RU2571507C1 - Diagnostic and monitoring technique for oncology diseases with use of blood exosomes - Google Patents
Diagnostic and monitoring technique for oncology diseases with use of blood exosomes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2571507C1 RU2571507C1 RU2014140894/15A RU2014140894A RU2571507C1 RU 2571507 C1 RU2571507 C1 RU 2571507C1 RU 2014140894/15 A RU2014140894/15 A RU 2014140894/15A RU 2014140894 A RU2014140894 A RU 2014140894A RU 2571507 C1 RU2571507 C1 RU 2571507C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- blood
- exosomes
- plasma
- concentration
- cancer
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к области диагностической медицины, а именно к разработке неинвазивных способов диагностики онкологических заболеваний человека, а также мониторинга эффективности противораковой терапии и направлено на повышение эффективности аналитических систем путем анализа опухолеспецифических маркеров и белков в составе экзосом крови.The invention relates to the field of diagnostic medicine, namely to the development of non-invasive methods for diagnosing human oncological diseases, as well as monitoring the effectiveness of anti-cancer therapy, and is aimed at increasing the effectiveness of analytical systems by analyzing tumor-specific markers and proteins in blood exosomes.
Экзосомы крови представляют собой микровезикулы размером 40-100 нм, активно секретируемые через каскад экзоцитоза, обычно используемый для разгрузки рецептора и внутриклеточных перекрестных сигналов. В дополнение к белкам главного комплекса гистосовместимости (МНС I, МНС II) и белкам, вовлеченным в представление антигена, экзосомы могут содержать мембранные и цитозольные белки, вовлеченные во множество клеточных функций. Экзосомы продуцируются всеми клетками организма человека и животных, а их состав и свойства зависят от функционального состояния клеток-продуцентов, что определяет уникальность экзосом каждой клетки (клеточной популяции) [1].Blood exosomes are microvesicles 40-100 nm in size, actively secreted through the cascade of exocytosis, usually used to unload the receptor and intracellular cross-signals. In addition to the proteins of the major histocompatibility complex (MHC I, MHC II) and the proteins involved in antigen presentation, exosomes may contain membrane and cytosolic proteins involved in many cellular functions. Exosomes are produced by all cells of the human and animal body, and their composition and properties depend on the functional state of producer cells, which determines the uniqueness of the exosomes of each cell (cell population) [1].
Раннее выявление в крови опухолеспецифических маркеров является важной проблемой в диагностической медицине. В то время как прямой анализ пораженных тканей бывает затруднен или недоступен (нет симптоматики), периферическая кровь является легкодоступным биологическим материалом для получения экзосом, которые могут быть удобным источником опухолеспецифичных мРНК [2], микроРНК [3] и белков [4].Early detection of tumor-specific markers in the blood is an important problem in diagnostic medicine. While direct analysis of affected tissues may be difficult or unavailable (no symptoms), peripheral blood is an easily accessible biological material for exosomes, which can be a convenient source of tumor-specific mRNA [2], microRNA [3] and proteins [4].
Известен способ диагностики меланомы при помощи определения в сыворотке крови пациентов матричной опухолеспецифичной РНК (мРНК), включающий сбор крови самотеком с последующим разделением собранной крови на сывороточную и клеточную фракции и определением РНК в сыворотке крови. Данным способом мРНК обнаруживают лишь в 67% случаев у больных меланомой [5].A known method for the diagnosis of melanoma by determining in the blood serum of patients matrix tumor-specific RNA (mRNA), including collecting blood by gravity, followed by separation of the collected blood into serum and cell fractions and determination of RNA in blood serum. In this way, mRNA is detected only in 67% of cases in patients with melanoma [5].
Недостатком данного способа являются трудоемкость, высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов, низкая чувствительность и специфичность маркера для определенного вида рака.The disadvantage of this method is the complexity, the high probability of obtaining false negative results, low sensitivity and specificity of the marker for a particular type of cancer.
Известен способ диагностики рака при помощи определения концентрации мРНК в плазме крови онкологических больных [6], включающий сбор крови самотеком с последующим разделением собранной крови на сыворотку и фракцию клеток крови и определением концентрации мРНК маммоглобина в сыворотке крови при помощи обратной транскрипции (ОТ) с последующей ПНР и детекцией амплифицированного продукта окрашиванием бромистым этидием в агарозном геле. Известный способ выявляет мРНК маммоглобина в сыворотке крови у здоровых доноров в 38% случаев, а у больных с раком молочной железы - 60% случаев.A known method for diagnosing cancer by determining the concentration of mRNA in the blood plasma of cancer patients [6], including collecting blood by gravity, followed by separation of the collected blood into serum and blood cell fraction and determining the concentration of mammoglobin mRNA in blood serum using reverse transcription (RT), followed by NDP and detection of the amplified product by staining with ethidium bromide in an agarose gel. The known method reveals serum mammoglobin mRNA in healthy donors in 38% of cases, and in patients with breast cancer - 60% of cases.
Недостатками данного способа являются высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов, поскольку данный способ не позволяет выявлять все виды онкологических заболеваний, высокая вероятность получения ложноположительных результатов, поскольку увеличение концентрации мРНК маммоглобина в плазме крови наблюдается также у здоровых женщин (44%) и мужчин (29%) [6].The disadvantages of this method are the high probability of obtaining false negative results, since this method does not allow to detect all types of oncological diseases, a high probability of obtaining false positive results, since an increase in the concentration of mammoglobin mRNA in blood plasma is also observed in healthy women (44%) and men (29%) [6].
Известен способ диагностики онкозаболеваний путем выявления опухолеспецифических микроРНК в плазме крови. Для анализа выделяют микроРНК одним из известных способов, а затем проводят ОТ с последующей количественной ПЦР [7]. Показано, что при раке легкого в плазме крови микроРНК-182 выявляется у 60,7% пациентов (17/28), а микроРНК-210 - 57,1% (16/28).A known method for the diagnosis of cancer by detecting tumor-specific miRNAs in blood plasma. For analysis, miRNAs are isolated using one of the known methods, and then RT is carried out followed by quantitative PCR [7]. It was shown that with lung cancer in plasma, miRNA-182 is detected in 60.7% of patients (17/28), and miRNA-210 - 57.1% (16/28).
Недостатками данного способа являются низкая достоверность результатов диагностики раковых и особенно предраковых состояний из-за небольшого удельного содержания специфических последовательностей микроРНК, что затрудняет клиническое использование данного способа.The disadvantages of this method are the low reliability of the results of the diagnosis of cancer and especially precancerous conditions due to the small specific content of specific miRNA sequences, which complicates the clinical use of this method.
Известен способ диагностики рака при помощи выявления опухолеспецифических белков в плазме крови онкологических больных, включающий сбор крови самотеком с последующим разделением собранной крови на сыворотку и фракцию клеток крови и определением концентрации ракового эмбрионального антигена (РЭА) при помощи иммуноферментного анализа. В норме сывороточный уровень РЭА не превышает 3 нг/мл. Повышенная концентрация этого антигена в крови наблюдается у 30-50% больных при карциномах молочной железы, головы и шеи; у 50-90% больных с карциномой пищеварительного тракта и дыхательных путей, а также у 23% больных со злокачественными новообразованиями соединительнотканного происхождения [8].A known method for diagnosing cancer by detecting tumor-specific proteins in the blood plasma of cancer patients, including collecting blood by gravity, followed by separation of the collected blood into serum and blood cell fraction and determining the concentration of cancer embryonic antigen (CEA) using enzyme-linked immunosorbent assay. Normally, the serum CEA level does not exceed 3 ng / ml. An increased concentration of this antigen in the blood is observed in 30-50% of patients with carcinomas of the mammary gland, head and neck; in 50-90% of patients with carcinoma of the digestive tract and respiratory tract, as well as in 23% of patients with malignant neoplasms of connective tissue origin [8].
Недостатками данного способа являются низкая специфичность и высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов.The disadvantages of this method are the low specificity and the high probability of obtaining false negative results.
Ближайшим к заявленному способу - прототипом, является способ диагностики рака легкого при помощи определения концентрации микроРНК в составе экзосом из плазмы крови онкологических больных [9]. Способ заключается в выделении экзосом из плазмы крови путем ультрацентрифугирования и определении концентрации 9 микроРНК (miR-629, miR-379, miR-378a, miR-200b-5p, miR-154-3р, miR-151a-5p, miR-139-5p, miR-100 и miR-30a-3p) у онкологических больных после проведения обратной транскрипции (ОТ) и последующей количественной ПИР Данный способ обеспечивает чувствительность 91% и специфичность 60%.The closest to the claimed method, the prototype, is a method for diagnosing lung cancer by determining the concentration of microRNA in the composition of exosomes from blood plasma of cancer patients [9]. The method consists in isolating exosomes from blood plasma by ultracentrifugation and determining the concentration of 9 microRNAs (miR-629, miR-379, miR-378a, miR-200b-5p, miR-154-3p, miR-151a-5p, miR-139- 5p, miR-100 and miR-30a-3p) in cancer patients after reverse transcription (RT) and subsequent quantitative PIR. This method provides a sensitivity of 91% and a specificity of 60%.
Недостатками данного способа являются большая трудоемкость (анализ 9 микроРНК) и низкая специфичность.The disadvantages of this method are the high complexity (analysis of 9 miRNAs) and low specificity.
Задачей изобретения является разработка более простого и достоверного способа для диагностики, оценки раковых состояний и мониторинга противораковой терапии.The objective of the invention is to develop a simpler and more reliable method for the diagnosis, assessment of cancer conditions and monitoring of cancer therapy.
Технический результат: уменьшение трудоемкости способа и повышение специфичности диагностики, при сохранении высокой чувствительности способа.Effect: reducing the complexity of the method and increasing the specificity of the diagnosis, while maintaining high sensitivity of the method.
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.The technical task is achieved by the proposed method, which consists in the following.
Производят забор крови в вакутейнер или другие пробирки для сбора и консервирования крови (например, Cell-Free DNA ВСТ, Streck, США). Кровь разделяют на плазму и клеточную фракцию при помощи центрифугирования. Далее проводят выделение экзосом, связанных с поверхностью форменных элементов, из клеточной фракции. Для этого может быть использован любой пригодный метод. В преимущественном варианте, клетки обрабатывают буферным раствором PBS (10 мМ фосфатный буфер, 0,15 Μ NaCl, рН 7,5), содержащим 5 мМ ЭДТА (5 мин инкубация с последующим центрифугированием 20 минут при 300 g, сбор супернатанта), либо клетки обрабатывают равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в PBS (5 минут инкубация, добавление ингибитора трипсина, перемешивание с последующим центрифугированием 20 минут при 300 g, сбор супернатанта), либо последовательно обрабатывают клетки буферным раствором PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, собирают первый супернатант, а затем обрабатывают клетки равным объемом 0,15-0,35% раствора трипсина в PBS, собирают второй супернатант.Blood is drawn into a wakutainer or other tubes for collecting and preserving blood (e.g., Cell-Free DNA of BST, Streck, USA). Blood is separated into plasma and cell fraction by centrifugation. Next, exosomes associated with the surface of the shaped elements are isolated from the cell fraction. Any suitable method may be used for this. In a preferred embodiment, the cells are treated with PBS buffer solution (10 mM phosphate buffer, 0.15 Μ NaCl, pH 7.5) containing 5 mM EDTA (5 min incubation followed by centrifugation for 20 minutes at 300 g, collection of supernatant), or cells treated with an equal volume of a 0.15-0.35% solution of trypsin in PBS (5 minutes incubation, addition of a trypsin inhibitor, stirring followed by centrifugation for 20 minutes at 300 g, collection of supernatant), or the cells are sequentially treated with PBS buffer solution containing 5 mM EDTA collect the first supernatant and then process The cells are harvested with an equal volume of 0.15-0.35% trypsin solution in PBS, and a second supernatant is collected.
Далее плазму и полученный супернатант из клеточной фракции объединяют, фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм и используют для выделения суммарного пула экзосом крови. Суммарный пул экзосом крови выделяют любым пригодным методом, а именно: путем последовательного удаления клеточного дебриса центрифугированием, а затем осаждением экзосом ультрацентрифугированием [10]; путем последовательного удаления клеточного дебриса фильтрацией, а затем отделением экзосом центрифугированием в градиенте сахарозы, отмывом экзосом PBS-ом и осаждением экзосом ультрацентрифугированием [11]; с помощью коммерческого набора ExoQuick™ Exosome Precipitation Solution (System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA) и др.Next, the plasma and the obtained supernatant from the cell fraction are combined, filtered through filters with a pore diameter of 0.1 μm and used to isolate the total pool of blood exosomes. The total pool of blood exosomes is isolated by any suitable method, namely: by sequential removal of the cell debris by centrifugation, and then by the deposition of exosomes by ultracentrifugation [10]; by sequentially removing cell debris by filtration, and then separating exosomes by sucrose gradient centrifugation, washing the exosomes with PBS and exosome precipitation by ultracentrifugation [11]; using the ExoQuick ™ Exosome Precipitation Solution commercial kit (System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA), etc.
Далее в составе экзосом крови выявляют не менее 2-х известных опухолеспецифических белков или выделяют РНК либо микроРНК и, после проведения обратной транскрипции, определяют концентрацию не менее 2-х опухолеспецифических маркеров, ассоциированных с определенным онкологическим заболеванием, и при концентрации последних, превышающих концентрацию данных маркеров в контрольном образце, диагностируют наличие онкологического заболеванияThen, at least 2 known tumor-specific proteins are detected in the blood exosomes or RNA or microRNAs are isolated and, after reverse transcription, the concentration of at least 2 tumor-specific markers associated with a particular cancer is determined, and at a concentration of the latter exceeding the data concentration markers in the control sample, diagnosed with cancer
Для выделения опухолеспецифических маркеров (мРНК или микроРНК) используют любой пригодный метод, например, метод, основанный на экстракции фенол-хлороформом [12]; гуанидин-фенольный метод [13]; метод выделения нуклеиновых кислот при помощи мелкодисперсного стекла или стекловолокнистых фильтров в присутствии хаотропных солей [14].Any suitable method is used to isolate tumor-specific markers (mRNA or miRNAs), for example, a method based on phenol-chloroform extraction [12]; guanidine-phenolic method [13]; a method for isolating nucleic acids using fine glass or glass fiber filters in the presence of chaotropic salts [14].
Определение концентрации опухолеспецифических маркеров также проводят любым известным методом исследования нуклеиновых кислот, как то: количественная ПЦР и ОТ-ПЦР, метод измерения концентрации нуклеиновых кислот при помощи флуоресцентных красителей (RiboGreen, SYBR Green II) и т.д.Determination of the concentration of tumor-specific markers is also carried out by any known method for studying nucleic acids, such as quantitative PCR and RT-PCR, a method for measuring the concentration of nucleic acids using fluorescent dyes (RiboGreen, SYBR Green II), etc.
Для выявления опухолеспецифических белков также могут быть использованы любые пригодные методы анализа белков, а именно: двумерный электрофорез с последующей оцифровкой; одномерный электрофорез с последующим выявлением опухолеспецифических белков путем окрашивания специфическими антителами после вестерн-блотинга; MALDI-анализ и др.To identify tumor-specific proteins, any suitable methods of protein analysis can also be used, namely: two-dimensional electrophoresis followed by digitization; one-dimensional electrophoresis followed by the detection of tumor-specific proteins by staining with specific antibodies after Western blotting; MALDI analysis, etc.
Определяющим отличием предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, является использование в качестве диагностического объекта суммарного пула экзосом крови, включающего экзосомы из плазмы и экзосомы, связанные с поверхностью форменных элементов, выделенные из клеточной фракции крови, что позволяет значительно повысить достоверность выявления опухолеспецифических маркеров и белков уже на ранних стадиях заболевания. В прототипе анализируют опухолеспецифические маркеры (последовательности микроРНК), выделенные только из экзосом плазмы крови.The defining difference of the proposed method, in comparison with the prototype, is the use of a total pool of blood exosomes as a diagnostic object, including exosomes from plasma and exosomes associated with the surface of shaped elements isolated from the cell fraction of blood, which can significantly increase the reliability of detection of tumor-specific markers and proteins already in the early stages of the disease. The prototype analyzes tumor-specific markers (miRNA sequences) isolated only from exosomes of blood plasma.
Использование нового диагностического объекта - экзосом, связанных с поверхностью форменных элементов крови (вкупе с экзосомами плазмы), позволяет увеличить специфичность детекции опухолеспецифических последовательностей РНК и белков за счет увеличения количества анализируемых экзосом крови без использования инвазивных методов диагностики, дифференцировать доброкачественные и злокачественные новообразования и осуществлять мониторинг эффективности противоопухолевой терапии.The use of a new diagnostic object, exosomes associated with the surface of blood cells (together with plasma exosomes), allows to increase the specificity of detection of tumor-specific sequences of RNA and proteins by increasing the number of blood exosomes analyzed without invasive diagnostic methods, to differentiate benign and malignant neoplasms and monitor the effectiveness of antitumor therapy.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.The invention is illustrated by the following examples of specific performance of the method.
Пример 1.Example 1
Проведена диагностика рака молочной железы путем определения концентрации двух опухолевых маркеров (мРНК RASSF8 и Ki-67) в составе экзосом плазмы (для сравнения) и экзосом крови (т.е. экзосом плазмы и экзосом, связанных с поверхностью клеток крови) у здоровых женщин (n=19), у пациентов с мастопатией (n=14) и у больных раком молочной железы (n=20) на I-II стадиях заболевания.Breast cancer was diagnosed by determining the concentration of two tumor markers (RASSF8 and Ki-67 mRNA) in plasma exosomes (for comparison) and blood exosomes (i.e., plasma exosomes and exosomes associated with the surface of blood cells) in healthy women ( n = 19), in patients with mastopathy (n = 14) and in patients with breast cancer (n = 20) at stages I-II of the disease.
У всех женщин была взята кровь в вакутейнер с К3ЭДТА во время первично установленного диагноза. Собранную кровь разделили на плазму и фракцию клеток крови при помощи центрифугирования (10 мин, 400 g). Затем провели выделение экзосом плазмы и экзосом крови. В первом случае плазму фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, экзосомы осаждали ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 1,5 ч. Во втором случае (из клеточной фракции) экзосомы, связанные с поверхностью клеток крови, элюировали PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА в течение 5 мин, затем клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 400 g) и отбирали супернатант. Для получения суммарного пула экзосом крови плазму и супернатант объединяли, фильтровали через фильтры с диаметром пор 0,1 мкм, экзосомы осаждали ультрацентрифугированием (100000 g, 1,5 ч). Выделение РНК из экзосом плазмы и из экзосом крови проводили на стекловолокнистых фильтрах производства «Биосилика» по протоколу, рекомендованному производителем. Образцы выделенной РНК инкубировали с 2 единицами активности ДНКазы, не содержащей РНКаз (Fermentas, EN0531) в течение 1 ч при 37°С. Реакцию ОТ проводили с использованием гексамерных праймеров случайной последовательности и набора Superscript ТМ II Reverse Transcriptase kit (Invitrogen, USA), как описано в работе [15]. Праймеры и Taqman-пробы для мРНК RASSF8 и Ki-67 были разработаны и синтезированы, как описано в работе [15].All women had blood taken in a wakutainer with K 3 EDTA during the initial diagnosis. The collected blood was divided into plasma and blood cell fraction by centrifugation (10 min, 400 g). Then, plasma exosomes and blood exosomes were isolated. In the first case, the plasma was filtered through filters with a pore diameter of 0.1 μm, exosomes were precipitated by ultracentrifugation at 100,000 g for 1.5 hours. In the second case (from the cell fraction), exosomes bound to the surface of blood cells were eluted with PBS containing 5 mM EDTA for 5 min, then cells were pelleted by centrifugation (5 min, 400 g) and the supernatant was collected. To obtain a total pool of blood exosomes, the plasma and supernatant were combined, filtered through filters with a pore diameter of 0.1 μm, exosomes were precipitated by ultracentrifugation (100,000 g, 1.5 h). Isolation of RNA from plasma exosomes and blood exosomes was carried out on fiberglass filters manufactured by Biosilik according to the protocol recommended by the manufacturer. Samples of isolated RNA were incubated with 2 units of DNase-free RNase activity (Fermentas, EN0531) for 1 h at 37 ° C. The RT reaction was carried out using random sequence hexamer primers and a Superscript TM II Reverse Transcriptase kit (Invitrogen, USA), as described in [15]. Primers and Taqman probes for RASSF8 and Ki-67 mRNA were developed and synthesized as described in [15].
Средняя концентрация мРНК RASSF8 и Ki-67 в составе экзосом крови у больных раком молочной железы составила 4,8×103 и 5,78×104 копий/мл, соответственно. С помощью ROC-анализа было установлено, что чувствительность теста для опухолеспецифической мРНК Ki-67 (при пороговом уровне 4×104 копий/мл) составила 80%, специфичность 89%; для мРНК RASSF8 чувствительность теста при пороговом уровне 3×103 копий/мл составила 79%, специфичность 91%, что подтверждает высокую специфичность заявляемого способа с одновременным снижением количества анализируемых маркерных последовательностей (по сравнению с прототипом).The average concentration of RASSF8 and Ki-67 mRNA in blood exosomes in patients with breast cancer was 4.8 × 10 3 and 5.78 × 10 4 copies / ml, respectively. Using ROC analysis, it was found that the sensitivity of the test for tumor-specific Ki-67 mRNA (at a threshold level of 4 × 10 4 copies / ml) was 80%, specificity 89%; for RASSF8 mRNA, the sensitivity of the test at a threshold level of 3 × 10 3 copies / ml was 79%, specificity 91%, which confirms the high specificity of the proposed method while reducing the number of analyzed marker sequences (compared to the prototype).
Данный пример иллюстрирует возможность использования разработанного способа для диагностики онкологических заболеваний у пациентов, являющихся группой риска, а также возможность дифференцировки доброкачественных и злокачественных новообразований с помощью измерения концентрации всего 2-х опухолеспецифических маркеров в составе экзосом крови.This example illustrates the possibility of using the developed method for the diagnosis of cancer in patients at risk, as well as the possibility of differentiating benign and malignant neoplasms by measuring the concentration of only 2 tumor-specific markers in the composition of blood exosomes.
Пример 2.Example 2
Была исследована концентрация двух микроРНК (miR-200a и miR-141) в составе экзосом, связанных с поверхностью клеток крови у пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ, являются группой риска) (n=15) и у больных раком предстательной железы на различных стадиях заболевания (n=19).We studied the concentration of two microRNAs (miR-200a and miR-141) in the composition of exosomes associated with the surface of blood cells in patients with benign prostatic hyperplasia (BPH, are a risk group) (n = 15) and in patients with prostate cancer on different stages of the disease (n = 19).
У всех пациентов была взята кровь во время первичного установления диагноза. Кровь была собрана в вакутейнеры и разделена центрифугированием на плазму и клеточную фракцию. Экзосомы, связанные с клетками крови, элюировали обработкой 0,25% раствором трипсина, с последующим ингибированием фермента, осаждали клетки центрифугированием и собирали супернатант. Плазму и супернатант объединяли и использовали для выделения суммарного пула экзосом крови коммерческим набором ExoQuick™ Exosome Precipitation Solution (System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA) по протоколу, рекомендованному производителем. МикроРНК из экзосом крови были выделены при помощи набора MirVana (США) по протоколу, рекомендованному производителем. ОТ проводили с помощью набора TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (США) по протоколу, рекомендованному производителем. Концентрация микроРНК в составе экзосом крови была определена при помощи количественного ПЦР с использованием специфических праймеров TaqMan MicroRNA assay (США) и TaqMan Universal PCR Master Mix (США).All patients had blood taken during the initial diagnosis. Blood was collected in wakutainers and separated by centrifugation into plasma and cell fraction. Exosomes bound to blood cells were eluted by treatment with a 0.25% trypsin solution, followed by inhibition of the enzyme, the cells were pelleted by centrifugation, and the supernatant was collected. Plasma and supernatant were combined and used to isolate the total pool of blood exosomes using the ExoQuick ™ Exosome Precipitation Solution (System Biosciences Inc., Mountain View, CA, USA) commercial kit according to the protocol recommended by the manufacturer. MicroRNAs from blood exosomes were isolated using the MirVana kit (USA) according to the protocol recommended by the manufacturer. RT was performed using the TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (USA) according to the protocol recommended by the manufacturer. The concentration of microRNAs in blood exosomes was determined by quantitative PCR using specific primers TaqMan MicroRNA assay (USA) and TaqMan Universal PCR Master Mix (USA).
Средняя концентрация miR-200a и miR-141 в составе экзосом крови у больных раком предстательной железы составила 483121 и 498158 копий/мл, соответственно. С помощью ROC-анализа было установлено, что чувствительность теста для опухолеспецифической miR-200a (количество правильно определенных пациентов со злокачественными опухолями) при пороговом уровне 105 копий/мл составила 86%, специфичность 88%; для miR-141 чувствительность теста при пороговом уровне 2,3×105 копий/мл составила 81%, специфичность 90%, что подтверждает высокую специфичность с одновременным снижением количества анализируемых маркерных последовательностей (по сравнению с прототипом).The average concentrations of miR-200a and miR-141 in blood exosomes in patients with prostate cancer were 483121 and 498158 copies / ml, respectively. Using ROC analysis, it was found that the sensitivity of the test for tumor-specific miR-200a (the number of correctly identified patients with malignant tumors) at a threshold level of 10 5 copies / ml was 86%, specificity 88%; for miR-141, the sensitivity of the test at a threshold level of 2.3 × 10 5 copies / ml was 81%, the specificity of 90%, which confirms the high specificity with a simultaneous decrease in the number of analyzed marker sequences (compared to the prototype).
Данный пример иллюстрирует возможность использования разработанного способа для дифференцировки неонкологических и онкологических заболеваний с помощью измерения концентрации всего двух опухолевых микроРНК в составе экзосом крови.This example illustrates the possibility of using the developed method for the differentiation of non-oncological and oncological diseases by measuring the concentration of only two tumor miRNAs in the composition of blood exosomes.
Пример 3.Example 3
У трех женщин, успешно прооперированных три года назад по поводу раковой опухоли груди и прошедших курс химиотерапии, были взяты образцы крови с профилактической целью, так как пациентки с раком груди входят в группу пациентов с высоким риском повторных новообразований.Three women who were successfully operated on three years ago for a breast cancer and underwent chemotherapy received blood samples for prophylactic purposes, as patients with breast cancer are among the group of patients with a high risk of recurrent neoplasms.
Кровь была собрана в вакутейнеры и разделена центрифугированием на плазму и клеточную фракцию. Экзосомы плазмы выделяли аналогично примеру 1. Экзосомы, связанные с форменными элементами (клеточная фракция), элюировали в две стадии: сначала клетки обрабатывали PBS, содержащим 5 мМ ЭДТА, клетки осаждали центрифугированием и собирали супернатант №1, затем клетки обрабатывали 0,15% раствором трипсина, с последующим ингибированием фермента, осаждением клеток центрифугированием и сбором супернатанта №2. Для получения экзосом крови плазму и супернатанты №1 и №2 объединяли и выделяли суммарный пул экзосом крови аналогично примеру 1.Blood was collected in wakutainers and separated by centrifugation into plasma and cell fraction. Plasma exosomes were isolated analogously to example 1. Exosomes associated with the shaped elements (cell fraction) were eluted in two stages: first, the cells were treated with PBS containing 5 mM EDTA, the cells were pelleted by centrifugation and supernatant No. 1 was collected, then the cells were treated with 0.15% solution trypsin, followed by inhibition of the enzyme, sedimentation of cells by centrifugation and collection of supernatant No. 2. To obtain blood exosomes, plasma and supernatants No. 1 and No. 2 were combined and a total pool of blood exosomes was isolated in the same manner as in Example 1.
Для выявления опухолеспецифических белков, имеющих важное прогностическое значение при раке груди, провели двумерный электрофорез белков экзосом плазмы и экзосом крови с последующим оцифровыванием полиакриламидного геля.To identify tumor-specific proteins that have important prognostic value in breast cancer, we performed two-dimensional electrophoresis of plasma exosomes and blood exosomes, followed by digitization of the polyacrylamide gel.
Эффективность выявления опухолеспецифических белков в составе экзосом плазмы и экзосом крови у пациенток представлена в таблице 1.The efficacy of detecting tumor-specific proteins in plasma exosomes and blood exosomes in patients is presented in table 1.
Из таблицы 1 видно, что анализ белков экзосом крови выявил у пациентки №2 наличие опухолеспецифических белков 14-3-3-γ и 14-3-3-σ, в то время как при анализе данных белков в составе экзосом только плазмы той же пациентки были получены отрицательные результаты. В течение последующего года у нее были клинически диагностированы повторные метастазы в регионарных лимфоузлах.From table 1 it is seen that the analysis of blood exosome proteins revealed in patient No. 2 the presence of tumor-specific proteins 14-3-3-γ and 14-3-3-σ, while in the analysis of these proteins only plasma of the same patient was contained in exosomes negative results were obtained. Over the next year, she was clinically diagnosed with repeated metastases in regional lymph nodes.
Данный пример иллюстрирует, что предлагаемый способ с использованием экзосом крови позволяет повысить эффективность диагностики онкологических заболеваний за счет увеличения специфичности выявления опухолеспецифических белков.This example illustrates that the proposed method using blood exosomes can improve the diagnosis of cancer by increasing the specificity of the detection of tumor-specific proteins.
Использование предлагаемого способа позволит, по сравнению с прототипом:Using the proposed method will allow, in comparison with the prototype:
- увеличить удельное содержание выявляемых специфических последовательностей в составе экзосом, связанных с клеточной поверхностью, по сравнению с содержанием специфических последовательностей в составе экзосом, выделенных из плазмы;- increase the specific content of detected specific sequences in the composition of exosomes associated with the cell surface, compared with the content of specific sequences in the composition of exosomes isolated from plasma;
- увеличить и специфичность детекции специфических (маркерных) последовательностей нуклеиновых кислот и белков в составе экзосом, связанных с поверхностью клеток крови, при сохранении высокой чувствительности, что особенно важно на ранних стадиях развития патологий;- increase the specificity of detection of specific (marker) sequences of nucleic acids and proteins in the composition of exosomes associated with the surface of blood cells, while maintaining high sensitivity, which is especially important in the early stages of the development of pathologies;
- исключить получение ложноположительных или ложноотрицательных результатов анализа;- exclude the receipt of false positive or false negative results of the analysis;
- расширить область применения способа за счет возможности мониторинга антираковой терапии онкологических заболеваний.- to expand the scope of the method due to the possibility of monitoring anti-cancer therapy of cancer.
Источники ирформацииSources of irformation
1. Villarroya-Beltri С., Baixauli F., Gutiérrez-Vázquez С., Sánchez-Madrid F., Mittelbrunn M. Sorting it out: Regulation of exosome loading // Semin Cancer Biol. 2014. V. 28C. P. 3-13.1. Villarroya-Beltri S., Baixauli F., Gutiérrez-Vázquez S., Sánchez-Madrid F., Mittelbrunn M. Sorting it out: Regulation of exosome loading // Semin Cancer Biol. 2014.V. 28C. P. 3-13.
2. Pant S., Hilton H., Burczynski M.E. The multifaceted exosome: biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities // Biochemical pharmacology. 2012. V. 83. P. 1484-1494.2. Pant S., Hilton H., Burczynski M.E. The multifaceted exosome: biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities // Biochemical pharmacology. 2012. V. 83. P. 1484-1494.
3. Salido-Guadarrama I., Romero-Cordoba S., Peralta-Zaragoza O., Hidalgo-Miranda Α., Rodríguez-Dorantes M. MicroRNAs transported by exosomes in body fluids as mediators of intercellular communication in cancer // Onco Targets Ther. 2014. V. 7. P. 1327-1338.3. Salido-Guadarrama I., Romero-Cordoba S., Peralta-Zaragoza O., Hidalgo-Miranda Α., Rodríguez-Dorantes M. MicroRNAs transported by exosomes in body fluids as mediators of intercellular communication in cancer // Onco Targets Ther . 2014. V. 7. P. 1327-1338.
4. Choi D.-S., Kim D.-K., Kim Y.-K., Gho Y.S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes // Proteomics. 2013. V. 13. P. 1554-1571.4. Choi D.-S., Kim D.-K., Kim Y.-K., Gho Y.S. Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes // Proteomics. 2013. V. 13. P. 1554-1571.
5. Kopreski M., Benko F., Kwak L., Gocke C. Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma // Clin. Cancer Res. 1999. V. 5. P. 1961-1965.5. Kopreski M., Benko F., Kwak L., Gocke C. Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma // Clin. Cancer Res. 1999. V. 5. P. 1961-1965.
6. Gal S., Fidler C., Lo Y.M., Chin K., Moore J., Harris A.L., Wainscoat J.S. Detection of mammaglobin mRNA in the plasma of breast cancer patients // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001 V. 945. P. 192-194.6. Gal S., Fidler C., Lo Y. M., Chin K., Moore J., Harris A. L., Wainscoat J.S. Detection of mammaglobin mRNA in the plasma of breast cancer patients // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001 V. 945. P. 192-194.
7. Shen J., Liu Z., Todd N.W., Zhang H., Liao J., Yu L., Guarnera M.A., Li R., Cai L., Zhan M., Jiang F. Diagnosis of lung cancer in individuals with solitary pulmonary nodules by plasma microRNA biomarkers // BMC Cancer. 2011. V. 11. P. 374.7. Shen J., Liu Z., Todd NW, Zhang H., Liao J., Yu L., Guarnera MA, Li R., Cai L., Zhan M., Jiang F. Diagnosis of lung cancer in individuals with solitary pulmonary nodules by plasma microRNA biomarkers // BMC Cancer. 2011. V. 11. P. 374.
8. Кушлинский H.E., Портный С.М., Лактионов К.П. 2005. Рак молочной железы. РАМН, М.8. Kushlinsky H.E., Tailor S.M., Laktionov K.P. 2005. Breast Cancer. RAMS, M.
9. Cazzoli R., Buttitta F., Di Nicola Μ., Malatesta S., Marchetti Α., Rom W.N., Pass H.I. microRNAs derived from circulating exosomes as noninvasive biomarkers for screening and diagnosing lung cancer // J. Thorac. Oncol. 2013. V. 8. P. 1156-1162.9. Cazzoli R., Buttitta F., Di Nicola Μ., Malatesta S., Marchetti Α., Rom W.N., Pass H.I. microRNAs derived from circulating exosomes as noninvasive biomarkers for screening and diagnosing lung cancer // J. Thorac. Oncol. 2013. V. 8. P. 1156-1162.
10. Gallo Α., Tandon M., Alevizos I., Illei G.G. The majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes // PLoS ONE. 2012. V. 7. P. e30679.10. Gallo Α., Tandon M., Alevizos I., Illei G.G. The majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes // PLoS ONE. 2012. V. 7. P. e30679.
11. Rupp A.-K., Rupp C., Keller S., Brase J.C., Ehehalt R., Fogel M., Moldenhauer G., Marmé F., Sültmann H., Altevogt P. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage // Gynecologic Oncology. 2011. V. 122. P. 437-446.11. Rupp A.-K., Rupp C., Keller S., Brase JC, Ehehalt R., Fogel M., Moldenhauer G., Marmé F., Sültmann H., Altevogt P. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage // Gynecologic Oncology. 2011. V. 122. P. 437-446.
12. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995.12. Short protocols in molecular biology. Third edition. Wiley, 1995.
13. Chomezynski P., Mackey K. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V. 10. P. 221-224.13. Chomezynski P., Mackey K. Single-step method of total RNA isolation by acid Guanidine-Phenol extraction // Organelles and cellular structures. 1996. V. 10. P. 221-224.
14. Boom R., Sol C.J.A. Rapid and simple method for purification nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 495-503.14. Boom R., Sol C.J.A. Rapid and simple method for purification nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 495-503.
15. Рыкова Е.Ю., Скворцова Т.Э., Хоффман А.Л., Тамкович С.Н., Стариков А.В., Брызгунова О.Е., Пермякова В.И., Варнеке Е., Шакиель Г., Власов В.В., Лактионов П.П. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике опухолей молочной железы. // Биомедицинская химия 2008. Т. 54. С. 94-103.15. Rykova E.Yu., Skvortsova T.E., Hoffman A.L., Tamkovich S.N., Starikov A.V., Bryzgunova O.E., Permyakova V.I., Varnecke E., Shakiel G ., Vlasov V.V., Laktionov P.P. Circulating extracellular DNA and blood RNA in the diagnosis of breast tumors. // Biomedical Chemistry 2008.V. 54.P. 94-103.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014140894/15A RU2571507C1 (en) | 2014-10-09 | 2014-10-09 | Diagnostic and monitoring technique for oncology diseases with use of blood exosomes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014140894/15A RU2571507C1 (en) | 2014-10-09 | 2014-10-09 | Diagnostic and monitoring technique for oncology diseases with use of blood exosomes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2571507C1 true RU2571507C1 (en) | 2015-12-20 |
Family
ID=54871391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014140894/15A RU2571507C1 (en) | 2014-10-09 | 2014-10-09 | Diagnostic and monitoring technique for oncology diseases with use of blood exosomes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2571507C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2769927C2 (en) * | 2020-02-28 | 2022-04-08 | Общество с ограниченной ответственностью "МедФлорина" | METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2181332B1 (en) * | 2007-07-25 | 2013-04-10 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Exosome-associated microrna as a diagnostic marker |
-
2014
- 2014-10-09 RU RU2014140894/15A patent/RU2571507C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2181332B1 (en) * | 2007-07-25 | 2013-04-10 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Exosome-associated microrna as a diagnostic marker |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LESLEY CHENG et al / Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood / J Extracell Vesicles / 2014, Vol.3. KAHLERT C et al / Identification of double-stranded genomic DNA spanning all chromosomes with mutated KRAS and p53 DNA in the serum exosomes of patients with pancreatic cancer / J Biol Chem / 2014, Vol.287, No.7, pp 3869-3875. TAYLOR DD et al / MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer / Gynecol Oncol / 2008, Vol.110, No.1, pp 13-21. JOHAN SKOG et al / Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers / Nature Cell Biology / 2008, Vol.10, pp 1470-1476. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2769927C2 (en) * | 2020-02-28 | 2022-04-08 | Общество с ограниченной ответственностью "МедФлорина" | METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rolfo et al. | Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers | |
| CN103993088B (en) | The application method of the long-chain non-coding RNA CASC2 that serum Exosomes originates | |
| Wang et al. | Combined detection of serum exosomal miR-21 and HOTAIR as diagnostic and prognostic biomarkers for laryngeal squamous cell carcinoma | |
| Ansari et al. | The liquid biopsy in lung cancer | |
| US10844436B2 (en) | Use of double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection | |
| Jin et al. | Liquid biopsy in uveal melanoma: are we there yet? | |
| US20220112555A1 (en) | Profiling microvesicle nucleic acids and uses thereof as signatures in diagnosis of renal transplant rejection | |
| JP2014513959A (en) | New organism diagnostic method | |
| RU2583871C1 (en) | Method for differential diagnosis of gliomas of human brain | |
| CN103981271B (en) | The application method of the long-chain non-coding RNA LINC00470 that serum Exosomes originates | |
| RU2556825C1 (en) | Method of extraction of exosomes from blood | |
| CN106191055A (en) | A kind of non-small cell lung carcinoma marker, detectable and test kit | |
| KR101335034B1 (en) | Method of using ANT2 mRNA in exosome for breast cancer diagnosis | |
| CN113092764A (en) | Use of TM9SF4 as a biomarker for tumor-associated exosomes | |
| RU2571507C1 (en) | Diagnostic and monitoring technique for oncology diseases with use of blood exosomes | |
| CN106939354B (en) | Application of miRNA-4530 as lung cancer diagnosis marker | |
| US20200399681A1 (en) | Assay for detection of androgen receptor variants | |
| Wróblewska et al. | MiRNAs from serum-derived extracellular vesicles as biomarkers for uveal melanoma progression | |
| CN106929599B (en) | Application of miRNA-6126 as lung cancer diagnosis marker | |
| WO2017221927A1 (en) | Mmp1 gene transcript for use as marker for diagnosis of ovarian cancer prognosis, and test method | |
| Lopez-Munoz et al. | Markers of circulating breast cancer cells | |
| US20200191789A1 (en) | In vitro method for detecting tumor growth and diagnosing or prognosticating the risk of metastasis in a human subject that has been diagnosed with uveal melanoma | |
| CN106967825B (en) | Application of miRNA-1268b as lung cancer diagnosis marker | |
| CN115232874B (en) | Application of long-chain non-coding RNA in regulation and control of ovarian cancer progression | |
| EP3464578A1 (en) | Extraction of circulating tumor cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191010 |