RU2575067C2 - Herpetic fever virus vaccines - Google Patents
Herpetic fever virus vaccines Download PDFInfo
- Publication number
- RU2575067C2 RU2575067C2 RU2012131167/10A RU2012131167A RU2575067C2 RU 2575067 C2 RU2575067 C2 RU 2575067C2 RU 2012131167/10 A RU2012131167/10 A RU 2012131167/10A RU 2012131167 A RU2012131167 A RU 2012131167A RU 2575067 C2 RU2575067 C2 RU 2575067C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hsv
- promoter
- virus
- sequence
- infection
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 69
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 title claims abstract description 38
- 206010067152 Oral herpes Diseases 0.000 title abstract 2
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 claims abstract description 75
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims abstract description 48
- 101700085547 ICP0 Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 101700008945 ICP4 Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 claims abstract description 18
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 7
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 131
- 101700067330 tetO Proteins 0.000 claims description 30
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 20
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims description 5
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010005593 glycoprotein D-herpes simplex virus type 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 claims description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 claims description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 claims description 2
- 101700021384 C2 Proteins 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 28
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 20
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 abstract 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 91
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 30
- 210000004392 Genitalia Anatomy 0.000 description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 21
- 238000011068 load Methods 0.000 description 20
- 210000003501 Vero Cells Anatomy 0.000 description 19
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 15
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 14
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 12
- 108010061543 Neutralizing Antibodies Proteins 0.000 description 11
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 11
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 11
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 108010030300 type 1 protein ICP4 herpes simplex virus Proteins 0.000 description 10
- 230000003612 virological Effects 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 206010068760 Ulcers Diseases 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 9
- 101710037611 BMLF1 Proteins 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 8
- 230000001718 repressive Effects 0.000 description 8
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 7
- 101710039223 tetR Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 6
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 6
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 6
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 101700014779 GLB1 Proteins 0.000 description 5
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 108010032623 tetracycline resistance-encoding transposon repressor protein Proteins 0.000 description 5
- 102100016908 ACKR1 Human genes 0.000 description 4
- 101710008404 GAPDH Proteins 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 3
- SXVBHNXTPNLOKR-FCLWLKJISA-L Calcium alginate Chemical compound [Ca+2].O1[C@@H](C([O-])=O)[C@@H](OC)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O SXVBHNXTPNLOKR-FCLWLKJISA-L 0.000 description 3
- 208000005721 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- 208000001688 Herpes Genitalis Diseases 0.000 description 3
- 206010040844 Skin exfoliation Diseases 0.000 description 3
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 3
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 description 3
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 3
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000035618 desquamation Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 201000004946 genital herpes Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 3
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Destomysin Chemical compound OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 210000001652 Frontal Lobe Anatomy 0.000 description 2
- 210000000609 Ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 229940097277 Hygromycin B Drugs 0.000 description 2
- 102000004851 Immunoglobulin G Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 210000003141 Lower Extremity Anatomy 0.000 description 2
- FRQMUZJSZHZSGN-HBNHAYAOSA-N Medroxyprogesterone Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](O)(C(C)=O)CC[C@H]21 FRQMUZJSZHZSGN-HBNHAYAOSA-N 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 description 2
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 229960004854 VIRAL VACCINES Drugs 0.000 description 2
- 210000003462 Veins Anatomy 0.000 description 2
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 201000001820 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229960004616 medroxyprogesterone Drugs 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing Effects 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CN=C2[C]1C(Cl)=C(Br)C=C2 BLEMLGBVQSNDOD-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1H-2-benzofuran-1-yl)-1H-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000565 Acquired immunodeficiency syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229940023040 Acyclovir Drugs 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 description 1
- 208000000350 Central Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- 206010061428 Decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 206010014599 Encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 206010048461 Genital infection Diseases 0.000 description 1
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 1
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 1
- DILRJUIACXKSQE-UHFFFAOYSA-N N',N'-dimethylethane-1,2-diamine Chemical compound CN(C)CCN DILRJUIACXKSQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108060006229 PIGV Proteins 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 229940056360 Penicillin G Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229960001412 Pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N Pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101710012186 SLC7A1 Proteins 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000278 Spinal Cord Anatomy 0.000 description 1
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229960002385 Streptomycin Sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 108060008443 TPPP Proteins 0.000 description 1
- 108010040939 Trans-Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000002142 Trans-Activators Human genes 0.000 description 1
- HDOVUKNUBWVHOX-QMMMGPOBSA-N Valacyclover Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCOC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C=N2 HDOVUKNUBWVHOX-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016350 Viral Proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 1
- 210000002268 Wool Anatomy 0.000 description 1
- 101710031342 YE0063 Proteins 0.000 description 1
- -1 a hunched posture Diseases 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N acyclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 230000001042 autoregulative Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 201000008779 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229960004396 famciclovir Drugs 0.000 description 1
- GGXKWVWZWMLJEH-UHFFFAOYSA-N famcyclovir Chemical compound N1=C(N)N=C2N(CCC(COC(=O)C)COC(C)=O)C=NC2=C1 GGXKWVWZWMLJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 101500002601 human Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000002318 immunoblotting Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic Effects 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated Effects 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 1
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 1
- 229960001234 valaciclovir Drugs 0.000 description 1
- 230000003313 weakening Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Перекрестные ссылки на родственные заявкиCross references to related applications
По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки на патент США № 61/288836, поданной 21 декабря 2009 года. Эта временная заявка полностью включена в настоящее описание путем ссылки.This application claims the priority of provisional patent application US No. 61/288836, filed December 21, 2009. This provisional application is incorporated herein by reference in its entirety.
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение в первую очередь относится к вакцинам, которые могут использоваться для иммунизации пациентов против инфекций вирусом простого герпеса типа 2 (Herpex Simplex Virus type 2, HSV-2), ассоциированными с хроническими генитальными язвами. Для вакцины используется дефектный по репликации вирус HSV-2, который в результате генноинженерных изменений экспрессирует антиген гликопротеин D HSV-2 (gD2) на высоком уровне. В предпочтительных вариантах осуществления вирус HSV-2 также экспрессирует один или более иммуномодулирующих генов, таких как IL15 и/или основные антигены HSV-1 или HSV-2, такие как gB или gC.The present invention primarily relates to vaccines that can be used to immunize patients against infections with herpes simplex virus type 2 (Herpex Simplex
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION
Вирусы простого герпеса (herpex simplex viruses, HSV) и инфекции HSVHerpes simplex viruses (herpex simplex viruses, HSV) and HSV infections
Вирус простого герпеса типа 2 (HSV-2) является основной причиной генитальных язв. Он может вызывать как острую, продуктивную инфекцию, так и длительную латентную инфекцию с непредсказуемыми периодическими рецидивами (66). Инфекция HSV приводит к возникновению рецидивирующих генитальных язв на протяжении всей жизни пациента, а также представляет опасность для пациентов со СПИД. Было показано, что генитальная инфекция HSV-2 утраивает риск заражения ВИЧ половым путем (20), и в Африке этот повышенный риск может служить причиной 25-35% недавних инфекций ВИЧ (1).Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) is the main cause of genital ulcers. It can cause both acute, productive infection and prolonged latent infection with unpredictable periodic relapses (66). HSV infection leads to recurrent genital ulcers throughout the patient's life, and is also a danger to AIDS patients. Genital HSV-2 infection has been shown to triple the risk of sexually transmitted HIV infection (20), and in Africa this increased risk may cause 25-35% of recent HIV infections (1).
Хотя силу и продолжительность наиболее симптоматических первичных инфекций HSV можно снизить с помощью перорального или внутримышечного введения ацикловира, валацикловира или фамцикловира, антивирусная терапия не препятствует переходу первичной инфекции в латентную и не ослабляет последующие рецидивы (66). Исходя из постоянного распространения генитального герпеса в США в течение двух последних десятков лет (19), а также учащения случаев резистентности HSV к современным антивирусным препаратам, очевидно, что в области техники существует потребность в безопасных и эффективных вакцинах против инфекций HSV (31, 60). Кроме того, тот факт, что супрессивная терапия HSV приводит к значительному снижению уровня ВИЧ в слизистых половых органов и плазме крови женщин, инфицированных HSV-2 и ВИЧ (52) позволяет предположить, что эффективная вакцина против HSV может иметь большое значение для контроля инфекции ВИЧ (1, 31).Although the strength and duration of the most symptomatic primary HSV infections can be reduced by oral or intramuscular administration of acyclovir, valaciclovir, or famciclovir, antiviral therapy does not prevent the primary infection from becoming latent and does not weaken subsequent relapses (66). Given the continued spread of genital herpes in the United States over the past two decades (19), as well as the increasing incidence of HSV resistance to modern antiviral drugs, it is clear that there is a need in the art for safe and effective vaccines against HSV infections (31, 60) . In addition, the fact that HSV suppressive therapy leads to a significant reduction in HIV levels in the mucous membranes of the genital organs and blood plasma of women infected with HSV-2 and HIV (52) suggests that an effective HSV vaccine may be of great importance for controlling HIV infection (1, 31).
Гликопротеин D HSV-2 (gD2)Glycoprotein D HSV-2 (gD2)
Гликопротеин D HSV (gD) представляет собой один из основных вирусных антигенов, экспрессируемых на поверхности инфицированных клеток (21) и на оболочке вируса (24). gD необходим для проникновения вируса в клетку. Он представляет собой мишень для нейтрализующих антител против инфекции HSV (12, 49, 53). Кроме того, gD является основной вирусной мишенью для CD4+ T-клеток, включая цитотоксичность, опосредованную CD4+ Т-клетками, и CD8+ Т-клеток в человеческих и мышиных моделях инфекции HSV (27, 28, 30, 34, 47, 65, 75). В силу вышеизложенных причин, разработка вакцин против субъединиц HSV сосредоточена на gD (32, 60).Glycoprotein D HSV (gD) is one of the main viral antigens expressed on the surface of infected cells (21) and on the envelope of the virus (24). gD is necessary for the virus to enter the cell. It is a target for neutralizing antibodies against HSV infection (12, 49, 53). In addition, gD is the major viral targets for CD4 + T-cells, including cytotoxicity mediated by CD4 + T cells and CD8 + T cells in human and mouse models of HSV infection (27, 28, 30, 34, 47, 65 , 75). For the foregoing reasons, the development of vaccines against HSV subunits focuses on gD (32, 60).
В фазе 3 клинических исследований Stanberry et al. показали, что эффективность защиты в результате вакцинации рекомбинантным gD HSV-2 (gD2) в комбинации с адъювантом AS04 от развития генитального герпеса у HSV-серонегативных женщин достигала 73-74% (62). Для мужчин и пациентов, сероположительных по HSV-1, значительной эффективности показано не было. Несмотря на то, что у иммунизированных хозяев были обнаружены gD2-специфичные гуморальный и CD4+ Т-клеточный ответы, остается неясным, может ли gD2/AS04 эффективно индуцировать CD8+ T-клеточный ответ (31, 32). Исходя из этого исследования, можно сделать вывод, что существует потребность в вакцине против HSV, индуцирующей более широкий гуморальный, а также CD4 и CD8 T-клеточный ответы на gD2 и другие вирусные антигены HSV (29, 31, 32).In
Вирусные вакциныViral vaccines
Хорошо известно, что живые вирусные вакцины, способные к синтезу иммуногенов de novo в теле хозяина, индуцируют более широкий и более длительный иммунный ответ, чем вакцины, состоящие только из пептидов или белков. Были получены и протестированы на потенциальную пригодность в качестве вакцин против инфекции HSV различные формы HSV, дефектных по репликации и нейро-аттенуированные мутанты, компетентные по репликации (патент США № 7223411; (18)).It is well known that live viral vaccines capable of synthesizing de novo immunogens in the host body induce a broader and longer-lasting immune response than vaccines consisting of only peptides or proteins. Various forms of replication-defective HSV and neuro-attenuated replication competent mutants have been obtained and tested as potential vaccines against HSV infection (US Pat. No. 7,223,411; (18)).
Поскольку вирусы, дефектные по репликации, а также нейро-аттенуированные мутанты способны в ходе ко-репликации с вирусом дикого типа или становиться компетентными по репликации в контексте вируса дикого типа, использование их в качестве человеческих вакцин несет определенный риск, в особенности для пациентов, несущих латентную инфекцию HSV (33). Поскольку было показано, что у мутантов HSV-1, дефектных по репликации, может реактивироваться предранний промотор HSV-1 в мозгу грызунов, существует дополнительный риск индукции такими мутантами продуктивной вирусной инфекции у латентно инфицированных пациентов (63). Таким образом, требуемая рекомбинантная вакцина против HSV, дефектная по репликации, должна быть способной синтезировать широкий спектр антигенов, кодируемых вирусом, а также должна кодировать уникальную функцию, предотвращающую литическую инфекцию HSV дикого типа при нахождении в одних и тех же клетках. Такой защитный механизм сведет к минимуму вероятность возникновения инфекции вирусом вакцины в результате рекомбинации вектора вакцины и вируса дикого типа, присутствующего в теле хозяина.Since replication-defective viruses, as well as neuro-attenuated mutants, can co-replicate with wild-type virus or become competent to replicate in the context of wild-type virus, using them as human vaccines carries a certain risk, especially for patients carrying latent HSV infection (33). Since it has been shown that replication-defective HSV-1 mutants can reactivate the early early HSV-1 promoter in rodent brain, there is an additional risk of inducing a productive virus infection in latently infected patients (63). Thus, the desired replication-defective recombinant HSV vaccine must be able to synthesize a wide range of virus-encoded antigens, and it must also encode a unique function that prevents wild-type HSV lytic infection in the same cells. Such a protective mechanism will minimize the likelihood of vaccine virus infection resulting from the recombination of the vaccine vector and the wild-type virus present in the host body.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
В общем, настоящее изобретения основано на использовании технологии индуцированного тетрациклином включения и выключения генов (T-REx производства Invitrogen) (73) и доминантно-негативной мутантной формы полипептида UL9 HSV-1, например, UL9-C535C, для разработки безопасной и эффективной вирусной вакцины против инфекции HSV-2.In general, the present invention is based on the use of tetracycline-induced on and off gene technology (T-REx from Invitrogen) (73) and the dominant negative mutant form of the UL9 HSV-1 polypeptide, e.g., UL9-C535C, to develop a safe and effective viral vaccine against HSV-2 infection.
В своем первом аспекте изобретение направлено на дефектный по репликации доминантно-негативный рекомбинантный вирус Herpes simplex 2 (HSV-2). В геноме этого вируса содержится по меньшей мере первая последовательность, кодирующая первый гликопротеин D HSV-2 (gD2), функционально связанная (operably linked) с первым промотором и предпочтительно вторая последовательность, кодирующая второй HSV-2 gD2, функционально связанная со вторым промотором. Промотор (промоторы) функционально связан с последовательностью тетрациклинового оператора (tet-O) и второй последовательностью tet-O, соответственно, каждая из которых разрешает транскрипцию в отсутствие связанного тетрациклинового репрессора, но блокирует транскрипцию при связывании репрессора. Геном также включает третью последовательность, кодирующую по меньшей мере первую доминантно-негативную мутантную форму белка UL9 HSV-1 или HSV-2, под контролем третьего промотора, и предпочтительно четвертую последовательность, кодирующую вторую доминантно-негативную форму белка UL9 HSV-1 или HSV-2, под контролем четвертого промотора. Как и первый и второй промоторы, третий и четвертый промоторы оба функционально связаны с последовательностями tet-O, блокирующими транскрипцию при связывании tet-репрессора. Кроме того, в геноме вируса отсутствует последовательность, кодирующая функциональный белок ICP0. Для усиления антигенности геном также предпочтительно экспрессирует иммуномодулирующие гены, такие как IL12 или IL15 и/или основные антигены HSV-1 или HSV-2, такие как gB или gC.In its first aspect, the invention is directed to a replication-defective dominant-negative
Термин “функционально связаны” означает, что геномные элементы соединены вместе таким образом, что они могут выполнять свои нормальные функции. Например, ген функционально связан с промотором, если его транскрипция находится под контролем этого промотора и если в результате транскрипции получается продукт, в норме кодируемый геном. Последовательность tet-оператор функционально связана с промотором, если оператор блокирует транскрипцию с промотора в присутствии связанного tet-репрессора, но разрешает транскрипцию в отсутствие репрессора. Термин “рекомбинантный” означает вирус, чьи нуклеотидные последовательности были получены путем рекомбинации нуклеотидных последовательностей и элементов последовательностей и введения этих рекомбинированных последовательностей в вирус или в вирус-предшественник.The term “functionally linked” means that genomic elements are connected together in such a way that they can perform their normal functions. For example, a gene is functionally linked to a promoter if its transcription is under the control of this promoter and if transcription results in a product normally encoded by the gene. The sequence of the tet-operator is functionally linked to the promoter if the operator blocks transcription from the promoter in the presence of a bound tet-repressor, but allows transcription in the absence of a repressor. The term “recombinant” means a virus whose nucleotide sequences were obtained by recombining nucleotide sequences and sequence elements and introducing these recombinant sequences into a virus or a predecessor virus.
Предпочтительно, используемые промоторы являются такими, которые содержат TATA-элемент и последовательности tet-оператора, связанные с промоторами, содержащими два сайта связывания репрессора op2, соединенные связывающими нуклеотидами, число которых может варьировать от 2 до 20. Положение операторной последовательности важно для достижения эффективного контроля промотора. В частности, первый нуклеотид операторной последовательности должен быть расположен на расстоянии от 6 до 24 нуклеотидов к 3'-концу от последнего нуклеотида ТАТА-элемента. Структурные последовательности, кодирующие, например, gD или доминантно-негативный мутантный полипептид UL9, должны находиться к 3'-концу от оператора. В особенности предпочтительные промоторы включают предранний промотор hCMV и предранние промоторы HSV-1 и HSV-2. В особенности предпочтительны промоторы ICP4 HSV-1 или HSV-2.Preferably, the promoters used are those that contain a TATA element and tet operator sequences linked to promoters containing two op2 repressor binding sites linked by binding nucleotides, the number of which can vary from 2 to 20. The position of the operator sequence is important to achieve effective control promoter. In particular, the first nucleotide of the operator sequence should be located at a distance of 6 to 24 nucleotides to the 3'-end of the last nucleotide of the TATA element. Structural sequences encoding, for example, gD or the dominant negative mutant UL9 polypeptide should be located at the 3'-end of the operator. Particularly preferred promoters include the hCMV pre-early promoter and the HSV-1 and HSV-2 pre-early promoters. Particularly preferred are ICP4 promoters HSV-1 or HSV-2.
В другом аспекте изобретение направлено на вакцину, которую можно использовать профилактически или терапевтически против экспрессии HSV и которая включает один или более вышеописанных рекомбинантных вирусов в стандартной дозировке. Термин “стандартная дозировка” означает однократное введение лекарственного препарата, такое как таблетка или капсула. Предпочтительно, “стандартная дозировка” представляет собой раствор лекарственного препарата с концентрацией, вызывающей терапевтический или профилактический эффект при введении выбранного объема (стандартной дозировки) пациенту путем инъекции, который находится во флаконе для инъекций. На основании эффективной дозы для мышей (2×106 БОЕ), можно сделать вывод, что минимальная эффективная доза для человека должна составлять примерно 1×107 БОЕ. Таким образом, стандартная дозировка должна содержать по меньшей мере такое количество вируса, типичная стандартная дозировка должна содержать 1×107-1×109 БОЕ. Вакцины можно хранить в лиофилизированной форме и восстанавливать в фармацевтически приемлемом носителе перед употреблением. Альтернативно, препарат может храниться непосредственно в носителе. Объем одной дозы вакцины может варьировать, но в общем должен находиться в интервале приблизительно от 0,1 мл до 10 мл и более типично приблизительно от 0,2 мл до 5 мл.In another aspect, the invention is directed to a vaccine that can be used prophylactically or therapeutically against the expression of HSV and which includes one or more of the above recombinant viruses in a unit dosage. The term “unit dosage” means a single administration of a drug, such as a tablet or capsule. Preferably, a “unit dosage” is a solution of a drug with a concentration that induces a therapeutic or prophylactic effect when a selected volume (unit dosage) is administered to a patient by injection, which is in the injection vial. Based on the effective dose for mice (2 × 10 6 PFU), it can be concluded that the minimum effective dose for humans should be approximately 1 × 10 7 PFU. Thus, the standard dosage should contain at least that amount of virus, a typical standard dosage should contain 1 × 10 7 -1 × 10 9 PFU. Vaccines can be stored in lyophilized form and reconstituted in a pharmaceutically acceptable carrier before use. Alternatively, the preparation may be stored directly in the carrier. The volume of a single dose of vaccine may vary, but in general should be in the range of about 0.1 ml to 10 ml, and more typically about 0.2 ml to 5 ml.
Изобретение также включает способы иммунизации пациентов против инфекции HSV-1 или HSV-2 и состояний, к которым приводят такие инфекции (например, герпетические генитальные язвы) путем введения пациентам вышеописанных вакцин. Вакцины могут вводиться инфицированным пациентам для предотвращения или подавления вспышки вируса. Любой способ введения вакцины пациенту, не приводящий к разрушению вируса, совместим с настоящим изобретением. В общем случае, препарат вводят парентеральным способом, таким как внутримышечная или внутривенная инъекция. Дозировку и график введения вакцин можно определить с помощью способов, стандартных для уровня техники. Препараты можно вводить путем однократных или многократных инъекций.The invention also includes methods of immunizing patients against HSV-1 or HSV-2 infection and the conditions resulting from such infections (eg, herpetic genital ulcers) by administering the above-described vaccines to patients. Vaccines can be given to infected patients to prevent or suppress an outbreak of the virus. Any method of administering a vaccine to a patient that does not destroy the virus is compatible with the present invention. In general, the drug is administered parenterally, such as by intramuscular or intravenous injection. Dosage and schedule for the introduction of vaccines can be determined using methods standard for the prior art. Drugs can be administered by single or multiple injections.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг.1А и 1В: На фиг.1А представлены схематические изображения плазмид, использованных для конструирования доминантно-негативного и дефектного по репликации рекомбинантов HSV-2: N2-C535C и CJ2-gD2. Плазмида pHSV-2/ICP0 представляет собой плазмиду, включающую последовательности HSV-2 ICP0 от 268 п.н. раньше открытой рамки считывания HSV-2 ICP0 (серый прямоугольник) до 40 п.н. после сигнала полиаденилирования последовательностей, кодирующих ICP0. pHSV-2.ICP0-V конструировали путем замещения фрагмента ДНК Xho I-ICP0, содержащего последовательности с множественной клонирующей последовательностью (MCS), включающей Xho I. pHSV-2.ICP0-lacZ получали путем вставки гена LacZ (диагональная штриховка) в область MCS pHSV-2.ICP0-V. p02lacZ-TOC535C конструировали путем замены указанного фрагмента, включающего lacZ, pHSV-2.ICP0-lacZ на последовательности ДНК, кодирующие UL9-C535C (черный прямоугольник) под контролем основного предраннего промотора hCMV, включающего tetO (вертикальная штриховка, CMVTO). p02lacZTO-gD2.C535C конструировали путем замены фрагмента SnaB I/Pst I p02lacZTO-C535C на последовательности ДНК, кодирующие ген gD2 (прямоугольник с градиентной заливкой) под контролем предраннего промотора ICP4 HSV-1, включающего tetO (белый прямоугольник, ICP4TO).FIGS. 1A and 1B : FIG. 1A is a schematic representation of plasmids used to construct the dominant negative and replication defective HSV-2 recombinants: N2-C535C and CJ2-gD2. Plasmid pHSV-2 / ICP0 is a plasmid comprising the sequence of HSV-2 ICP0 from 268 bp before open reading frame HSV-2 ICP0 (gray rectangle) up to 40 bp after the polyadenylation signal of sequences encoding ICP0. pHSV-2.ICP0-V was constructed by replacing the Xho I-ICP0 DNA fragment containing multiple cloning sequence (MCS) sequences including Xho I. pHSV-2.ICP0-lacZ was obtained by inserting the LacZ gene (diagonal hatching) in the MCS region pHSV-2.ICP0-V. p02lacZ-TOC535C was constructed by replacing the indicated fragment comprising lacZ, pHSV-2.ICP0-lacZ with DNA sequences encoding UL9-C535C (black rectangle) under the control of the hCMV main early promoter including tetO (vertical hatching, CMVTO). p02lacZTO-gD2.C535C was constructed by replacing the SnaB I / Pst I fragment of p02lacZTO-C535C with DNA sequences encoding the gD2 gene (gradient filled rectangle) under the control of the ICP4 HSV-1 early promoter including tetO (white rectangle, ICP4TO).
На фиг.1В приведены схематические изображения геномов HSV-2 дикого типа, мутанта HSV-2 ICP0 null (N2-lacZ), N2-C535C и CJ2-gD2. UL и US обозначают уникальную длинную и уникальную короткую область генома HSV-2 соответственно. Эти области фланкированы соответствующими областями обратных повторов (белые прямоугольники). Под развернутыми последовательностями, кодирующими ICP0 генома HSV-2, показана замена обеих копий последовательностей, кодирующих ICP0, на ген lacZ в N2-lacZ и на последовательности ДНК (1) кодирующие UL9-C535C под контролем основного предраннего промотора hCMV, несущего tetO, в N2-535C и (2) кодирующие UL9-C535C и gD2 под контролем указанных промоторов, несущих tetO, в противоположных ориентациях.1B is a schematic representation of the wild-type HSV-2 genome, HSV-2 mutant ICP0 null (N2-lacZ), N2-C535C, and CJ2-gD2. UL and US denote the unique long and unique short region of the HSV-2 genome, respectively. These areas are flanked by the corresponding areas of reverse repeats (white rectangles). Under the expanded sequences encoding ICP0 of the HSV-2 genome, it is shown that both copies of the sequences encoding ICP0 are replaced by the lacZ gene in N2-lacZ and the DNA sequence (1) encoding UL9-C535C under the control of the hCMV main early promoter carrying tetO in N2 -535C and (2) encoding UL9-C535C and gD2 under the control of these promoters carrying tetO, in opposite orientations.
Фиг.2А и 2В: На этих фигурах показан высокий уровень экспрессии gD2 и UL9-C535C после инфекции клеток Vero CJ2-gD2. На фиг.2А клетки Vero не инфицировали или инфицировали HSV-2 дикого типа, N2-lacZ, N2-C535C или CJ2-gD2 со множественностью заражения 10 БОЕ на клетку. Эксперимент повторяли дважды. Экстракты инфицированных клеток готовили через 9 часов после инфекции. На фиг.2В клетки Vero инфицировали штаммом KOS HSV-1 дикого типа, CJ9-gD, HSV-2 дикого типа или CJ2-gD2 со множественностью инфекции 10 БОЕ на клетку. Экстракты инфицированных клеток готовили через 9 часов после инфекции. Белки, содержащиеся в экстрактах инфицированных клеток, разделяли с помощью SDS-PAGE и далее проводили иммуноблоттинг с использованием поликлональных антител к gD HSV-1 (R45), UL9, или моноклональных антител, специфичных к ICP27 и gB (Santa Cruz). Figa and 2B : These figures show a high level of expression of gD2 and UL9-C535C after infection of Vero cells CJ2-gD2. 2A, Vero cells were not infected or infected with wild-type HSV-2, N2-lacZ, N2-C535C or CJ2-gD2 with a multiplicity of infection of 10 PFU per cell. The experiment was repeated twice. Extracts of infected cells were prepared 9 hours after infection. 2B, Vero cells were infected with the wild-type KOS HSV-1 strain, CJ9-gD, wild-type HSV-2, or CJ2-gD2 strain with a multiplicity of infection of 10 PFU per cell. Extracts of infected cells were prepared 9 hours after infection. Proteins contained in extracts of infected cells were separated by SDS-PAGE and immunoblot was performed using polyclonal antibodies to gD HSV-1 (R45), UL9, or monoclonal antibodies specific for ICP27 and gB (Santa Cruz).
Фиг.3: На фиг.3 показана регуляция экспрессии gD2 и UL9-C535C с помощью tetR в клетках VCEP4R-28, инфицированных CJ2-gD2. Клетки VCEP4R-28 рассаживали в количестве 5×105 клеток на чашку диаметром 60 мм. Через 40 ч после рассадки клетки не инфицировали или инфицировали HSV-2 дикого типа или CJ2-gD2 при множественности инфекции 10 БОЕ на клетку в присутствии или в отсутствие тетрациклина. Эксперимент повторяли дважды. Через 9 часов после инфекции готовили экстракты инфицированных клеток. Экстракты исследовали с помощью иммуноблоттинга поликлональными антителами к gD и UL9 HSV и моноклональными антителами к ICP27. Figure 3 : Figure 3 shows the regulation of expression of gD2 and UL9-C535C using tetR in VCEP4R-28 cells infected with CJ2-gD2. VCEP4R-28 cells were seeded in an amount of 5 × 10 5 cells per plate with a diameter of 60 mm. 40 hours after transplantation, the cells were not infected or infected with wild-type HSV-2 or CJ2-gD2 with a multiplicity of 10 PFU infection per cell in the presence or absence of tetracycline. The experiment was repeated twice. 9 hours after infection, extracts of infected cells were prepared. The extracts were examined by immunoblotting with polyclonal antibodies to gD and UL9 HSV and monoclonal antibodies to ICP27.
Фиг.4А и 4В: На этих фигурах показан транс-доминантно-негативный эффект CJ2-gD2 на репликацию HSV-2 дикого типа. На фиг.4А клетки Vero инфицировали штаммом 186 HSV-2 дикого типа при множественности инфекции 2 БОЕ на клетку, 186 при множественности инфекции 2 БОЕ на клетку и CJ2-gD2 при множественности инфекции 5 БОЕ на клетку или 186 при множественности инфекции 2 БОЕ на клетку и N2-lacZ при множественности инфекции 5 БОЕ на клетку. Эксперимент повторяли трижды. На фиг.4В клетки Vero инфицировали только HSV-2 дикого типа при множественности инфекции 5 БОЕ на клетку, ко-инфицировали 186 и CJ2-gD2 при множественности инфекции 5 БОЕ на клетку для обоих вирусов или инфицировали только 186 при множественности инфекции 15 БОЕ на клетку и ко-инфицировали 186 при множественности инфекции 15 БОЕ на клетку и CJ2-gD2 при множественности инфекции 5 БОЕ на клетку. Через 18 часов после инфекции собирали инфицированные клетки и определяли титры вирусов на монослоях клеток Vero. Титры вирусов представлены в виде среднее ± стандартное отклонение. Числа сверху графика означают, во сколько раз выход вируса при ко-инфекции меньше выхода вируса при одиночной инфекции. 4A and 4B : These figures show the trans-dominant negative effect of CJ2-gD2 on wild-type HSV-2 replication. 4A, Vero cells were infected with wild type HSV strain 186 with a multiplicity of infection of 2 PFU per cell, 186 with a multiplicity of infection of 2 PFU per cell, and CJ2-gD2 with a multiplicity of infection of 5 PFU per cell or 186 with a multiplicity of
Фиг.5А и 5В: На этих фигурах показана нейровирулентность штамма 186 HSV-2 дикого типа, N2-lacZ, N2-C535C и CJ2-gD2 у мышей BALB/c после интрацеребральной прививки. Самок мышей BALB/c в возрасте 4-6 недель случайным образом разделяли на 5 групп по 8 мышей в каждой. Животных анестезировали пентобарбиталом натрия и прививали DMEM, 25 БОЕ на мышь штамма 186 HSV-2 дикого типа, 1×106 БОЕ на мышь N2-lacZ, 2,5×106 БОЕ на мышь CJ2-gD2 или N2-C535C путем интрацеребральной инъекции в левую лобную долю мозга в объеме 20 мкл на глубину 4 мм. За развитием у мышей признаков и симптомов болезни наблюдали в течение 35 дней после прививки. На фиг.5А приведены показатели заболевания в различные дни после инфекции, а на фиг.5В приведен процент выживших мышей. 5A and 5B : These figures show the neurovirulence of wild-type HSV-2 strain 186, N2-lacZ, N2-C535C and CJ2-gD2 in BALB / c mice after intracerebral vaccination. Female BALB / c mice aged 4-6 weeks were randomly divided into 5 groups of 8 mice each. Animals were anesthetized with sodium pentobarbital and inoculated with DMEM, 25 PFU per mouse of wild-type strain 186 HSV-2, 1 × 10 6 PFU per mouse N2-lacZ, 2.5 × 10 6 PFU per mouse CJ2-gD2 or N2-C535C by intracerebral injection in the left frontal lobe of the brain in a volume of 20 μl to a depth of 4 mm. The development of signs and symptoms of the disease in mice was observed for 35 days after vaccination. On figa shows indicators of disease on various days after infection, and on figv shows the percentage of surviving mice.
Фиг.6А и 6В: На фиг.6А и 6В показана индукция антител, специфичных к gD2, и ответов, нейтрализующих HSV-2. Самкам мышей BALB/c в возрасте 4-6 недель вводили DMEN (n=7, 6, 8, 8) или иммунизировали CJ2-gD2 (n=7, 6, 8, 8), N2-C535C (n=7, 8, 6) или CJ9-gD (n=6, 8, 6) в дозировке 2×106 БОЕ на мышь, и повторяли иммунизацию через 2 недели. Через 4-5 недель после первичной иммунизации у мышей забирали кровь из хвостовой вены. На фиг.6А сыворотку мышей из отдельной группы объединяли и инактивировали нагреванием. Определяли титры специфических антител, нейтрализующих HSV-2. Результаты приведены в виде средних титров ± стандартная ошибка среднего. На фиг.6В сыворотку контрольных мышей и мышей, иммунизированных CJ2-gD2, N2-C535C или CJ9-gD, инкубировали с клеточным экстрактом, полученным из клеток U2OS, трансфицированных плазмидой p02.4TO-gD2, экспрессирующей gD2. Комплексы gD со специфическими мышиными иммуноглобулинами преципитировали с помощью белка А, разделяли с помощью SDS-PAGE и детектировали поликлональными антителами R45, специфичными к gD. 6A and 6B : FIGS. 6A and 6B show the induction of gD2 specific antibodies and HSV-2 neutralizing responses. Female 4-6 week old BALB / c mice were injected with DMEN (n = 7, 6, 8, 8) or immunized with CJ2-gD2 (n = 7, 6, 8, 8), N2-C535C (n = 7, 8 , 6) or CJ9-gD (n = 6, 8, 6) at a dosage of 2 × 10 6 PFU per mouse, and immunization was repeated after 2 weeks. 4-5 weeks after the primary immunization, mice were sampled from the tail vein. On figa the serum of mice from a separate group were combined and inactivated by heating. The titers of specific antibodies neutralizing HSV-2 were determined. The results are shown as mean titers ± standard error of the mean. 6B, the serum of control mice and mice immunized with CJ2-gD2, N2-C535C or CJ9-gD was incubated with a cell extract obtained from U2OS cells transfected with plasmid p02.4TO-gD2 expressing gD2. GD complexes with specific mouse immunoglobulins were precipitated with protein A, separated by SDS-PAGE, and detected with R45 polyclonal antibodies specific for gD.
Фиг.7А-7D: На этих фигурах показана индукция CD4+ и CD8+ Т-клеточных ответов, специфичных к HSV-2, у мышей, иммунизированных CJ2-gD2. Самок мышей BALB/c не иммунизировали или иммунизировали CJ2-gD2 при множественности инфекции 2×106 БОЕ на мышь дважды с промежутком времени 2 недели. На фиг.7А и 7В контрольных и иммунизированных мышей не инфицировали или инфицировали HSV-2 дикого типа подкожно в дозировке 1×104 БОЕ на мышь через 9-10 недель после вторичной иммунизации (n=3). CD4+ и CD8+ T-клеточные ответы анализировали на 5 день после нагрузки с помощью тестов IFNγ ELISPOT на индивидуально очищенных CD4+ и CD8+ Т-клетках, выделенных из селезенки мышей, с использованием наборов реагентов Dynal для выделения мышиных CD4- и CD8- Т-клеток. На фиг.7C и 7D контрольных мышей и мышей, иммунизированных CJ2-gD2, не инфицировали или инфицировали HSV-2 дикого типа через 5-6 недель после вторичной иммунизации и далее проводили тесты IFNγ ELISPOT через 4 дня после инфекции (n=3). Число клеток, образующих пятна IFNγ (spot-forming cells, SFC) выражали в виде среднего ± стандартная ошибка среднего на миллион CD4+ или CD8+ Т-клеток. Figa-7D : These figures show the induction of CD4 + and CD8 + T-cell responses specific for HSV-2 in mice immunized with CJ2-gD2. Female BALB / c mice were not immunized or were immunized with CJ2-gD2 with a multiplicity of infection of 2 × 10 6 PFU per mouse twice with a time interval of 2 weeks. On figa and 7B, control and immunized mice were not infected or infected wild-type HSV-2 subcutaneously at a dose of 1 × 10 4 PFU per mouse 9-10 weeks after secondary immunization (n = 3). CD4 + and CD8 + T-cell responses were analyzed on
Фиг.8: На фиг.8 показано ослабление вагинальной репликации нагрузочного HSV-2 у мышей, иммунизированных CJ2-gD2. Самок мышей BALB/c в возрасте 4-6 недель случайным образом разделяли на 4 группы по 10 мышей в каждой. Мышам BALB/c в возрасте 4-6 вводили DMEM или иммунизировали CJ2-gD2, N2-C535C или CJ9-gD в дозировке 2×106 БОЕ на мышь, и вакцинацию повторяли через 2 недели. Через 5 недель мышам давали медроксипрогестерон и нагружали интравагинально 5×105 БОЕ штамма G HSV-2. Вагинальные мазки брали на 1, 2, 3, 5 и 7 день после нагрузки. Инфекционность вирусов в материале мазков оценивали по стандартному тесту образования бляшек на монослое клеток Vero. Титры вирусов приведены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего в индивидуальных вагинальных мазках. Fig. 8 : Fig. 8 shows weakening of vaginal replication of HSV-2 loading in mice immunized with CJ2-gD2. Female BALB / c mice aged 4-6 weeks were randomly divided into 4 groups of 10 mice each. BALB / c mice aged 4-6 were injected with DMEM or immunized with CJ2-gD2, N2-C535C or CJ9-gD at a dose of 2 × 10 6 PFU per mouse, and vaccination was repeated after 2 weeks. After 5 weeks, mice were given medroxyprogesterone and loaded intravaginally with 5 × 10 5 PFU of strain G HSV-2. Vaginal smears were taken on 1, 2, 3, 5 and 7 days after exercise. Virus infectivity in smear material was assessed using the standard plaque assay for Vero cell monolayer. Virus titers are shown as mean ± standard error of the mean in individual vaginal smears.
Фиг.9А и 9В: На этих фигурах показано предотвращение заболевания HSV-2 у мышей, иммунизированных CJ2-gD2. После нагрузки HSV-2 дикого типа у индивидуальных мышей, описанных в подписи к фиг.8, наблюдали в течение 21-дневного срока, наблюдали частоту генитального и системного заболевания HSV-2 (фиг.9) и выживаемость (фиг.9В), используя следующую шкалу: 0 = признаки не выражены, 1 = легкое покраснение и отек гениталий, 2 = умеренное воспаление гениталий, 3 = гнойные язвы гениталий и/или системное заболевание, 4 = паралич задних конечностей, 5 = гибель. Figa and 9B : These figures show the prevention of HSV-2 disease in mice immunized with CJ2-gD2. After loading wild-type HSV-2, the individual mice described in the signature of FIG. 8 were observed for a 21-day period, the incidence of genital and systemic HSV-2 disease (FIG. 9) and survival (FIG. 9B) were observed using the following scale: 0 = no signs, 1 = slight redness and swelling of the genitals, 2 = moderate inflammation of the genitals, 3 = purulent genital ulcers and / or systemic disease, 4 = hind limb paralysis, 5 = death.
Фиг.10: На фиг.10 показана кодирующая последовательность UL9-C535C HSV-1 (SEQ ID NO:2). UL9-C535C состоит из аминокислот 1-10 UL9, трипептида Thr-Met-Gly и аминокислот 535-851 UL9 (смотрите Yao et al. (69)). Figure 10 : Figure 10 shows the coding sequence of UL9-C535C HSV-1 (SEQ ID NO: 2). UL9-C535C consists of amino acids 1-10 of UL9, the Thr-Met-Gly tripeptide and amino acids 535-851 of UL9 (see Yao et al. (69)).
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение основано на идее использования технологии включения/выключения генов с помощью тетрациклина, а также доминантно-негативного пептида UL9 HSV-1 с целью получения рекомбинантного вируса HSV, дефектного по репликации и способного ингибировать инфекции HSV дикого типа (доминантно-негативного). CJ9-gD является прототипным доминантно-негативным дефектным по репликации рекомбинантным вирусом HSV-1 с высоким уровнем экспрессии основного антигена HSV-1 - гликопротеина D (gD), независимым от репликации вирусной ДНК HSV (7). В наиболее предпочтительной форме настоящего изобретения используется доминантно-негативный дефектный по репликации рекомбинантный HSV-2 (CJ2-gD2), кодирующий 2 копии гена gD HSV-2 (gD2) под контролем основного предраннего промотора ICP4 HSV-1, несущего tetO. CJ2-gD2 экспрессирует gD2 также эффективно, как и вирус HSV-2 дикого типа, и способен оказывать сильное транс-ингибирующее воздействие на репликацию HSV-2 дикого типа при ко-инфекции в одних и тех же клетках. Иммунизация CJ2-gD2 приводит к выработке эффективных нейтрализующих антител, специфичных к HSV-2, а также индукции Т-клеточных ответов, и обеспечивает полную защиту от интравагинальной инфекции HSV-2 дикого типа у мышей.The present invention is based on the idea of using the technology of turning on / off the genes using tetracycline, as well as the dominant negative peptide UL9 HSV-1, to produce recombinant replication defective HSV virus and capable of inhibiting wild-type (dominant negative) HSV infection. CJ9-gD is a prototype dominant negative replication defective recombinant HSV-1 virus with a high level of expression of the main HSV-1 antigen - glycoprotein D (gD), independent of HSV viral DNA replication (7). In a most preferred form of the present invention, a dominant negative replication defective recombinant HSV-2 (CJ2-gD2) encoding 2 copies of the gD HSV-2 (gD2) gene is used under the control of the main early early promoter ICP4 HSV-1 carrying tetO. CJ2-gD2 expresses gD2 as efficiently as the wild-type HSV-2 virus, and is capable of exerting a strong trans-inhibitory effect on wild-type HSV-2 replication with co-infection in the same cells. Immunization with CJ2-gD2 leads to the production of effective neutralizing antibodies specific for HSV-2, as well as the induction of T-cell responses, and provides complete protection against intravaginal infection of wild-type HSV-2 in mice.
CJ2-gD2 представляет собой вакцину, более эффективно защищающую от генитальной инфекции HSV-2 и вызванного им заболевания, чем CJ9-gD. Кроме того, интрацеребральная инъекция большой дозы CJ2-gD2 не приводит к заболеваемости или смертности у мышей. Исходя из совокупности этих наблюдений, можно предположить, что CJ2-gD2 обладает определенными преимуществами перед традиционными вакцинами на основе вируса, дефектного по репликации, и вакцинами на основе субъединиц HSV-2 в защите против генитальной инфекции HSV-2 и вызванного им заболевания у человека.CJ2-gD2 is a vaccine that protects against genital HSV-2 infection and the disease it causes more effectively than CJ9-gD. In addition, intracerebral injection of a large dose of CJ2-gD2 does not lead to morbidity or mortality in mice. Based on the totality of these observations, it can be assumed that CJ2-gD2 has certain advantages over traditional vaccines based on the replication defective virus and vaccines based on the HSV-2 subunits in protection against genital HSV-2 infection and the disease caused by it in humans.
Система включения/выключения генов Tet оператор/репрессор и рекомбинантная ДНКTet operator on / off gene system / repressor and recombinant DNA
Настоящее изобретение направлено inter alia на вирусы, содержащие гены, экспрессию которых регулируется tet-оператором и белком-репрессором. Способы, используемые для получения рекомбинантных молекул ДНК, содержащих эти элементы и последовательности ДНК, были описаны ранее (смотрите патент США № 6444871; патент США № 6251640; и патент США № 5972650), а плазмиды, содержащие индуцируемый тетрациклином переключатель транскрипции, имеются в продаже (T-RExTM производства Invitrogen, США).The present invention is directed, inter alia, to viruses containing genes whose expression is regulated by the tet operator and the repressor protein. The methods used to produce recombinant DNA molecules containing these elements and DNA sequences have been described previously (see US Patent No. 6444871; US Patent No. 6251640; and US Patent No. 5972650), and plasmids containing a tetracycline-induced transcription switch are commercially available (T-REx ™ manufactured by Invitrogen, USA).
Существенным признаком ДНК согласно настоящему изобретению является присутствие генов, функционально связанных с промотором, предпочтительно включающим TATA-элемент. Последовательность tet-оператор располагается между 6 и 24 нуклеотидом к 3'-концу от последнего нуклеотида ТАТА-элемента промотора и к 5'-концу от гена. Для блокирования транскрипции генов и разрешения репликации вируса вирус можно растить в клетках, экспрессирующих tet-репрессор. Сила, с которой tet-репрессор связывается с операторной последовательностью, увеличивается при использовании формы оператора, включающей два сайта связывания рецептора op2 (каждый сайт имеет нуклеотидную последовательность TCCCTATCAGTGATAGAGA (SEQ ID NO:1)), разделенных последовательностью длиной 2-20, предпочтительно 1-3 или 10-13 нуклеотидов. При связывании репрессора с этим оператором транскрипции ассоциированного гена не происходит, или она очень слаба. Если ДНК с такими характеристиками присутствует в клетке, также экспрессирующей тетрациклиновый репрессор, транскрипция гена, который может предотвратить вирусную инфекцию, будет блокироваться репрессором, связывающимся с оператором, и таким образом будет иметь место репликация вируса.An essential feature of the DNA of the present invention is the presence of genes operably linked to a promoter, preferably comprising a TATA element. The tet operator sequence is located between 6 and 24 nucleotides to the 3'-end of the last nucleotide of the TATA element of the promoter and to the 5'-end of the gene. To block gene transcription and allow replication of the virus, the virus can be grown in cells expressing a tet repressor. The strength with which the tet repressor binds to the operator sequence increases when using an operator form that includes two op2 receptor binding sites (each site has the nucleotide sequence TCCCTATCAGTGATAGAGA (SEQ ID NO: 1)), separated by a sequence of 2-20, preferably 1- 3 or 10-13 nucleotides. When a repressor binds to this transcription operator, the associated gene does not occur, or it is very weak. If DNA with these characteristics is present in a cell also expressing a tetracycline repressor, transcription of a gene that can prevent viral infection will be blocked by a repressor that binds to the operator, and thus virus replication will occur.
Выбор промоторов и геновThe choice of promoters and genes
Во время продуктивной инфекции экспрессию генов HSV разделяют на три основных класса в зависимости от времени экспрессии: различают предранние (α), ранние (β) и поздние (γ) гены, причем поздние гены далее разделяют на две группы, γ1 и γ2. Экспрессия предранних генов не требует синтеза вирусных белков de novo и активируется белком VP16, ассоциированным с вирионом, совместно с клеточными факторами транскрипции при попадании вирусной ДНК в ядро. Белковые продукты предранних генов обозначаются ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 и ICP47 (от infected cell polypeptides, полипептиды инфицированных клеток); промоторы этих генов предпочтительно используют для контроля экспрессии рекомбинантных генов, обсуждаемых в настоящей заявке.During a productive infection, the expression of HSV genes is divided into three main classes depending on the time of expression: early (α), early (β) and late (γ) genes are distinguished, and later genes are further divided into two groups, γ1 and γ2. The expression of early genes does not require the synthesis of de novo viral proteins and is activated by the VP16 protein associated with the virion, together with cellular transcription factors when viral DNA enters the nucleus. Protein products of the early gene are designated ICP0, ICP4, ICP22, ICP27 and ICP47 (from infected cell polypeptides, polypeptides of infected cells); the promoters of these genes are preferably used to control the expression of the recombinant genes discussed in this application.
ICP0 играет важную роль в усилении реактивации HSV из латентного состояния и дает HSV значительное преимущество в росте при низкой множественности инфекции. ICP4 представляет собой основной белковый регулятор транскрипции HSV-1, активирующий экспрессию ранних и поздних генов. ICP27 требуется для продуктивной вирусной инфекции и необходим для эффективной репликации вирусной ДНК и оптимальной экспрессии вирусных генов γ и части вирусных генов β. Считается что функция ICP47 при инфекции HSV заключается в снижении экспрессии белков основного комплекса тканевой совместимости (MHC) I класса на поверхности инфицированных клеток.ICP0 plays an important role in enhancing the reactivation of HSV from the latent state and gives HSV a significant growth advantage with low multiplicity of infection. ICP4 is the main protein transcriptional regulator of HSV-1, activating the expression of early and late genes. ICP27 is required for productive viral infection and is required for efficient replication of viral DNA and optimal expression of the viral genes γ and part of the viral genes β. It is believed that the function of ICP47 in HSV infection is to reduce the expression of proteins of the main tissue compatibility complex (MHC) class I on the surface of infected cells.
Полноразмерная последовательность геномной последовательности HSV-1 области, кодирующей UL9-C535C HSV-1, приведена на фиг.10 (SEQ ID NO:2). Из области техники известны другие последовательности, чье использование в рекомбинантных вирусах было описано ранее. Например, полноразмерная геномная последовательность HSV-1 зарегистрирована в GenBank за номером X14112. Последовательность ICP4 HSV-1 зарегистрирована в GenBank за номером Х06461; последовательность гликопротеина D HSV-1 зарегистрирована в GenBank за номером J02217; последовательность гликопротеина D HSV-2 зарегистрирована в GenBank за номером К01408; и последовательность гена UL9 HSV-1 зарегистрирована в GenBank за номером М19120 (все последовательности полностью включены в настоящую заявку путем ссылки).The full length sequence of the HSV-1 genomic sequence of the region encoding UL9-C535C HSV-1 is shown in FIG. 10 (SEQ ID NO: 2). Other sequences are known in the art whose use in recombinant viruses has been described previously. For example, the full-length genomic sequence of HSV-1 is registered in GenBank number X14112. The sequence of ICP4 HSV-1 is registered in GenBank under the number X06461; the HSV-1 glycoprotein D sequence is registered in GenBank as J02217; the HSV-2 glycoprotein D sequence is registered in GenBank as K01408; and the sequence of the UL9 HSV-1 gene is registered in GenBank under the number M19120 (all sequences are fully incorporated into this application by reference).
Включение tet-репрессора и создание вирусаTurning on the tet repressor and creating the virus
Последовательности промоторов ICP0 и ICP4 HSV, а также последовательности генов, находящихся под их эндогенным контролем, хорошо известны из уровня техники (43, 44, 56). Процедуры создания вирусных векторов, содержащих эти элементы, также были описаны ранее (смотрите опубликованную заявку на патент США № 2005-0266564). Эти промоторы не только очень активно индуцируют экспрессию генов, но сами специфически индуцируются трансактиваторным белком VP16, высвобождающимся при инфекции клетки HSV-1 или HSV-2.The sequences of the ICP0 and ICP4 HSV promoters, as well as the sequences of genes under their endogenous control, are well known in the art (43, 44, 56). Procedures for creating viral vectors containing these elements have also been described previously (see published US patent application No. 2005-0266564). These promoters not only very actively induce gene expression, but they themselves are specifically induced by the transactivator protein VP16, which is released upon infection of HSV-1 or HSV-2 cells.
После получения необходимых конструктов ДНК их можно инкорпорировать в вирус HSV-2, используя способы, хорошо известные из уровня техники (смотрите Yao et al. (68)).After obtaining the necessary DNA constructs, they can be incorporated into the HSV-2 virus using methods well known in the art (see Yao et al. (68)).
Способы иммунизацииImmunization Methods
Вирусы, описанные в настоящей заявке, используют для иммунизации пациентов, как правило, путем инъекции, в качестве вакцины. Вакцина может использоваться профилактически для предотвращения инфекции HSV-1 или HSV-2 или терапевтически для ослабления уже существующей инфекции HSV-1 или HSV-2. Для получения вакцины вирусы можно суспендировать в любом фармацевтически приемлемом растворе, включая стерильный физиологический раствор, воду, физиологический раствор на фосфатном буфере, 1,2-пропиленгликоль, полигликоли, смешанные с водой, раствор Рингера и т.д. Точное количество вводимого вируса не является решающим для изобретения, однако должно представлять собой "эффективное количество", т.е. количество, достаточное для индукции иммунологического ответа, достаточно сильного для подавления инфекции HSV. В общем, ожидается, что количество первично вводимого вируса (БОЕ) будет находиться в интервале от 1×107 до 1×1010.The viruses described herein are used to immunize patients, usually by injection, as a vaccine. The vaccine can be used prophylactically to prevent HSV-1 or HSV-2 infection, or therapeutically to attenuate an existing HSV-1 or HSV-2 infection. To obtain a vaccine, viruses can be suspended in any pharmaceutically acceptable solution, including sterile saline, water, saline on phosphate buffer, 1,2-propylene glycol, polyglycols mixed with water, Ringer's solution, etc. The exact amount of virus introduced is not critical to the invention, but should be an "effective amount", i.e. an amount sufficient to induce an immunological response strong enough to suppress HSV infection. In general, it is expected that the amount of initially introduced virus (PFU) will be in the range from 1 × 10 7 to 1 × 10 10 .
Эффективность дозировки, а также общую эффективность лечения можно оценить, используя стандартные иммунологические способы тестирования на присутствие антител, эффективно борющихся с HSV. Иммунологические инъекции можно повторять требуемое количество раз.Dosage efficacy as well as overall treatment efficacy can be assessed using standard immunological testing methods for the presence of antibodies that effectively combat HSV. Immunological injections can be repeated as many times as needed.
ПримерыExamples
В настоящем примере описывается создание рекомбинантного вируса HSV-2 и тесты на определение его иммунологических эффектов.This example describes the creation of a recombinant HSV-2 virus and tests to determine its immunological effects.
1. Материалы и способы1. Materials and methods
КлеткиCells
Клетки почки африканской зеленой мартышки (Vero) и клетки линии остеосаркомы U2OS культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, производство Sigma Aldrich) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в присутствии 100 ед/мл пенициллина G и 100 мкг/мл стрептомицина сульфата (GIBCO, Карлсбад, штат Калифорния, США) (71). Клетки U2OS способны к функциональной комплементации делеции ICP0 HSV-1 (71). Клетки U2CEP4R11, которые представляют собой клетки U2OS, экспрессирующие tetR, культивировали в DMEM с добавлением 10% FBS и гигромицина B в концентрации 50 мкг/мл (73). Клетки VCEP4R-28, представляющие собой клетки Vero, экспрессирующие tetR, культивировали в DMEM с добавлением 10% FBS и гигромицина B в концентрации 50 мкг/мл (73).African green monkey (Vero) kidney cells and U2OS osteosarcoma cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, manufactured by Sigma Aldrich) supplemented with 10% fetal calf serum (FBS) in the presence of 100 units / ml penicillin G and 100 μg / ml streptomycin sulfate (GIBCO, Carlsbad, California, USA) (71). U2OS cells are capable of functional complementation of the ICP0 HSV-1 deletion (71). U2CEP4R11 cells, which are U2OS cells expressing tetR, were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and hygromycin B at a concentration of 50 μg / ml (73). VCEP4R-28 cells, which are Vero cells expressing tetR, were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and hygromycin B at a concentration of 50 μg / ml (73).
ПлазмидыPlasmids
Плазмида pHSV2/ICP0 представляет собой производную плазмиды pUC19, кодирующую последовательности ICP0 HSV-2, амплифицированные с помощью PCR, от 268 п.н. выше открытой рамки считывания (ORF) ICP0 до 40 п.н. ниже сигнала полиаденилирования последовательностей, кодирующих ICP0. pHSV2.ICP0-V представляет собой плазмиду, клонирующую ICP0 HSV-2, полученную из плазмиды pHSV-2/ICP0 путем замены фрагмента ДНК Xho I-ICP0, содержащего последовательности от 25 п.н. выше кодона инициации ICP0 до 397 п.н. выше стоп-кодона ORF ICP0, на множественную клонирующую последовательность (MCS), содержащую Xho I. Плазмида pHSV2.ICP0-lacZ была получена путем вставки фрагмента HindIII-Not I-, содержащего ген LacZ pcDNA3-lacZ, в pHSV2.ICP0-V по сайтам Hind III-Not I. Плазмида pcmvtetO-UL9C535C представляет собой плазмиду, кодирующую UL9-C535C под контролем предраннего промотора hCMV, содержащего tetO (68). Плазмиду p02lacZ-TOC535C, экспрессирующую UL9-С535С под контролем основного предраннего промотора hCMV, содержащего tetO (фиг.1А), конструировали путем замены фрагмента pHSV2.ICP0-lacZ EcoR I/Age I, содержащего lacZ, на фрагмент pcmvtetOUL9-C535C EcoR I/Hind III, содержащий hcmvtetO-UL9C535C (69).Plasmid pHSV2 / ICP0 is a derivative of plasmid pUC19 encoding the ICP0 HSV-2 sequences amplified by PCR from 268 bp above open reading frame (ORF) ICP0 up to 40 bp below the polyadenylation signal of sequences encoding ICP0. pHSV2.ICP0-V is a plasmid cloning ICP0 HSV-2 obtained from plasmid pHSV-2 / ICP0 by replacing the Xho I-ICP0 DNA fragment containing sequences of 25 bp above the initiation codon ICP0 to 397 bp above the ORF ICP0 stop codon, to a multiple cloning sequence (MCS) containing Xho I. The plasmid pHSV2.ICP0-lacZ was obtained by inserting the HindIII-Not I- fragment containing the LacZ pcDNA3-lacZ gene into pHSV2.ICP0-V according to Hind III-Not I. sites. Plasmid pcmvtetO-UL9C535C is a plasmid encoding UL9-C535C under the control of the hCMV early promoter containing tetO (68). Plasmid p02lacZ-TOC535C expressing UL9-C535C under the control of the hCMV primary early promoter containing tetO (Fig. 1A) was constructed by replacing the pHSV2.ICP0-lacZ EcoR I / Age I fragment containing lacZ with the pcmvtetOUL9-C535C Eco fragment Hind III containing hcmvtetO-UL9C535C (69).
pAzgD-HSV-2 представляет собой плазмиду, кодирующую gD2 HSV-2, любезно предоставленную д-ром Patricia Spear (Northwestern University). pICP4TO-hEGF экспрессирует человеческий эпидермальный фактор роста под контролем предраннего промотора ICP4 HSV-1, несущего tetO, состоящего из последовательности промотора ICP4 HSV-1 от -377 п.н. до -19 п.н. относительно сайта начала транскрипции гена ICP4. Также, как и основной предранний промотор hCMV, несущий tetO, в плазмиде pcmvtetO-hEGF (73), промотор ICP4, содержащий tetO, включает две тандемные копии tet-операторов на 10 п.н. выше ТАТА-элемента ICP4, TATATGA. Таким образом, как и pcmvtetO-hEGF, pICP4TO-hEGF можно жестко регулировать с помощью тетрациклина в присутствии tetR, но вставка tetO не оказывает никакого влияния на активность промотора ICP4 в отсутствие tetR. Промотор ICP4, несущий tetO, в pICP4TO-hEGF имеет еще одно уникальное свойство - у него отсутствует ДНК-связывающая последовательность ICP4 (ATCGTCCACACGGAG (SEQ ID NO:3), включающая сайт инициации транскрипции гена ICP4 (51) в промоторе ICP4 дикого типа. Таким образом, в отличие от промотора ICP4 дикого типа, авто-регулирующегося ICP4 (16, 57), промотор ICP4, несущий tetO, в pICP4TO-hEGF не супрессируется основным регуляторным белком HSV-1 ICP4.pAzgD-HSV-2 is a plasmid encoding gD2 HSV-2, kindly provided by Dr. Patricia Spear (Northwestern University). pICP4TO-hEGF expresses human epidermal growth factor under the control of the early early promoter ICP4 HSV-1 carrying tetO, consisting of the sequence of the ICP4 HSV-1 promoter from -377 bp up to -19 bp relative to the start site of transcription of the ICP4 gene. As well as the main early hCMV promoter carrying tetO in plasmid pcmvtetO-hEGF (73), the ICP4 promoter containing tetO includes two tandem copies of 10 bp tet operators. above the TATA element ICP4, TATATGA. Thus, like pcmvtetO-hEGF, pICP4TO-hEGF can be tightly regulated with tetracycline in the presence of tetR, but the tetO insert has no effect on the activity of the ICP4 promoter in the absence of tetR. The ICP4 promoter carrying tetO in pICP4TO-hEGF has another unique property - it lacks the DNA-binding sequence ICP4 (ATCGTCCACACGGAG (SEQ ID NO: 3), including the ICP4 gene transcription initiation site (51) in the wild-type ICP4 promoter. Thus, unlike the wild-type ICP4 promoter, auto-regulatory ICP4 (16, 57), the ICP4 promoter carrying tetO in pICP4TO-hEGF is not suppressed by the main regulatory protein HSV-1 ICP4.
Чтобы клонировать gD2 под контроль промотора ICP4, содержащего tetO, заявители вначале сконструировали плазмиду p02ICP4-TO путем клонирования Sma I-Bam HI промотора ICP4, содержащего tetO, из pICP4TO-hEGF в pHSV2.ICP0-V в MCS вектора. p02.4TO-gD2 представляет собой плазмиду, производную p02ICP4-TO, кодирующую ген gD2 pAzgD-HSV-2 под контролем промотора ICP4, содержащего tetO.In order to clone gD2 under the control of the ICP4 promoter containing tetO, the applicants first constructed the plasmid p02ICP4-TO by cloning the Sma I-Bam HI promoter of ICP4 containing tetO from pICP4TO-hEGF in pHSV2.ICP0-V in the MCS vector. p02.4TO-gD2 is a plasmid derived p02ICP4-TO encoding the gD2 gene pAzgD-HSV-2 under the control of the ICP4 promoter containing tetO.
p02lacZTO-gD2.С535С, плазмиду, кодирующую UL9-C535C под контролем предраннего промотора hCMV, содержащего tetO, с 5'-укорочением на -236 п.н. от промотора hCMV, и ген gD2 под контролем промотора tetO-ICP4 (фиг.1А), получали путем замены фрагмента SnaB I/Pst I p02lacZTO-С535С на фрагмент Hind III/Pst I p02.4TO-gD2, содержащий gD2. В p02lacZTO-gD2.С535С транскрипция гена UL9-С535С и гена gD2 происходит в противоположных направлениях.p02lacZTO-gD2.C535C, a plasmid encoding UL9-C535C under the control of the hCMV early promoter containing tetO, with a 5'-shortening of -236 bp from the hCMV promoter, and the gD2 gene under the control of the tetO-ICP4 promoter (Fig. 1A) was obtained by replacing the SnaB I / Pst I p02lacZTO-C535C fragment with the Hind III / Pst I p02.4TO-gD2 fragment containing gD2. In p02lacZTO-gD2. C535C, transcription of the UL9-C535C gene and the gD2 gene occurs in opposite directions.
ВирусыViruses
HSV-2 дикого типа штаммов 186 и G размножали и оценивали по бляшкам на клетках Vero. N2-lacZ представляет собой мутант HSV-2 ICP0 null, кодирующий ген Lac Z под контролем промотора ICP0 HSV-2, где обе копии гена ICP0 заменены на ген Lac Z в pHSV2.ICP0-lacZ путем гомологичной рекомбинации с помощью трансфекции клеток U2OS линеаризованной Nhe I pHSV2.ICP0-lacZ и последующей суперинфекцией HSV-2 как описано ранее (74). Замену гена ICP0 на ген Lac Z в локусе ICP0 подтверждали с помощью PCR-анализа ДНК вируса N2-lacZ с праймерами, фланкирующими ген ICP0, и праймерами, специфичными для гена lac Z (41, 74).Wild-type HSV-2 strains 186 and G were propagated and evaluated by plaques on Vero cells. N2-lacZ is a HSV-2 ICP0 null mutant encoding the Lac Z gene under the control of the ICP0 HSV-2 promoter, where both copies of the ICP0 gene are replaced with the Lac Z gene in pHSV2.ICP0-lacZ by homologous recombination by transfection of linearized Nhe U2OS cells I pHSV2.ICP0-lacZ and subsequent superinfection of HSV-2 as previously described (74). The replacement of the ICP0 gene with the Lac Z gene at the ICP0 locus was confirmed by PCR analysis of N2-lacZ virus DNA with primers flanking the ICP0 gene and primers specific for the lac Z gene (41, 74).
N2-C535C представляет собой производное N2-lacZ, где обе копии гена Lac Z заменены на последовательности ДНК, кодирующие UL9-C535C под контролем промотора hCMV, содержащего tetO, в плазмиде p02lacZ-TOC535C (фиг.1В). Вкратце, клетки U2CEP4R11 ко-трансфецировали линеаризованной p02lacZ-TOC535C и инфекционной ДНК вируса N2-lacZ с помощью Lipofectamine 2000. Трансфицированные клетки скринировали на рекомбинационную замену генов lacZ N2-lacZ на последовательность ДНК, содержащую cmvtetOUL9-C535C с помощью стандартных тестов на образование бляшек. Бляшки окрашивали 5-бром-4-хлор-3-индолил-b-D-галактопиранозидом (X-Gal) через 96 часов после инфекции. Выделяли белые бляшки, означающие замену обеих копий гена lacZ на последовательность ДНК, кодирующую UL9-C535C. Через четыре раунда очистки бляшек удалось получить один изолят, обозначенный N2-C535C, дающий однородные белые бляшки.N2-C535C is an N2-lacZ derivative where both copies of the Lac Z gene are replaced by DNA sequences encoding UL9-C535C under the control of the hCMV promoter containing tetO in plasmid p02lacZ-TOC535C (Fig. 1B). Briefly, U2CEP4R11 cells were co-transfected with linearized p02lacZ-TOC535C and infectious N2-lacZ virus
CJ2-gD2 конструировали путем замены обеих копий гена Lac Z в локусе ICP0 в N2-lacZ на последовательности ДНК, кодирующие UL9-C535C под основным предранним промотором hCMV, несущим tetO, и gD2 под контролем промотора ICP4 HSV-1, содержащим tetO (фиг.1В), который состоит из последовательности промотора ICP4 HSV-1 от -377 п.н. до -19 п.н. относительно сайта начала транскрипции гена ICP4 (71).CJ2-gD2 was constructed by replacing both copies of the Lac Z gene at the ICP0 locus in N2-lacZ with DNA sequences encoding UL9-C535C under the main early hCMV promoter carrying tetO and gD2 under the control of the ICP4 HSV-1 promoter containing tetO (Fig. 1B), which consists of the sequence of the promoter ICP4 HSV-1 from -377 bp up to -19 bp relative to the start site of transcription of the ICP4 gene (71).
SDS-PAGE и Вестерн-блот-анализSDS-PAGE and Western Blot Analysis
Клетки Vero, рассаженные в 60-мм чашки в количестве 7,5×105 клеток на чашку, не инфицировали или инфицировали указанными вирусами со множественностью инфекции 10 БОЕ на клетку. Экстракты клеток готовили через 9 ч или 16 после инфекции (72). Белки экстрактов клеток разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) (9% акриламида), переносили на поливинилиден-дифторидные (PVDF) мембраны и детектировали с помощью поликлональных антител к gD HSV-1 (R54, любезно предоставлены д-рами Gary H. Cohen и Roselyn J Eisenberg), UL9 (любезно предоставлены Mark Challberg) или моноклональными антителами, специфичными к ICP27 и gB (Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, штат Калифорния, США).Vero cells seated in a 60 mm dish in an amount of 7.5 × 10 5 cells per dish did not or are infected with the indicated viruses with a multiplicity of infection of 10 PFU per cell. Cell extracts were prepared 9 hours or 16 after infection (72). Proteins of cell extracts were separated by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) (9% acrylamide), transferred to polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes and detected using polyclonal antibodies to gD HSV-1 (R54, kindly provided Dr. Gary H. Cohen and Roselyn J Eisenberg), UL9 (courtesy of Mark Challberg), or monoclonal antibodies specific for ICP27 and gB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA).
МышиMice
Самок мышей BALB/c в возрасте 4-6 недель приобретали у Charles River Laboratories (Уилмингтон, штат Массачусетс, США). Мышей содержали в металлических клетках по 4 мыши на клетку в условиях 12-часового цикла свет/темнота. Мыши акклиматизировались к условиям содержания в течение 1 недели до начала эксперимента. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с протоколом, одобренным постоянным комитетом по животным Harvard Medical Area и Американской ассоциацией ветеринарных врачей.Female 4-6 week old BALB / c mice were purchased from Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, USA). Mice were kept in metal cages, 4 mice per cell under a 12-hour light / dark cycle. The mice acclimatized to the conditions for 1 week before the start of the experiment. All animal experiments were performed according to a protocol approved by the Harvard Medical Area Standing Committee on Animals and the American Association of Veterinarians.
Иммунизация и нагрузкиImmunization and burden
Мышей BALB/c случайным образом распределяли по нескольким группам. Животным выстригали шерсть на левом боку. Мышей вакцинировали 2×106 БОЕ на мышь CJ2-gD2, N2-C535C, CJ9-gD или вводили DMEM в объеме 30 мкл под кожу левого бока сзади с использованием 1-мл шприца и иглы 27G. Мышей вторично иммунизировали через 2 недели и нагружали HSV-2 дикого типа штамма G через 3 недели после вторичной иммунизации. За 5 дней до нагрузки мышам инъецировали подкожно в загривок медроксипрогестерон (SICOR Pharmaceuticals, Inc., Ирвин, штат Калифорния, США) в количестве 3 мг на мышь в объеме 20 мкл (7, 50). Для интравагинальной нагрузки мышей всех групп анестезировали, наносили альгинат кальция с помощью стерильного уретро-генитального аппликатора с альгинатом кальция производства Puritan Medical Products company LLC, Гилфорд, штат Мэн, США) и прививали интравагинально по 20 мкл культуральной среды, содержащей 5×105 БОЕ (50 LD50) HSV-2 штамма G (50). Животные оставались под анестезией в положении на спине с приподнятым задним концом тела в течение 30-45 минут после инфекции.BALB / c mice were randomly assigned to several groups. The animals were trimmed with wool on their left side. Mice were vaccinated with 2 × 10 6 PFU per mouse CJ2-gD2, N2-C535C, CJ9-gD or DMEM was injected in a volume of 30 μl under the skin of the left side from behind using a 1-ml syringe and a 27G needle. Mice were immunized a second time after 2 weeks and loaded with wild-type strain G HSV-2 3 weeks after secondary immunization. 5 days before the load, mice were injected subcutaneously in the scruff of medroxyprogesterone (SICOR Pharmaceuticals, Inc., Irwin, California, USA) in an amount of 3 mg per mouse in a volume of 20 μl (7, 50). For intravaginal loading, mice of all groups were anesthetized, calcium alginate was applied using a sterile urethro-genital calcium alginate applicator (Puritan Medical Products company LLC, Guildford, Maine, USA) and inoculated intravaginally with 20 μl of culture medium containing 5 × 10 5 PFU (50 LD 50 ) HSV-2 strain G (50). Animals remained under anesthesia in a supine position with a raised rear end of the body for 30-45 minutes after infection.
Анализ острой инфекции и клинические наблюденияAcute infection analysis and clinical observations
На 1, 2, 3, 5 и 7 день после нагрузки брали мазок слизистой оболочки влагалища с альгинатом кальция (7). Инфекционность вирусов в материале мазков оценивали с помощью стандартного теста на образования бляшек на монослое клеток Vero. После нагрузки HSV-2 дикого типа у мышей в течение 21-дневного срока наблюдали частоту возникновения генитальных язв и системного заболевания. Для оценки тяжести заболевания использовали следующую шкалу: 0 = признаки герпетической инфекции не выражены, 1 = легкое покраснение и отек гениталий, 2 = умеренное воспаление гениталий, 3 = гнойные язвы гениталий и/или системное заболевание, 4 = паралич задних конечностей, 5 = гибель (8, 50).On
Детекция нейтрализующих антител, специфичных к HSV-2Detection of neutralizing antibodies specific for HSV-2
Через 4 недели после первичной иммунизации у иммунизированных и контрольных мышей забирали кровь из хвостовой вены. Титры нейтрализующих антител в сыворотке крови определяли как описано ранее в присутствии комплемента (5-7) с 250 БОЕ HSV-2 дикого типа штамма 186. Титр нейтрализующих антител выражался в виде конечного серийного разведения, достаточного для снижения БОЕ HSV на 50% относительно БОЕ HSV, полученного в среде с комплементом.4 weeks after the primary immunization, blood was taken from the tail vein from immunized and control mice. Serum neutralizing antibody titers were determined as described previously in the presence of complement (5-7) with 250 PFU HSV-2 wild-type strain 186. The neutralizing antibody titer was expressed as a final serial dilution sufficient to reduce HSV PFU by 50% relative to HSV PFU obtained in a complement environment.
ИммунопреципитацияImmunoprecipitation
Клетки U2OS рассаживали в количестве 7,5×106 клеток на 100-мм чашку и трансфицировали 10 мкг p02.4TO-gD с помощью Lipofectamine 2000 через 24 часа после рассадки. Экстракты клеток готовили через 48 часов после трансфекции (72). Иммунопреципитации проводили путем смешивания 10 мкл объединенной сыворотки, забранной у контрольных и иммунизированных мышей, с 70 мкл вышеописанных экстрактов клеток. Комплексы gD со специфическим мышиными IgG преципитировали с помощью белка А (Pierce Classic IP kit производства Pierce Biotechnilogy, Рокфорд, штат Иллинойс, США), разделяли с помощью SDS-PAGE и детектировали с помощью поликлональных кроличьих антител к gD, R45 и далее с помощью реакции с козьими антителами к IgG кролика, конъюгированными с HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, штат Калифорния, США).U2OS cells were seeded at 7.5 × 10 6 cells per 100 mm plate and transfected with 10 μg p02.4TO-
Тест IFNγ-ELISPOTIFNγ-ELISPOT Test
Самок мышей BALB/c иммунизировали CJ2-gD2 в дозировке 2×106 БОЕ на мышь или вводили DMEM дважды с промежутком в 2 недели. Через 5-10 недель после второй иммунизации контрольных и иммунизированных CJ2-gD2 мышей нагружали HSV-2 дикого типа штамма 186 подкожно в дозировке 1×104 БОЕ на мышь или ставили контроль нагрузки. У отдельных групп мышей (n=3) выделяли спленоциты на 4 или 5 день после нагрузки. Реакцию ELISPOT на клетках CD4+ и CD8+ проводили как описано ранее (42). Вкратце, CD4+ и CD8+ Т-клетки выделяли из спленоцитов с использованием набора реагентов Dynal для выделения мышиных CD4- и CD8- и рассаживали в 96-луночный фильтрационный планшет, предварительно покрытый моноклональными антителами, специфичными к мышиному IFNγ (AN18) в количестве 7,5×104 или 1,5×105 на лунку. Эксперимент повторяли четыре раза. После инкубации при 37ºC в течение 20 ч планшеты промывали, добавляли биотинилированные моноклональные антитела, специфичные к IFNγ (R4-6A2 производства Mabtech) при комнатной температуре и инкубировали со стрептавидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Mabtech). Клетки, образующие пятна IFNγ, детектировали путем добавления субстрата BCIP/NBT. Пятна подсчитывали под препаровальной лупой; число клеток, образующих пятна IFNγ (SFC) выражали в виде среднего ± стандартная ошибка среднего на миллион CD4+ или CD8+ Т-клеток.Female BALB / c mice were immunized with CJ2-gD2 at a dose of 2 × 10 6 PFU per mouse or DMEM was administered twice with an interval of 2 weeks. 5-10 weeks after the second immunization of control and immunized CJ2-gD2 mice, wild-type HSV-2 strain 186 was loaded subcutaneously at a dose of 1 × 10 4 PFU per mouse or load control was set. In separate groups of mice (n = 3) splenocytes were isolated on 4 or 5 days after exercise. The ELISPOT reaction on CD4 + and CD8 + cells was carried out as described previously (42). Briefly, CD4 + and CD8 + T cells were isolated from splenocytes using the Dynal reagent kit to isolate murine CD4- and CD8- and plated in a 96-well filter plate precoated with murine IFNγ specific antibodies (AN18) in an amount of 7 , 5 × 10 4 or 1.5 × 10 5 per well. The experiment was repeated four times. After incubation at 37 ° C for 20 hours, the plates were washed, biotinylated monoclonal antibodies specific for IFNγ (R4-6A2 manufactured by Mabtech) were added at room temperature and incubated with streptavidin conjugated with alkaline phosphatase (Mabtech). IFNγ stain cells were detected by the addition of a BCIP / NBT substrate. Spots were counted under a dissecting magnifier; the number of cells forming IFNγ spots (SFC) was expressed as mean ± standard error of the mean of a million CD4 + or CD8 + T cells.
Количественная PCR в реальном времениReal-time quantitative PCR
Через 16 дней после вторичной иммунизации или через 21 день после интравагинальной нагрузки 5×105 БОЕ HSV-2 штамма G у 9 или 10 мышей, иммунизированных CJ2-gD2 или CJ9-gD, забирали нижнюю поясничную и копчиковую часть позвоночника, включая спинной мозг и дорсальные корешковые ганглии. Позвоночник разрезали на 4 части, части помещали по отдельности в 0,5 мл нормальной питательной среды и замораживали при -80ºС для дальнейшей обработки. Тотальную ДНК выделяли из каждого дорсального корешкового ганглия с использованием набора реагентов Dneasy tissue kit (Quiagen, Санта-Кларита, штат Калифорния, США) и суспендировали в 400 мкл буфера АЕ. Присутствие ДНК HSV-2 определяли с помощью количественного PCR в реальном времени (система RT-PCR Applied Biosystems 7300), с использованием 100 нг ДНК ганглиев и праймеры, специфичные для ДНК-полимеразы HSV (прямой: 5' GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C (SEQ ID NO:4), обратный: 5' CGG GGC GCT CGG CTA AC (SEQ ID NO:5)), как описано ранее (8). Минимальное количество достоверно определяемых копий вирусной ДНК HSV-2 составляло 1 копию на реакцию.16 days after secondary immunization or 21 days after intravaginal loading of 5 × 10 5 PFU of HSV-2 strain G in 9 or 10 mice immunized with CJ2-gD2 or CJ9-gD, the lower lumbar and coccygeal parts of the spine, including the spinal cord and dorsal radicular ganglia. The spine was cut into 4 parts, the parts were placed individually in 0.5 ml of normal nutrient medium and frozen at -80 ° C for further processing. Total DNA was isolated from each dorsal radicular ganglion using the Dneasy tissue kit reagent kit (Quiagen, Santa Clarita, California, USA) and suspended in 400 μl of AE buffer. The presence of HSV-2 DNA was determined by real-time quantitative PCR (Applied Biosystems 7300 RT-PCR system) using 100 ng ganglia DNA and primers specific for HSV DNA polymerase (direct: 5 'GCT CGA GTG CGA AAA AAC GTT C (SEQ ID NO: 4), reverse: 5 'CGG GGC GCT CGG CTA AC (SEQ ID NO: 5)) as previously described (8). The minimum number of reliably detectable copies of HSV-2 viral DNA was 1 copy per reaction.
Статистический анализStatistical analysis
Для статистического анализа применяли непарные t-тесты Стьюдента. Результаты считались статистически значимыми при значении P<0,05.For statistical analysis, unpaired student t-tests were used. The results were considered statistically significant at a value of P <0.05.
II. РезультатыII. results
Конструирование CJ2-gD2Construction of the CJ2-gD2
В качестве первого шага в создании доминантно-негативного дефектного по репликации рекомбинантного вируса HSV-2, экспрессирующего gD2 и UL9-C535C, заявители сконструировали делеционный мутант HSV-2 ICP0, N2-lacZ, в котором обе копии ICP0 HSV-2 штамма 186 заменены на ген LacZ под контролем промотора HSV-2 ICP0 (фиг.1В). Заявители показали, что, как и у мутанта HSV-2 ICP0 null 7314 (11), эффективность образования бляшек N2-lacZ на клетках остеосаркомы человека U2OS в 425 раз выше чем на клетках Vero, что указывает на то, что клеточная активность в клетках U2OS может функционально замещать ICP0 HSV-2. По сравнению с HSV-2 дикого типа, эффективность репликации N2-lacZ в клетках Vero ослаблена в более, чем 600 раз при множественности инфекции 0,1 БОЕ на клетку. В соответствии с этим наблюдением, интравагинальная прививка N2-lacZ в количестве 1×105 и 5×105 БОЕ на мышь не приводила к системному или локальному заболеванию, в то время как у мышей, инфицированных 1×104 БОЕ на мышь HSV-2 дикого типа развился тяжелый генитальный герпес, приведший к гибели всех животных через 11 дней после инфекции. Кроме того, после интравагинальной инфекции N2-lacZ в дозировке 5×105 БОЕ на мышь у животных не развивается реактивируемая латентная инфекция. Эти результаты указывают на то, что так же, как и у ICP0 HSV-1 (10, 11, 37, 64), делеция ICP0 HSV-2 значительно ослабляет способность вируса вызывать острую и реактивируемую латентную инфекцию in vivo.As a first step in creating a dominant negative replication defective recombinant HSV-2 virus expressing gD2 and UL9-C535C, the applicants constructed a deletion mutant HSV-2 ICP0, N2-lacZ, in which both copies of ICP0 HSV-2 strain 186 were replaced by the LacZ gene under the control of the HSV-2 ICP0 promoter (Fig. 1B). The applicants showed that, like the HSV-2 mutant ICP0 null 7314 (11), the efficiency of N2-lacZ plaque formation on U2OS human osteosarcoma cells is 425 times higher than on Vero cells, which indicates that cellular activity in U2OS cells can functionally replace ICP0 HSV-2. Compared to wild-type HSV-2, the efficiency of N2-lacZ replication in Vero cells is weakened by more than 600 times with a multiplicity of infection of 0.1 PFU per cell. According to this observation, intravaginal inoculation of N2-lacZ in the amount of 1 × 10 5 and 5 × 10 5 PFU per mouse did not lead to systemic or local disease, while in mice infected with 1 × 10 4 PFU per mouse HSV- 2 wild-type severe genital herpes developed, leading to the death of all
Для повышения уровня экспрессии gD2 доминантно-негативным дефектным по репликации рекомбинантным вирусом HSV-2 заявители сконструировали доминантно-негативный дефектный по репликации рекомбинант HSV-2 (CJ2-gD2) путем замены обеих копий гена Lac Z у N2-lacZ на последовательности ДНК, кодирующие ген gD2 под контролем основного предраннего промотора ICP4 HSV-1, несущего tetO, и UL9-C535C под контролем основного предраннего промотора hCMV, содержащего tetO, укороченного на -236 п.н. от полной длины предраннего промотора hCMV (фиг.1В). Таким образом, в отличие от CJ9-gD, кодирующего одну копию вставленного гена gD HSV-1 под контролем промотора hCMV, содержащего tetO, в локусе UL9 HSV-1 (41), CJ2-gD2 содержит 2 копии гена gD2 под контролем предраннего промотора ICP4 HSV-1, несущего tetO, состоящего из последовательности промотора ICP4 HSV-1 от -377 п.н. до -19 п.н. относительно сайта начала транскрипции гена ICP4. N2-C535C представляет собой рекомбинант HSV-2, у которого обе копии гена Lac Z у N2-lacZ заменены на UL9-C535C под контролем полноразмерного предраннего промотора hCMV, несущего tetO.To increase the level of gD2 expression by a dominant negative replication defective recombinant HSV-2 virus, the applicants constructed a dominant negative replication defective defective recombinant HSV-2 (CJ2-gD2) by replacing both copies of the Lac Z gene in N2-lacZ with DNA sequences encoding the gene gD2 under the control of the main early early promoter ICP4 HSV-1 carrying tetO, and UL9-C535C under the control of the main early early promoter hCMV containing tetO, shortened by -236 bp from the full length of the hCMV early early promoter (FIG. 1B). Thus, unlike CJ9-gD, which encodes one copy of the inserted gD HSV-1 gene under the control of the hCMV promoter containing tetO at the UL9 HSV-1 locus (41), CJ2-gD2 contains 2 copies of the gD2 gene under the control of the early promoter ICP4 HSV-1 carrying tetO, consisting of the sequence of the ICP4 promoter HSV-1 from -377 bp up to -19 bp relative to the start site of transcription of the ICP4 gene. N2-C535C is an HSV-2 recombinant in which both copies of the Lac Z gene in N2-lacZ are replaced by UL9-C535C under the control of the full-length hCMV early promoter carrying tetO.
Высокий уровень экспрессии gD2 и UL9-C535C при инфекции клеток Vero CJ2-gD2High expression of gD2 and UL9-C535C in Vero CJ2-gD2 cell infections
Для проверки экспрессии gD2 и UL9-C535C с предраннего промотора ICP4 HSV-1, несущего tetO, и предраннего промотора hCMV, соответственно, клетки Vero инфицировали HSV-2 дикого типа, N2-lacZ, N2-C535C и CJ2-gD2 при множественности инфекции 10 БОЕ на клетку и собирали через 9 ч после инфекции. Белки инфицированных клеток анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител к ICP27 HSV-1/2, поликлональных антител к UL9 и поликлональных антител к gD1 (R45). Поскольку gB2, как и gD2, является основной мишенью нейтрализующих антител, а также Т-клеточных ответов, и представляет собой продукт γ1, белки инфицированных клеток также инкубировали с моноклональными антителами, специфичными к gB. На фиг.2А показано, что уровень экспрессии предраннего белка ICP27 HSV-2 CJ2-gD2 и N2-C535C сходен с таковым HSV-2 дикого типа и N2-lacZ. В клетках, инфицированных CJ2-gD2 и N2-C535C, обнаруживали значительное количество UL9-C535C, однако в то же время в клетках, инфицированных N2-C535C, обнаружили малое количество gD2 или gB2. В отличие от инфекции N2-C535C, инфекция клеток Vero CJ2-gD2 ведет к высокому уровню экспрессии gD2, сходному с таковым в клетках, инфицированных HSV-2 дикого типа, и экспрессия gD2 не влияла на экспрессию gB2. Из приведенных результатов также следует, что также, как и в случае мутанта HSV-1 ICP0 null 7134 (71), делеция ICP0 HSV-2 в N2-lacZ значительно ослабляет экспрессию gD2. Из-за очень низкого уровня экспрессии UL9 со своего собственного раннего промотора HSV (68), в клетках, инфицированных этими четырьмя вирусами, не удалось обнаружить UL9 дикого типа. Кроме того, заявители показали, что уровень экспрессии UL9-С535С в клетках, инфицированных CJ2-gD2, был неизменно выше, чем в клетках, инфицированных N2-C535C, что позволяет предположить, что VP16-респонсивные элементы HSV, TAATGARAT, присутствующие в промоторе ICP4 HSV-1 (71) могут приводить к повышенной экспрессии UL9-C535C с предраннего промотора hCMV в описанной промоторной системе ICP4/hCMV.To verify the expression of gD2 and UL9-C535C from the early early promoter ICP4 HSV-1 carrying tetO and the early early hCMV promoter, respectively, Vero cells infected wild-type HSV-2, N2-lacZ, N2-C535C and CJ2-gD2 with a multiplicity of infection 10 PFU per cell and collected 9 hours after infection. Proteins of infected cells were analyzed by Western blotting using monoclonal antibodies to ICP27 HSV-1/2, polyclonal antibodies to UL9 and polyclonal antibodies to gD1 (R45). Since gB2, like gD2, is the main target of neutralizing antibodies, as well as T-cell responses, and is a product of γ1, proteins of infected cells were also incubated with monoclonal antibodies specific for gB. On figa shows that the expression level of the early protein ICP27 HSV-2 CJ2-gD2 and N2-C535C is similar to that of wild-type HSV-2 and N2-lacZ. A significant amount of UL9-C535C was detected in cells infected with CJ2-gD2 and N2-C535C, however, at the same time, a small amount of gD2 or gB2 was found in cells infected with N2-C535C. Unlike N2-C535C infection, Vero CJ2-gD2 cell infection leads to a high level of gD2 expression similar to that in wild-type HSV-2 infected cells, and gD2 expression did not affect gB2 expression. The results also show that, as in the case of the HSV-1 mutant ICP0 null 7134 (71), deletion of ICP0 HSV-2 in N2-lacZ significantly attenuates the expression of gD2. Due to the very low level of UL9 expression from its own early HSV promoter (68), wild-type UL9 was not detected in cells infected with these four viruses. In addition, the applicants showed that the level of expression of UL9-C535C in cells infected with CJ2-gD2 was consistently higher than in cells infected with N2-C535C, suggesting that VP16-responsive elements of HSV, TAATGARAT, present in the ICP4 promoter HSV-1 (71) can lead to increased expression of UL9-C535C from the early hCMV promoter in the described ICP4 / hCMV promoter system.
Вестерн-блот анализ с использованием поликлональных антител к gD1 (R45), результаты которого приведены на фиг.2В, показал, что в клетках, инфицированных HSV-1 дикого типа, был обнаружен гораздо более высокий уровень gD, чем в клетках, инфицированных HSV-2 дикого типа, а уровень gD, обнаруживаемый в клетках, инфицированных CJ9-gD, был гораздо ниже, чем в клетках, инфицированных CJ2-gD2. Это факты говорят о том, что CJ2-gD2 экспрессирует gD2 более эффективно, чем CJ9-gD экспрессирует gD1.Western blot analysis using polyclonal antibodies to gD1 (R45), the results of which are shown in Fig.2B, showed that in cells infected with wild-type HSV-1, a much higher level of gD was detected than in cells infected with HSV- 2 wild type, and the level of gD found in cells infected with CJ9-gD was much lower than in cells infected with CJ2-gD2. These facts suggest that CJ2-gD2 expresses gD2 more efficiently than CJ9-gD expresses gD1.
Чтобы показать, что UL9-C535C и gD2, экспрессируемые в клетках Vero, инфицированных CJ2-gD2, действительно находятся под контролем промоторов, несущих tetO, далее заявители инфицировали стабильную линию клеток Vero, экспрессирующих tetR, VCEP4R-28, HSV-2 дикого типа и CJ2-gD2 при множественности инфекции 10 БОЕ на клетку в присутствии или в отсутствие тетрациклина. Белки инфицированных клеток собирали через 9 часов после инфекции и анализировали с помощью Вестерн-блота. Как показано на фиг.3, в клетках VCEP4R-28, инфицированных HSV-2 дикого типа и CJ2-gD2, в присутствии и в отсутствие тетрациклина выявлялись сходные уровни ICP27, в то время как в клетках VCEP4R-28, инфицированных CJ2-gD2, UL9-C535C выявлялся только в присутствии тетрациклина, и также в присутствии тетрациклина выявлялись значительно более высокие уровни gD2, чем в его отсутствие.To show that the UL9-C535C and gD2 expressed in Vero cells infected with CJ2-gD2 are indeed controlled by promoters carrying tetO, the applicants further infected a stable line of Vero cells expressing wild-type tetR, VCEP4R-28, HSV-2 and CJ2-gD2 with a multiplicity of infection of 10 PFU per cell in the presence or absence of tetracycline. Proteins of infected cells were collected 9 hours after infection and analyzed using Western blot. As shown in FIG. 3, similar levels of ICP27 were detected in VCEP4R-28 cells infected with wild-type HSV-2 and CJ2-gD2 in the presence and absence of tetracycline, while in VCEP4R-28 cells infected with CJ2-gD2, UL9-C535C was detected only in the presence of tetracycline, and significantly higher gD2 levels were also detected in the presence of tetracycline than in its absence.
CJ2-gD2 не реплицируется в клетках VeroCJ2-gD2 does not replicate in Vero cells
Из-за отсутствия ICP0 и высокой экспрессии UL9-C535C с основного предраннего промотора hCMV, несущего tetO, CJ2-gD2 конструировали и размножали в комплементирующей по ICP0 линии клеток U2OS, U2CEP4R11, экспрессирующей tetR (68). При исследовании на образование бляшек на монослоях клеток Vero 6,65×107 БОЕ CJ2-gD2 инфекционного вируса выявлено не было, что означает, что эффективность образования бляшек CJ2-gD2 на клетках Vero снижена по меньшей мере в 6,65×107 раз по сравнению с эффективностью на комплементирующих клетках U2CEP4R11.Due to the lack of ICP0 and high expression of UL9-C535C from the main early hCMV promoter carrying tetO, CJ2-gD2 was constructed and expanded in the ICP0 complementing cell line U2OS, U2CEP4R11 expressing tetR (68). In the study on the formation of plaques on monolayers of Vero cells 6.65 × 10 7 PFU CJ2-gD2, no infectious virus was detected, which means that the efficiency of plaque formation CJ2-gD2 on Vero cells was reduced by at least 6.65 × 10 7 times in comparison with efficiency on complementary U2CEP4R11 cells.
Ингибирование репликации HSV-2 дикого типа CJ2-gD2Inhibition of wild-type HSV-2 replication CJ2-gD2
Далее с помощью ко-инфекции заявители исследовали доминатно-негативный эффект высокого уровня экспрессии UL9-C535C CJ2-gD2 на репликацию HSV-2 дикого типа (фиг.4). На фиг.4А показано, что ко-инфекция клеток Vero CJ2-gD2 при множественности инфекции 5 БОЕ на клетку и HSV-2 дикого типа при множественности инфекции 2 БОЕ на клетку приводило к почти 500-кратному снижению продукции HSV-2 по сравнению с клетками, инфицированными только HSV-2 при такой же множественности инфекции, вне зависимости от того, определяли ли титры вируса в клетках Vero или U2CEP4R11. В сходном эксперименте по ко-инфекции с N2-lacZ наблюдали только небольшое снижение выхода вируса дикого типа.Further, using co-infection, the applicants investigated the dominant negative effect of the high level of expression of UL9-C535C CJ2-gD2 on wild-type HSV-2 replication (Fig. 4). Figure 4A shows that co-infection of Vero CJ2-gD2 cells with a multiplicity of infection of 5 PFU per cell and wild-type HSV-2 with a multiplicity of infection of 2 PFU per cell resulted in an almost 500-fold decrease in HSV-2 production compared to cells infected only with HSV-2 with the same multiplicity of infection, regardless of whether the virus titers were determined in Vero or U2CEP4R11 cells. In a similar experiment on co-infection with N2-lacZ, only a slight decrease in the yield of wild-type virus was observed.
Для дальнейшего изучения степени ингибирования CJ2-gD2 репликации HSV-2 дикого типа заявители провели эксперименты по ко-инфекции HSV-2 дикого типа и CJ2-gD2 при отношении множественности инфекций 1:1 и 3:1. Из результатов, приведенных на фиг.4В, видно, что CJ2-gD2 эффективно предотвращает инфекцию HSV-2 в обоих случаях. Ко-инфекция приводит к 151- и 94-кратному снижению синтеза вируса дикого типа в случае указанных соотношений по сравнению с клетками, инфицированными только HSV-2 дикого типа при множественности инфекции 5 БОЕ на клетку и 15 БОЕ на клетку соответственно.To further investigate the degree of inhibition of wild-type HSV-2 replication of CJ2-gD2, the applicants conducted experiments on co-infection of wild-type HSV-2 and CJ2-gD2 with a ratio of infection rates of 1: 1 and 3: 1. From the results of FIG. 4B, it can be seen that CJ2-gD2 effectively prevents HSV-2 infection in both cases. Co-infection leads to a 151- and 94-fold decrease in the synthesis of wild-type virus in the case of the indicated ratios compared to cells infected only with wild-type HSV-2 with a multiplicity of infection of 5 PFU per cell and 15 PFU per cell, respectively.
CJ2-gD2 авирулентен при внутрицеребральной инъекции мышамCJ2-gD2 is avirulent in intracerebral injection to mice
Нейровирулентность является одним из основных свойств инфекции HSV. Чтобы изучить способность CJ2-gD2 и N2-C535C реплицироваться в ЦНС, самок мышей BALB/c возрастом 5-6 недель случайным образом делили на 5 групп по 8 мышей в каждой группе. CJ2-gD2 и N2-C535C прививали напрямую в левую лобную долю мозга каждой мыши при множественности инфекции 2,5×106 БОЕ на мышь в объеме 20 мкл инсулиновой иглой 28G на глубину 4 мм (74). Заболеваемость и смертность отслеживали на протяжении 35 дней. Поскольку LD50 HSV-2 дикого типа штамма 186 у самок мышей BALB/c составляет примерно 10 БОЕ на мышь при инъекции в камеру глаза (38), группе мышей также прививали HSV-2 дикого типа в количестве 25 БОЕ на мышь. В качестве дополнительного контроля, мышей в пятой группе прививали N2-lacZ в количестве 1×106 БОЕ на мышь. На фиг.5 показано, что как и у мышей, привитых DMEM, у мышей, внутрицеребрально привитых CJ2-gD2 и N2-C535C в дозировке 2,5×106 БОЕ не наблюдалось признаков нейровирулентности в течение 35-дневного срока наблюдения, в то время как все мыши, привитые HSV-2 дикого типа в количестве 25 БОЕ на мышь, (доза меньше в 100000 раз, чем доза CJ2-gD2), умерли на 10 день после прививки, причем у всех привитых мышей наблюдались симптомы заболевания ЦНС, обычно ассоциированного с инфекцией HSV-2, включая взъерошенный мех, сгорбенную позу, атаксию и анорексию. Несмотря на то, что 100% мышей, привитых N2-lacZ, выжили, у всех мышей наблюдались симптомы энцефалита.Neurovirulence is one of the main properties of HSV infection. To study the ability of CJ2-gD2 and N2-C535C to replicate to the central nervous system, female BALB / c mice aged 5-6 weeks were randomly divided into 5 groups of 8 mice in each group. CJ2-gD2 and N2-C535C were grafted directly into the left frontal lobe of the brain of each mouse with a multiplicity of infection of 2.5 × 10 6 PFU per mouse in a volume of 20 μl of a 28G insulin needle to a depth of 4 mm (74). Morbidity and mortality were monitored for 35 days. Since the LD 50 HSV-2 strain 186 wild type females BALB / c mice is approximately 10 pfu per mouse when injected into the chamber of the eye (38), also a group of mice inoculated with HSV-2 wild type in an amount of 25 pfu per mouse. As an additional control, mice in the fifth group were inoculated with N2-lacZ in an amount of 1 × 10 6 PFU per mouse. Figure 5 shows that, as in mice inoculated with DMEM, in mice intracerebrally inoculated with CJ2-gD2 and N2-C535C at a dosage of 2.5 × 10 6 PFU, no signs of neurovirulence were observed during the 35-day observation period, while all mice inoculated with wild-type HSV-2 in an amount of 25 PFU per mouse (the dose is 100,000 times less than the dose of CJ2-gD2) died on the 10th day after vaccination, all vaccinated mice showed symptoms of central nervous system disease, usually associated with HSV-2 infection, including ruffled fur, a hunched posture, ataxia, and anorexia. Although 100% of the mice inoculated with N2-lacZ survived, all mice showed symptoms of encephalitis.
Индукция нейтрализующих антител, специфичных к HSV-2, а также образование gD2-специфичных антител у мышей иммунизированных CJ2-gD2Induction of neutralizing antibodies specific for HSV-2, as well as the formation of gD2-specific antibodies in mice immunized with CJ2-gD2
Способность CJ2-gD2 индуцировать нейтрализующие антитела, специфичные к HSV-2, определяли у мышей, иммунизированных CJ2-gD2 в дозировке 2×106 БОЕ на мышь. В качестве контроля мышей также иммунизировали N2-C535C или CJ9-gD в той же дозировке. Как показано на фиг.6А, средний титр нейтрализующих антител, специфичных к HSV-2, у мышей, иммунизированных CJ2-gD2, составлял в среднем 500, что в три раза выше, чем у мышей, иммунизированных N2-C535C (p=0,015), и сравнимо с титром нейтрализующих антител, индуцированным у мышей, иммунизированных CJ9-gD (p=0,28). У контрольных мышей в разведении 1:10 не выявлялось титра антител, специфичных к HSV-2.The ability of CJ2-gD2 to induce neutralizing antibodies specific for HSV-2 was determined in mice immunized with CJ2-gD2 at a dose of 2 × 10 6 PFU per mouse. As a control, mice were also immunized with N2-C535C or CJ9-gD at the same dosage. As shown in FIG. 6A, the average titer of neutralizing antibodies specific for HSV-2 in mice immunized with CJ2-gD2 averaged 500, which is three times higher than in mice immunized with N2-C535C (p = 0.015) , and is comparable to the titer of neutralizing antibodies induced in mice immunized with CJ9-gD (p = 0.28). In control mice at a 1:10 dilution, no antibody titer specific for HSV-2 was detected.
На фиг.6В показано, что у мышей, иммунизированных CJ2-gD2 и CJ9-gD, наблюдались сходные уровни образования антител, специфичных к gD, при детекции соответственных иммунопреципитированных комплексов gD2 антителами к gD1 (R45). В то же время, у мышей, иммунизированных CJ2-gD2, уровни антител, специфичных к gD, были значительно выше, чем у мышей, иммунизированных N2-C535C, и контрольных. Результаты, приведенные на фиг.6, в совокупности указывают на то, что высокий уровень экспрессии gD2 CJ2-gD2 ведет к повышенной эффективности образования антител к gD2, а также к образования нейтрализующих антител, специфичных к HSV-2, по сравнению с N2-C535C.FIG. 6B shows that mice immunized with CJ2-gD2 and CJ9-gD showed similar levels of antibody formation specific for gD when detecting the corresponding immunoprecipitated gD2 complexes with antibodies to gD1 (R45). At the same time, in mice immunized with CJ2-gD2, the levels of antibodies specific for gD were significantly higher than in mice immunized with N2-C535C and control. The results shown in Fig.6 collectively indicate that a high level of expression of gD2 CJ2-gD2 leads to increased efficiency in the formation of antibodies to gD2, as well as to the formation of neutralizing antibodies specific for HSV-2, compared with N2-C535C .
Индукция Т-клеточного ответа, специфичного к HSV-2, у мышей, иммунизированных CJ2-gD2Induction of T-cell response specific for HSV-2 in mice immunized with CJ2-gD2
Для оценки эффективности иммунизации CJ2-gD2 в отношении индукции Т-клеточного ответа, специфичного к HSV-2, заявители исследовали ответы Т-клеток памяти у иммунизированных мышей на нагрузку HSV-2 дикого типа. Контрольных или вакцинированных CJ2-gD2 мышей не нагружали или нагружали HSV-2 дикого типа через 9-10 недель после вторичной иммунизации и исследовали с помощью теста IFNγ ELISPOT CD4+ и CD8+ Т-клетки из селезенки отдельных групп мышей (n=3) на 5 день после нагрузки (фиг.7А). У мышей, вакцинированных CJ2-gD2 и нагруженных HSV-2 дикого типа, наблюдалось 4,8-кратное увеличение количества IFNγ-положительных CD4+ Т-клеток по сравнению с контрольными мышами, иммунизированными CJ2-gD2 (p<0,0001). Более существенно то, что количество CD4+ Т-клеток, секретирующих IFNγ, обнаруженных у мышей, инфицированных HSV-2 и предварительно вакцинированных CJ2-gD2, оказалось в 18 раз больше, чем у невакцинированных мышей, инфицированных HSV-2 (p<0,0001). У контрольных невакцированных и ненагруженных мышей в тех же условиях IFNγ-положительные CD4+ Т-клетки не обнаруживались. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что CJ2-gD2 вызывает сильный ответ CD4+ Т-клеток памяти.To evaluate the effectiveness of immunization with CJ2-gD2 in inducing a T-cell response specific for HSV-2, we examined the responses of memory T cells in immunized mice to a wild-type load of HSV-2. Control or vaccinated CJ2-gD2 mice were not loaded or were loaded with wild-type HSV-2 9-10 weeks after secondary immunization and examined using the IFNγ ELISPOT CD4 + and CD8 + T cells from the spleen of individual groups of mice (n = 3) on 5 day after exercise (figa). In mice vaccinated with CJ2-gD2 and loaded with wild-type HSV-2, a 4.8-fold increase in the number of IFNγ-positive CD4 + T cells was observed compared to control mice immunized with CJ2-gD2 (p <0.0001). More significantly, the number of CD4 + T cells secreting IFNγ found in mice infected with HSV-2 and pre-vaccinated with CJ2-gD2 was 18 times greater than in unvaccinated mice infected with HSV-2 (p <0, 0001). In control unvaccinated and unloaded mice under the same conditions, IFNγ-positive CD4 + T cells were not detected. These observations suggest that CJ2-gD2 induces a strong response of CD4 + T-cells in memory.
У мышей, вакцинированных CJ2-gD2, наблюдалось более, чем двукратное увеличение количества CD8+ Т-клеток, секретирующих IFNγ, чем у невакцинированных контрольных мышей, но сходные количества CD8+ Т-клеток, секретирующих IFNγ, наблюдались в селезенке невакцинированных мышей, инфицированных HSV-2, и мышей, вакцинированных CJ2-gD2 и инфицированных HSV-2 (фиг.7В). Заявители провели вторую серию экспериментов, в которых мышей, невакцинированных и вакцинированных CJ2-gD2, не нагружали или нагружали HSV-2 дикого типа (n=3) через 5-6 недель после второй вакцинации. Тесты CD4+ и CD8+ ELISPOT проводили через 4 дня после инфекции (фиг.7C и 7D). У мышей, иммунизированных CJ2-gD2, после инфекции HSV-2 наблюдалось 8,6- и 5,7-кратное увеличение количества CD4+ и CD8+ Т-клеток, секретирующих IFNγ, соответственно, по сравнению с неинфицированными мышами, иммунизированными CJ2-gD2 (CD4+ Т-клетки: p=0,035; CD8+ Т-клетки: p=0,01). Кроме того, у мышей, вакцинированных CJ2-gD2, после нагрузки HSV-2 количество CD4+ и CD8+ Т-клеток, секретирующих IFNγ, было в 8 и 9,5 раз больше соответственно, чем у невакцинированных мышей (CD4+ Т-клетки: р=0,036; CD8+ Т-клетки: р=0,01). Эти данные в совокупности указывает на то, что CJ2-gD2 может вызывать мощные ответы CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти, специфичных к HSV-2, обеспечивающие эффективный вторичный иммунный ответ при инфекции HSV-2.In mice vaccinated with CJ2-gD2, there was a more than twofold increase in the number of CD8 + T cells secreting IFNγ than in unvaccinated control mice, but similar amounts of CD8 + T cells secreting IFNγ were observed in the spleen of unvaccinated mice infected with HSV -2, and mice vaccinated with CJ2-gD2 and infected with HSV-2 (pigv). Applicants conducted a second series of experiments in which mice unvaccinated and vaccinated with CJ2-gD2 were not loaded or were loaded with wild-type HSV-2 (n = 3) 5-6 weeks after the second vaccination. The CD4 + and CD8 + ELISPOT tests were performed 4 days after infection (Figs. 7C and 7D). In mice immunized with CJ2-gD2, an 8.6- and 5.7-fold increase in the number of CD4 + and CD8 + T cells secreting IFNγ was observed after HSV-2 infection, respectively, compared with uninfected mice immunized with CJ2-gD2 (CD4 + T cells: p = 0.035; CD8 + T cells: p = 0.01). In addition, in mice vaccinated with CJ2-gD2, after loading of HSV-2, the number of CD4 + and CD8 + T cells secreting IFNγ was 8 and 9.5 times higher, respectively, than in unvaccinated mice (CD4 + T cells : p = 0.036; CD8 + T cells: p = 0.01). These data together indicate that CJ2-gD2 can elicit powerful responses of HSV-2 specific CD4 + and CD8 + T memory cells, providing an effective secondary immune response in HSV-2 infection.
Защита от генитальной инфекции и заболевания, вызванного HSV-2 у иммунизированных мышейProtection against genital infection and HSV-2 disease in immunized mice
Через 5-6 недель после первичной иммунизации мышей нагружали интравагинально HSV-2 штамма G в количестве 50 LD50 (5×105 БОЕ на мышь). Вагинальные мазки брали на 1, 2, 3, 5 и 7 день после нагрузки. У мышей наблюдали в течение 21-дневного периода частоту возникновения генитального и системного заболевания, вызванного HSV-2. Как показано на фиг.8А, выход нагрузочного вируса был снижен более, чем в 200 раз на 1 день (p<0,001) и в 130 раз на 2 день (p<0,0001) у мышей, иммунизированных CJ2-gD2 (n=9) по сравнению с неиммунизированным контролем (n=10). Заявители не наблюдали значимой разницы в ослаблении вирусного слущивания на 1, 2 и 3 день после нагрузки между группами мышей, иммунизированных CJ2-gD2 и N2-C535C (n=10), однако, по сравнению с CJ9-gD, иммунизация CJ2-gD2 более эффективно ослабляла вирусное слущивание на 1 (р=0,03), 2 (р=0,025) и 3 (p<0,007) дни. У мышей, иммунизированных CJ2-gD2, N2-C535C или CJ9-gD, на 5 день после инфекции практически не наблюдалось нагрузочного вируса, в то время как у всех неиммунизированных мышей вирус продолжал слущиваться в количестве в среднем более 5×103 БОЕ/мл. У трех иммунизированных групп мышей в материале вагинальных мазков, взятых на 7 день после нагрузки, не обнаруживалось нагрузочного вируса. В ходе другого эксперимента заявители показали, что на 5 день после нагрузки у мышей, иммунизированных CJ2-gD2, не наблюдалось вирусного слущивания, но у 5 из 7 мышей, иммунизированных N2-C535C, и у 4 из 7 мышей, иммунизированных CJ9-gD, присутствовал HSV-2 дикого типа.5-6 weeks after primary immunization, the mice were loaded intravaginally with HSV-2 strain G in an amount of 50 LD 50 (5 × 10 5 PFU per mouse). Vaginal smears were taken on 1, 2, 3, 5 and 7 days after exercise. In mice, the incidence of genital and systemic diseases caused by HSV-2 was observed over a 21-day period. As shown in FIG. 8A, the yield of the loading virus was reduced by more than 200 times on day 1 (p <0.001) and 130 times on day 2 (p <0.0001) in mice immunized with CJ2-gD2 (n = 9) compared with non-immunized control (n = 10). Applicants did not observe a significant difference in attenuation of viral desquamation on
Результаты, приведенные на фиг.9, свидетельствуют о том, что иммунизация мышей CJ2-gD2 полностью предотвратила развитие локальных генитальных язв и системного заболевания после нагрузки HSV-2 дикого типа (фиг.9А). У всех неиммунизированных мышей развились тяжелые генитальные язвы; все мыши погибли от инфекции HSV-2 дикого типа на 11 день после нагрузки (фиг.9В). Несмотря на то, что иммунизация N2-C535C и CJ9-gD предохраняла мышей от летальной нагрузки HSV-2 дикого типа, у 20% и 30% мышей соответственно наблюдались преходящее легкое локальное генитальное заболевание (1 балл) (таблица 1). В сходном эксперименте (таблица 1) заявители показали, что у мышей, иммунизированных CJ9-gD (n=7) у двух мышей наблюдались преходящее локальное локальное генитальное заболевание и у 1 мыши наблюдались симптомы системного заболевания. Эта мышь умерла на 14 день после нагрузки. У 3 из 7 мышей, иммунизированных N2-C535C (43%) наблюдались преходящее легкое локальное генитальное заболевание (1 балл). У мышей, иммунизированных CJ2-gD2, опять не наблюдалось симптомов локального или системного заболевания герпесом (n=7). Совокупность этих данных указывает на то, что CJ2-gD2 представляет собой более эффективную вакцину, чем N2-C535C и CJ9-gD, для защиты мышей от генитального заболевания, вызванного интравагинальной нагрузкой HSV-2 дикого типа.The results shown in Fig. 9 indicate that immunization of CJ2-gD2 mice completely prevented the development of local genital ulcers and systemic disease after loading wild-type HSV-2 (Fig. 9A). All non-immunized mice developed severe genital ulcers; all mice died from wild-type HSV-2
Процент защиты от заболевания герпесом у контрольных и иммунизированных мышей после интравагинальной нагрузки HSV-2 дикого типаPercentage of protection against herpes disease in control and immunized mice after intravaginal loading of wild-type HSV-2
Список литературыBibliography
1. Abu-Raddad, et al., PLoS ONE 3:e2230 (2008).1. Abu-Raddad, et al., PLoS ONE 3: e2230 (2008).
2. Ackermann, et al., J. Virol. 52:108-18 (1984).2. Ackermann, et al., J. Virol. 52: 108-18 (1984).
3. Adelson, et al., J. Clin. Virol. 55:25-34 (2005).3. Adelson, et al., J. Clin. Virol. 55: 25-34 (2005).
4. Arvin, et al., Infect. Immun. 40:184-9 (1983).4. Arvin, et al., Infect. Immun. 40: 184-9 (1983).
5. Augustinova, et al., J. Virol. 78:5156-65 (2004).5. Augustinova, et al., J. Virol. 78: 5156-65 (2004).
6. Bourne, et al., Vaccine 14:1230-4 (1996).6. Bourne, et al., Vaccine 14: 1230-4 (1996).
7. Brans, et al., J. Invest. Dermatol. 129:2470-9 (2009).7. Brans, et al., J. Invest. Dermatol. 129: 2470-9 (2009).
8. Brans, et al., J. Invest. Dermatol. 725:2825-32 (2008).8. Brans, et al., J. Invest. Dermatol. 725: 2825-32 (2008).
9. Bryson, et al., J. Infect. Dis. 167:942-6 (1993).9. Bryson, et al., J. Infect. Dis. 167: 942-6 (1993).
10. Cai, et al., J. Virol. 67:1501-12 (1993).10. Cai, et al., J. Virol. 67: 1501-12 (1993).
11. Cai, et al., J. Virol. 65:4579-89 (1989).11. Cai, et al., J. Virol. 65: 4579-89 (1989).
12. Cohen, et al., J. Virol. 49:102-8 (1984).12. Cohen, et al., J. Virol. 49: 102-8 (1984).
13. Coleman, et al., J. Clin. Microbiol. 75:287-91 (1983).13. Coleman, et al., J. Clin. Microbiol. 75: 287-91 (1983).
14. Cooper, et al., Cell. Immunol. 239:113-20 (2006).14. Cooper, et al., Cell. Immunol. 239: 113-20 (2006).
15. Corey, et al., N. Engl. J. Med. 314:149-51 (1986).15. Corey, et al., N. Engl. J. Med. 314: 149-51 (1986).
16. DeLuca, et al., J. Virol. 62:132-43 (1988).16. DeLuca, et al., J. Virol. 62: 132-43 (1988).
17. Dolan, et al., J. Virol. 72:2010-21 (1998).17. Dolan, et al., J. Virol. 72: 2010-21 (1998).
18. Dudek, et al., Virology 344:230-9 (2006).18. Dudek, et al., Virology 344: 230-9 (2006).
19. Fleming, et al., N. Engl. J. Med. 557:1105-11 (1997).19. Fleming, et al., N. Engl. J. Med. 557: 1105-11 (1997).
20. Freeman, et al., Aids 20:73-83 (2006).20. Freeman, et al., Aids 20: 73-83 (2006).
21. Glorioso, et al., J. Virol. 50:805-12 (1984).21. Glorioso, et al., J. Virol. 50: 805-12 (1984).
22. Grammer, et al., J. Immunol. 145:2249-53 (1990).22. Grammer, et al., J. Immunol. 145: 2249-53 (1990).
23. Gupta, et al., Lancet 370:2121-31 (2007).23. Gupta, et al., Lancet 370: 2121-31 (2007).
24. Handler, et al., J. Virol. 70:6067-70(1996).24. Handler, et al., J. Virol. 70: 6067-70 (1996).
25. Hirsch, Herpes simplex virus, p. 1144-1153. In G. L. Mandell, R. G. J. Douglas, and J. E. Bennett (ed.), Principles and practice of infectious diseases. Churchill Livingstone Inc., New York (1990).25. Hirsch, Herpes simplex virus, p. 1144-1153. In G. L. Mandell, R. G. J. Douglas, and J. E. Bennett (ed.), Principles and practice of infectious diseases. Churchill Livingstone Inc., New York (1990).
26. Honess, et al., J. Gen. Virol. 22:159-69 (1974).26. Honess, et al., J. Gen. Virol. 22: 159-69 (1974).
27. Hosken, et al., J. Virol. 50:5509-15 (2006).27. Hosken, et al., J. Virol. 50: 5509-15 (2006).
28. Johnson, et al., J. Immunol. 145:102-10 (1990).28. Johnson, et al., J. Immunol. 145: 102-10 (1990).
29. Jones, et al., Herpes 11:12-1 (2004).29. Jones, et al., Herpes 11: 12-1 (2004).
30. Kim, et al., J. Immunol. 181:6604-15 (2008).30. Kim, et al., J. Immunol. 181: 6604-15 (2008).
31. Koelle, et al., Annu. Rev. Med. 5P:381-395 (2008).31. Koelle, et al., Annu. Rev. Med. 5P: 381-395 (2008).
32. Koelle, et al., Clin. Microbiol. Rev. 16:96-113 (2003).32. Koelle, et al., Clin. Microbiol. Rev. 16: 96-113 (2003).
33. Koelle, et al., Curr. Eye Res. 30:929-42 (2005).33. Koelle, et al., Curr. Eye Res. 30: 929-42 (2005).
34. Koelle, et al., J. Clin. Invest. 91:961-8 (1993).34. Koelle, et al., J. Clin. Invest. 91: 961-8 (1993).
35. Kousoulas, et al., Virology 166:423-31 (1988).35. Kousoulas, et al., Virology 166: 423-31 (1988).
36. Lakeman, et al., Sex. Transm. Dis. 13:61-6 (1986).36. Lakeman, et al., Sex. Transm. Dis. 13: 61-6 (1986).
37. Leib, et al., J. Virol. 65:759-68 (1989).37. Leib, et al., J. Virol. 65: 759-68 (1989).
38. Lewandowski, et al., J. Neuroimmunol 81:66-15 (1998).38. Lewandowski, et al., J. Neuroimmunol 81: 66-15 (1998).
39. Liesegang, Cornea 20:1-13 (2001).39. Liesegang, Cornea 20: 1-13 (2001).
40. Looker, et al., Sex. Transm. Infect. 81:103-1 (2005).40. Looker, et al., Sex. Transm. Infect. 81: 103-1 (2005).
41. Lu, et al., J. Invest. Dermatol. 129:1114-84 (2009).41. Lu, et al., J. Invest. Dermatol. 129: 1114-84 (2009).
42. McGeoch, et al., J. Gen. Virol. 69:1531-74 (1988).42. McGeoch, et al., J. Gen. Virol. 69: 1531-74 (1988).
43. McGeoch et al., J. Gen. Virol. 72:3057-3075 (1991).43. McGeoch et al., J. Gen. Virol. 72: 3057-3075 (1991).
44. McGeoch et al., Nucl. Acid Res. 14:1121-1145 (1986).44. McGeoch et al., Nucl. Acid Res. 14: 1121-1145 (1986).
45. McGeoch, et al., Nucleic Acids Res 14:3435-48 (1986).45. McGeoch, et al., Nucleic Acids Res 14: 3435-48 (1986).
46. Mertz, et al., Ann. Intern. Med. 116:191-202 (1992).46. Mertz, et al., Ann. Intern. Med. 116: 191-202 (1992).
47. Mikloska, et al., J. Gen. Virol. 7P:353-61 (1998).47. Mikloska, et al., J. Gen. Virol. 7P: 353-61 (1998).
48. Mikloska, et al., J. Immunol. 164:5161-16 (2000).48. Mikloska, et al., J. Immunol. 164: 5161-16 (2000).
49. Minson, et al., J. Gen. Virol. 67 (Pt 6): 1001-13 (1986).49. Minson, et al., J. Gen. Virol. 67 (Pt 6): 1001-13 (1986).
50. Morrison, et al., Virology 245:178-87 (1998).50. Morrison, et al., Virology 245: 178-87 (1998).
51. Muller, J. Virol. 67:858-65 (1987).51. Muller, J. Virol. 67: 858-65 (1987).
52. Nagot, et al., N. Engl J. Med. 356:190-9 (2007).52. Nagot, et al., N. Engl J. Med. 356: 190-9 (2007).
53. Para, et al., J. Virol. 55:483-8 (1985).53. Para, et al., J. Virol. 55: 483-8 (1985).
54. Pereira, Dev. Biol. Stand. 52:115-31 (1982).54. Pereira, Dev. Biol. Stand. 52: 115-31 (1982).
55. Pereira, et al., Infect. Immun. 29:124-32 (1980).55. Pereira, et al., Infect. Immun. 29: 124-32 (1980).
56. Perry, et al., J. Gen. Virol. 67:2365-2380 (1986).56. Perry, et al., J. Gen. Virol. 67: 2365-2380 (1986).
57. Roberts, et al., J. Virol. 62:4301-20 (1988).57. Roberts, et al., J. Virol. 62: 4301-20 (1988).
58. Roizman, et al., Herpes simplex viruses and their replication, p. 2399-2459. In a. P. M. H. D. M. Knipe (ed.), Fields Virology, 4rd ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. (2001).58. Roizman, et al., Herpes simplex viruses and their replication, p. 2399-2459. In a. P. M. H. D. M. Knipe (ed.), Fields Virology, 4rd ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. (2001).
59. Schmidt, et al., J. Infect. Dis. 149:645-6 (1984).59. Schmidt, et al., J. Infect. Dis. 149: 645-6 (1984).
60. Stanberry, Herpes 11(Suppl 3):161A-169A (2004).60. Stanberry, Herpes 11 (Suppl 3): 161A-169A (2004).
61. Stanberry, et al., Clin. Infect. Dis. 30:549-66 (2000).61. Stanberry, et al., Clin. Infect. Dis. 30: 549-66 (2000).
62. Stanberry, et al., N. Engl. J. Med. 347:1652-61 (2002).62. Stanberry, et al., N. Engl. J. Med. 347: 1652-61 (2002).
63. Starr, et al., Gene Ther 5:615-23 (1996).63. Starr, et al., Gene Ther 5: 615-23 (1996).
64. Stow, et al., J. Gen. Virol. 67:2571-85 (1986).64. Stow, et al., J. Gen. Virol. 67: 2571-85 (1986).
65. Tigges, et al., J. Virol. 66:1622-34 (1992).65. Tigges, et al., J. Virol. 66: 1622-34 (1992).
66. Whitley, et al., Clin Infect Dis 26:541-53; quiz 554-5 (1998).66. Whitley, et al., Clin Infect Dis 26: 541-53; quiz 554-5 (1998).
67. Xu, et al., J. Infect. Dis. 755:1019-24 (2002).67. Xu, et al., J. Infect. Dis. 755: 1019-24 (2002).
68. Yao, et al., Hum. Gene Ther. 70:1811-8 (1999).68. Yao, et al., Hum. Gene Ther. 70: 1811-8 (1999).
69. Yao, et al., Hum. Gene Ther. 10:419-27 (1999).69. Yao, et al., Hum. Gene Ther. 10: 419-27 (1999).
70. Yao, et al., Antiviral Res. 53:127-33 (2002).70. Yao, et al., Antiviral Res. 53: 127-33 (2002).
71. Yao, et al., J. Virol. 69:6249-58 (1995).71. Yao, et al., J. Virol. 69: 6249-58 (1995).
72. Yao, et al., J. Virol. 65:8158-68 (1994).72. Yao, et al., J. Virol. 65: 8158-68 (1994).
73. Yao, et al., Hum. Gene Ther. 9:1939-50 (1998).73. Yao, et al., Hum. Gene Ther. 9: 1939-50 (1998).
74. Yao, et al., Mol. Ther. 75:1133-41 (2006).74. Yao, et al., Mol. Ther. 75: 1133-41 (2006).
75. Zarling, et al., J. Immunol. 136:4669-13 (1986).75. Zarling, et al., J. Immunol. 136: 4669-13 (1986).
Все литературные источники, процитированные в настоящей заявке, полностью включены путем ссылки. Из развернутого описания изобретения для специалиста в области техники очевидно, что изобретение может применяться с использованием широкого эквивалентного диапазона условий, параметров и т.д., без отступления от сущности и объема настоящего изобретения или любого его воплощения.All references cited in this application are fully incorporated by reference. From the detailed description of the invention for a specialist in the field of technology it is obvious that the invention can be applied using a wide equivalent range of conditions, parameters, etc., without departing from the essence and scope of the present invention or any of its embodiments.
Claims (17)
a) первую последовательность, кодирующую первый гликопротеин D HSV-2 (gD2), где указанная последовательность функционально связана с первым промотором, причем указанный первый промотор представляет собой промотор ICP4, модифицированный путем исключения ДНК-связывающей последовательности ICP4, и указанный первый промотор функционально связан с первой последовательностью тетрациклинового оператора (Tet-O);
b) вторую последовательность, кодирующую второй HSV-2 gD2, где указанная вторая последовательность функционально связана со вторым промотором, причем указанный второй промотор представляет собой промотор ICP4, модифицированный путем исключения ДНК-связывающей последовательности ICP4, и причем указанный второй промотор функционально связан со второй последовательностью Tet-O;
c) третью последовательность, кодирующую белок UL9-C535C, где указанная третья последовательность функционально связана с третьим промотором, и указанный третий промотор представляет собой предранний промотор hCMV, функционально связанный с третьей последовательностью тетрациклинового оператора (Tet-O);
d) четвертую последовательность, кодирующую белок UL9-C535C, где указанная четвертая последовательность функционально связана с четвертым промотором, и указанный четвертый промотор представляет собой предранний промотор hCMV, функционально связанный с четвертой последовательностью тетрациклинового оператора (Tet-O);
и где указанный геном не включает последовательности, кодирующей функциональный белок ICP0.1. Replication-defective dominant-negative recombinant herpes simplex virus 2 (Herpes Simplex Virus, HSV-2) for use as a vaccine, the genome of which includes:
a) a first sequence encoding a first HSV-2 glycoprotein D (gD2), wherein said sequence is operably linked to a first promoter, said first promoter being an ICP4 promoter modified by excluding the ICP4 DNA binding sequence, and said first promoter operably linked to the first sequence of the tetracycline operator (Tet-O);
b) a second sequence encoding a second HSV-2 gD2, wherein said second sequence is operably linked to a second promoter, said second promoter being an ICP4 promoter modified by eliminating the ICP4 DNA binding sequence, and wherein said second promoter is operably linked to a second sequence Tet-o;
c) a third sequence encoding a UL9-C535C protein, wherein said third sequence is operably linked to a third promoter, and said third promoter is an hCMV early promoter operably linked to a third tetracycline operator sequence (Tet-O);
d) a fourth sequence encoding a UL9-C535C protein, wherein said fourth sequence is operably linked to a fourth promoter and said fourth promoter is an hCMV early promoter operably linked to a fourth tetracycline operator sequence (Tet-O);
and where the specified genome does not include a sequence encoding a functional protein ICP0.
a) каждый из указанных первого, второго, третьего и четвертого промоторов содержит TATA-элемент;
b) каждый из указанных первого, второго, третьего и четвертого промоторов содержит 2 сайта ор2 связывания репрессора, соединенных последовательностью длиной 2-20 нуклеотидов, где первый нуклеотид указанного tet-оператора располагается между 6 и 24 нуклеотидом к 3′-концу от последнего нуклеотида указанного TATA-элемента;
c) указанная последовательность, кодирующая gD2 HSV-2, и указанная вторая последовательность, кодирующая gD2 HSV-2, располагается к 3′-концу от указанных первой и второй последовательностей Tet-O и функционально связаны с указанными первым и вторым промотором;
d) указанная последовательность, кодирующая указанную первую доминантно-негативную мутантную форму белка UL9 HSV-1 или HSV-2, располагается к 3′-концу от указанной третьей последовательности Tet-O и функционально связана с указанным третьим промотором;
e) указанная последовательность, кодирующая указанную вторую доминантно-негативную мутантную форму белка UL9 HSV-1 или HSV-2, располагается к 3′-концу от указанной четвертой последовательности Tet-O и функционально связана с указанным четвертым промотором.2. The virus according to claim 1, where:
a) each of the indicated first, second, third and fourth promoters contains a TATA element;
b) each of the first, second, third and fourth promoters contains 2 rep2 binding sites op2 connected by a sequence of 2-20 nucleotides in length, where the first nucleotide of the specified tet-operator is located between 6 and 24 nucleotides to the 3'-end of the last nucleotide of the specified TATA element;
c) said gD2 HSV-2 coding sequence and said second HSV-gD2 coding sequence are located at the 3′-end of said first and second Tet-O sequences and are operably linked to said first and second promoter;
d) said sequence encoding said first dominant negative mutant form of UL9 HSV-1 or HSV-2 protein is located at the 3′-end of said third Tet-O sequence and is operably linked to said third promoter;
e) said sequence encoding said second dominant negative mutant form of UL9 HSV-1 or HSV-2 protein is located at the 3′-end of said fourth Tet-O sequence and is operably linked to said fourth promoter.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28883609P | 2009-12-21 | 2009-12-21 | |
| US61/288,836 | 2009-12-21 | ||
| PCT/US2010/061320 WO2011079073A2 (en) | 2009-12-21 | 2010-12-20 | Herpes simplex virus vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012131167A RU2012131167A (en) | 2014-01-27 |
| RU2575067C2 true RU2575067C2 (en) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990013652A1 (en) * | 1989-05-12 | 1990-11-15 | Triton Diagnostics, Inc. | Herpes simplex virus type 2-glycoprotein g proteins and polypeptides |
| RU2236256C2 (en) * | 1990-09-25 | 2004-09-20 | Кантаб Фармасьютикалз Рисерч Лимитед | Mutant herpes virus-comprising vaccine |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990013652A1 (en) * | 1989-05-12 | 1990-11-15 | Triton Diagnostics, Inc. | Herpes simplex virus type 2-glycoprotein g proteins and polypeptides |
| RU2236256C2 (en) * | 1990-09-25 | 2004-09-20 | Кантаб Фармасьютикалз Рисерч Лимитед | Mutant herpes virus-comprising vaccine |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LU et al.: 'High-level expression of glycoprotein D by a dominant-negative HSV-1 virus augments its efficacy as a vaccine against HSV-1 infection'. JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY vol. 129, 13 November 2008, pages 1174 - 1184. BRANS RICHARD et al: "Prevention of Genital Herpes Simplex Virus Type 1 and 2 Disease in Mice Immunized with a gD-Expressing Dominant-Negative Recombinant HSV-1". JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 129, no. 10, October 2009, pages 2470-2479. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9408905B2 (en) | Herpes simplex virus vaccines | |
| US8501194B2 (en) | Vaccine for viruses that cause persistent or latent infections | |
| Akhrameyeva et al. | Development of a glycoprotein D-expressing dominant-negative and replication-defective herpes simplex virus 2 (HSV-2) recombinant viral vaccine against HSV-2 infection in mice | |
| JP2022180463A (en) | Novel immunization agents and methods of use | |
| US11229697B2 (en) | Vaccines against genital herpes simplex infections | |
| US20040185056A1 (en) | Vaccines containing bovine herpesvirus 1 attenuated by mutation in latency-related gene | |
| US11390650B2 (en) | Recombinant Herpes Simplex Virus-2 expressing glycoprotein B and D antigens | |
| RU2575067C2 (en) | Herpetic fever virus vaccines | |
| US20150359878A1 (en) | Use of replication deficient hsv-1 as a vaccine vector for the deli vary of hiv-1 tat antigen | |
| US20030215463A1 (en) | Means of inducing durable immune responses | |
| ES2577704T3 (en) | Herpes simplex virus vaccines | |
| Ďurmanová et al. | Herpes simplex virus 1 and 2 vaccine design: What can we learn from the past | |
| Sharawi | Fouad Fouad Saad El-Mayet | |
| Ramachandran | Influence of herpes simplex virus type-1 glycoprotein B expression on viral pathogenecity and the CD8+ T cell response | |
| Fukumoto | Epstein-Barr Virus Infections and Vaccine Advances | |
| Bidula | Development of HSV-1 lacking the immunodominant gB498-505 epitope and analyses of the alternative CD8+ T cell response in the murine ocular infection model |