RU2574206C1 - New recombinant strain (versions) of mycelial fungus penicillium verruculosum, and enzymatic agent (versions) intended for hydrolysis of fruit raw material, and method of its production - Google Patents
New recombinant strain (versions) of mycelial fungus penicillium verruculosum, and enzymatic agent (versions) intended for hydrolysis of fruit raw material, and method of its production Download PDFInfo
- Publication number
- RU2574206C1 RU2574206C1 RU2014139811/10A RU2014139811A RU2574206C1 RU 2574206 C1 RU2574206 C1 RU 2574206C1 RU 2014139811/10 A RU2014139811/10 A RU 2014139811/10A RU 2014139811 A RU2014139811 A RU 2014139811A RU 2574206 C1 RU2574206 C1 RU 2574206C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- verruculosum
- strain
- bkm
- fungus penicillium
- activity
- Prior art date
Links
- 241001516650 Talaromyces verruculosus Species 0.000 title claims abstract description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 title abstract description 9
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title description 17
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title description 13
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 title description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 101700085733 PELA Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims abstract description 17
- 230000002351 pectolytic Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000001461 cytolytic Effects 0.000 claims abstract description 8
- 229940040387 Citrus Pectin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000009194 citrus pectin Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 claims abstract description 3
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 241001444063 Aronia Species 0.000 claims abstract 3
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 claims description 36
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 claims description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 7
- 241000219095 Vitis Species 0.000 claims description 6
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000009754 grape Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000012333 grape Nutrition 0.000 claims description 6
- 241001092391 Sorbus Species 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 235000008345 mountainash Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 33
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 abstract description 3
- 235000018185 birch Nutrition 0.000 abstract description 3
- 235000018212 birch Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 241000228172 Penicillium canescens Species 0.000 abstract description 2
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 abstract description 2
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 3
- 101700028102 BAGBG Proteins 0.000 abstract 1
- 101710038792 PALG1 Proteins 0.000 abstract 1
- 235000006085 Vigna mungo var mungo Nutrition 0.000 abstract 1
- 240000005616 Vigna mungo var. mungo Species 0.000 abstract 1
- 238000006266 etherification reaction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 229940079919 digestives Enzyme preparations Drugs 0.000 description 17
- 240000000361 Prunus canescens Species 0.000 description 16
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 15
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 15
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010029182 EC 4.2.2.10 Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 101700083572 bglI Proteins 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 101710013859 At1g04680 Proteins 0.000 description 8
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 8
- 101700025636 PELO Proteins 0.000 description 8
- 101700007624 PLB Proteins 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 101710026439 NIAA Proteins 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 5
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 4
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 4
- 101700006119 XYL1 Proteins 0.000 description 4
- 101700047052 XYLA Proteins 0.000 description 4
- 101700051122 XYLD Proteins 0.000 description 4
- 101700065756 XYN4 Proteins 0.000 description 4
- 101700001256 Xyn Proteins 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000002609 media Substances 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 4
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 4
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 4
- 101700065693 xlnA Proteins 0.000 description 4
- 101700006979 xyl2 Proteins 0.000 description 4
- 101710017636 xynS20E Proteins 0.000 description 4
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 101700038856 cbhB Proteins 0.000 description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 3
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 3
- 210000001938 protoplasts Anatomy 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 229920001706 Glucuronoxylan Polymers 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N Isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091022054 Polysaccharide-Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000020163 Polysaccharide-Lyases Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002879 macerating Effects 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N n-butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 2
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 2
- IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-(4-nitrophenoxy)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940106157 CELLULASE Drugs 0.000 description 1
- 101710039650 CTP Proteins 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 Cell Wall Anatomy 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-Galacturonic acid Chemical group OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 1
- 235000002673 Dioscorea communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000544230 Dioscorea communis Species 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 206010062515 Periorbital contusion Diseases 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 240000002799 Prunus avium Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 240000001122 Vitis cinerea Species 0.000 description 1
- 235000011862 Vitis cinerea Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007257 deesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013575 mashed potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035943 smell Effects 0.000 description 1
- JMHRGKDWGWORNU-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[1-(4-chlorobenzoyl)-5-methoxy-2-methylindol-3-yl]acetate Chemical compound [Na+].CC1=C(CC([O-])=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 JMHRGKDWGWORNU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения комплексных мультиферментных препаратов с пектинлиазной целлобиогидролазной, эндоглюканазной и β-глюкозидазной (целлобиазной) активностями путем культивирования рекомбинантных штаммов мицелиальных грибов рода Penicillium verruculosum, трансформированных смесью двух плазмид, несущих гены гетерологичных β-глюкозидазы (целлобиазы) из Aspergillus niger и пектинлиазы из Penicillium canescens.The invention in the field of biotechnology relates to the microbiological industry and is a method for producing complex multienzyme preparations with pectinliase cellobiohydrolase, endoglucanase and β-glucosidase (cellobiase) activities by culturing recombinant strains of mycelial fungi of the genus Penicillium verruculosum, transformed with glucose-transformed glucose two plasmids with two (cellobiases) from Aspergillus niger and pectin lyases from Penicillium canescens.
В последние десятилетия применение ферментных препаратов, полученных на основе грибных штаммов-продуцентов, в процессах получения вина, плодово-ягодных соков, джемов, пюре и других продуктов из плодово-ягодного сырья завоевало особую популярность среди производителей в пищевой промышленности.In recent decades, the use of enzyme preparations obtained on the basis of mushroom producer strains in the processes of obtaining wine, fruit and berry juices, jams, mashed potatoes and other products from fruit and berry raw materials has gained particular popularity among manufacturers in the food industry.
Ферментативный гидролиз плодово-ягодного сырья происходит под действием карбогидразного комплекса - совокупности ферментов различной специфичности, расщепляющих полисахаридные молекулы с получением олиго- и моносахаридов. Качественный состав ферментных препаратов определяется составом плодово-ягодного сырья. Поскольку к числу основных компонентов плодово-ягодного сырья относятся пектиновые вещества и целлюлоза, то ферментные препараты для его гидролиза должны обладать, в основном, целлюлолитической и пектолитической активностью.Enzymatic hydrolysis of fruit and berry raw materials takes place under the influence of a carbohydrase complex — a combination of enzymes of various specificity that break down polysaccharide molecules to produce oligo- and monosaccharides. The qualitative composition of enzyme preparations is determined by the composition of fruit and berry raw materials. Since pectin and cellulose are among the main components of fruit and berry raw materials, enzymatic preparations for its hydrolysis should possess mainly cellulolytic and pectolytic activity.
Лучшими продуцентами ферментов-карбогидраз, на сегодняшний день, являются микроскопические грибы, преимущественно относящиеся к родам Trichoderma, Penicillium, а также Aspergillus. Это связано с высоким уровнем секреции внеклеточных ферментов. Причем Trichoderma reesei обладает высокоэффективным комплексом целлюлолитических ферментов [Martinez D. et all. Nat. Biotechnol., 2008, v. 26, №5, page 553-560], в то время как грибы рода Aspergillus секретируют комплекс пектолитических ферментов [Martens-Uzimova E.S. et all. Fungal Genet. Biol., 2009, v. 46, p. 170-179].The best producers of carbohydrase enzymes, to date, are microscopic fungi, mainly belonging to the genera Trichoderma, Penicillium, as well as Aspergillus. This is due to the high level of secretion of extracellular enzymes. Moreover, Trichoderma reesei has a highly effective complex of cellulolytic enzymes [Martinez D. et all. Nat. Biotechnol., 2008, v. 26, No. 5, page 553-560], while fungi of the genus Aspergillus secrete a complex of pectolytic enzymes [Martens-Uzimova E.S. et all. Fungal Genet. Biol., 2009, v. 46, p. 170-179].
Гриб P.verruculosum секретирует целлюлазный ферментный комплекс достаточно сбалансированного состава, основными компонентами которого являются целлобиогидролазы и эндоглюканазы, а также ксиланзы. Комплекс ферментов-карбогидраз данного состава позволяет эффективно осуществлять гидролиз целлюлозной и гемицеллюлозной компонент растительных материалов, в частности, плодово-ягодного сырья. Однако пектолитическая активность ферментного комплекса гриба P.verruculosum низка. В силу особенностей строения клеточной стенки растений с высоким содержанием пектиновых веществ низкая пектолитическая активность ферментных препаратов является существенным фактором, снижающим эффективность гидролиза плодово-ягодного сырья. Следовательно, создание ферментных препаратов с использованием продуцентов пектолитических ферментов, полученных на основе исходного штамма P.verruculosum BI-537 niaD(-), является актуальной задачей.The fungus P.verruculosum secrets a cellulase enzyme complex of a fairly balanced composition, the main components of which are cellobiohydrolases and endoglucanases, as well as xylanases. The complex of carbohydrase enzymes of this composition allows the hydrolysis of the cellulosic and hemicellulose components of plant materials, in particular, fruit and berry raw materials, to be efficiently carried out. However, the pectolytic activity of the enzyme complex of P.verruculosum fungus is low. Due to the structural features of the cell wall of plants with a high content of pectin substances, the low pectolytic activity of enzyme preparations is a significant factor that reduces the efficiency of hydrolysis of fruit and berry raw materials. Therefore, the creation of enzyme preparations using producers of pectolytic enzymes obtained on the basis of the initial strain P.verruculosum BI-537 niaD (-) is an urgent task.
В качестве целевого пектолитического фермента была выбрана пектинлиаза А из P.canescens. Пектинлиаза (КФ 4.2.2.10, 1-я семья полисахарид-лиаз) катализирует реакцию расщепления α-1,4-D-гликозидной связи между метоксилированными остатками галактуроновой кислоты в составе пектиновых веществ. Этот фермент - один из немногих пектолитических ферментов, воздействующих на этерифицированный гомогалактуронан без предварительной деэтерификации, которая обычно предшествует гидролитическому расщеплению пектина. Поэтому пектинлиаза обеспечивает осветление соков без разрушения летучих эфирных компонентов, придающих соку специфический фруктовый запах.Pectin lyase A from P. canescens was chosen as the target pectolytic enzyme. Pectin lyase (EC 4.2.2.10, 1st family of polysaccharide lyases) catalyzes the cleavage reaction of the α-1,4-D-glycosidic bond between methoxylated galacturonic acid residues in the composition of pectin substances. This enzyme is one of the few pectolytic enzymes that act on the esterified homogalacturonan without prior deesterification, which usually precedes the hydrolytic cleavage of pectin. Therefore, pectin lyase provides clarification of juices without destroying volatile ether components, giving the juice a specific fruity smell.
В отличие от пектинлиаз из A.niger, оптимум активности которых составляет от 6,0 до 8,5 ед рН [Whitaker J.R. Voragen A.G., Wong D.W.S. Handbook of food enzymology. New York, Basel. (2003) 1108 p.], пектинлиаза А из P.canescens обладает более кислым оптимумом рН - 5,0 ед. Поскольку нативный рН фруктов и ягод составляет от 3,3 до 4,0 ед [Belitz H.-D., Grosch W., Schieberle P. Food Chemistry. 2009. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, p. 815], то пектинлиаза А из P.canescens обладает большей активностью в условиях гидролиза плодово-ягодного сырья по сравнению с аналогичными ферментами грибов рода Aspergillus. Причем фермент стабилен при рН, близком к нативному рН различных фруктов и ягод. Так, пектинлиаза А из P.canescens после 3 ч инкубирования при рН 4,0 при комнатной температуре сохраняет более 90% активности, а при повышении температуры до 40°С и 50°С активность пектинлиазы сохраняется на уровне 70% и 40% от первоначальной активности. Следовательно, пектинлиаза А из P.canescens является активным и стабильным пектолитическим ферментом в условиях гидролиза плодово-ягодного сырья, а получение ферментных препаратов с высокой пектолитической и целлюлолитической активностями на основе штаммов P.verruculosum, секретирующих гетерологичную пектинлиазу А из P.canescens, является целесообразным.Unlike pectinliases from A.niger, the optimum activity of which is from 6.0 to 8.5 pH units [Whitaker J.R. Voragen A.G., Wong D.W.S. Handbook of food enzymology. New York, Basel. (2003) 1108 p.], Pectin lyase A from P. canescens has a more acidic optimum pH of 5.0 units. Since the native pH of fruits and berries ranges from 3.3 to 4.0 units [Belitz H.-D., Grosch W., Schieberle P. Food Chemistry. 2009. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, p. 815], pectin lyase A from P. canescens is more active under conditions of hydrolysis of fruit and berry raw materials in comparison with similar enzymes of fungi of the genus Aspergillus. Moreover, the enzyme is stable at a pH close to the native pH of various fruits and berries. So, pectin lyase A from P. canescens after 3 hours of incubation at pH 4.0 at room temperature retains more than 90% activity, and when the temperature rises to 40 ° C and 50 ° C, pectin lyase activity remains at 70% and 40% of the initial activity. Consequently, pectin lyase A from P.canescens is an active and stable pectolytic enzyme under the hydrolysis of fruit and berry raw materials, and the preparation of enzyme preparations with high pectolytic and cellulolytic activities based on P.verruculosum strains secreting heterologous pectin lyase A from P.canescens is advisable .
Известно, что ферментные препараты с β-глюкозидазой способствуют улучшению органолиптических показателей продуктов, изготовленных из плодово-ягодного сырья. Например, под действием β-глюкозидазы происходит высвобождение соединений, способствующих усилению фруктово-цветочной нотки при изготовлении джема из вишни и сливы, β-глюкозидазу также используют для удаления горечи из цитрусовых соков и джемов [Belitz H.-D., Grosch W., Schieberle P. Food Chemistry. 2009. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1070 р.]. Поэтому β-глюкозидаза в ферментных препаратах для обработки плодово-ягодного сырья является значимым компонентом, а получение ферментных препаратов с высокой β-глюкозидазной активностью также является актуальной задачей.It is known that enzyme preparations with β-glucosidase contribute to the improvement of organoliptic parameters of products made from fruit and berry raw materials. For example, under the action of β-glucosidase, compounds are released that enhance the fruity-floral note in the manufacture of cherry and plum jam, β-glucosidase is also used to remove bitterness from citrus juices and jams [Belitz H.-D., Grosch W., Schieberle P. Food Chemistry. 2009. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1070 p.]. Therefore, β-glucosidase in enzyme preparations for processing fruit and berry raw materials is an important component, and the preparation of enzyme preparations with high β-glucosidase activity is also an urgent task.
Таким образом, ферментные препараты для гидролиза плодово-ягодного сырья получают с использованием рекомбинантных штаммов P.verruculosum, трансформированных смесью двух плазмид, несущих гены гетерологичных β-глюкозидазы (целлобиазы) из A.niger и пектинлиазы из P.canescens.Thus, enzyme preparations for hydrolysis of fruit and berry raw materials are obtained using recombinant P.verruculosum strains transformed with a mixture of two plasmids carrying heterologous β-glucosidase (cellobiase) genes from A.niger and pectin lyase from P.canescens.
Прототипом разработанного технического решения может служить патент РФ №2378372 «Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба Penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата». Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения фермента, предпочтительно целлюлазы или ксиланазы, расщепляющих целлюлозу или ксиланы, соответственно, путем культивирования штамма гриба P.verruculosum. При этом указанный штамм получают трансформацией клетки гриба P.verruculosum генетической конструкцией, содержащей целевую кодирующую последовательность фермента, функционально связанную с регуляторными элементами гена целлобиогидролазы I P.verruculosum, которые представляют собой промотор и терминатор гена целлобиогидролазы I, а также сигнальным пептидом соответствующего целевого гена.The prototype of the developed technical solution can be the patent of the Russian Federation No. 2378372 "Genetic design for the expression of target homologous and heterologous genes in the cells of the mycelial fungus Penicillium verruculosum used as the host, a method for producing a strain of the fungus Penicillium verruculosum and a method for producing an enzyme preparation". The invention relates to biotechnology and is a method for producing an enzyme, preferably cellulase or xylanase, cleaving cellulose or xylans, respectively, by culturing a strain of the fungus P.verruculosum. Moreover, this strain is obtained by transforming the P.verruculosum fungal cell with a genetic construct containing the target coding sequence of the enzyme functionally linked to the regulatory elements of the P. verruculosum cellobiohydrolase I gene, which are the promoter and terminator of the cellobiohydrolase I gene, as well as the signal peptide of the corresponding target gene.
Техническая задача, решаемая группой разработанных технических решений, состоит в создании способа получения ферментных препаратов с заданным соотношением ферментов карбогидразного комплекса при ферментации рекомбинантных штаммов, полученных при трансформации реципиентного высокопродуктивного штамма P.verruculosum смесью двух плазмид, несущих гены гетерологичных β-глюкозидазы (целлобиазы) из A.niger и пектинлиазы А из P.canescens.The technical problem solved by the group of developed technical solutions consists in creating a method for producing enzyme preparations with a given ratio of enzymes of the carbohydrase complex during fermentation of recombinant strains obtained by transformation of a recipient highly productive P.verruculosum strain with a mixture of two plasmids carrying heterologous β-glucosidase (cellobiase) genes from A.niger and pectin lyase A from P. canescens.
Технический результат, получаемый при реализации разработанных технических решений, состоит в получении промышленных ферментных препаратов (ФП) сбалансированного состава с высокой пектолитической и целлюлолитической, в частности, β-глюкозидазной, активностью при культивировании новых мультикопийных штаммов грибов рода P.verruculosum, полученных с привлечением методов рекомбинантных ДНК и микробиологии.The technical result obtained by the implementation of the developed technical solutions consists in obtaining industrial enzyme preparations (FP) of a balanced composition with high pectolytic and cellulolytic, in particular, β-glucosidase activity in the cultivation of new multicopy strains of P. verruculosum fungi, obtained using methods recombinant DNA and microbiology.
Для получения указанного технического результата предложено провести трансформацию мицелиального гриба P.verruculosum, используемого в качестве хозяина, смесью двух плазмид, обеспечивающих экспрессию целевых гетерологичных генов. Целевые плазмиды содержат целевую кодирующую последовательность гена β-глюкозидазы (целлобиазы) из A.niger или пектинлиазы А из P.canescens, функционально связанную с регуляторными элементами, промотором и терминатором, гена целлобиогидролазы I из P.verruculosum.In order to obtain the indicated technical result, it was proposed to transform P. myrucelium fungus P.verruculosum, used as a host, with a mixture of two plasmids providing expression of target heterologous genes. Target plasmids contain the target coding sequence of the β-glucosidase (cellobiase) gene from A. niger or pectin lyase A from P. canescens, functionally linked to the regulatory elements, promoter and terminator, of the cellobiohydrolase I gene from P. verruculosum.
Для получения указанного технического результата предложено также использовать способ получения штамма гриба P.verruculosum - продуцента карбогидразного комплекса ферментов, кодирующихся нуклеотидной последовательностью генов β-глюкозидазы (целлобиазы) из A.niger или пектинлиазы А из P.canescens, предусматривающей трансформацию клетки гриба P.verruculosum смесью двух плазмид, состоящих из целевой кодирующей последовательности, функционально связанной с регуляторными элементами, промотором и терминатором, гена целлобиогидролазы I P.verruculosum.To obtain the indicated technical result, it is also proposed to use a method for producing a P.verruculosum fungus strain, a producer of a carbohydrase complex of enzymes encoded by the nucleotide sequence of β-glucosidase (cellobiase) genes from A.niger or pectin lyase A from P.canescens, involving the transformation of P.verruculosum fungal cells a mixture of two plasmids consisting of a target coding sequence operably linked to regulatory elements, a promoter and a terminator, of the P. verruculosum cellobiohydrolase I gene.
Кроме того, для получения указанного технического результата предложено использовать способ получения ферментных препаратов, включающих ферменты карбогидразного комплекса, расщепляющие растительные полисахариды, путем культивирования микроорганизмов, причем ранее указанным способом получают штаммы гриба P.verruculosum, осуществляют культивирование полученных штаммов и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости гриба. При реализации указанного способа для получения комплексных ферментного препарата получают штаммы P.verruculosum РВ4 и PB7 (ВКМ F-4586D, ВКМ F-4587D), мультикопийные по гену pelA - пектинлиазы А из P.canescens и гену bglI - β-глюкозидазы (целлобиазы) из A.niger.In addition, to obtain the indicated technical result, it is proposed to use a method for producing enzyme preparations, including carbohydrase complex enzymes that break down plant polysaccharides by cultivating microorganisms, moreover, P.verruculosum fungus strains are obtained by the above-mentioned method, the obtained strains are cultured and the target product is isolated from the culture fluid mushroom. When implementing this method to obtain complex enzyme preparation, strains of P.verruculosum PB4 and PB7 (VKM F-4586D, VKM F-4587D) are obtained, multicopy of the pelA gene - pectin lyase A from P. canescens and the bglI gene of β-glucosidase (cellobiase) from A.niger.
Указанные варианты не исчерпывают возможности разработанного способа.These options do not exhaust the possibilities of the developed method.
Схема разработки способа получения каждого из ферментных препаратов, обладающего комплексом карбогидразных активностей, складывется из трех типовых этапов.The development scheme of a method for producing each of the enzyme preparations possessing a complex of carbohydrase activities consists of three typical steps.
Этап 1. Амплифицируют целевые гены ферментов карбогидразного комплекса - pelA, кодирующий пектинлиазы А из P.canescens, и bglI, кодирующий β-глюкозидазу (целлобиазу) из A.niger, а также промоторную и терминаторную область гена cbhI P.verruculosum. Конструируют две плазмиды - pPelA и pBG, представляющие собой полинуклеотидные последовательности, состоящие из промоторной области гена cbhl, сигнального пептида соответствующего целевого гена, целевого гена pelA в составе плазмиды pPelA, целевого гена bglI в составе плазмиды pBG и терминаторной области гена cbhI.Stage 1. The target genes of the enzymes of the carbohydrase complex are amplified - pelA, encoding pectin lyase A from P. canescens, and bglI, encoding β-glucosidase (cellobiase) from A. niger, as well as the promoter and terminator region of the P. verruculosum cbhI gene. Two plasmids are constructed: pPelA and pBG, which are polynucleotide sequences consisting of the promoter region of the cbhl gene, the signal peptide of the corresponding target gene, the target pelA gene in the plasmid pPelA, the target bglI gene in the plasmid pBG and the terminator region of the cbhI gene.
Этап 2. Проводят трансформацию реципиентного высокопродуктивного штамма P.verruculosum 537 (niaD-) смесью плазмид pPelA и pBG, полученных на Этапе 1, в условиях котрансформации вместе с плазмидой, несущей последовательность niaD гена, как маркера селекции, и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость искомые ферменты карбогидразного комплекса. Проводят ферментацию отобранных трансформантов в качалочных колбах и среди них выбирают наиболее продуктивные варианты штаммов-продуцентов комплекса карбогидраз с искомым соотношением карбогидраз.Stage 2. The recipient highly productive strain P.verruculosum 537 (niaD - ) is transformed with the mixture of pPelA and pBG plasmids obtained in Stage 1 under cotransformation together with the plasmid carrying the niaD gene sequence as a selection marker and selection of transformants secreting in culture fluid; desired enzymes of the carbohydrase complex. The selected transformants are fermented in rocking flasks and among them the most productive variants of the producer strains of the carbohydrase complex with the desired ratio of carbohydrases are selected.
Этап 3 - Проводят процесс ферментации отобранного наиболее активных вариантов штаммов-продуцентов в ферментерах, получают и характеризуют ФП с высокой активностью искомых ферментов карбогидразного комплекса.Stage 3 - Carry out the fermentation process of the selected most active variants of producer strains in fermenters, obtain and characterize AF with high activity of the desired enzymes of the carbohydrase complex.
Целесообразность применения полученных ФП определялась эффективностью их воздействия на различные плодово-ягодные субстраты, позволяющего интенсифицировать процессы извлечения сусла и его дальнейшую обработку в ряде производств пищевой промышленности. Условия ферментативной обработки, в свою очередь, подбирались исходя из возможности получения плодового сусла, максимально сохранявшего вкусовые и ароматические свойства, характерные для используемого растительного сырья.The feasibility of using the obtained AF was determined by the effectiveness of their effect on various fruit and berry substrates, which allows intensifying the processes of wort extraction and its further processing in a number of food industry productions. The conditions of the enzymatic treatment, in turn, were selected based on the possibility of obtaining fruit wort, preserving the taste and aromatic properties characteristic of the plant raw materials used to the maximum.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение целевых плазмид pPelA и pBG заключалось в клонировании генов bglI A.niger [(GenBank AN:DQ220304), 372] и pelA P.canescens в универсальный вектор, обеспечивающий экспрессию целевого гена под контролем промотора и терминатора гена cbhI P.verruculosum [РФ №2378372].Example 1. Obtaining the target plasmids pPelA and pBG consisted in cloning the A. niger bglI genes [(GenBank AN: DQ220304), 372] and P.canescens pelA into a universal vector that ensures the expression of the target gene under the control of the promoter and terminator of the P. verruculosum cbhI gene [RF No. 2378372].
Амплификацию гена bglI и pelA проводили с использованием геномной ДНК A.niger и P.canescens, а также праймеров соответствующего состава:The amplification of the bglI and pelA gene was performed using the genomic DNA of A.niger and P.canescens, as well as primers of the corresponding composition:
BGA 5′ CACTGGTGGYGGYRNTGCYACCCCYGTCTACCC 3′BGA 5 ′ CACTGGTGGYGGYRNTGCYACCCCYGTCTACCC 3 ′
BGB 5′ GTAGTGGTAGCCATCGCAGGTGGCGGAGTA 3′BGB 5 ′ GTAGTGGTAGCCATCGCAGGTGGCGGAGTA 3 ′
PELA 5′ CACTGGTGGYGGYRNTGCYACCCCYGTCTACCC 3′PELA 5 ′ CACTGGTGGYGGYRNTGCYACCCCYGTCTACCC 3 ′
PELB 5′ GTAGTGGTAGCCATCGCAGGTGGCGGAGTA 3′PELB 5 ′ GTAGTGGTAGCCATCGCAGGTGGCGGAGTA 3 ′
Последовательность нуклеотидов в праймерах PELA и PELB вычисляют на основе консервативных нуклеотидных последовательностей грибных пектин-лиаз, имеющихся в GenBank Database.The nucleotide sequence in the PELA and PELB primers is calculated based on the conserved nucleotide sequences of fungal pectin lyases available in the GenBank Database.
Нуклеотидные последовательности полученных фрагментов определяют методом секвенирования по Сэнгеру по обеим цепям. Общая структура экспрессионных кассет представлена на фиг. 1. Полинуклеотидная последовательность генетических конструкций представлена на фиг. 2.The nucleotide sequences of the obtained fragments are determined by Sanger sequencing on both chains. The general structure of expression cassettes is shown in FIG. 1. The polynucleotide sequence of the genetic constructs is shown in FIG. 2.
Первичные аминокислотные последовательности целевых ферментов представлены на фиг. 3.The primary amino acid sequences of the target enzymes are shown in FIG. 3.
Пример 2. Трансформация высокопродуктивного штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD-) смесью плазмид, указанных в Примере 1 для получения набора рекомбинантных штаммов, обладающих карбогидразными активностями.Example 2. Transformation of a highly productive recipient strain P.verruculosum 537 (niaD - ) with a mixture of plasmids indicated in Example 1 to obtain a set of recombinant strains with carbohydrase activities.
К смеси трех ДНК (1 мкг котрансформационной плазмиды PSTA10 (несущей ген niaD+ A.niger), 5 мкг плазмиды pPelA (несущей ген pelA из P.canescens) и 5 мкг плазмиды pBG (несущей ген β-глюкозидазы из A.niger)) объемом 20 мкл добавляют 200 мкл раствора протопластов штамма P.verruculosum 537 (niaD-), полученных по методике, описанной в статье [А. Y. Aleksenko, N. A. Makarova, I. V. Nikolaev, A. J. Clutterbuck Integrative and replicative transformation of Pénicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. - 1995. - V. 28. - P. 474-477] и 50 мкл буфера PCT1, содержащего: 50%-ный ПЭГ 4000 (по объему) + 0.01М трис-HCl рН 7.5 + 0.02М CaCl2. Смесь аккуратно перемешивают и оставляют на 20 мин во льду. Затем добавляют 500 мкл буфера РСТ1 и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Параллельно проводят эксперимент с контрольными протопластами без добавления ДНК. Далее пробирки со смесью протопластов и ДНК центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в 200 мкл стерильного раствора сорбитола (182,2 г/л). Трансформационную смесь стерильно переносят над пламенем горелки в 5 мл верхнего агара (для приготовления 100 мл верхнего агара берут 21,86 г 1,2 M сорбитола, 0,7 г агара, 0,8 г глюкозы, 1 мл 1М источника азота) перемешивают и распределяют агар по поверхности предварительно подготовленных чашек с нижним агаром (для приготовления 100 мл нижнего агара берут 21,86 г 1,2 M сорбитола, 2 г агара, 0,8 г глюкозы, 1 мл 1М источника азота). Так же переносят и контрольные смеси.To a mixture of three DNAs (1 μg of the PSTA10 cotransformation plasmid (carrying the niaD + A.niger gene), 5 μg of pPelA plasmid (carrying the pelA gene from P.canescens) and 5 μg of pBG plasmid (carrying the β-glucosidase gene from A.niger) 20 μl volume add 200 μl of a solution of protoplasts of the strain P.verruculosum 537 (niaD - ), obtained by the method described in the article [A. Y. Aleksenko, NA Makarova, IV Nikolaev, AJ Clutterbuck Integrative and replicative transformation of Pénicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. - 1995. - V. 28. - P. 474-477] and 50 μl of PCT1 buffer containing: 50% PEG 4000 (by volume) + 0.01 M Tris-HCl pH 7.5 + 0.02 M CaCl 2 . The mixture is gently mixed and left for 20 minutes in ice. Then add 500 μl of PCT buffer and leave for 5 min at room temperature. In parallel, an experiment is performed with control protoplasts without the addition of DNA. Next, tubes with a mixture of protoplasts and DNA are centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes. The supernatant is drained, and the pellet is resuspended in 200 μl of a sterile solution of sorbitol (182.2 g / l). The transformation mixture is sterilized over the burner flame in 5 ml of top agar (to prepare 100 ml of top agar, 21.86 g of 1.2 M sorbitol, 0.7 g of agar, 0.8 g of glucose, 1 ml of 1 M nitrogen source are taken) are mixed and distribute the agar on the surface of previously prepared plates with lower agar (for the preparation of 100 ml of lower agar, 21.86 g of 1.2 M sorbitol, 2 g of agar, 0.8 g of glucose, 1 ml of 1 M nitrogen source are taken). Control mixtures are also transferred.
Готовят три чашки Петри с нижним агаром, две с селективной средой (источник азота: NaNO3 10 mM) и одна - с неселективной (источник азота: NH4Cl 10 mM). Чашки Петри помещают в инкубатор на 30°С и оставляют там на 6 дней. На шестой день роста трансформанты переносят на селективную минимальную среду (источник азота: NaNO3 10 mM). В результате трансформации реципиентного штамма P.verruculosum 537 смесью плазмид получают около 90 трансформантов на 10 мкг введенной целевой ДНК, что соответствует стандартной частоте трансформации грибных штаммов.Prepare three Petri dishes with lower agar, two with selective medium (nitrogen source: NaNO 3 10 mM) and one with non-selective (nitrogen source: NH 4 Cl 10 mM). Petri dishes are placed in an incubator at 30 ° C and left there for 6 days. On the sixth day of growth, transformants were transferred to a selective minimal medium (nitrogen source: NaNO 3 10 mM). As a result of transformation of the recipient strain P.verruculosum 537 with a mixture of plasmids, about 90 transformants per 10 μg of the introduced target DNA are obtained, which corresponds to the standard transformation frequency of the fungal strains.
Для определения наличия встроенного экзогенного генетического материала в хромосому рекомбинантных штаммов проводят первичный скрининг трансформантов с использованием ПЦР-реакции. Поскольку целевая плазмида pBG содержит гетерологичный ген β-глюкозидазы (целлобиазы), то скрининг гена bglI осуществляют с использованием пары праймеров BGA и BGB. Полученный ПЦР-продукт, анализируемый методом электрофореза в агарозном геле, должен иметь размер ~3000 п.н., что соответствует размеру полинуклеотидной последовательности гена bglI из A.niger. Аналогичным образом скрининг гена pelA осуществляют с использованием пары праймеров PELA и PELB, получая ПЦР-продукт размером ~1500 п.н.To determine the presence of embedded exogenous genetic material in the chromosome of recombinant strains, primary transformants are screened using the PCR reaction. Since the target plasmid pBG contains a heterologous β-glucosidase (cellobiase) gene, the bglI gene is screened using a pair of BGA and BGB primers. The obtained PCR product, analyzed by agarose gel electrophoresis, should have a size of ~ 3000 bp, which corresponds to the size of the polynucleotide sequence of the bglI gene from A.niger. Similarly, pelA gene screening is performed using a pair of PELA and PELB primers to obtain a PCR product of ~ 1500 bp.
Пример 3. Получение ФП рекомбинантных штаммов РВ4 и PB7 P.verruculosum, мультикопийного по pelA гену пектинлиазы А из P.canescens (1-е семейство полисахарид-лиаз, молекулярная масса 38 кДа) и bglI гену β-глюкозидазы (целлобиазы) из A.niger (3-е семейство гликозид-гидролаз, молекулярная масса 120 кДа).Example 3. Obtaining AF recombinant strains PB4 and PB7 P.verruculosum multicopy pelA pectin lyase A gene from P. canescens (1st family of polysaccharide lyases, molecular weight 38 kDa) and bglI gene β-glucosidase (cellobiase) from A. niger (3rd family of glycoside hydrolases, molecular weight 120 kDa).
Полученные в Примере 2 позитивные по генам bglI и pelA трансформанты пересевают на чашки с минимальной средой и источником азота NaNO3 и инкубируют при 30°С в течение 140 часов до образования конидий. Затем трансформанты ферментируют в качалочных колбах, используя водную ферментационную среду следующего состава, в г/л: МКЦ - 40, пшеничные отруби - 10, дрожжевой экстракт - 10, (NH4)2SO4 - 5, KН2РО4 - 5, MgSO4×7H2O - 0,3, CaCl2×2H2O - 0,3, рН 4,5. Колбы инкубируют на качалке при 32°С и 200 об/мин в течение 144 ч. Далее отбирают трансформанты с увеличенной по сравнению с реципиентным штаммом P.verruculosum 537 пектинлиазной и β-глюкозидазной (целлобиазной) активностью.The bglI and pelA gene-positive transformants obtained in Example 2 are transplanted into plates with minimal medium and a nitrogen source of NaNO 3 and incubated at 30 ° C. for 140 hours until conidia is formed. Then the transformants are fermented in rocking flasks using an aqueous fermentation medium of the following composition, in g / l: MCC - 40, wheat bran - 10, yeast extract - 10, (NH 4 ) 2 SO 4 - 5, KH 2 PO 4 - 5, MgSO 4 × 7H 2 O — 0.3, CaCl 2 × 2H 2 O — 0.3, pH 4.5. Flasks were incubated on a shaker at 32 ° C and 200 rpm for 144 h. Next, transformants with increased pectinlase and β-glucosidase (cellobiase) activity compared to the recipient strain P.verruculosum were selected.
Для отобранных штаммов определяют в культуральной жидкости (КЖ) активности по следующим субстратам: пектин цитрусовый (степень этерификации (СЭ) ~70%, растворимый субстрат), МКЦ (микрокристаллическая целлюлоза, нерастворимый субстрат), КМЦ (Na-соль карбоксиметилцеллюлозы, растворимый субстрат), глюкуроноксилану березы, ПНФГ (п-нитрофенил-β-D-глюкопиранозид). Активность по отношению к пектину цитрусовому (пектинлиазная активность, характеризует активность пектинлиазы) определяют при 40°С и рН=5,0 по начальной скорости образования Δ-4,5-ненасыщенного продукта реакции, регистрируя изменение оптической плотности реакционной смеси при 232 нм. Активность по отношению к МКЦ (авицелазная активность, характеризует активность целлобиогидролаз) определяют при 40°С и рН=5,0 по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС). Активность по отношению к КМЦ (характеризует активность целлюлаз, преимущественно эндоглюканаз) и к глюкуроноксилану березы (характеризует активность ксиланаз) определяют при 50°С и рН=5,0 по начальной скорости образования ВС. Концентрация полисахаридных субстратов в реакционной смеси составляет 5 г/л. Концентрацию ВС определяют методом Шомоди-Нельсона [M. Somogui, 1945, JBC, №61, p 160].For the selected strains, the activity in the culture fluid (QOL) is determined by the following substrates: citrus pectin (degree of esterification (SE) ~ 70%, soluble substrate), MCC (microcrystalline cellulose, insoluble substrate), CMC (carboxymethyl cellulose Na salt, soluble substrate) , birch glucuronoxylan, PNPH (p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside). Citrus pectin activity (pectin lyase activity, characterizes pectin lyase activity) is determined at 40 ° C and pH = 5.0 by the initial rate of formation of the Δ-4,5-unsaturated reaction product, recording a change in the optical density of the reaction mixture at 232 nm. Activity in relation to MCC (aerosol activity, characterizes the activity of cellobiohydrolases) is determined at 40 ° C and pH = 5.0 according to the initial rate of formation of reducing sugars (BC). Activity in relation to CMC (characterizes the activity of cellulases, mainly endoglucanases) and to birch glucuronoxylan (characterizes the activity of xylanases) is determined at 50 ° C and pH = 5.0 according to the initial rate of formation of BC. The concentration of polysaccharide substrates in the reaction mixture is 5 g / l. The concentration of the sun is determined by the Shomody-Nelson method [M. Somogui, 1945, JBC, No. 61, p 160].
Активность по пНФГ (характеризует активность β-глюкозидаз / целлобиаз) определяют по начальной скорости образования п-нитрофенола (ПНФ). Раствор 0,05 M субстрата в 0,1 М, Na-ацетатном буфере, рН 5,0, инкубируют с ферментом при 40°С в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением раствора 1М Na2CO3. Образовавшийся в растворе ПНФ определяли спектрофотометрически при длине волны 400 нм, используя коэффициент молярного поглощения (ε=18300 моль*см-1).PNFH activity (characterizes β-glucosidase / cellobiase activity) is determined by the initial rate of p-nitrophenol (PNP) formation. A solution of 0.05 M substrate in 0.1 M Na-acetate buffer, pH 5.0, was incubated with the enzyme at 40 ° C for 10 minutes. The reaction is stopped by adding a solution of 1M Na 2 CO 3 . The PNP formed in the solution was determined spectrophotometrically at a wavelength of 400 nm using the molar absorption coefficient (ε = 18300 mol * cm -1 ).
Активность ферментов выражают в международных единицах: 1 единица соответствует образованию 1 мкмоль продукта за 1 мин при действии ферментов на соответствующий субстрат.The enzyme activity is expressed in international units: 1 unit corresponds to the formation of 1 μmol of the product in 1 min when the enzymes act on the corresponding substrate.
Для КЖ проводят ДДС-электрофорез в денатурирующих условиях для идентификации полос, соответствующих зонам, занимаемым пектинлиазой (38 кДа), целлобиогидролазой I (66 кДа), эндоглюканазой II (40 кДа) и β-глюкозидазой (120 кДа).For QOL, DDS electrophoresis is performed under denaturing conditions to identify bands corresponding to the zones occupied by pectin lyase (38 kDa), cellobiohydrolase I (66 kDa), endoglucanase II (40 kDa) and β-glucosidase (120 kDa).
Проводят ферментацию наиболее продуктивных трансформантов P.verruculosum РВ4 и РВ7 (ВКМ F-4586D, ВКМ F-4587D) в 10-литровом ферментере, используя питательную среду того же состава, что в качалочных колбах, и проводя подпитку глюкозой, при рН 4,5 и 32°С в течение 144 час. После окончания ферментации с помощью ультрафильтрации КЖ на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кDa) и последующего лиофильного высушивания получают сухой ФП и характеризуют их по уровню карбогидразных активностей (см. Табл. 1).Fermentation of the most productive transformants P.verruculosum PB4 and PB7 (VKM F-4586D, VKM F-4587D) is carried out in a 10-liter fermenter using a nutrient medium of the same composition as in the rocking flasks and feeding with glucose at pH 4.5 and 32 ° C for 144 hours. After fermentation by ultrafiltration of QOL on hollow fibers (with a cutoff limit of 10 kDa) and subsequent freeze drying, dry phase transitions are obtained and characterized by the level of carbohydrase activities (see Table 1).
Карбогидразные активности отобранных наиболее активных трансформантов P.verruculosum РВ4 и PB7 (ВКМ F-4586D, ВКМ F-4587D) в КЖ после ферментации в 10-литровом ферментере составляют: 110 и 66 ед/мл пектинлиазной активности, 80 и 460 ед/мл ксиланазной активности, 133 и 325 ед/мл КМЦ-азной активности, 49 и 37 ед/мл β-глюкозидазной активности, соответственно. Активности полученных ферментных препаратов приведены в Табл. 1.Carbohydrase activities of the selected most active transformants P.verruculosum PB4 and PB7 (VKM F-4586D, VKM F-4587D) in QOL after fermentation in a 10-liter fermenter are: 110 and 66 units / ml of pectinase activity, 80 and 460 units / ml of xylanase activity, 133 and 325 units / ml of CMC-ase activity, 49 and 37 units / ml of β-glucosidase activity, respectively. The activity of the obtained enzyme preparations are given in Table. one.
Пример 4. Получение сладкого виноградного сусла как полупродукта винодельческого производства с использованием ферментных препаратов РВ7, 537, а также без добавления ферментного препарата.Example 4. Obtaining sweet grape must as an intermediate in winemaking using enzyme preparations PB7, 537, as well as without adding an enzyme preparation.
Виноградное сусло получали из технических сортов винограда «Ркацители» и «Каберне Совиньон» в соответствии с принципиальными технологическими схемами, представленными в Табл. 2.The grape must was obtained from the technical grapes “Rkatsiteli” and “Cabernet Sauvignon” in accordance with the basic technological schemes presented in Table. 2.
K2S2O5 вносили в образцы, растворяя его в небольшом количестве сусла. Ферментный препарат PB 7 обеспечивал наибольший выход самотечных фракций виноградного сусла после 1 часа обработки мезги при дозировке 0,03% от массы сырья (дозировка рассчитывалась исходя из содержания общего белка в сухом ФП).K 2 S 2 O 5 was introduced into the samples, dissolving it in a small amount of wort. The enzyme preparation PB 7 provided the highest yield of gravity fractions of grape must after 1 hour of pulp processing at a dosage of 0.03% by weight of the feed (the dosage was calculated based on the total protein content in dry AF).
В ходе работы велся контроль выхода самотечных и прессовых фракций сусла из образцов, по результатам которого можно судить о преимуществах обработки виноградной мезги ФП.During the work, the exit of gravity and press fractions of the wort from the samples was controlled, according to the results of which it is possible to judge the advantages of processing grape pulp AF.
Анализируя данные, представленные в Табл. 3, можно заключить, что при ферментативной обработке виноградной мезги увеличивается выход самотечных фракций сусла, отличающихся наиболее высоким качеством (низкая массовая концентрация взвесей в сусле), а также общий выход сусла из мезги, что говорит о мацерирующем эффекте ФП.Analyzing the data presented in Tab. 3, it can be concluded that the enzymatic processing of grape pulp increases the yield of gravity wort fractions of the highest quality (low mass concentration of suspensions in the must), as well as the overall yield of the wort from the pulp, which indicates the macerating effect of AF.
Пример 5. Получение сусла из рябины сортов «Сказочная» и «Черноокая» как полупродукта соковой промышленности с использованием ферментных препаратов РВ4, 537, а также без добавления ферментного препарата.Example 5. Obtaining must from mountain ash of the varieties "Fairytale" and "Black eye" as an intermediate in the juice industry using enzyme preparations PB4, 537, as well as without adding an enzyme preparation.
Мацерацию проводили в стандартных условиях при 40°С, титруемой кислотности 6,8 г/л и 900 об/мин в соответствии с принципиальной технологической схемой, представленной в Табл. 2. Через 3 часа определяли выход сока-самотека из субстрата через бумажный складчатый фильтр.Maceration was carried out under standard conditions at 40 ° C, titratable acidity of 6.8 g / l and 900 rpm in accordance with the flow chart presented in Table. 2. After 3 hours, the yield of gravity juice from the substrate was determined through a folded paper filter.
Каждая проба включала в себя рябиновое пюре, раствор ферментного препарата, дистиллированную воду. Разбавление пробы соответствовало заданной титруемой кислотности. Дозировка ферментных препаратов составляла 0,05% от массы субстрата и рассчитывалась с учетом содержания в препаратах общего белка.Each sample included mountain ash puree, a solution of the enzyme preparation, distilled water. Dilution of the sample corresponded to a given titratable acidity. The dosage of enzyme preparations was 0.05% of the substrate mass and was calculated taking into account the total protein content in the preparations.
В Табл. 4 представлены результаты контроля выхода самотечных фракций из образцов, исходя из которых можно судить о мацерирующих способностях ФП РВ4, позволившего увеличить выход сусла из рябиновой мезги на 50% в сравнении с контрольными образцами, не проходившими ферментативную обработку.In Tab. Figure 4 presents the results of controlling the exit of gravity fractions from samples, based on which it is possible to judge the macerating ability of PB PB4, which allowed to increase the yield of wort from the mountain ash pulp by 50% in comparison with control samples that did not undergo enzymatic treatment.
Приведенные параметры обработки растительного сырья были выбраны в результате предварительных экспериментов как наиболее оптимальные с точки зрения экономической эффективности и сохранения высокого качества получаемого полупродукта.The above processing parameters of plant materials were selected as a result of preliminary experiments as the most optimal from the point of view of economic efficiency and maintaining the high quality of the resulting intermediate.
Пример 6. Определение вязкости сусла и содержания в нем взвесей после ферментативной обработки, как качественных характеристик полупродукта.Example 6. Determination of the viscosity of the wort and its content of suspensions after enzymatic treatment, as the qualitative characteristics of the intermediate.
Самотечные и прессовые фракции виноградного сусла объединяли, после чего измеряли вязкость общего сусла и содержание в нем взвесей. Также эти параметры определяли в рябиновом сусле, прошедшем через складчатый фильтр.The gravity and press fractions of the grape must were combined, after which the viscosity of the total must and the content of suspended matter were measured. Also, these parameters were determined in a mountain ash must, passing through a pleated filter.
Для определения вязкости образцы сусла предварительно центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 мин. Вискозиметр Оствальда термостатировали при 40°C, вносили 5 см3 анализируемого раствора и инкубировали 5 мин. Определяли время истечения раствора в трех повторностях, отличающихся не более чем на 0,1 секунды. Между определениями вискозиметр промывали дистиллированной водой и ацетоном.To determine the viscosity, the wort samples were pre-centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes. Ostwald viscometer thermostated at 40 ° C, was added with 5 cm 3 of the sample solution and incubated for 5 min. The flow time of the solution was determined in triplicate, differing by no more than 0.1 seconds. Between determinations, the viscometer was washed with distilled water and acetone.
Вязкость сока определяли в сП, исходя из калибровочного графика, построенного с использованием воды, ацетона, изобутанола и н-бутанола.The viscosity of the juice was determined in SP, based on a calibration graph constructed using water, acetone, isobutanol and n-butanol.
Содержание взвесей определяли гравиметрически, отделяя их центрифугированием.Suspension was determined gravimetrically, separating them by centrifugation.
В предварительно взвешенные центрифужные пробирки помещали по 5 см образца и центрифугировали при частоте вращения 8000 об/мин в течение 20 мин. Осветленный раствор сливали, оставляя пробирки с осадком в течение 3 дней высушиваться. Сухой осадок вместе с пробиркой взвешивали с точностью до четвертого знака.5 cm of the sample were placed in pre-weighed centrifuge tubes and centrifuged at a rotation speed of 8000 rpm for 20 min. The clarified solution was poured, leaving the tubes with sediment for 3 days to dry. The dry sediment together with the tube was weighed to the fourth digit.
Содержание взвесей рассчитывали по формуле:The suspension content was calculated by the formula:
C=(m2-m1)*100/V, гдеC = (m 2 -m 1 ) * 100 / V, where
m2 - масса центрифужной пробирки с осадком взвесей, г;m 2 - the mass of the centrifuge tube with sediment suspensions, g;
m1 - масса пустой центрифужной пробирки, г;m 1 - mass of an empty centrifuge tube, g;
V - объем пробы, см3.V is the sample volume, cm 3 .
Результаты контроля данных качественных показателей полупродуктов винодельческой и соковой промышленности (Табл. 5) подтвердили положительный эффект, оказываемый используемыми ФП в процессе их получения.The results of the control of these qualitative indicators of semi-products of the wine and juice industries (Table 5) confirmed the positive effect of the used FPs in the process of obtaining them.
Claims (6)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2574206C1 true RU2574206C1 (en) | 2016-02-10 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2378372C2 (en) * | 2008-03-03 | 2010-01-10 | ООО НПК "Фермтек" | Genetic maker to ensure expression of target homologous and heterologous genes in cells of filamentous fungus penicillium verruculosum; used as host, method for making strain of fungus penicillium verruculosum and method for making enzymatic agent |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2378372C2 (en) * | 2008-03-03 | 2010-01-10 | ООО НПК "Фермтек" | Genetic maker to ensure expression of target homologous and heterologous genes in cells of filamentous fungus penicillium verruculosum; used as host, method for making strain of fungus penicillium verruculosum and method for making enzymatic agent |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| БУШИНА Е.В. Новые высокоэффективные ферментные препараты для гидролиза пектин- и целлюлозосодержащих субстратов на основе рекомбинантных штаммов грибов рода Penicillium. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва-2012, дата поступления в РГБ 10.01.2013. * |
| ПРАВИЛЬНИКОВ А.Г. Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва-2012, с. 1-23. SINITSYNA O.A. ET AL. Isolation and characterization of extracellular pectin lyase from Penicillium canescens. // Biochemistry (Mosc). 2007 May;72(5):565-71. GenBank: DQ220304.1, 31-OCT-2005. Найдено в Интернет по адресу http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/78172197. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Van Rensburg et al. | Enzymes in winemaking: harnessing natural catalysts for efficient biotransformations | |
| Naidu et al. | Production of pectolytic enzymes–a review | |
| DK2379717T3 (en) | A process for the preparation of an enzyme product, | |
| US8802415B2 (en) | Talaromyces transformants | |
| EP2421965B1 (en) | Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof | |
| Shrestha et al. | New insights in pectinase production development and industrial applications | |
| US8790894B2 (en) | Mutant cellobiohydrolase | |
| Martos et al. | Production of pectinolytic enzymes by the yeast Wickerhanomyces anomalus isolated from citrus fruits peels | |
| US10550376B2 (en) | Xylanase | |
| Mojsov et al. | Enzymes and wine–the enhanced quality and yield | |
| Almowallad et al. | Utilization of agro-industrial orange peel and sugar beet pulp wastes for fungal endo-polygalacturonase production | |
| US10266814B2 (en) | Systems and methods for production and use of fungal glycosyl hydrolases | |
| AU3948393A (en) | Endo-beta -1,4-glucanase and a DNA sequence | |
| Byaruagaba-Bazirake et al. | Characterisation of banana wine fermented with recombinant wine yeast strains | |
| RU2574206C1 (en) | New recombinant strain (versions) of mycelial fungus penicillium verruculosum, and enzymatic agent (versions) intended for hydrolysis of fruit raw material, and method of its production | |
| RU2532840C2 (en) | FUNGAL STRAIN Penicillium verruculosum B10 EGII PRODUCER OF ENDO-1,3/1,4-β-GLUCANASE, CELLULASE, β-GLUCOSIDASE AND XYLANASE AND METHOD OF PRODUCTION OF FODDER COMPLEX ENZYME PREPARATION | |
| RU2646132C1 (en) | Recombinant strain of mitsenal mushroom penicillium canescens cl14, production component of cellulosum clostridium thermocellum and method of its cultivation | |
| Sinitsyn et al. | Using an inducible promoter of the glucoamylase gene to construct new multienzyme complexes from Penicillium verruculosum | |
| Akçadağ | Recombinant production of pectinolytic enzymes in pichia pastoris and process optimization for food industry | |
| Debnath | Trichoderma Enzymes in the Wine and Beer Industry | |
| RU2538149C2 (en) | CELL OF MYCELIAL FUNGUS Penicillium canescens - XYLANASE AND LACCASE PRODUCENT, METHOD OF OBTAINING COMBINED EXYME XYLANASE AND LACCASE PREPARATION | |
| RU2612158C1 (en) | New recombinant strain of filamentous fungi penicillium canescens cs15, producing cellulase clostridium thermocellum and method of its cultivation | |
| Parvez et al. | Biolistic transformation of Saccharomyces cerevisiae with β-glucosidase gene from Cellulomonas biazotea | |
| CN116355769A (en) | Kluyveromyces marxianus strain and application thereof | |
| EP3282012A1 (en) | Improved variants of cellobiohydrolase 1 |