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 9
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 9
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 102000007312 Recombinant Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010033725 Recombinant Proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- -1 nucleic acids acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 description 3
- 108010057186 Insulin Glargine Proteins 0.000 description 3
- 229960002869 Insulin Glargine Drugs 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating Effects 0.000 description 3
- 239000002609 media Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 108030001895 EC 2.4.1.109 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101800001171 Leader peptide Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010087568 Mannosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000006722 Mannosyltransferases Human genes 0.000 description 2
- 102100006023 POMT1 Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 241001063594 Acasta Species 0.000 description 1
- 101710026100 Act57B Proteins 0.000 description 1
- 210000000577 Adipose Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 210000002472 Endoplasmic Reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 230000036081 Excretion rate Effects 0.000 description 1
- 229920001272 Exogenous DNA Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002288 Golgi Apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101700017628 INS2A Proteins 0.000 description 1
- HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N Ibuprofen Chemical compound CC(C)CC1=CC=C(C(C)C(O)=O)C=C1 HEFNNWSXXWATRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 210000002027 Muscle, Skeletal Anatomy 0.000 description 1
- 102100015077 NEUROD6 Human genes 0.000 description 1
- 101710008008 NEUROD6 Proteins 0.000 description 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 229940081969 Saccharomyces cerevisiae Drugs 0.000 description 1
- 229940014598 TAC Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H Tricalcium phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002877 acrylic styrene acrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 238000011087 biopharmaceutical technology Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 101710004159 ins-a Proteins 0.000 description 1
- 101710004161 ins-b Proteins 0.000 description 1
- 101710004448 insm1a Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 1
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000029964 regulation of glucose metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000003616 serine group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY
Изобретение относится к дизрупции генов протеин-маннозилтрансфераз (Protein mannosyi transferase, PTM) Pichia pastoris, приводящей к снижению уровня O-гликозилирования молекулы предшественника инсулина, продуцируемой Pichia sp.Настоящее изобретение обеспечивает нокаутированные с помощью генной инженерии штаммы метилотрофных дрожжей, в том числе рода Pichia, в частности, вида Pichia pastoris, способные продуцировать гетерологичные белки со сниженной степенью гликозилирования. Настоящим изобретением предусмотрены векторы, содержащие кодирующие последовательности генов РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6 для трансформации метилотрофных дрожжей.The invention relates to the disruption of the protein mannosyl transferase (Protein mannosyi transferase, PTM) genes of Pichia pastoris, resulting in a decrease in the O-glycosylation of the insulin precursor molecule produced by Pichia sp. The present invention provides genetically knocked out strains of methylotrophic yeast P, in particular, the species Pichia pastoris, capable of producing heterologous proteins with a reduced degree of glycosylation. The present invention provides vectors containing the coding sequences of the PMT1, PMT2, PMT4, PMT5 and PMT6 genes for the transformation of methylotrophic yeast.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
Рекомбинантные формы инсулина, аналогов инсулина и/или его производных были продуцированы в различных микробных системах экспрессии. В настоящее время организмы, такие как E. coli и S. cerevisiae, применяют для промышленного производства рекомбинантного человеческого инсулина и его производных. Вследствие некоторых недостатков указанных систем, таких как низкий уровень экспрессии, трудности в последующей очистке и т.п., предпочтение отдается применению метилотрофных дрожжей Pichia pastoris в качестве системы для экспрессии белков. Данная экспрессионная система имеет ряд преимуществ, таких как высокий уровень экспрессии, простая переработка, низкая стоимость производства, высокая плотность культуры (US 6800606).Recombinant forms of insulin, analogues of insulin and / or its derivatives have been produced in various microbial expression systems. Currently, organisms such as E. coli and S. cerevisiae are used for the industrial production of recombinant human insulin and its derivatives. Due to some drawbacks of these systems, such as a low level of expression, difficulties in subsequent purification, etc., the use of methylotrophic yeast Pichia pastoris as a system for the expression of proteins is preferred. This expression system has several advantages, such as a high level of expression, simple processing, low cost of production, high density culture (US 6800606).
Дрожжевые экспрессионные системы широко распространены, поскольку их легко выращивать, они характеризуются быстрым ростом и являются масштабируемыми, однако некоторые дрожжевые экспрессионные системы дают противоречивые результаты, и иногда бывает трудно добиться высокого выхода. Одну из дрожжевых экспрессионных систем, показавшую перспективность применения, представляют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris. По сравнению с другими эукариотическими экспрессионными системами, Pichia обладает многими преимуществами, поскольку не влечет за собой проблем, связанных с эндотоксинами, ассоциированных с бактериями, или проблем загрязнения белков, продуцируемых в культуре клеток животных, вирусами (Cino, Am Biotech Lab, May 1999).Yeast expression systems are widespread because they are easy to grow, they are fast growing and are scalable, however, some yeast expression systems give conflicting results, and sometimes it is difficult to achieve high yields. One of the yeast expression systems, which has shown promise, is methylotrophic Pichia pastoris yeast. Compared to other eukaryotic expression systems, Pichia has many advantages because it does not entail problems associated with endotoxins associated with bacteria or problems of contamination of proteins produced in animal cell cultures with viruses (Cino, Am Biotech Lab, May 1999) .
Несмотря на различные преимущества, характерные для экспрессионных систем на основе дрожжей, таких как Pichia pastoris, одним из основных недостатков этой системы является посттрансляционная модификация образующихся белков, что впоследствии приводит к наличию примесей в конечном продукте, от которых его трудно очистить. Хотя известен целый ряд посттрансляционных модификаций белков, наиболее распространенной формой посттрансляционной модификации является гликозилирование. (Hart G.W, Glycosylation, Curr. Opin. Cell. Biol 1992; 4: 1017). Гликозилирования может быть либо N-связанным, либо O-связанным, в зависимости от экспрессионной системы. (Gemmill TR et al., Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species, Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1426:227). Гликозилирование влияет на стабильность конформации белка, иммуногенность, скорость выведения из организма, защиту от протеолиза и повышает растворимость белка (Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006; 24:769).Despite the various advantages that are characteristic of yeast-based expression systems, such as Pichia pastoris, one of the main disadvantages of this system is the post-translational modification of the resulting proteins, which subsequently leads to the presence of impurities in the final product that are difficult to purify. Although a number of post-translational protein modifications are known, glycosylation is the most common form of post-translational modification. (Hart G.W., Glycosylation, Curr. Opin. Cell. Biol 1992; 4: 1017). Glycosylation can be either N-linked or O-linked, depending on the expression system. (Gemmill TR et al., Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species, Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1426: 227). Glycosylation affects the stability of protein conformation, immunogenicity, excretion rate, protection against proteolysis and increases protein solubility (Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006; 24: 769).
У дрожжей модификация сахарных ветвей в аппарате Гольджи включает в себя ряд присоединений остатков маннозы различными маннозилтрансферазами («внешнецепочечное» гликозилирование). Структура внешнецепочечного гликозилирования является специфичной для конкретного организма. Такое гликозилирование часто является нежелательным, поскольку оно приводит к неоднородности рекомбинантного белкового продукта по составу углеводов и молекулярной массе, что может затруднять очистку белков. Это также может обуславливать более высокую иммуногенность белка, и может провоцировать аллергические реакции, которые являются нежелательными.In yeast, the modification of sugar branches in the Golgi apparatus includes a number of additions of mannose residues to various mannosyl transferases (“out-chain” glycosylation). The structure of external chain glycosylation is specific for a particular organism. Such glycosylation is often undesirable because it leads to heterogeneity of the recombinant protein product in carbohydrate composition and molecular weight, which may complicate protein purification. It can also lead to a higher immunogenicity of the protein, and can provoke allergic reactions that are undesirable.
Несмотря на значительный прогресс в улучшении биотехнологического производства, не существует общего решения проблемы для каждого белка. Процесс производства каждого конкретного терапевтического белка требует новых и инновационных путей решения проблем, которые могут быть специфичными для данного белка или семейства белков.Despite significant progress in improving biotechnological production, there is no general solution to the problem for each protein. The manufacturing process of each specific therapeutic protein requires new and innovative ways to solve problems that may be specific to a given protein or protein family.
Таким образом, желательно создание с помощью генно-инженерных способов штаммов метилотрофных дрожжей, таких как Pichia pastoris, в которых степень гликозилирования белков можно регулировать, существенно снизить, и в которых можно получать рекомбинантные гликопротеины с посттрансляционным паттерном, схожим с таковым для млекопитающих, при этом не затрагивая продуктивность желаемого конечного продукта.Thus, it is desirable to create, using genetic engineering methods, strains of methylotrophic yeast, such as Pichia pastoris, in which the degree of glycosylation of proteins can be controlled, significantly reduced, and in which recombinant glycoproteins with a post-translational pattern similar to that for mammals can be obtained, while without affecting the productivity of the desired end product.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу снижения гликозилирования белка, продуцируемого штаммом метилотрофных дрожжей, посредством инактивации по меньшей мере одного или более гена, выбранного из группы, включающей гены РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, имеющие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно, при этом указанные последовательности кодируют протеин-маннозилтрансферазу или ее функциональную часть; вектор, содержащий ген протеин-маннозилтрансферазы или его функциональную часть, выбранный из группы, включающей гены РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, имеющие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно, при этом встраивание вектора в гомологичный локус ингибирует экспрессию функциональной протеин-маннозилтрансферазы в организме-хозяине, предпочтительно, в клетке метилотрофных дрожжей; способу получения нокаутированного штамма метилотрофных дрожжей, в котором (а) вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, способную к гомологичной рекомбинации, содержащую целевую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из генов, выбранных из группы, включающей РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, имеющие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер, (б) культивирование клеток при условиях, делающих возможной гомологичную рекомбинацию между ДНК, кодирующей целевой ген в векторе, и ДНК клетки-хозяина, что таким образом приводит к дизрупции целевого гена в клетке-хозяине, (в) селекцию клеток-хозяев с инактивированным целевым геном; белку, продуцируемому с помощью способа, описанного выше; «нокаутированному» штамму метилотрофных дрожжей, где указанный штамм содержит по меньшей мере один инактивированный ген, выбранный из группы, включающей РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, имеющий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно; штамм с инактивированными геном РМТ1, как описано выше; штамм с инактивированными геном РМТ4, как описано выше; штамм с инактивированными геном РМТ5, как описано выше; штамм с инактивированными геном РМТ6, как описано выше; белок, продуцируемый «нокаутированным» штаммом, как описано выше; белок, продуцируемый «нокаутированным» штаммом по п.23 формулы изобретения, где «нокаутированный штамм» представляет собой один из штаммов МТСС5515, МТСС5516, МТСС5517, 5518 МТСС, или модифицированный штамм на его основе; и белок, соответствующий любому из вышеуказанных описаний, при этом белок демонстрирует измененный характер гликозилирования.Thus, the present invention relates to a method for reducing the glycosylation of a protein produced by a methylotrophic yeast strain by inactivating at least one or more genes selected from the group consisting of the PMT1, PMT2, PMT4, PMT5 and PMT6 genes having a nucleotide sequence that is at least at least 80% homologous to the nucleotide sequence shown in
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к способам получения белка со сниженным уровнем гликозилирования, при этом указанный способ предусматривает применение векторов, с помощью которых генетически модифицируют штаммы метилотрофных дрожжей, что позволяет им продуцировать белки с пониженным уровнем гликозилирования.The present invention relates to methods for producing a protein with a reduced level of glycosylation, while this method involves the use of vectors with which genetically modify strains of methylotrophic yeast, which allows them to produce proteins with a low level of glycosylation.
В предпочтительном варианте реализации векторы для инактивации согласно настоящему изобретению включают нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин-маннозилтрансферазу (РМТ, долихил-фосфат-манноза-протеин маннозилтрансферазу, ЕС 2.4.1.109) или ее функциональную часть, и способны нарушать или инактивировать протеин-маннозилтрансферазу или ее функциональную часть в штаммах метилотрофных дрожжей. Предпочтительными нуклеотидными последовательностями являются нуклеотидные последовательности, кодирующие гены РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5, РМТ6, как представлено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, и их функциональные части, выбранные для дизрупции генов, как показано в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, соответственно.In a preferred embodiment, the inactivation vectors of the present invention include a nucleotide sequence encoding a protein mannosyl transferase (PMT, dolichyl phosphate mannose protein mannosyl transferase, EC 2.4.1.109) or a functional part thereof, and are capable of disrupting or inactivating the protein mannosyl transferase or its functional part in strains of methylotrophic yeast. Preferred nucleotide sequences are nucleotide sequences encoding the genes PMT1, PMT2, PMT4, PMT5, PMT6 as set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and their functional parts, selected for gene disruption, as shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, respectively.
В соответствии со способами, изложенными в настоящем описании, нуклеотидная последовательность, способная экспрессировать гетерологичный белок, может быть введена в штамм метилотрофных дрожжей, который предварительно был трансформирован с помощью одного или более из векторов настоящего изобретения поэтапным способом. Такой штамм дрожжей может быть трансформирован, последовательно или одновременно, одним или более вектором настоящего изобретения. Кроме того, штамм метилотрофных дрожжей может быть трансформирован одним или более вектором для инактивации согласно настоящему изобретению, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую протеин-маннозилтрансферазу, как указано в списке последовательностей.In accordance with the methods described herein, a nucleotide sequence capable of expressing a heterologous protein can be introduced into a methylotrophic yeast strain that has previously been transformed using one or more of the vectors of the present invention in a stepwise manner. Such a yeast strain can be transformed, sequentially or simultaneously, by one or more of the vector of the present invention. In addition, a strain of methylotrophic yeast can be transformed with one or more inactivation vectors according to the present invention, comprising a nucleotide sequence encoding a protein mannosyl transferase as indicated in the sequence list.
Также настоящее изобретение предусматривает штаммы метилотрофных дрожжей, созданные с помощью способов и векторов настоящего изобретения, а также белки, полученные в таких генетически модифицированных штаммах.The present invention also provides strains of methylotrophic yeast created using the methods and vectors of the present invention, as well as proteins obtained in such genetically modified strains.
Гетерологичные белковые продукты, полученные с помощью способов настоящего изобретения, т.е. белки со сниженной степенью O-гликозилирования, также являются частью настоящего изобретения.Heterologous protein products obtained using the methods of the present invention, i.e. proteins with reduced O-glycosylation are also part of the present invention.
Согласно наиболее значимым аспектам настоящего изобретения, эффективность продукции желаемого конечного продукта остается неизменной.According to the most significant aspects of the present invention, the production efficiency of the desired final product remains unchanged.
Дополнительные цели и преимущества настоящего изобретения частично изложены в описании, которое следует ниже, и частично могут быть очевидны из описания или могут быть понятны из практического осуществления настоящего изобретения. Цели и преимущества могут быть реализованы и достигнуты с помощью технических средств и комбинаций, которые особым образом указаны в прилагаемой формуле настоящего изобретения.Additional objectives and advantages of the present invention are set forth in part in the description that follows, and in part may be apparent from the description or may be understood from the practical implementation of the present invention. The goals and advantages can be realized and achieved using technical means and combinations, which are specifically indicated in the attached claims of the present invention.
Прилагаемые графические материалы, которые включены в настоящую заявку и которые составляют часть настоящей заявки, иллюстрируют различные характерные признаки, применяемые в настоящем описании, и вместе с описанием служат для объяснения различных значимых характерных признаков, формирующих суть настоящего изобретения.The accompanying graphic materials, which are included in this application and which form part of this application, illustrate the various features used in the present description, and together with the description serve to explain various significant features that form the essence of the present invention.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПРИЛАГАЕМЫХ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF THE APPLICABLE GRAPHIC MATERIALS
Фигура 1: Клоны, полученные при субклонировании генов РМТ в pPICZ-альфа.Figure 1: Clones obtained by subcloning of PMT genes in pPICZ-alpha.
Дорожка 1 = плазмида PMBL184, расщепленная с помощью рестриктаз BamHI и SmaI (фрагменты 1775+576 п.о.),
Дорожка 2 = плазмида PMBL184, расщепленная с помощью рестриктазы BstEII (линеаризованный фрагмент 2351 п.о.),
Дорожка 3 = плазмида PMBL185, расщепленная с помощью рестриктаз BamHI и SmaI (фрагменты 1930+431 п.о.).
Дорожка 4 = плазмида PMBL185, расщепленная с помощью рестриктазы KpnI (линеаризованный фрагмент 2361 п.о.),
Дорожка 5 = Маркер молекулярного веса, ДНК А, рестрицированная с помощью EcoRI и HindIII.
Дорожка 6 = плазмида PMBL186, расщепленная с помощью рестриктаз BamHI и SmaI (фрагменты 1923+428 п.о.),
Дорожка 7 = плазмида PMBL186, расщепленная с помощью рестриктазы XmnI (линеаризованный фрагмент 2351 п.о.),
Дорожка 8 = плазмида PMBL187, расщепленная с помощью рестриктаз BamHI и SmaI (фрагменты 1929+437 п.о.),
Дорожка 9 = плазмида PMBL187, расщепленная с помощью рестриктазы BstEII (линеаризованный фрагмент 2366 п.о.),
Дорожка 10 = плазмида PMBL188, расщепленная с помощью рестриктаз BamHI и SmaI (фрагменты 1929+497 п.о.) и
Дорожка 11 = плазмида PMBL188, расщепленная с помощью рестриктазы NdeI (линеаризованный фрагмент 2426 п.о.).
Фигура 2А: pMBL184 - дизрупция гена РМТ1, клонированного в векторе pPICZ-альфа. Для линеаризации плазмиды использовали сайт рестрикции BstEII.Figure 2A: pMBL184 - disruption of the PMT1 gene cloned in the pPICZ alpha vector. The BstEII restriction site was used to linearize the plasmid.
Фигура 2Б: нокаут В1СС#9104 с дизрупцией гена РМТ1, дорожка 1 и 13=маркер молекулярного веса, А, дорожка 18=BICC#9104.Figure 2B: knockout B1CC # 9104 with PMT1 gene disruption,
Фигура 2(В): Саузерн-блот-анализ геномной ДНК, рестрицированной с помощью рестриктазы Hind III, с использованием в качестве зонда фрагмента для дизрупции РМТ1.Figure 2 (B): Southern blot analysis of genomic DNA restricted with Hind III restriction enzyme using PMT1 disruption fragment as probe.
Дорожка М = Маркер молекулярного веса ДНК, 1 тыс.п.о.,Lane M = DNA molecular weight marker, 1 thousand bp,
Дорожка 1 = Продуцирующий предшественник инсулина родительский клон №11,
Дорожка 2 = Нокаутированный по гену РМТ1 продуцирующий предшественник инсулина клон №11,
Дорожка 3 = Продуцирующий предшественник инсулина родительский клон №8,
Дорожка 4 = Нокаутированный по гену РМТ1 продуцирующий предшественник инсулина клон №8,
Дорожка 5 = Продуцирующий предшественник аналога инсулина родительский клон,
Дорожка 6 = Нокаутированный по гену РМТ1 продуцирующий предшественник аналога инсулина клон и контрольная плазмида.
Фигура 3А: pMBL188 - дизрупция гена РМТ6 гена, клонированного в векторе pPICZ-альфа. Для линеаризации плазмиды использовали сайт рестрикции NdeI.Figure 3A: pMBL188 - disruption of the PMT6 gene of the gene cloned in the pPICZ alpha vector. An NdeI restriction site was used to linearize the plasmid.
Фигура 3Б: Результаты ПЦР, подтверждающие нокаут гена РМТ6.Figure 3B: PCR Results Confirming Knockout of the PMT6 Gene.
Дорожка 1 = Маркер молекулярного веса ДНК, лестница 1 тыс.п.о.,
Дорожка 2 = ПЦР родительского клона с InsteZRP и PMT6DSCHK (нет продукта),
Дорожка 3 = ПЦР клона В1СС#9107 с InsteZRP и PMT6DSCHK (продукт 895 п.о.),
Дорожка 4 = ПЦР родительского клона с TEFDSRP и SPMT6DCFP (нет продукта),
Дорожка 5 = ПЦР клона В1СС#9107 с TEFDSRP и SPMT6DCFP (продукт 639 п.о.),
Дорожка 6 = ПЦР клона В1СС#9107 с ISCHKFP и PMT6DSCHK (продукт 835 п.о.).
Фигура 4А: pMBL186 - дизрупция гена РМТ4 нарушения гена, клонированного в плазмиде pPICZ-альфа. Для линеаризации плазмиды использовали сайт рестрикции XcmI.Figure 4A: pMBL186 - disruption of the PMT4 gene disruption of the gene cloned in the plasmid pPICZ-alpha. The XcmI restriction site was used to linearize the plasmid.
Фигура 4Б: Результаты ПЦР, подтверждающие дизрупцию гена РМТ4.Figure 4B: PCR Results Confirming PMT4 Gene Disruption.
Дорожка 1 = ПЦР родительского клона с InsteZRP и PMT4DSCHK (нет продукта, контроль),
Дорожка 2 = Положительный контроль РМТ6#79 с InsteZRP и PMT6DSCHK (продукт 895 п.о.),
Дорожка 3 = ПЦР клона В1СС#9105 с InsteZRP и PMT4DSCHK (продукт 981 п.о.) (4-я субкультура),
Дорожка 4=ПЦР клона В1СС#9105 с TEFDSRP и SPMT4DCFP (продукт 649 п.о.) (4-я субкультура),
Дорожка 5=ДНК-маркер, лестница 1 тыс.п.о.,
Дорожка 6 = ПЦР клона В1СС#9105 с InsteZRP и PMT4DSCHK (продукт 981 п.о.) (1-я субкультура), Дорожка 7=ПЦР В1СС#9105 с TEFDSRP и SPMT4DRP (продукт 649 п.о.) (1-я субкультура).
Фигура 5А: pMBL-187 - дизрупция гена РМТ5, клонированного в плазмиде pPICZ-альфа. Для линеаризации плазмиды использовали сайт рестрикции BstEII.Figure 5A: pMBL-187 - disruption of the PMT5 gene cloned in the plasmid pPICZ-alpha. The BstEII restriction site was used to linearize the plasmid.
Фигура 5Б: ПЦР-скрининг клонов с дизрупцией РМТ5.Figure 5B: PCR screening of clones with PMT5 disruption.
Дорожка 1 и 13 = ДНК-маркер молекулярного веса,
Дорожка 2-12 и 14-21 = скрининг разных клонов с дизрупцией РМТ5.Lane 2-12 and 14-21 = screening of different clones with PMT5 disruption.
Фигура 6А: pMBL185 - дизрупция гена РМТ2, клонированного в плазмиде pPICZ-альфа. Для линеаризации плазмиды использовали сайт рестрикции KpnI.Figure 6A: pMBL185 - disruption of the PMT2 gene cloned in the plasmid pPICZ-alpha. The KpnI restriction site was used to linearize the plasmid.
Фигура 6Б: Положительный скрининг клонов с дизрупцией гена РМТ2.Figure 6B: Positive screening of clones with disruption of the PMT2 gene.
Фигура 7: Наложение хроматограмм указывает на сниженную степень гликозилирования инсулина/клон РМТ1.Figure 7: Overlay chromatograms indicates a reduced degree of glycosylation of insulin / clone PMT1.
Фигура 8: Профиль ОФ-ВЭЖХ, указывающий на профиль гликозилирования аналога инсулина 1 до и после инактивации гена РМТ1.Figure 8: RP-HPLC profile indicating the glycosylation profile of the
Фигура 9: Профиль ОФ-ВЭЖХ, указывающий на профиль гликозилирования аналога инсулина 2 до и после инактивации гена РМТ1.Figure 9: RP-HPLC profile indicating the glycosylation profile of the
ОПИСАНИЕ ПРИЛАГАЕМОГО ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙDESCRIPTION OF THE ATTACHED LIST OF SEQUENCES
SEQ ID NO:1: нуклеотидная кодирующая последовательность РМТ1SEQ ID NO: 1: nucleotide coding sequence of PMT1
SEQ ID NO:2: нуклеотидная кодирующая последовательность РМТ2SEQ ID NO: 2: PMT2 nucleotide coding sequence
SEQ ID NO:3: нуклеотидная кодирующая последовательность РМТ4SEQ ID NO: 3: PMT4 nucleotide coding sequence
SEQ ID NO:4: нуклеотидная кодирующая последовательность РМТ5SEQ ID NO: 4: PMT5 nucleotide coding sequence
SEQ ID NO:5: нуклеотидная кодирующая последовательность РМТ6SEQ ID NO: 5: PMT6 nucleotide coding sequence
SEQ ID NO:6: Последовательность с дизрупцией РМТ1SEQ ID NO: 6: PMT1 Disruption Sequence
SEQ ID NO:7: Последовательность с дизрупцией РМТ2SEQ ID NO: 7: PMT2 Disruption Sequence
SEQ ID NO:8: Последовательность с дизрупцией РМТ4SEQ ID NO: 8: PMT4 Disruption Sequence
SEQ ID NO:9: Последовательность с дизрупцией РМТ5SEQ ID NO: 9: PMT5 Disruption Sequence
SEQ ID NO:10: Последовательность с дизрупцией РМТ6'SEQ ID NO: 10: PMT6 'Disruption Sequence
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к способу снижения гликозилирования белка, продуцируемого в клетках метилотрофных дрожжей, что обеспечивается инактивацией по меньшей мере одного или более гена, выбранного из группы, включающей гены РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, имеющего нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно, при этом указанная последовательность кодирует протеин-маннозилтрансферазу или ее функциональную часть.The present invention relates to a method for reducing the glycosylation of a protein produced in methylotrophic yeast cells, which is achieved by inactivating at least one or more genes selected from the group comprising the PMT1, PMT2, PMT4, PMT5 and PMT6 genes having a nucleotide sequence that is at least at least 80% homologous to the nucleotide sequence shown in
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения метилотрофные дрожжи принадлежат к роду Pichia sp.В другом варианте реализации настоящего изобретения метилотрофные дрожжи относятся к виду Pichia pastoris.In one embodiment, the methylotrophic yeast belongs to the genus Pichia sp. In another embodiment, the methylotrophic yeast belongs to the species Pichia pastoris.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения, белок представлен формулойIn yet another embodiment of the present invention, the protein is represented by the formula
X-B-Y-A,X-B-Y-A,
гдеWhere
Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту.X is a leader peptide sequence containing at least one amino acid.
В представляет собой аминокислотной последовательностью В-цепи молекулы инсулина, его производного или аналогаB represents the amino acid sequence of the B chain of an insulin molecule, derivative or analog thereof
Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислоту.Y is a linker peptide containing at least one amino acid.
А представляет собой аминокислотную последовательность А-цепи молекулы инсулина, его производного или аналога,And represents the amino acid sequence of the A-chain of an insulin molecule, its derivative or analogue,
и А- и В-цепи могут быть модифицированы в результате замены, делеции и/или добавления аминокислоты.and the A and B chains may be modified by substitution, deletion and / or addition of an amino acid.
В другом варианте реализации настоящего изобретения способ гликозилирования представляет собой 0-гликозилирование.In another embodiment of the present invention, the glycosylation method is 0-glycosylation.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения, степень гликозилирования снижается по меньшей мере на 10% до примерно 99%.In yet another embodiment of the present invention, the degree of glycosylation is reduced by at least 10% to about 99%.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения степень гликозилирования снижается на 25%.In yet another embodiment, the degree of glycosylation is reduced by 25%.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения степень гликозилирования снижается на 65%.In yet another embodiment of the present invention, the degree of glycosylation is reduced by 65%.
Настоящее изобретение относится к вектору, содержащему ген протеин-маннозилтрансферазы или его функциональную часть, выбранный из группы, включающей гены РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, имеющий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно, при этом встраивание вектора в гомологичный локус ингибирует экспрессию функциональной протеин-маннозилтрансферазы в клетке-хозяине, предпочтительно клетке метилотрофных дрожжей.The present invention relates to a vector containing the protein-mannosyl transferase gene or its functional part, selected from the group consisting of the PMT1, PMT2, PMT4, PMT5 and PMT6 genes, having a nucleotide sequence that is at least 80% homologous to the nucleotide sequence shown in
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предусмотрен способ снижения или изменения степени гликозилирования белков, продуцированных метилотрофными дрожжами, включающий трансформацию указанных дрожжей вектором, как описано выше.In one embodiment of the present invention, there is provided a method for reducing or altering the degree of glycosylation of proteins produced by methylotrophic yeast, comprising transforming said yeast with a vector as described above.
В другом варианте реализации настоящего изобретения метилотрофные дрожжи относятся к роду Pichia sp.In another embodiment, the methylotrophic yeast belongs to the genus Pichia sp.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения метилотрофные дрожжи относятся к виду Pichia pastoris.In yet another embodiment of the present invention, methylotrophic yeast belongs to the species Pichia pastoris.
Настоящее изобретение относится к способу производства нокаутированного штамма метилотрофных дрожжей, в котором (а) вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, способную к гомологичной рекомбинации, включающую целевую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из генов, выбранных из группы, включающей гены РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, имеющие нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер, (б) культивирование клеток при условиях, при которых возможно осуществление гомологичной рекомбинации между ДНК, кодирующих целевой ген в векторе и в клетке-хозяине, что, таким образом, приводит к нарушению целевого гена в клетке-хозяине, (в) селекцию клеток-хозяев с инактивированным целевым геном. Настоящее изобретение также относится к белку, продуцируемому с помощью способа по любому из указанных предыдущих пунктов.The present invention relates to a method for producing a knockout strain of methylotrophic yeast, in which (a) a vector comprising a nucleic acid sequence capable of homologous recombination, comprising a target nucleic acid sequence encoding at least one of the genes selected from the group consisting of PMT1 genes, PMT2, PMT4, PMT5 and PMT6 having a nucleotide sequence that is at least 80% homologous to the nucleotide sequence shown in
Настоящее изобретение также относится к нокаутированному штамму метилотрофных дрожжей, при этом такой штамм содержит по меньшей мере один инактивированный ген, выбранный из группы, включающей РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, имеющий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5 соответственно.The present invention also relates to a knocked out strain of methylotrophic yeast, wherein such a strain contains at least one inactivated gene selected from the group consisting of PMT1, PMT2, PMT4, PMT5 and PMT6 having a nucleotide sequence that is at least 80% homologous to the nucleotide the sequence shown in
Настоящее изобретение относится к штамму с инактивированным геном РМТ1, как описано выше, имеющим номер доступа МТСС5515.The present invention relates to a strain with an inactivated PMT1 gene, as described above, having an accession number MTCC5515.
Настоящее изобретение относится к штамму с инактивированным геном РМТ4, как описано выше, имеющим номер доступа МТСС5516.The present invention relates to a strain with an inactivated PMT4 gene, as described above, having an accession number MTCC5516.
Настоящее изобретение относится к штамму с инактивированным геном РМТ5, как описано выше, имеющим номер доступа МТСС5517.The present invention relates to a strain with an inactivated PMT5 gene, as described above, having an accession number MTCC5517.
Настоящее изобретение также относится к штамму с инактивированным геном РМТ6, как описано выше, имеющим номер доступа МТСС5518.The present invention also relates to a strain with an inactivated PMT6 gene, as described above, having an accession number MTCC5518.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин продуцирует белок с пониженным уровнем гликозилирования, по сравнению с белковым продуктом, экспрессируемым в немодифицированном штамме-хозяине.In one embodiment of the present invention, the host strain produces a protein with reduced glycosylation compared to the protein product expressed in the unmodified host strain.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения степень гликозилирования снижается по меньшей мере на 25%.In yet another embodiment, the degree of glycosylation is reduced by at least 25%.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения степень гликозилирования снижается по меньшей мере на 65%.In yet another embodiment, the degree of glycosylation is reduced by at least 65%.
Настоящее изобретение относится к белку, продуцируемому нокаутированным штаммом, как описано выше.The present invention relates to a protein produced by a knockout strain as described above.
Настоящее изобретение относится к белку, продуцируемому нокаутированным штаммом, в соответствии с п.23, при этом указанный нокаутированный штамм является одним из штаммов с номерами доступа МТСС5515, МТСС5516, МТСС5517, МТСС5518 или модифицированным штаммом на его основе.The present invention relates to a protein produced by a knocked out strain according to
В одном из вариантов настоящего изобретения селективный маркер представляет собой маркер устойчивости к зеоцину.In one embodiment of the present invention, the selective marker is a zeocin resistance marker.
В другом варианте реализации настоящего изобретения белок представляет собой молекулу инсулина/аналога инсулина/молекулу предшественника инсулина.In another embodiment of the present invention, the protein is an insulin / insulin analogue molecule / insulin precursor molecule.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения белок представляет собой гетерологичный белковый продукт.In yet another embodiment of the present invention, the protein is a heterologous protein product.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения белок характеризуется изменением степени гликозилирования. В еще одном варианте реализации настоящего изобретения производительность желаемого конечного белкового продукта остается неизменной.In yet another embodiment of the present invention, the protein is characterized by a change in the degree of glycosylation. In yet another embodiment, the performance of the desired final protein product remains unchanged.
Далее будут подробно описаны предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, которые вместе со следующими ниже примерами служат для объяснения принципов настоящего изобретения.Next will be described in detail preferred embodiments of the present invention, which together with the following examples serve to explain the principles of the present invention.
Примеры, которые следуют ниже, приведены для облегчения понимания настоящего изобретения, но они ни в коей мере не ограничивают объем настоящего изобретения. Примеры не включают подробные описания стандартных методов, применяемых при конструировании векторов, встраивании генов, кодирующих полипептиды, в такие векторы или введении образующихся в результате плазмид в клетку-хозяина. Примеры также не включают в себя подробное описание стандартных методов, применяемых для анализа полипептидов, полученных с помощью таких векторных систем хозяина. Такие методы хорошо известны специалистам в данной области и описаны в многочисленных публикациях, некоторые из которых приведены в качестве примеров.The examples that follow are given to facilitate understanding of the present invention, but they in no way limit the scope of the present invention. The examples do not include detailed descriptions of standard methods used in constructing vectors, embedding genes encoding polypeptides in such vectors, or introducing resulting plasmids into a host cell. The examples also do not include a detailed description of standard methods used for the analysis of polypeptides obtained using such vector host systems. Such methods are well known to specialists in this field and are described in numerous publications, some of which are given as examples.
Стандартные методы применяются для различных технологий рекомбинантной ДНК, трансформации (например, электропорация, липофекция) и систем анализа. Методы и процедуры рекомбинации, как правило, производят в соответствии со стандартными методами, хорошо известными в данной области, и описанными в различных общих и более частных источниках, которые процитированы и обсуждены в настоящем описании. См., например, справочник Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), включенный в настоящую заявку посредством ссылки.Standard methods are used for various recombinant DNA technologies, transformation (for example, electroporation, lipofection) and analysis systems. Recombination methods and procedures are generally performed in accordance with standard methods well known in the art and described in various general and more private sources, which are cited and discussed in the present description. See, for example, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), incorporated herein by reference.
В описании и в формуле настоящего изобретения используется следующая терминология в соответствии с определениями, изложенными в настоящей заявке.In the description and in the claims of the present invention, the following terminology is used in accordance with the definitions set forth in this application.
Если не определено иначе в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значения, которые обычно понимают специалисты в данной области. Кроме того, если контекстом не предусмотрено иное, термины, употребляемые в единственном числе, включают значения во множественном числе, и термины, используемые во множественном числе, включают значения в единственном числе. Способы и методики настоящего изобретения, как правило, осуществляют в соответствии со стандартными способами, хорошо известными в данной области. В целом, используемая терминология, а также методы молекулярной и клеточной биологии, биохимии, химии белков и нуклеиновых кислот и методы гибридизации, описанные в настоящей заявке, являются хорошо известными и широко применимыми в данной области. Способы и технологии настоящего изобретения, как правило, осуществляют в соответствии со стандартными методами, хорошо известными в данной области.Unless otherwise specified herein, the scientific and technical terms used in connection with the present invention have meanings that are generally understood by those skilled in the art. In addition, unless the context otherwise provides, terms used in the singular include the plural, and terms used in the plural include the singular. The methods and techniques of the present invention are generally carried out in accordance with standard methods well known in the art. In general, the terminology used, as well as the methods of molecular and cellular biology, biochemistry, chemistry of proteins and nucleic acids and the hybridization methods described in this application, are well known and widely applicable in this field. The methods and technologies of the present invention are generally carried out in accordance with standard methods well known in the art.
Используемый в настоящей заявке термин «аминокислота» относится к пептидной или белковой последовательности или ее части. Термины «белок», «пептид» и «полипептид» используются как синонимы.As used herein, the term “amino acid” refers to a peptide or protein sequence or part thereof. The terms “protein”, “peptide” and “polypeptide” are used synonymously.
Гетерологичный белок в соответствии с предпочтительными вариантами реализации настоящего изобретения представляет собой молекулу предшественника инсулина или аналога инсулина.A heterologous protein according to preferred embodiments of the present invention is an insulin precursor molecule or an insulin analogue.
ДНК кодирует гетерологичный белок, представленный формулой IDNA encodes a heterologous protein represented by formula I
X-B-Y-A,X-B-Y-A,
гдеWhere
Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту.X is a leader peptide sequence containing at least one amino acid.
В представляет собой аминокислотную последовательность В-цепи молекулы инсулина, его производного или аналога,B represents the amino acid sequence of the B chain of an insulin molecule, derivative or analog thereof,
Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере одну аминокислоту.Y is a linker peptide containing at least one amino acid.
А представляет собой аминокислотную последовательность А-цепи молекулы инсулина, его производного или аналога, и А- и В-цепи могут быть модифицированы в результате замены, делеции и/или добавления аминокислоты.A is the amino acid sequence of the A chain of an insulin molecule, derivative or analog thereof, and the A and B chains can be modified by substitution, deletion and / or addition of an amino acid.
Термин «С-пептид» или «линкерный пептид», используемый в настоящей заявке, включает в себя все формы инсулинового С-пептида, в том числе нативного или синтетического пептида. Такой инсулиновый С-пептид может представлять собой человеческий пептид, или может происходить от других видов и родов животных, предпочтительно от млекопитающего.The term "C-peptide" or "linker peptide" as used in this application includes all forms of an insulin C-peptide, including a native or synthetic peptide. Such an insulin C peptide may be a human peptide, or may be derived from other species and genera of animals, preferably from a mammal.
Таким образом, также охвачены варианты и модификации нативного инсулинового С-пептида при условии, что они сохраняют активность инсулинового С-пептида. Как известно в данной области, модификация последовательности белков или пептидов, при сохранении их необходимой активности, может быть осуществлена с помощью методов, которые являются стандартными в данной области и широко описаны в литературе, например, случайного или сайт-направленного мутагенеза, расщепления и лигирования нуклеиновых кислот и т.д. Таким образом, функционально эквивалентные варианты или производные последовательности нативного инсулинового С-пептида можно легко получить в соответствии со способами, хорошо известными в данной области, и они включают пептидные последовательности, имеющие функциональную, например, биологическую, активность нативного инсулинового С-пептида. Все такие аналоги, варианты, производные или фрагменты инсулинового С-пептида, в частности, включены в объем настоящего изобретения и входят в понятие термина «инсулиновый С-пептид».Thus, variants and modifications of the native insulin C peptide are also covered, provided that they maintain the activity of the insulin C peptide. As is known in the art, the modification of the sequence of proteins or peptides, while maintaining their necessary activity, can be carried out using methods that are standard in the art and are widely described in the literature, for example, random or site-directed mutagenesis, cleavage and ligation of nucleic acids acids, etc. Thus, functionally equivalent variants or derivative sequences of a native insulin C peptide can be easily obtained in accordance with methods well known in the art, and they include peptide sequences having the functional, for example, biological, activity of the native insulin C peptide. All such analogs, variants, derivatives or fragments of the insulin C-peptide, in particular, are included in the scope of the present invention and are included in the term "insulin C-peptide".
Линкерная последовательность может представлять собой любую последовательность, имеющую по меньшей мере две аминокислоты. Линкерный участок может включать от 2 до 25, от 2 до 15, от 2 до 12 или от 2 до 10 аминокислотных остатков, хотя его длина не является критичной и может быть выбрана для удобства или по желанию, или же может отсутствовать.The linker sequence may be any sequence having at least two amino acids. The linker site may include from 2 to 25, from 2 to 15, from 2 to 12, or from 2 to 10 amino acid residues, although its length is not critical and may be chosen for convenience or optionally, or may be absent.
Линкерный пептид может представлять собой любую последовательность, включающую по меньшей мере две аминокислоты, при условии, что первые две аминокислоты представляют собой «RR».The linker peptide may be any sequence comprising at least two amino acids, provided that the first two amino acids are “RR”.
В соответствии с другими вариантами реализации настоящего изобретения полипептиды, упоминаемые в настоящей заявке, могут обладать активностью инсулина гларгина, например, представляют собой инсулин гларгин, который имеет аминокислотную последовательность с двумя изменениями в структуре человеческого инсулина: заменой на аминокислоту глицин нативного аспарагина в положении А21 А-цепи человеческого инсулина и добавлением двух молекул аргинина с СООН-конца В-цепи человеческого инсулина, и такие изменения произведены с помощью технологии рекомбинантной ДНК.In accordance with other variants of implementation of the present invention, the polypeptides referred to in this application may have insulin glargine activity, for example, are insulin glargine, which has an amino acid sequence with two changes in the structure of human insulin: substitution of the amino acid glycine for native asparagine at position A21 A -chain of human insulin and the addition of two arginine molecules from the COOH end of the B-chain of human insulin, and such changes were made using and recombinant DNA.
Первичным действием любого инсулина, в том числе инсулина гларгина, является регуляция метаболизма глюкозы. Инсулин и его аналоги снижают уровень глюкозы в крови путем стимуляции периферического поглощения глюкозы, в частности, в скелетных мышцах и жировой ткани, а также путем ингибирования образования глюкозы в печени.The primary action of any insulin, including insulin glargine, is the regulation of glucose metabolism. Insulin and its analogues lower blood glucose levels by stimulating peripheral glucose uptake, in particular in skeletal muscle and adipose tissue, as well as by inhibiting the formation of glucose in the liver.
Термин «инсерционная инактивация» обозначает прерывание кодирующей области гена путем введения экзогенной ДНК, что приводит к потере функции гена. Такой подход широко используется в генной технологии и позволяет легко осуществить селекцию рекомбинантов после трансформации.The term "insertional inactivation" means interruption of the coding region of a gene by introducing exogenous DNA, which leads to loss of gene function. This approach is widely used in gene technology and makes it easy to select recombinants after transformation.
Термин «нокаут» относится к дизрупции гена, и при этом такая дизрупция приводит к функциональной инактивации нативного гена; делеции нативного гена или его части, или мутации в нативном гене. В частности, в отношении настоящего изобретения «нокаут» относится к дизрупции генов РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5, РМТ6.The term “knockout” refers to gene disruption, and in doing so, such disruption leads to functional inactivation of the native gene; deletions of a native gene or part thereof, or mutations in a native gene. In particular, with respect to the present invention, “knockout” refers to the disruption of the PMT1, PMT2, PMT4, PMT5, and PMT6 genes.
Нокаутированный штамм может быть получен в соответствии с любым из различных способов, известных в данной области. Например, клетка-хозяин может быть трансформирована вектором, обуславливающим гомологичную рекомбинацию, содержащим гомологичные целевому гену последовательности гена в направлении 5' и 3' от последовательности, которую необходимо делегировать. В идеале, при гомологичной рекомбинации может быть осуществлен нокаут целевого гена, кодирующего фермент.The knocked out strain can be obtained in accordance with any of various methods known in the art. For example, a host cell can be transformed with a vector for homologous recombination, containing the gene sequences homologous to the target gene in the 5 ′ and 3 ′ directions of the sequence to be delegated. Ideally, in homologous recombination, the target gene encoding the enzyme can be knocked out.
«Гомологичная рекомбинация» обозначает обмен фрагментами ДНК между двумя молекулами ДНК пары хромосом в области идентичных или почти идентичных нуклеотидных последовательностей. При гомологичной рекомбинации входящая ДНК взаимодействует с и встраивается в сайт в геноме, который содержит по существу гомологичную последовательность ДНК. При негомологичном («случайном» или «незаконном») встраивании входящая ДНК встраивается не в гомологичную последовательность в геноме, а в другом месте, в одном из множества потенциальных сайтов."Homologous recombination" means the exchange of DNA fragments between two DNA molecules of a pair of chromosomes in the region of identical or almost identical nucleotide sequences. Upon homologous recombination, the incoming DNA interacts with and integrates into a site in the genome that contains a substantially homologous DNA sequence. In non-homologous (“random” or “illegal”) embedding, the incoming DNA is inserted not in a homologous sequence in the genome, but in another place, at one of the many potential sites.
Например, мутантные, функциональные или нефункциональные гены, фланкированные ДНК, гомологичной эндогенному гену-мишени (например, кодирующие области, фланкирующие ген-мишень) можно применять совместно или без селективного маркера и/или отрицательного селективного маркера, для трансформации клеток, содержащих нежелательную форму гена-мишени in vivo. Встраивание конструкции ДНК посредством целевой гомологичной рекомбинации приводит к инактивации эндогенного гена.For example, mutant, functional, or non-functional genes flanked by a DNA homologous to the endogenous target gene (e.g., coding regions flanking the target gene) can be used together or without a selective marker and / or negative selective marker to transform cells containing an undesired gene shape targets in vivo. Embedding a DNA construct through targeted homologous recombination leads to inactivation of the endogenous gene.
При использовании в настоящей заявке термин «гомологичный» обозначает либо I) белок или пептид, который имеет последовательность аминокислот, которая является по существу схожей (то есть, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%) с последовательностью данного исходного белка или пептида и который сохраняет нужную функцию исходного белка или пептида, либо II) нуклеиновую кислоту, имеющую последовательность, которая является по существу схожей (то есть, по меньшей мере на 70, 75, 80, 75, 90, 95 или 98%) с последовательностью данной нуклеиновой кислоты и которая сохраняет нужную функцию исходной последовательности нуклеиновой кислоты. Во всех вариантах реализации настоящего изобретения любой описанный белок, пептид или любая нуклеиновая кислота может быть замещена гомологичным или по существу гомологичным белком, пептидом или нуклеиновой кислотой, которая сохраняет необходимую функцию. Во всех вариантах реализации настоящего изобретения при описании (раскрытии) любой нуклеиновой кислоты следует предположить, что описание также включает в себя все нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с описанной нуклеиновой кислотой.As used herein, the term “homologous” means either I) a protein or peptide that has an amino acid sequence that is substantially similar (that is, at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, or 98%) with a sequence of a given parent protein or peptide and which retains the desired function of the parent protein or peptide, or II) a nucleic acid having a sequence that is substantially similar (i.e., at least 70, 75, 80, 75, 90, 95 or 98%) with the sequence of a given nucleic acid and co oraya preserves the desired function of the original nucleic acid sequence. In all embodiments of the present invention, any protein, peptide, or any nucleic acid described can be substituted with a homologous or substantially homologous protein, peptide, or nucleic acid that retains the desired function. In all embodiments of the present invention, when describing (disclosing) any nucleic acid, it should be assumed that the description also includes all nucleic acids that hybridize with the described nucleic acid.
Под «функциональной частью» понимают фрагмент гена РМТ, соответствующий белок которого по существу сохраняет ферментативную активность полноразмерного белка. «По существу» означает, что сохраняется по меньшей мере около 40% или предпочтительно по меньшей мере 50% или более ферментативной активности полноразмерного РМТ.By "functional part" is meant a fragment of the PMT gene, the corresponding protein of which essentially retains the enzymatic activity of the full-sized protein. “Essentially” means that at least about 40%, or preferably at least 50% or more, of the enzymatic activity of full-length PMT is retained.
Нуклеиновые кислоты «функционально связаны», когда они находятся в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Таким образом, когда говорят, что кодирующая последовательность «функционально связана» с контролирующими последовательностями, это относится к конфигурации, в которой кодирующая последовательность может экспрессироваться под контролем этих последовательностей, и при этом последовательности ДНК прилегают друг к другу.Nucleic acids are “operably linked” when they are in functional association with another nucleic acid sequence. Thus, when it is said that the coding sequence is “operably linked” to the control sequences, this refers to a configuration in which the coding sequence can be expressed under the control of these sequences, and the DNA sequences are adjacent to each other.
При использовании в настоящей заявке термин «экспрессия» относится к процессу, при котором на основе нуклеиновой кислоты гена образуется полипептид. Этот процесс включает в себя как транскрипцию, так и трансляцию. В одном аспекте, изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере около 80% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 81% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 82% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 83% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 84% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по меньшей мере около 85% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по меньшей мере около 86% идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 87% нуклеиновых кислот идентичности последовательностей, как альтернатива, по меньшей мере около 88% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 89% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 90% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 91% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 92% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 93% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 94% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 95% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 96% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 97% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты, как альтернатива, по меньшей мере около 98% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты и как альтернатива, по меньшей мере около 99% идентичности последовательности нуклеиновой кислоты к молекуле ДНК, кодирующей гены РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5, РМТ6.As used herein, the term “expression” refers to a process in which a polypeptide is formed based on a nucleic acid of a gene. This process includes both transcription and translation. In one aspect, an isolated nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence having at least about 80% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 81% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 82% nucleic acid sequence acid, as an alternative to at least about 83% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 84% identity after nucleic acid sequences, alternatively at least about 85% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 86% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 87% nucleic acids, sequence identity, as an alternative to at least about 88 % nucleic acid sequence identity, as an alternative, at least about 89% nucleic acid sequence identity, as an alternative, at least at least about 90% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 91% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 92% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 93% nucleic acid sequence identity as an alternative to at least about 94% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 95% nucleic acid sequence identity acid, as an alternative to at least about 96% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 97% nucleic acid sequence identity, as an alternative to at least about 98% nucleic acid sequence identity, and as an alternative to at least about 99% identity of the nucleic acid sequence to the DNA molecule encoding the genes PMT1, PMT2, PMT4, PMT5, PMT6.
Кроме того, оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть осуществлено с помощью алгоритма локальной идентичности Смита и Уотермана, (Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482), с помощью алгоритма выравнивания Нидлмана и Вунша (Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443), и при помощи методов поиска сходства Пирсона и Липмана (Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444,), с помощью автоматизированной реализации указанных алгоритмов (BLAST, FASTA, GAP, BESTFIT и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.), или путем наблюдения.In addition, optimal sequence alignment for comparison can be achieved using the local identity algorithm of Smith and Waterman, (Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482), using the alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970 ) J. Mol. Biol. 48: 443), and using the Pearson and Lipman similarity search methods (Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444,) using an automated implementation of these algorithms ( BLAST, FASTA, GAP, BESTFIT and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.), Or by observation.
Одним из примеров алгоритмов, которые можно применять для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей являются алгоритмы BLAST и BLAST 2,0, которые описаны в работах Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389 3402 и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410, соответственно.One example of an algorithm that can be used to determine percent sequence identity and sequence similarity is the BLAST and BLAST 2.0 algorithms, which are described by Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389 3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410, respectively.
В частности, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, в частности изолированной последовательности нуклеиновой кислоты, которая включает или содержит по меньшей мере SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, их варианты или их части, или по меньшей мере один из генов РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5, РМТ6, включая его варианты или части. Настоящее изобретение также относится к изолированной нуклеиновой кислоте, способной к гибридизации в жестких условиях с такими последовательностями нуклеиновых кислот.In particular, the present invention relates to a nucleic acid sequence, in particular an isolated nucleic acid sequence that includes or contains at least SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, their variants or parts thereof, or at least one of the PMT1, PMT2, PMT4, PMT5, PMT6 genes, including variants or parts thereof. The present invention also relates to an isolated nucleic acid capable of hybridization under stringent conditions with such nucleic acid sequences.
Настоящее изобретение обеспечивает векторы, содержащие ДНК, кодирующую любой из описанных в настоящей заявке генов. Клетки-хозяева, содержащие такие векторы, также предусмотрены настоящим изобретением. Например, клетки-хозяева могут представлять собой клетки бактерий, грибов или млекопитающих.The present invention provides vectors containing DNA encoding any of the genes described in this application. Host cells containing such vectors are also contemplated by the present invention. For example, host cells can be bacteria, fungi, or mammalian cells.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяину, в которой по меньшей мере часть последовательности нуклеиновой кислоты, как определено выше, нарушается, в результате чего такая рекомбинантная клетка-хозяин характеризуется снижением уровня гликозилирования предшественника инсулина, по сравнению с соответствующей родительской рекомбинантной клеткой-хозяином. Рекомбинантные экспрессионные системы выбраны из прокариотических и эукариотических клеток-хозяев. Эукариотические хозяева включают дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris), клетки млекопитающих или клетки растений. Бактериальные и эукариотические клетки можно получить из ряда различных источников, включая коммерческие источники, известные специалистам в данной области, например, из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, Md.). Коммерческие источники клеток, применяемых для экспрессии рекомбинантного белка, также предоставляют инструкции по применению таких клеток. Выбор экспрессионной системы зависит от желаемых характеристик экспрессируемого полипептида.The present invention also relates to a recombinant host cell in which at least a portion of the nucleic acid sequence as defined above is disrupted, resulting in such a recombinant host cell having a lower glycosylation level of the insulin precursor compared to the corresponding parent recombinant host cell . Recombinant expression systems are selected from prokaryotic and eukaryotic host cells. Eukaryotic hosts include yeast cells (e.g., Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris), mammalian cells, or plant cells. Bacterial and eukaryotic cells can be obtained from a number of different sources, including commercial sources known to those skilled in the art, for example, from the American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, Md.). Commercial sources of cells used for expression of the recombinant protein also provide instructions for the use of such cells. The choice of expression system depends on the desired characteristics of the expressed polypeptide.
Наиболее предпочтительными в отношении аспектов настоящего изобретения клетками-хозяевами являются метилотрофные дрожжи. Штаммы метилотрофных дрожжей, которые могут быть модифицированы с помощью настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются перечисленными, штаммы дрожжей, способные расти на метаноле, такие как дрожжи родов Pichia, Candida, Hansenula или Torulopsis. Предпочтительные метилотрофные дрожжи относятся к роду Pichia. Штаммы метилотрофных дрожжей, которые могут быть модифицированы с помощью способов настоящего изобретения, также включают штаммы метилотрофных дрожжей, модифицированные с помощью генно-инженерного подхода для экспрессии одного или более целевого гетерологичного белка. Степень гликозилирования гетерологичных белков, экспрессирующихся в таких модифицированных генно-инженерными методами штаммах, может быть снижена путем трансформации таких штаммов с помощью одного или более вектора настоящего изобретения.Most preferred with respect to aspects of the present invention, the host cells are methylotrophic yeast. Strains of methylotrophic yeast that can be modified using the present invention include, but are not limited to, strains of yeast that can grow on methanol, such as yeast of the genera Pichia, Candida, Hansenula or Torulopsis. Preferred methylotrophic yeasts are of the genus Pichia. Methylotrophic yeast strains that can be modified using the methods of the present invention also include methylotrophic yeast strains modified by a genetic engineering approach to express one or more target heterologous proteins. The degree of glycosylation of heterologous proteins expressed in such genetically modified strains can be reduced by transforming such strains using one or more of the vectors of the present invention.
Клетки-хозяева или организм может быть модифицирован генно-инженерным способом для экспрессии рекомбинантного белка или пептида с применением стандартных способов. Например, рекомбинантный белок может экспрессироваться с вектора или экзогенного гена, встроенного в геном хозяина.Host cells or an organism can be modified by genetic engineering to express a recombinant protein or peptide using standard methods. For example, a recombinant protein may be expressed from a vector or an exogenous gene inserted into the host genome.
Векторы, которые можно применять для экспрессии экзогенных белков, хорошо известны в данной области и описаны ниже. Гены для экспрессии рекомбинантных белков или пептидов также могут быть встроены в геном с применением таких подходов, как гомологичная и гетерологичная рекомбинация, как описано в настоящей заявке. Предпочтительные векторы настоящего изобретения, содержащие гены протеин-маннозилтрансферазы, включают, но неограничены pPICZ альфа и pTZ57R.Vectors that can be used to express exogenous proteins are well known in the art and are described below. Genes for the expression of recombinant proteins or peptides can also be integrated into the genome using approaches such as homologous and heterologous recombination, as described in this application. Preferred vectors of the present invention containing protein mannosyl transferase genes include, but are not limited to, pPICZ alpha and pTZ57R.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает векторы для инактивации, которые при встраивании в дрожжевой метилотрофный штамм, инактивируют или повреждают (дизруптируют) ген, что, таким образом, способствует снижению степени гликозилирования целевого конечного белкового продукта, синтезируемого в дрожжевом метилотрофном штамме, при этом не оказывая влияния на производительность конечного продукта.In another aspect, the present invention provides inactivation vectors that, when inserted into a yeast methylotrophic strain, inactivate or damage (disrupt) the gene, thereby reducing the degree of glycosylation of the target final protein product synthesized in the yeast methylotrophic strain impact on the performance of the final product.
Рекомбинантный белок или пептид может экспрессироваться после индукции химическим соединением или под действием экспрессии эндогенного гена или продукта гена. Рекомбинантный белок может также экспрессироваться в том случае, когда хозяйская клетка находится на определенной среде. Специфические промоторные элементы описаны ниже.A recombinant protein or peptide can be expressed after induction by a chemical compound or by expression of an endogenous gene or gene product. A recombinant protein can also be expressed when the host cell is on a specific medium. Specific promoter elements are described below.
При использовании в настоящей заявке термины «трансформированный» и «стабильно трансформированный» относятся к клеткам, которые были созданы путем введения ненативных (гетерологичных) полинуклеотидных последовательностей, интегрированных в эписомальные плазмиды, которые поддерживаются на протяжении не менее двух поколений.When used in this application, the terms “transformed” and “stably transformed” refer to cells that were created by introducing non-native (heterologous) polynucleotide sequences integrated into episomal plasmids that have been maintained for at least two generations.
При использовании в настоящей заявке термин «рекомбинантный» относится к клетке или вектору, которые были модифицированы с помощью введения гетерологичной нуклеотидной последовательности, или клетку, которая произошла от клетки, модифицированной таким образом.As used herein, the term “recombinant” refers to a cell or vector that has been modified by introducing a heterologous nucleotide sequence, or a cell that has descended from a cell modified in this way.
Векторы могут быть введены в клетки-хозяева с помощью способов, включающих, но не ограниченных перечисленными, электропорацию, вирусную инфекцию, кальций-фосфатную преципитацию, с помощью DEAE-декстрана, направленную микроинъекцию, с помощью липосом, загруженных ДНК, и комплексов липофектамин-ДНК, ультразвуковую трансформацию, бомбардировку с применением высокоскоростных микрочастиц, или любых других способов, описанных в настоящей заявке или известных в данной области.Vectors can be introduced into host cells using methods including, but not limited to, electroporation, viral infection, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran, targeted microinjection, liposomes loaded with DNA, and lipofectamine-DNA complexes , ultrasonic transformation, bombardment using high-speed microparticles, or any other methods described in this application or known in this field.
Настоящее изобретение также относится к способу получения желаемого белка, включающему ферментирование при условиях и на среде, подходящей для получения таких белковых соединений или их аналагов, в организме, таком как Pichia sp., в который перенесены гены, кодирующие полипептиды, достаточные для направленного синтеза желаемого конечного продукта.The present invention also relates to a method for producing a desired protein, comprising fermenting under conditions and on a medium suitable for producing such protein compounds or their analogs in an organism such as Pichia sp., Into which genes encoding polypeptides sufficient for targeted synthesis of the desired are transferred final product.
Было обнаружено, что протеин-маннозилтрансферазы (РМТ) катализируют O-гликозилирование сериновых и треониновых остатков в эндоплазматическом ретикулуме. В настоящем изобретении было продемонстрировано, что дизрупция генов РТМ резко снижает уровень O-гликозилирования продуцируемых молекул предшественников инсулина. Дизрупция гена РМТ1 приводит к формированию предшественника инсулина, характеризующегося снижением присоединения маннозных остатков на 65%. Дизрупции генов РМТ5 и РМТ6 в отдельности приводят к снижению уровня гликозилирования предшественника инсулина на 31% и 28%, соответственно. Дизрупции генов РМТ2 и РМТ4 не влияют на присоединение маннозных остатков.Protein-mannosyl transferases (PMT) have been found to catalyze the O-glycosylation of serine and threonine residues in the endoplasmic reticulum. In the present invention, it was demonstrated that disruption of RTM genes dramatically reduces the level of O-glycosylation of produced insulin precursor molecules. The disruption of the PMT1 gene leads to the formation of an insulin precursor, characterized by a 65% decrease in the attachment of mannose residues. Disruptions in the PMT5 and PMT6 genes individually lead to a decrease in glycosylation of the insulin precursor by 31% and 28%, respectively. Disruptions in the PMT2 and PMT4 genes do not affect the attachment of mannose residues.
В настоящей заявке термин «снижение уровня экспрессии» используется в широком смысле и включает снижение продукции целевого белка. Пониженная экспрессия представляет собой такую экспрессию, уровень которой ниже уровня нормальной экспрессии в соответствующем хозяйском штамме, который не был модифицирован в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, но был выращен при тех же условиях. В контексте настоящего изобретения целевые ферменты или белки представляют собой маннозилтрансферазы, которые играют важную роль в гликозилировании маннозных остатков молекул предшественников инсулина/аналогов инсулина.As used herein, the term “reduction in expression level” is used in a broad sense and includes a decrease in the production of the target protein. Reduced expression is an expression that is below the level of normal expression in the corresponding host strain, which has not been modified in accordance with the methods described in this application, but was grown under the same conditions. In the context of the present invention, the target enzymes or proteins are mannosyl transferases that play an important role in the glycosylation of mannose residues of insulin precursor molecules / insulin analogs.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения снижение степени гликозилирования может составлять по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 25%, предпочтительно по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 35%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 40%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 45%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 55%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 60%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 65% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 70%. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения снижение степени гликозилирования достигает 100%.In accordance with one aspect of the present invention, the reduction in the degree of glycosylation may be at least 20%, preferably at least 25%, preferably at least 30%, preferably at least 35%, most preferably at least 40%, most preferably at least 45%, most preferably at least 50%, most preferably at least 55%, most preferably at least 60%, most preferably at least 65% and most preferably at least re 70%. In accordance with another aspect of the present invention, the reduction in the degree of glycosylation reaches 100%.
При использовании в настоящей заявке, термин «праймер» относится к олигонуклеотиду, либо природному, в очищенном рестрицированном виде, либо синтетическому, который способен инициировать синтез при условиях, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеотидной последовательности (например, в присутствии нуклеотидов и агента, такого как ДНК-полимераза и при подходящей температуре и рН). Методика ПЦР описана в многочисленных публикациях, в том числе в руководствах PCR: А Practical Approach, M.J. McPherson et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, by Innis et al., Academic Press (1990), и PCR Technology: Principals and Applications of DNA Amplification, H.A. Eriich, Stockton Press (1989).When used in this application, the term "primer" refers to an oligonucleotide, either natural, in purified restricted form, or synthetic, which is capable of initiating synthesis under conditions under which the synthesis of a primer extension product that is complementary to the nucleotide sequence (for example, in the presence of nucleotides is induced) and an agent such as DNA polymerase and at a suitable temperature and pH). The PCR technique is described in numerous publications, including PCR manuals: A Practical Approach, M.J. McPherson et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, by Innis et al., Academic Press (1990), and PCR Technology: Principals and Applications of DNA Amplification, H.A. Eriich, Stockton Press (1989).
Метод ПЦР также описан во многих патентах США, включая патенты с номерами 4, 683,195, 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 4, 889,818; 5, 075, 216; 5,079, 352; 5,104,792, 5,023,171; 5,091,310; и 5, 066,584, которые включены в качестве ссылок.The PCR method is also described in many US patents, including patents numbered 4, 683.195, 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 4, 889.818; 5, 075, 216; 5,079, 352; 5,104,792; 5,023,171; 5,091,310; and 5, 066,584, which are incorporated by reference.
В соответствии с наиболее значимыми аспектами настоящего изобретения предусмотрен способ производства «нокаутированных» штаммов метилотрофных дрожжей, включающий (а) вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один ген, выбранный из группы, включающей РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, как представлено в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно, и нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, (б) культивирование клеток при условиях, при которых происходит гомологичная рекомбинация, в результате которой происходит дизрупция целевой нуклеотидной последовательности в клетках-хозяевах, (в) селекцию клеток, в которых произошла гомологичная рекомбинация и (г) оценку степени снижения уровня гликозилирования в модифицированных штаммах.In accordance with the most significant aspects of the present invention, there is provided a method for producing “knocked out” strains of methylotrophic yeast, comprising (a) a vector containing a nucleotide sequence encoding at least one gene selected from the group consisting of PMT1, PMT2, PMT4, PMT5 and PMT6, as shown in
Трансформацию Pichia pastoris осуществляли с помощью электропорации.Transformation of Pichia pastoris was carried out by electroporation.
Трансформанты, содержащие вектор с геном устойчивсти к зеоцину, были отобраны на чашках с YPD, содержащих 100 мкг/мл зеоцина.Transformants containing a vector with the zeocin resistance gene were selected on YPD plates containing 100 μg / ml zeocin.
Таким образом, способы настоящего изобретения приводят к изменению дрожжевого штамма, который становится способным производить целевой белок, при этом (а) вышеупомянутый штамм содержит по меньшей мере один инактивированный ген из группы, включающей РМТ1, РМТ2, РМТ4, РМТ5 и РМТ6, как представлено в SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4 и 5, соответственно, и (б) выращивание вышеупомянутого измененного штамма при условиях, при которых происходит снижение степени гликозилирования конечного продукта, по сравнению с белковым продуктом, продуцированным неизмененным штаммом-хозяином.Thus, the methods of the present invention lead to a change in the yeast strain, which becomes able to produce the target protein, while (a) the aforementioned strain contains at least one inactivated gene from the group including PMT1, PMT2, PMT4, PMT5 and PMT6, as presented in
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено описанными конкретными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами, видами или родами и компонентами сред, которые могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология используется только с целью описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения области настоящего изобретения, которое ограничено лишь формулой настоящего изобретения. Приведенное выше описание предназначено для того, чтобы указать специалисту, как применять настоящее изобретение, и его целью не является детальное описание всех явных модификаций и вариантов настоящего изобретения, которые очевидны специалисту в данной области при прочтении настоящего описания.It should be understood that the present invention is not limited to the specific methods described, protocols, cell lines, vectors, species or genera and components of the media, which may vary. It should also be understood that the terminology is used only to describe specific embodiments and is not intended to limit the scope of the present invention, which is limited only by the claims of the present invention. The above description is intended to indicate to a person skilled in the art how to apply the present invention, and it is not intended to provide a detailed description of all the obvious modifications and variations of the present invention that are apparent to one skilled in the art upon reading the present description.
Депонирование штаммов с инактивированными генами РМТDeposition of strains with inactivated PMT genes
В соответствии с требованиями полного описания изобретения штаммы настоящего изобретения были депонированы в IMTEC Института микробных технологий, сектор 3 9-А, Чандигарх, 160036, Индия (в соответствии с международным депонированием на основании Будапештского договора). Штаммы являются следующими (номера доступа указаны в скобках):In accordance with the requirements of the full description of the invention, the strains of the present invention were deposited with IMTEC Institute of Microbial Technologies,
Настоящее изобретение может быть более полно описано и понято с помощью следующих примеров, которые приведены в качестве иллюстрации и ни в коей мере не предназначены для ограничения настоящего изобретения.The present invention can be more fully described and understood by the following examples, which are given by way of illustration and are in no way intended to limit the present invention.
ПРИМЕР 1: ДИЗРУПЦИЯ РМТ1:EXAMPLE 1: DISPUTION PMT1:
Около 477 п.о. кодирующей последовательности, включающей часть кодирующей области РМТ1 Pichia pastoris, амплифицировали с помощью следующих праймеров РМТ1.About 477 bp the coding sequence, including part of the coding region of PMT1 Pichia pastoris, amplified using the following primers PMT1.
РМТ1 FP=5' GGA ТСС ТАА TAG CCC ACT CTG АТС TAG CTC ACT 3'PMT1 FP = 5 'GGA TSS TAA TAG CCC ACT CTG ATS TAG CTC ACT 3'
РМТ1 RP=5' GGA ТСС ААА GCC CTC ATG ТСС АТА AGC AGA 3'.PMT1 RP = 5 'GGA TCC AAA GCC CTC ATG TCC ATA AGC AGA 3'.
Два стоп-кодона были включены в прямой праймер, чтобы избежать какого-либо прочтения с ранних потенциальных сайтов начала трансляции в векторе. Продукт ПЦР был клонирован в вектор pTZ57R, и для подтверждения он был секвенирован с помощью M13FP и M13RP. Фрагмент РМТ1 был вырезан при помощи BamHI и клонирован в pPICZ-альфа по сайтам BamHI и BgI II. Клон, давший фрагменты размером 1775 п.о. и 576 п.о., был отобран. Кассета для дизрупции РМТ1 была перенесена в Pichia Pastoris GS115. Плазмида была линеаризована по уникальному сайту BstEII, который находится почти в середине фрагмента для дизрупции РМТ1, перенесенного в штамм Pichia с помощью электропорации.Two stop codons were included in the forward primer to avoid any reading from the early potential start sites of translation in the vector. The PCR product was cloned into the pTZ57R vector, and it was sequenced using M13FP and M13RP to confirm. The PMT1 fragment was excised using BamHI and cloned into pPICZ alpha at the BamHI and BgI II sites. Clone producing 1775 bp fragments and 576 bp, was selected. The PMT1 disruption cassette was moved to the Pichia Pastoris GS115. The plasmid was linearized at the unique site of BstEII, which is located almost in the middle of the fragment for the disruption of PMT1 transferred to the Pichia strain by electroporation.
Трансформированные клоны были отобраны с помощью 100 мкг/мл зеоцина. Была получена пара сотен колоний, и отдельные колонии были высажены штрихом на чашки со средой YPD. Геномная ДНК была изолирована из каждого клона, и для проверки клонов с дизрупцией проводили ПЦР. Нокаут РМТ1 подтверждали с помощью ПЦР (см. фиг.2Б), а также с помощью Саузерн-блота (см. фиг 2В). Отобранные клоны были депонированы как МТСС5515. Последовательности праймеров:Transformed clones were selected using 100 μg / ml zeocin. A couple of hundred colonies were obtained, and individual colonies were streaked onto plates with YPD medium. Genomic DNA was isolated from each clone, and PCR was performed to check for clones with disruption. Knockout PMT1 was confirmed by PCR (see FIG. 2B), as well as by Southern blot (see FIG. 2B). Selected clones were deposited as MTCC5515. Primer Sequences:
InSTEzRP: 5' TAG CAG AGC GAG GTA TGT AGG CGG TGC 3'InSTEzRP: 5 'TAG CAG AGC GAG GTA TGT AGG CGG TGC 3'
TEFDSRP: 5' GAG ТСС GAG ААА АТС TGG AAG AGT 3'TEFDSRP: 5 'GAG TCC GAG AAA ATS TGG AAG AGT 3'
ISCHKFP: 5' GCT АСА СТА GAA GGA CAG TAT TTG GTA 3'ISCHKFP: 5 'GCT ACA STA GAA GGA CAG TAT TTG GTA 3'
SPMT1 DCFP: 5' GGA CTT ATG GTT CAT CAT TGG TGA 3'SPMT1 DCFP: 5 'GGA CTT ATG GTT CAT CAT TGG TGA 3'
ПРИМЕР 2: ДИЗРУПЦИЯ РМТ6:EXAMPLE 2: DISPUTION PMT6:
Около -515 п.о. кодирующей последовательности, включающей часть кодирующей области РМТ6, амплифицировали с применением следующих праймеров:Around -515 bp the coding sequence, including part of the coding region of PMT6, was amplified using the following primers:
PMT6FP=5' GGA ТСС ТАА TAG CTT GCC GTT AAG AGA TAC GAT GAPMT6FP = 5 'GGA TSS TAA TAG CTT GCC GTT AAG AGA TAC GAT GA
3' PMT6RP=5'GGA ТСС TGA GAA TGC AAG TTT GCA ССА GTA 3'3 'PMT6RP = 5'GGA TCC TGA GAA TGC AAG TTT GCA CCA GTA 3'
Два стоп-кодона были включены в прямой праймер, чтобы избежать какого-либо прочтения с ранних потенциальных сайтов начала трансляции в векторе. Продукт ПЦР был клонирован в вектор pTZ57R, и для подтверждения он был секвенирован с помощью M13FP и M13RP. Кассета для дизрупции РМТ6 была перенесена в Pichia Pastoris GS115. Плазмида была линеаризована по уникальному сайту NdeI, который находится почти в середине фрагмента для дизрупции РМТ6, перенесенного в штамм Pichia с помощью электропорации. Трансформированные клоны отбирали с помощью 100 мкг/мл зеоцина. Была получена пара сотен колоний, и отдельные колонии были высажены штрихом на чашки со средой YPD. Геномная ДНК была изолирована из каждого клона, и для проверки клонов с дизрупцией проводили ПЦР (см. фиг.3Б). Отобранные клоны были депонированы как МТСС5518.Two stop codons were included in the forward primer to avoid any reading from the early potential start sites of translation in the vector. The PCR product was cloned into the pTZ57R vector, and it was sequenced using M13FP and M13RP to confirm. The PMT6 disruption cassette was moved to the Pichia Pastoris GS115. The plasmid was linearized at the unique NdeI site, which is located almost in the middle of the fragment for PMT6 disruption transferred to the Pichia strain by electroporation. Transformed clones were selected with 100 μg / ml zeocin. A couple of hundred colonies were obtained, and individual colonies were streaked onto plates with YPD medium. Genomic DNA was isolated from each clone, and PCR was performed to check for clones with disruption (see FIG. 3B). Selected clones were deposited as MTCC5518.
ПРИМЕР 3: ДИЗРУПЦИЯ РМТ4:EXAMPLE 3: DISPUTION PMT4:
Около -516 п.о. кодирующей последовательности, включающей часть кодирующую область РМТ4, амплифицировали с применением следующих праймеров:Around -516 bp the coding sequence, including part of the coding region of PMT4, was amplified using the following primers:
PMT4FP=51 GGA ТСС ТАА TAG GTT CAT TTC GCT АТТ СТА AGC А 3'PMT4FP = 51 GGA TSS TAA TAG GTT CAT TTC GCT ATT STA AGC A 3 '
PMT4RP=5' GGA ТСС TTT CGA CTT CAA AGG ACG GGT Т 3'PMT4RP = 5 'GGA TCC TTT CGA CTT CAA AGG ACG GGT T 3'
Два стоп-кодона были включены в прямой праймер, чтобы избежать какого-либо прочтения с ранних потенциальных сайтов начала трансляции в векторе. Продукт ПЦР был клонирован в вектор pTZ57R, и для подтверждения он был секвенирован с помощью M13FP и M13RP. Кассета для дизрупции РМТ4 была введена в Pichia Pastoris GS115. Плазмида была линеаризована по уникальному сайту XcmI, который находится почти в середине фрагмента для дизрупции РМТ4, перенесенного в штамм Pichia с помощью электропорации. Трансформированные клоны отбирали с помощью 100 мкг/мл зеоцина. Была получена пара сотен колоний, и отдельные колонии были высажены штрихом на чашки со средой YPD. Геномная ДНК была изолирована из каждого клона, и для проверки клонов с дизрупцией проводили ПЦР (см. фиг.4Б). Отобранные клоны были депонированы как МТСС5516.Two stop codons were included in the forward primer to avoid any reading from the early potential start sites of translation in the vector. The PCR product was cloned into the pTZ57R vector, and it was sequenced using M13FP and M13RP to confirm. The PMT4 Disruption Cassette was introduced in the Pichia Pastoris GS115. The plasmid was linearized at the unique XcmI site, which is located almost in the middle of the fragment for PMT4 disruption transferred to the Pichia strain by electroporation. Transformed clones were selected with 100 μg / ml zeocin. A couple of hundred colonies were obtained, and individual colonies were streaked onto plates with YPD medium. Genomic DNA was isolated from each clone, and PCR was performed to check for clones with disruption (see FIG. 4B). Selected clones were deposited as MTCC5516.
ПРИМЕР 4: ДИЗРУПЦИЯ РМТ5:EXAMPLE 4: DISPUTION PMT5:
Около -455 п.о. кодирующей последовательности, включающей часть кодирующую область РМТ5, амплифицировали с применением следующих праймеров:Around -455 bp the coding sequence, including part of the PMT5 coding region, was amplified using the following primers:
PMT5FP=51 АСА ТСТ ТАА TAG АТС СТА ССА GTG АТС АТТ ТАС СТ 3'PMT5FP = 51 ASA TST TAA TAG ATC STA SSA GTG ATC ATT TAS ST 3 '
PMT5RP=5' AGA ТСТ ТСА СТА АТТ GGA AGG ТСТ AGA АТС 3'PMT5RP = 5 'AGA TST TSA STA ATT GGA AGG TST AGA PBX 3'
Два стоп-кодона были включены в прямой праймер, чтобы избежать какого-либо прочтения с ранних потенциальных сайтов начала трансляции в векторе. Продукт ПЦР был клонирован в вектор pTZ57R, и для подтверждения он был секвенирован с помощью M13FP и M13RP. Кассета для дизрупции РМТ5 была введена в Pichia Pastoris GS115. Плазмида была линеаризована по уникальному сайту BstEII, который находится почти в середине фрагмента для дизрупции РМТ5, перенесенного в штамм Pichia с помощью электропорации. Трансформированные клоны отбирали с помощью 100 мкг/мл зеоцина. Была получена пара сотен колоний, и отдельные колонии были высажены штрихом на чашки со средой YPD. Геномная ДНК была изолирована из каждого клона, и для проверки клонов с дизрупцией проводили ПЦР (см. фиг.5Б). Отобранные клоны были депонированы как МТСС5517.Two stop codons were included in the forward primer to avoid any reading from the early potential start sites of translation in the vector. The PCR product was cloned into the pTZ57R vector, and it was sequenced using M13FP and M13RP to confirm. The PMT5 disruption cassette was introduced in the Pichia Pastoris GS115. The plasmid was linearized at the unique BstEII site, which is located almost in the middle of the fragment for PMT5 disruption transferred to the Pichia strain by electroporation. Transformed clones were selected with 100 μg / ml zeocin. A couple of hundred colonies were obtained, and individual colonies were streaked onto plates with YPD medium. Genomic DNA was isolated from each clone, and PCR was performed to check for clones with disruption (see FIG. 5B). Selected clones were deposited as MTCC5517.
ПРИМЕР 5: ДИЗРУПЦИЯ РМТ2:EXAMPLE 5: DISPUTION PMT2:
Около -439 п.о. кодирующей последовательности, включающей часть кодирующую область РМТ2, амплифицировали с применением следующих праймеров:Around -439 bp the coding sequence, including part of the coding region of PMT2, amplified using the following primers:
PMT2FP=5' GGA ТСС ТАА TAG GTG GGT ТТА ТТТ GTC AC A GTA 3'PMT2FP = 5 'GGA TSS TAA TAG GTG GGT TTA TTT GTC AC A GTA 3'
Pmt2RP=5' GGA ТСС GAA АСА ССС ААТ CAT TGT TGG СА 3'Pmt2RP = 5 'GGA TCC GAA ACA SSS AAT CAT TGT TGG CA 3'
Два стоп-кодона были включены в прямой праймер, чтобы избежать какого-либо прочтения с ранних потенциальных сайтов начала трансляции в векторе. Продукт ПЦР был клонирован в вектор pTZ57R, и для подтверждения он был секвенирован с помощью M13FP и M13RP.Two stop codons were included in the forward primer to avoid any reading from the early potential start sites of translation in the vector. The PCR product was cloned into the pTZ57R vector, and it was sequenced using M13FP and M13RP to confirm.
Кассета для дизрупции РМТ2 была введена в Pichia Pastoris GS115. Плазмида была линеаризована по уникальному сайту KpnI, который находится почти в середине фрагмента для дизрупции РМТ2, перенесенного в штамм Pichia с помощью электропорации. Трансформированные клоны отбирали с помощью 100 мкг/мл зеоцина. Была получена пара сотен колоний, и отдельные колонии были высажены штрихом на чашки со средой YPD. Геномная ДНК была изолирована из каждого клона, и для проверки клонов с дизрупцией проводили ПЦР (см. фиг.6).The PMT2 Disruption Cassette was introduced in the Pichia Pastoris GS115. The plasmid was linearized at the unique KpnI site, which is located almost in the middle of the fragment for PMT2 disruption transferred to the Pichia strain by electroporation. Transformed clones were selected with 100 μg / ml zeocin. A couple of hundred colonies were obtained, and individual colonies were streaked onto plates with YPD medium. Genomic DNA was isolated from each clone, and PCR was performed to check for clones with disruption (see FIG. 6).
ПРИМЕР 6: СНИЖЕНИЕ СТЕПЕНИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ ИНСУЛИНА С ПОМОЩЬЮ НОКАУТА РМТEXAMPLE 6: REDUCED INSULINE Glycosylation by RMT Knockout
Для получения клона В1СС#7743, уровень гликозилирования в котором использовали в качестве контроля, штамм Pichia pastoris GS115 трансформировали конструкцией для экспрессии инсулина; степень гликозилирования секретируемого инсулина в таком клоне составила 1,90-2,0 (принята за 100%).To obtain clone B1CC # 7743, the glycosylation level of which was used as a control, the strain Pichia pastoris GS115 was transformed with a construct for insulin expression; the degree of glycosylation of secreted insulin in such a clone was 1.90-2.0 (taken as 100%).
Были также клонированы штаммы с нокаутом РМТ МТСС5515, МТСС5517 и МТСС5518 с конструкцией для экспрессии инсулина для сравнения уровня гликозилирования секретируемого инсулина с контрольным уровнем. Было отмечено снижение (см. фиг.7) степени гликозилирования на 61%, 31% и 28%, соответственно, по сравнению с инсулином, продуцированным контрольным клоном В1СС#7743.Knockout strains PMT MTCC5515, MTCC5517 and MTCC5518 with a construct for insulin expression were also cloned to compare the glycosylation level of secreted insulin with a control level. There was a decrease (see Fig. 7) of the degree of glycosylation by 61%, 31% and 28%, respectively, compared with insulin produced by the control clone B1CC # 7743.
ПРИМЕР 7: СНИЖЕНИЕ СТЕПЕНИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ АНАЛОГА ИНСУЛИНА 1 С ПОМОЩЬЮ НОКАУТА РМТEXAMPLE 7: REDUCING THE DEGREE OF GLYCOSYLATION OF ANALOGUE OF
Для получения клона В1СС#7744, уровень гликозилирования в котором использовали в качестве контроля, штамм Pichia pastoris GS115 трансформировали конструкцией для экспрессии инсулина; степень гликозилирования секретируемого инсулина в таком клоне составила 1,66 (принята за 100%). Был также клонирован штамм с нокаутом РМТ МТСС5515 с конструкцией для экспрессии инсулина для сравнения уровня гликозилирования секретируемого инсулина с контрольным уровнем. Было отмечено снижение (см. фиг.8) степени гликозилирования на 46%, по сравнению с аналогом инсулина 1, продуцированным контрольным клоном В1СС#7744.To obtain clone B1CC # 7744, the glycosylation level of which was used as a control, the strain Pichia pastoris GS115 was transformed with a construct for insulin expression; the degree of glycosylation of secreted insulin in such a clone was 1.66 (taken as 100%). The PMT MTCC5515 knockout strain was also cloned with a construct for insulin expression to compare the glycosylation level of secreted insulin with a control level. There was a decrease (see FIG. 8) of the degree of glycosylation by 46%, compared with the
ПРИМЕР 8: СНИЖЕНИЕ СТЕПЕНИ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ АНАЛОГА ИНСУЛИНА 2 С ПОМОЩЬЮ НОКАУТА РМТEXAMPLE 8: REDUCING THE DEGREE OF GLYCOSYLATION OF ANALOGUE OF
Для получения клона BICC #7996, уровень гликозилирования в котором использовали в качестве контроля, штамм Pichia pastoris GS115 трансформировали конструкцией для экспрессии инсулина; степень гликозилирования секретируемого инсулина в таком клоне составила 1,92 (принята за 100%). Был также клонирован штамм с нокаутом РМТ МТСС5515 с конструкцией для экспрессии инсулина для сравнения уровня гликозилирования секретируемого инсулина с контрольным уровнем. Было отмечено снижение (см. фиг.9) степени гликозилирования на 65%, по сравнению с аналогом инсулина 1, продуцированным контрольным клоном BICC #7744.To obtain clone BICC # 7996, the glycosylation level of which was used as a control, the strain Pichia pastoris GS115 was transformed with a construct for insulin expression; the degree of glycosylation of secreted insulin in such a clone was 1.92 (taken as 100%). The PMT MTCC5515 knockout strain was also cloned with a construct for insulin expression to compare the glycosylation level of secreted insulin with a control level. A decrease of 65% in glycosylation was noted (see FIG. 9) compared to the
Claims (10)
(а) получение вектора, включающего последовательность нуклеиновой кислоты, способную к гомологичной рекомбинации, содержащую целевую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из генов, выбранных из группы, включающей гены PMT1, PMT5 и PMT6, имеющий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NOs 1, 4 и 5 соответственно, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер,
(б) культивирование клеток в условиях, делающих возможной гомологичную рекомбинацию между ДНК, кодирующей целевой ген в векторе, и ДНК, кодирующей целевой ген в клетке-хозяине, что приводит к нарушению целевого гена в клетке-хозяине;
(в) селекцию клеток-хозяев с инактивированным целевым геном для получения нокаутированного штамма метилотрофных дрожжей для продуцирования предшественника инсулина или предшественника аналога инсулина со сниженной степенью гликозилирования.4. A method for producing a knockout strain of methylotrophic yeast for the production of an insulin precursor or an insulin analog precursor with a reduced degree of glycosylation, including:
(a) obtaining a vector comprising a homologous recombination nucleic acid sequence comprising a target nucleic acid sequence encoding at least one of the genes selected from the group comprising the PMT1, PMT5 and PMT6 genes having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs 1, 4, and 5, respectively, and a nucleic acid sequence encoding a selectable marker,
(b) culturing the cells under conditions that allow homologous recombination between DNA encoding the target gene in the vector and DNA encoding the target gene in the host cell, which leads to disruption of the target gene in the host cell;
(c) selection of host cells with an inactivated target gene to produce a knockout strain of methylotrophic yeast to produce an insulin precursor or an insulin analog precursor with a reduced degree of glycosylation.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IN332/CHE/2010 | 2010-02-10 | ||
| IN332CH2010 | 2010-02-10 | ||
| PCT/IN2010/000190 WO2011099028A1 (en) | 2010-02-10 | 2010-03-29 | Method of reducing glycosylation of proteins, processes and proteins thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012137953A RU2012137953A (en) | 2014-03-20 |
| RU2575607C2 true RU2575607C2 (en) | 2016-02-20 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007061631A2 (en) * | 2005-11-15 | 2007-05-31 | Glycofi, Inc | Production of glycoproteins with reduced o-glycosylation |
| RU2316563C2 (en) * | 2001-02-23 | 2008-02-10 | Иммьюнекс Корпорейшн | Method for promotion of active conformation of glycosylated recombinant protein, method for preparing active glycosylated protein and method for preparing composition of this protein for administration to user and/or patient or for using by user and/or patient |
| WO2009105357A1 (en) * | 2008-02-20 | 2009-08-27 | Glycofi, Inc. | Vectors and yeast strains for protein production |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2316563C2 (en) * | 2001-02-23 | 2008-02-10 | Иммьюнекс Корпорейшн | Method for promotion of active conformation of glycosylated recombinant protein, method for preparing active glycosylated protein and method for preparing composition of this protein for administration to user and/or patient or for using by user and/or patient |
| WO2007061631A2 (en) * | 2005-11-15 | 2007-05-31 | Glycofi, Inc | Production of glycoproteins with reduced o-glycosylation |
| WO2009105357A1 (en) * | 2008-02-20 | 2009-08-27 | Glycofi, Inc. | Vectors and yeast strains for protein production |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8778659B2 (en) | Method of reducing glycosylation of proteins, processes and proteins thereof | |
| US11702627B2 (en) | High cAMP yielding yeast strain and use thereof | |
| CN113667682A (en) | YH66-RS11190 gene mutant and application thereof in preparation of L-valine | |
| KR20210128742A (en) | Recombinant Acid Resistant Yeast Inhibited Glycerol Production and Method for Preparing Lactic Acid Using The Same | |
| CN112725210A (en) | Recombinant acid-resistant yeast inhibiting lactic acid metabolism and ethanol production and method for producing lactic acid using same | |
| EP3954774A1 (en) | Rna site-directed editing using artificially constructed rna editing enzymes and related uses | |
| KR20140091018A (en) | Engineered lower eukaryotic host strains for recombinant protein expression | |
| JP2000136199A (en) | Signal peptide usable in schizosaccharomyces pombe, secretion-type expression vector, and production of protein by using the same | |
| WO2016003368A1 (en) | Optimized vectors for the production of recombinant proteins | |
| CN107384813B (en) | Aspergillus niger strain for protein production and application thereof | |
| RU2575607C2 (en) | Method for reducing degree of protein glycosylation, methods and proteins | |
| CN112899252A (en) | High-activity transposase and application thereof | |
| JP2010522549A (en) | Polynucleotide for enhancing expression of polynucleotide of interest | |
| CN110592084A (en) | Recombinant strain modified by rhtA gene promoter and construction method and application thereof | |
| CN110804617B (en) | KdtA gene modified recombinant strain and construction method and application thereof | |
| CN113549560B (en) | Construction method of engineering yeast for glycoprotein preparation and strain thereof | |
| CN114107358A (en) | Construction method of heat-resistant aspergillus niger engineering bacteria for increasing content of stress trehalose | |
| CN113337472A (en) | Recombinant cell line for efficiently and stably expressing cat interferon-omega 2 and application thereof | |
| CN114958914B (en) | Human and mammal cell attachment body expression vector, construction method and application | |
| JP7471395B2 (en) | Recombinant strains based on Escherichia coli and methods for their construction and use | |
| US20240084084A1 (en) | Promoter for yeast | |
| EP1436379B1 (en) | Dna fpr expression of alpha i-antitrypsin in methylotropic yeast | |
| US7270979B1 (en) | DNA for expression of alpha 1-antitrypsin in methylotropic yeast | |
| WO2017122638A1 (en) | Transformant, and transferrin manufacturing method | |
| EP3992294A1 (en) | Escherichia coli-based recombinant strain and construction method therefor and application thereof |