RU2566553C1 - STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B - Google Patents

STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B Download PDF

Info

Publication number
RU2566553C1
RU2566553C1 RU2014145295/10A RU2014145295A RU2566553C1 RU 2566553 C1 RU2566553 C1 RU 2566553C1 RU 2014145295/10 A RU2014145295/10 A RU 2014145295/10A RU 2014145295 A RU2014145295 A RU 2014145295A RU 2566553 C1 RU2566553 C1 RU 2566553C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
strain
monoclonal antibodies
cells
botulinum
producer
Prior art date
Application number
RU2014145295/10A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Татьяна Александровна Иващенко
Елена Валентиновна Белова
Ирина Петровна Мицевич
Евгений Викторович Мицевич
Арина Владимировна Козырь
Александр Владимирович Колесников
Иван Алексеевич Дятлов
Игорь Георгиевич Шемякин
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ)
Priority to RU2014145295/10A priority Critical patent/RU2566553C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2566553C1 publication Critical patent/RU2566553C1/en

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: bioengineering.
SUBSTANCE: strain of hybrid cells of animals Mus. musculus 3F11 - producer of monoclonal antibodies specific to botulinus toxin type B is suggested. The strain is deposited to state collection of pathogens and cell cultures of Federal Budget Institution of Science of State Scientific Centre of Applied Microbiology and Bioengineering (FBIS SSC AMB),collection No. - H-45.
EFFECT: invention ensures production of the highly specific monoclonal antibodies to botulinic neurotoxin type B, suitable for construction of their base of the test-systems to identify botulinus.
6 dwg, 2 tbl, 8 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител к ботулиническому токсину типа В.The invention relates to biotechnology and can be used to obtain monoclonal antibodies to botulinum toxin type B.

Ботулизм представляет собой тяжелое нервно-паралитическое заболевание пищевого происхождения, обусловленное действием ботулинических нейротоксинов (BoNTs), секректируемых анаэробными микроорганизмами Clostridium botulinum [Stanker, L.H. А Monoclonal Antibody Based Capture ELISA for Botulinum Neurotoxin Serotype B: Toxin Detection in Food / L.H. Stanker, M.C. Scotcher, L. Cheng, K. Ching, J. McGarvey, D. Hodge, and R. Hnasko // Toxins (Basel). - 2013. - V. 5. - P. 2212-2226].Botulism is a severe foodborne neuropsychiatric disease caused by the action of botulinum neurotoxins (BoNTs) secreted by the anaerobic microorganisms Clostridium botulinum [Stanker, L.H. A Monoclonal Antibody Based Capture ELISA for Botulinum Neurotoxin Serotype B: Toxin Detection in Food / L.H. Stanker, M.C. Scotcher, L. Cheng, K. Ching, J. McGarvey, D. Hodge, and R. Hnasko // Toxins (Basel). - 2013. - V. 5. - P. 2212-2226].

Широкое использование домашнего консервирования, соление, копчение рыбы и мясных продуктов без соблюдения соответствующих технологий влияет на интенсивность эпидемических проявлений данной инфекции. Заражение людей происходит преимущественно в результате употребления в пищу продуктов, содержащих ботулотоксины и самих возбудителей Clostridium botulinum (пищевой бутулизм), и через поврежденные кожные покровы (травматический ботулизм) [Носкова, О.А. Клинико-эпидемиологические особенности и совершенствование лабораторной диагностики ботулизма в Иркутской области / О.А. Носкова, Т.Ю. Загоскина, Е.Н. Субычева, Е.Ю. Марков, С.Е. Лекомцева, О.Б. Бодрых, С.В. Балахонов // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2013. - №2 (90). Часть 1. - С. 102-106]. В естественных условиях BoNTs существуют в составе стабильных комплексов с другими белками. Существование в комплексе защищает ботулотоксины от агрессивной среды желудка при пищевой интоксикации и увеличивает их время жизни в кровотоке [Аббасова С.Г. Моноклональные антитела к ботулиническим нейротоксинам типов А, В, E и F / С.Г. Аббасова, Н.В. Руденко, А.Ю. Гороховатский, М.В. Капралов, И.Д. Виноградова, Ю.В. Вертиев, В.А. Несмеянов, Е.В. Гришин // Биоорганическая химия. - 2011. - т. 37. - №3. - С. 344-353].The widespread use of home canning, salting, smoking of fish and meat products without observing appropriate technologies affects the intensity of the epidemic manifestations of this infection. Infection of people occurs mainly as a result of eating foods containing botulinum toxins and the causative agents of Clostridium botulinum (food butulism), and through damaged skin (traumatic botulism) [Noskova, O.A. Clinical and epidemiological features and improvement of laboratory diagnosis of botulism in the Irkutsk region / O.A. Noskova, T.Yu. Zagoskina, E.N. Subycheva, E.Yu. Markov, S.E. Lekomtseva, O.B. Bodrykh, S.V. Balakhonov // Bulletin of the VSNS SB RAMS. - 2013. - No. 2 (90). Part 1. - S. 102-106]. In vivo, BoNTs exist as part of stable complexes with other proteins. Existence in the complex protects botulinum toxins from the aggressive environment of the stomach during food intoxication and increases their lifetime in the bloodstream [Abbasova SG Monoclonal antibodies to botulinum neurotoxins of types A, B, E and F / C.G. Abbasova, N.V. Rudenko, A.Yu. Gorokhovatsky, M.V. Kapralov, I.D. Vinogradova, Yu.V. Vertiev, V.A. Nesmeyanov, E.V. Grishin // Bioorganic chemistry. - 2011. - T. 37. - No. 3. - S. 344-353].

Существуют семь различных серотипов токсинов (А-Н), которые отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов и некоторыми другими признаками. Наибольшую угрозу для людей представляют токсины серотипов А, В, E и F. [Cheng, L.W. Detection of Botulinum Neurotoxin Serotypes A and В Using a Chemiluminescent versus Electrochemiluminescent Immunoassay in Food and Serum / L.W. Cheng, L.H. Stanker // Agric Food Chem. - 2013. - V 61. - P. 755-760].There are seven different serotypes of toxins (AH) that differ in the antigenic properties of the toxins they produce and some other characteristics. The greatest threat to humans is toxins of serotypes A, B, E and F. [Cheng, L.W. Detection of Botulinum Neurotoxin Serotypes A and B Using a Chemiluminescent versus Electrochemiluminescent Immunoassay in Food and Serum / L.W. Cheng, L.H. Stanker // Agric Food Chem. - 2013. - V 61. - P. 755-760].

В общей сложности с 2001 по 2007 г. в США было зарегистрировано 139 случаев пищевого ботулизма, из них основная масса случаев, вызванных интоксикацией BoNT/A и BoNT/E, и только 10 случаев, непосредственно связанных с потреблением пищи, зараженной BoNT/B. В тот же период времени было отмечено 387 случаев BoNT/B детского ботулизма, причиной которых явилось действие BoNT/B. Хотя пищевой ботулизм, ассоциированный с серотипом В, встречается реже, тем не менее, представляет собой серьезную угрозу для безопасности пищевых продуктов. Подтверждением этому являются зарегистрированные США и Великобритании крупные вспышки ботулизма [Scotcher, М.С. Detection of botulinum neurotoxin serotype В at sub mouse LD50 levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk / M.C. Scotcher, L.W Cheng, L.H. Stanker // PLoS ONE. - 2010. - V 5. - P. 1-10].In total, from 2001 to 2007, 139 cases of foodborne botulism were registered in the United States, of which the bulk of cases caused by intoxication BoNT / A and BoNT / E, and only 10 cases directly related to the consumption of food infected with BoNT / B. In the same time period, 387 cases of BoNT / B of childhood botulism were reported, due to the effect of BoNT / B. Although foodborne botulism associated with serotype B is less common, it nevertheless poses a serious threat to food safety. The evidence of this is the large outbreaks of botulism registered by the USA and Great Britain [Scotcher, M.S. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD50 levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk / M.C. Scotcher, L.W Cheng, L.H. Stanker // PLoS ONE. - 2010. - V 5. - P. 1-10].

Специфические антитела широко применяются для диагностики ботулинической инфекций. Существует российский патент RU 2152036 (приоритет от 12.05.1998, правообладатель НПО «Биомед»), описывающий способ определения ботулотоксинов А и В на основе специфических F(ab)2-фрагментов антител. Предложены Fab-фрагменты рекомбинантных антител, специфичных к ботулотоксинам типов А и В. Эти Fab-фрагменты могут использоваться в качестве иммуносенсоров для обнаружения ботулотоксинов в продуктах питания и для других нужд здравоохранения и министерства обороны [пат. 5932449 США, C07K 16/12, С12Р 021/04. Обнаружение ботулотоксина / The Secretary of the Army, США, №08792824, заявл. 30.01.1997]. Большинство описанных систем детекции токсинов ботулизма с применением антител основывается на классическом иммуноферментном анализе.Specific antibodies are widely used to diagnose botulinum infections. There is a Russian patent RU 2152036 (priority dated 05/12/1998, copyright of the NGO Biomed) that describes a method for determining botulinum toxins A and B based on specific F (ab) 2 antibody fragments. Fab fragments of recombinant antibodies specific for types A and B botulinum toxins are proposed. These Fab fragments can be used as immunosensors for detecting botulinum toxins in food and for other health and defense ministries [US Pat. 5932449 USA, C07K 16/12, C12P 021/04. Detection of botulinum toxin / The Secretary of the Army, USA, No. 08792824, declared. 01/30/1997]. Most of the described botulinum toxin detection systems using antibodies are based on classical enzyme-linked immunosorbent assay.

Известны гибридомы, продуцирующие мышиные МКА к ботулиническому нейротоксину типа В, характеризующиеся стабильностью продукции антител, на основе которых разработан ряд высокочувствительных тест-систем в формате иммуноферментного анализа [Stanker, L.H. A Monoclonal Antibody Based Capture ELISA for Botulinum Neurotoxin Serotype B: Toxin Detection in Food / L.H. Stanker, M.C. Scotcher, L. Cheng, K. Ching, J. McGarvey, D. Hodge, and R. Hnasko // Toxins (Basel). - 2013. - V. 5. - P. 2212-2226]. Однако известные зарубежные штаммы гибридных клеток Mus museums - продуценты МКА, которые можно использовать для выявления ботулинических нейротоксинов, недоступны для получения МКА и производства отечественных диагностических тест-систем. В России в настоящее время отсутствуют запатентованные штаммы-продуценты МКА к ботулотоксинам.Hybridomas are known that produce mouse MCAs for botulinum neurotoxin type B, which are characterized by the stability of antibody production, on the basis of which a number of highly sensitive test systems have been developed in the format of an enzyme immunoassay [Stanker, L.H. A Monoclonal Antibody Based Capture ELISA for Botulinum Neurotoxin Serotype B: Toxin Detection in Food / L.H. Stanker, M.C. Scotcher, L. Cheng, K. Ching, J. McGarvey, D. Hodge, and R. Hnasko // Toxins (Basel). - 2013. - V. 5. - P. 2212-2226]. However, the famous foreign strains of hybrid cells of Mus museums - producers of MCA, which can be used to detect botulinum neurotoxins, are not available for MCA and the production of domestic diagnostic test systems. In Russia, currently there are no patented strains producing MCA for botulinum toxins.

Диагностика ботулизма проводится на основании клинических, эпидемиологических и лабораторных данных. Применяемые в настоящее время методы лабораторной диагностики ботулизма трудоемки, затратны и требуют создания особых условий проведения анализа или использования специального дорогостоящего оборудования [Носкова, О.А. Клинико-эпидемиологические особенности и совершенствование лабораторной диагностики ботулизма в Иркутской области / О.А. Носкова, Т.Ю. Загоскина, Е.Н. Субычева, Е.Ю. Марков, С.Е. Лекомцева, О.Б. Бодрых, СВ. Балахонов // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2013. - №2 (90). Часть 1. - С. 102-106].Diagnosis of botulism is carried out on the basis of clinical, epidemiological and laboratory data. Currently used methods of laboratory diagnosis of botulism are laborious, costly and require the creation of special conditions for analysis or the use of special expensive equipment [Noskova, O.A. Clinical and epidemiological features and improvement of laboratory diagnosis of botulism in the Irkutsk region / O.A. Noskova, T.Yu. Zagoskina, E.N. Subycheva, E.Yu. Markov, S.E. Lekomtseva, O.B. Vigorous, SV. Balakhonov // Bulletin of the VSNS SB RAMS. - 2013. - No. 2 (90). Part 1. - S. 102-106].

Разработка экспресс-методов детекции BoNTs остается актуальной проблемой как для медицины, так и для органов государственного санитарно-эпидемиологического контроля вследствие их экстремальной токсичности и самой высокой летальности при пищевых отравлениях. Кроме того, в последнее время во всем мире внимание к данной категории токсинов возросло из-за угрозы биотерроризма [Аббасова С.Г. Моноклональные антитела к ботулиническим нейротоксинам типов А, В, E и F / С.Г. Аббасова, Н.В. Руденко, А.Ю. Гороховатский, М.В. Капралов, И.Д. Виноградова, Ю.В. Вертиев, В.А. Несмеянов, Е.В. Гришин // Биоорганическая химия. - 2011. - Т. 37. - №3. - С. 344-353].The development of rapid detection methods for BoNTs remains an urgent problem for both medicine and the state sanitary and epidemiological control authorities due to their extreme toxicity and highest mortality in food poisoning. In addition, recently in the whole world attention to this category of toxins has increased due to the threat of bioterrorism [Abbasova SG Monoclonal antibodies to botulinum neurotoxins of types A, B, E and F / C.G. Abbasova, N.V. Rudenko, A.Yu. Gorokhovatsky, M.V. Kapralov, I.D. Vinogradova, Yu.V. Vertiev, V.A. Nesmeyanov, E.V. Grishin // Bioorganic chemistry. - 2011. - T. 37. - No. 3. - S. 344-353].

Наиболее ярким примером в этой области является создание гибридомной технологии для получения моноклокнальных антител (МКА) с заданными свойствами.The most striking example in this area is the creation of hybridoma technology for producing monoclonal antibodies (MABs) with desired properties.

Задача данного изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к ботулиническому токсину типа В и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя ботулизма.The objective of the invention is to obtain a strain of hybrid cultured cells producing monoclonal antibodies specific for type B botulinum toxin and suitable for constructing test systems based on them to detect the causative agent of botulism.

Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 3F11 - продуцент высокоспецифичных моноклональных антител к ботулиническому токсину типа В.The problem is solved by the fact that a new strain of hybrid cultured animal cells of animals mus musculus 3F11 - a producer of highly specific monoclonal antibodies to botulinum toxin type B.

Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 3F11 депонирован в государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ МПБ), коллекционный номер - Н-45, и используется как продуцент моноклональных антител для выявления ботулинического нейротоксина типа В.The strain of hybrid animal cells Mus musculus 3F11 was deposited in the state collection of pathogenic microorganisms and cell cultures of the Federal budget institution of science of the State scientific center for applied microbiology and biotechnology (FBUN SSC MPB), collection number - H-45, and is used as a producer of monoclonal antibodies to detect botulinum neurotoxin type B.

Родословная штаммаPedigree strain

Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 3F11 получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют 4-кратным введением рекомбинантного ботулинического токсина типа В в дозе 100 мкг/мышь. На третьи сутки после последней иммунизации проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×108 клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (1×107 клеток). В качестве сливающего агента использовали 50% раствор полиэтиленгликоля фирмы (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.Mus musculus 3F11 animal hybrid cell strain is obtained by immunization of BALB / c mice. Mice are immunized with 4 times the introduction of recombinant botulinum toxin type B at a dose of 100 μg / mouse. On the third day after the last immunization, the splenocytes of the immune mice (1 × 10 8 cells) are hybridized with the cells of mouse myeloma PZ-X63 Ag / 8-653 (1 × 10 7 cells). A 50% solution of polyethylene glycol (Sigma, USA) was used as a merging agent. After hybridization, selection, screening, cloning, and cryopreservation of the hybridoma are performed.

Характеристика штамма гибридных клеток животных Mus musculus 3F11.Characterization of the strain of hybrid cells of animals Mus musculus 3F11.

Морфологическая характеристикаMorphological characteristics

Культура гибридных клеток состоит из слабо прикрепленных к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку.The hybrid cell culture consists of rounded cells loosely attached to the substrate the size of the original myeloma cell.

Культуральные свойстваCultural properties

Культивирование штамма гибридных клеток животных Mus musculus 3F11 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование клеток гибридомы 3F11 проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2 - 1:3. Посевная концентрация клеток составляет 1×105 в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1×105 на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).The cultivation of the strain of hybrid animal cells of animals Mus musculus 3F11 is carried out at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is RPMI - 1640 medium containing 20% fetal calf serum, 2 mM / L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin. Cells are cultured as a stationary suspension in Costar plastic mattresses. Passage of 3F11 hybridoma cells is carried out 2 times a week with a dilution ratio of 1: 2 - 1: 3. The inoculum cell concentration is 1 × 10 5 in 1 ml of medium. The maximum concentration of hybrid cells during cultivation is 1 × 10 5 per 1 ml of medium. The hybrid clone does not lose the ability to synthesize antibodies at 10 passages in vitro (observation period).

Культивирование гибридомы 3F11 в организме животногоCultivation of hybridoma 3F11 in the animal

Самкам мышей BALB/c 20-недельного возраста предварительно вводят внутрибрюшинно 0,3-0,5 мл пристана (Sigma, США). Через 2-4 недели культивируемые клетки штамма, находящиеся в логарифмической фазе роста, стерильно центрифугируют 5-10 мин при 1000 об/мин на центрифуге ОПН-3. Надосадок удаляют, а осадок клеток суспензируют в стерильной среде RPMI. Самкам мышей BALB/c внутрибрюшинно вводят каждой по 1 мл клеточной суспензии, содержащей не менее 10 млн гибридомных клеток. Гибридома прививается в 100% случаев. Асцитическая опухоль формируется на 7-10 день, на 10-21 сутки животных усыпляют и из брюшной полости извлекают 3-5 мл иммуноасцитической (ИАЖ) жидкости. Клетки из ИАЖ отделяют центрифугированием, а в надосадочной жидкости определяют титр МКА с помощью иммуноферментного анализа [Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова // Т33. - М.: Высш. шк., 1991. - С. 174-175].Female 20-week old BALB / c mice were pre-injected intraperitoneally with 0.3-0.5 ml pristan (Sigma, USA). After 2-4 weeks, the cultured cells of the strain located in the logarithmic phase of growth are sterile centrifuged for 5-10 minutes at 1000 rpm in an OPN-3 centrifuge. The supernatant is removed and the cell pellet is suspended in a sterile RPMI medium. Female BALB / c mice were intraperitoneally injected each with 1 ml of a cell suspension containing at least 10 million hybridoma cells. Hybridoma is vaccinated in 100% of cases. An ascitic tumor forms on days 7–10, animals are euthanized on days 10–21, and 3-5 ml of immuno-ascitic (IAG) fluid is removed from the abdominal cavity. Cells from the IAH are separated by centrifugation, and the titer of the MCA is determined in the supernatant by enzyme immunoassay [Egorov, A.M. Theory and practice of enzyme immunoassay / A.M. Egorov, A.P. Osipov, B.B. Dzantiev, E.M. Gavrilova // T33. - M .: Higher. school., 1991. - S. 174-175].

Характеристика полезного продуктаProduct Feature

Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 3F11 продуцирует специфичные моноклональные антитела к ботулотоксину типа В, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:640000, в ИАЖ 1:1000000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяли путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, Bio Rad, США).The mus musculus 3F11 animal hybrid cell strain produces specific monoclonal antibodies to botulinum toxin type B, the titer of which is in the culture fluid (QOL) 1: 640000, in the IAI 1: 1000000. Monoclonal antibodies from QOL and IAG were isolated by affinity chromatography on a column of protein G-Sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). The purity of the obtained immunoglobulin fractions was evaluated in SDS-PAGE-electrophoresis under denaturing conditions. The concentration of immunoglobulins was determined spectrophotometrically at a wavelength of 280 nm (Smart Spec Plus spectrophotometer, Bio Rad, USA).

Продуктивность штамма гибридных клеток животных Mus musculus 3F11The productivity of the strain of hybrid cells of animals Mus musculus 3F11

Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 5-10 мг/мл. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 10 пассажей in vitro при непрерывном культивировании.MCA production in the cultivation medium is 20-50 μg / ml, in ascitic fluid - 5-10 mg / ml. Stable production of MCA is maintained for at least 10 passages in vitro with continuous cultivation.

Контаминация штамма гибридных клеток животных Mus musculus 3F11. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микоплазмы не определяли.The contamination of the strain of hybrid cells of animals Mus musculus 3F11. Hybrid line contaminants, including bacteria, yeast, fungi, were not detected. Mycoplasmas were not determined.

Режим криоконсервации и отогреваCryopreservation and heating mode

Среда для замораживания содержит фетальной сыворотки - 90%, диметилсульфоксид - 10%. 1-1,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре - 70°С и затем опускают в жидкий азот.The freezing medium contains fetal serum - 90%, dimethyl sulfoxide - 10%. 1-1.5 ml of the cell suspension is transferred into plastic cryovials and placed in a foam container with a wall thickness of 1 cm and left for 16-24 hours in a kelvinator at a temperature of -70 ° C and then immersed in liquid nitrogen.

Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 37-41°С. Клетки разводят средой RPMI 1640 («HyClone», США) и центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде и клетки переносят в культуральные флаконы в концентрации 200-300 тысяч в миллилитре. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 60-80%. Каждая ампула содержит не менее 10 млн/мл клеток.Defrosting is carried out by lowering the tubes into water at a temperature of 37-41 ° C. Cells were diluted with RPMI 1640 medium (HyClone, USA) and centrifuged at 1000 rpm. The sediment is resuspended in a growth medium and the cells are transferred into culture bottles at a concentration of 200-300 thousand per milliliter. Cell viability after thawing is 60-80%. Each ampoule contains at least 10 million / ml cells.

Свойства полезного продуктаUseful Product Properties

Гибридома продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgG1 подклассу иммуноглобулинов мыши.The hybridoma produces monoclonal antibodies belonging to the IgG1 subclass of mouse immunoglobulins.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.The invention is illustrated by the following graphic materials.

Фиг. 1. Дот-блот с МКА 3F11. Определение специфической активности в отношении микроорганизмов рода Clostridium.FIG. 1. Dot blot with MCA 3F11. Determination of specific activity against microorganisms of the genus Clostridium.

Фиг. 2. Дот-блот с МКА 3F11. Определение чувствительности МКА 3F11 в отношении штаммов Clostridium botulinum, содержащих ботулинический нейротоксин типа В.FIG. 2. Dot blot with MCA 3F11. Determination of the sensitivity of MCA 3F11 in relation to strains of Clostridium botulinum containing botulinum neurotoxin type B.

Фиг. 3. Дот-блот с МКА 3F11. Определение чувствительности МКА 3F11 в отношении рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа В.FIG. 3. Dot blot with MCA 3F11. Determination of the sensitivity of MCA 3F11 in relation to recombinant botulinum neurotoxin type B.

Фиг. 4. Определение подклассовой принадлежности МКА 3F11.FIG. 4. The definition of subclass affiliation MCA 3F11.

Фиг. 5. SDS-PAGE электрофорез МКА 3F11.FIG. 5. SDS-PAGE electrophoresis of MCA 3F11.

Фиг. 6. Иммуноферментный анализ. Выявление ботулотоксина В методом иммуноферментного анализа.FIG. 6. Enzyme-linked immunosorbent assay. Detection of botulinum toxin B by enzyme immunoassay.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.For a better understanding of the invention, the following are examples of its specific implementation.

Пример 1. Получение штамма гибридных клеток 3F11Example 1. Obtaining a strain of hybrid cells 3F11

ИммунизацияImmunization

В качестве антигена для иммунизации использовали рекомбинантный белок, состоящий из фрагментов тяжелой цепи ботулинического токсина В. Для создания суперпродуцентов фрагментов тяжелых цепей ботулинического токсина В последовательности ДНК, кодирующие C-концевые фрагменты этих токсинов, образующие домен НС50В (аминокислоты N853 - Е1291 белка-предшественника ботулотоксина В), были получены ПЦР-амплификацией с геномной ДНК возбудителя, клонированы в экспрессионные, вектор pET22b(+) (Novagen, США). Полученные экспрессионные конструкты были трансформированы в клетки Е. coli штамма BL21(DE3), наработка бактериальной биомассы и продукция белка проводились при температуре +300°С и 1 мм ИПТГ [Рябко А.К. Разработка метода детекции ботулинического нейротоксина на основе иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией / А.К. Рябко, А.Е. Хлынцева, А.В. Колесников, О.Н. Красавцева, И.Г. Шемякин, Т.И. Комбарова, И.В. Жарникова, А.В. Козырь // Современная медицина и фрамацевтика: анализ и перспективы развития: Материалы VI Международной научно-практической конференции (20.11.2012). - М.: Издательство «Спутник+». - 2012. - 70 с].A recombinant protein consisting of botulinum toxin B heavy chain fragments was used as an antigen for immunization. To create superproducers of botulinum toxin B heavy chain fragments, DNA sequences encoding the C-terminal fragments of these toxins forming the HC50B domain (amino acids N853 - E1291 of the botulinum toxin precursor protein C), were obtained by PCR amplification with the genomic DNA of the pathogen, cloned into the expression vector pET22b (+) (Novagen, USA). The resulting expression constructs were transformed into E. coli cells of strain BL21 (DE3), bacterial biomass production and protein production were carried out at a temperature of + 300 ° C and 1 mm IPTG [Ryabko A.K. Development of a method for detecting botulinum neurotoxin based on immunodetection coupled with PCR amplification / A.K. Ryabko, A.E. Khlyntseva, A.V. Kolesnikov, O.N. Krasavtseva, I.G. Shemyakin, T.I. Kombarova, I.V. Zharnikova, A.V. Trump // Modern medicine and pharmaceuticals: analysis and development prospects: Materials of the VI International Scientific and Practical Conference (11/20/2012). - M .: Publishing house "Sputnik +". - 2012. - 70 s].

Штамм гибридных клеток Mus musculus получают следующим образом. Самок мышей BALB/c иммунизируют по схеме, которая приведена ниже в таблице 1.A strain of Mus musculus hybrid cells is prepared as follows. Female BALB / c mice are immunized according to the scheme shown in Table 1 below.

Figure 00000001
Figure 00000001

Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после последней инъекции антигеном в концентрации 100 мкг согласно Animal protocol № P 02-19 стр. 7.Blood from immune mice was taken on the third day after the last injection of antigen at a concentration of 100 μg according to Animal protocol No. P 02-19 p. 7.

Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.The titers of specific antibodies in animal sera are determined using indirect solid-phase ELISA.

ГибридизацияHybridization

Для слияния используют селезеночные клетки мышей и клетки мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 в количестве 1×108 и 1×107 соответственно. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 1 мл 50% раствора ПЭГ в течение 1 мин. Смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Затем клетки растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют 96-луночные микропланшеты (Costar, США) на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c, по 50 мкл в лунку.For fusion, spleen cells of mice and mouse myeloma cells PZ-X63 Ag / 8-653 in the amount of 1 × 10 8 and 1 × 10 7, respectively, are used. The mixture of cells is centrifuged, the supernatant is thoroughly removed, and 1 ml of a 50% PEG solution is added to the cell pellet over 1 minute. The mixture is centrifuged for 15 minutes at 1000 rpm. Then the cells are dissolved in the growth medium. Cells dispense 96-well microplates (Costar, USA) onto a layer of peritoneal macrophages taken from BALB / c mice at 50 μl per well.

СелекцияSelection

Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ («ПанЭко», Россия), состоящей из питательной среды RPMI, в которую добавлены 20% фетальной сыворотки коров, 0,1 мM гипоксантина, 0,04 мM тимидина и 0,01 мM аминоптерина. Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде RPMI - 1640 с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM /L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.The hybrid cells are selected in GAT medium (PanEco, Russia), consisting of RPMI nutrient medium, in which 20% fetal bovine serum, 0.1 mM hypoxanthine, 0.04 mM thymidine, and 0.01 mM aminopterin are added. After 21 days, aminopterin is removed from the medium. Subsequently, the cultivation is carried out on RPMI - 1640 medium with 20% fetal calf serum, 2 mM / L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin.

Скрининг гибридных клоновHybrid Clone Screening

Отбор специфических гибридов проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА).Specific hybrids are selected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96 - луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 1 мкг/лунку рекомбинантного болулинического нейротоксина типа В и выдерживают при температуре 37°С в течение 2 часов или при 4°С в течение 18 часов. После инкубации лунки промывают 3-5 раз фосфатно-солевым буфером рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20 (Sigma). (ФСБ-Т). Далее вносят в лунки по 160 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности, и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. Три раза отмывают ФСБ-Т. Затем в лунки переносят по 100 мкл культуральной среды исследуемых гибридом и инкубируют 1 ч при 37°С. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа, затем 6 раз отмывают лунки раствором ФСБ-Т. Далее планшеты промывают и проводят ферментативную реакцию: в лунки вносят по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (10 мкл 30% Н2O2 и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-нитратного буфера pH 5,0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Учет результатов проводят на фотометре (xMark, Microplate Spectrophotometr, Bio-Rad, США) для ИФА при длине волны 492 нм.To perform an indirect ELISA, 1 μg / well of recombinant bolulinic neurotoxin type B is added to the wells of a 96-well polystyrene plate for immunoassay and kept at 37 ° C for 2 hours or at 4 ° C for 18 hours. After incubation, the wells are washed 3-5 times with phosphate-buffered saline, pH 7.4, containing 0.05% tween-20 (Sigma). (FSB-T). Then, 160 μl of a 0.5% solution of bovine serum albumin (BSA), tested for the absence of peroxidase activity, is added to the wells and incubated at 37 ° C for 1 hour. FSB-T is washed three times. Then, 100 μl of the culture medium of the studied hybridomas are transferred to the wells and incubated for 1 h at 37 ° C. After that, the wells of the tablet are washed three times with a solution of PBS-T and the peroxidase conjugate is added to the wells to the whole mouse IgG molecule (Sigma, USA) in working dilution. The plate is incubated at 37 ° C for 1 hour, then the wells are washed 6 times with FSB-T solution. Next, the plates are washed and an enzymatic reaction is carried out: 100 μl of a substrate-indicator solution (10 μl of 30% H 2 O 2 and 8 mg of orthophenylenediamine per 10 ml of phosphate-nitrate buffer pH 5.0) are added to the wells. A positive reaction is evaluated by the appearance of a tan solution. The reaction is stopped by adding 50 μl of 4N sulfuric acid to the wells. The results are taken into account on a photometer (xMark, Microplate Spectrophotometr, Bio-Rad, USA) for ELISA at a wavelength of 492 nm.

Клонирование гибридных клеток 3F11 проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 1×104 клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.Cloning of 3F11 hybrid cells was performed by limiting dilution in 96-well plates on a layer of peritoneal macrophages at the rate of 1 × 10 4 cells per well. Clone screening is carried out by indirect solid-phase ELISA, as described above.

КультивированиеCultivation

Культивирование штамма гибридных клеток 3F11 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.The cultivation of the strain of hybrid cells 3F11 is carried out at a temperature of 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The cultivation medium is RPMI - 1640 medium containing 20% fetal calf serum, 2 mM / L-glutamine, 100 μg / ml gentamicin.

КриоконсервацияCryopreservation

Клоны гибридомы 3F11 криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.Clones of 3F11 hybridoma are cryopreserved on a freezing medium consisting of fetal calf serum - 90%, dimethyl sulfoxide - 10%. Hybridoma clones are stored in Dewar vessels with liquid nitrogen.

Пример 2. Выращивание культуры С.botulinum в условиях продукции токсинаExample 2. Cultivation of C. botulinum culture in the conditions of toxin production

Выбранные хорошо изолированные, типичные, колонии С.botulinum, выросшие на твердой питательной среде (клостридиальный агар - 25,25 г, 1 г дрожжевого экстракта, 2 г агара, 475 мл дистиллированной воды), инкубированной в анаэробных условиях в течение 48 ч при 35°С, суспендировали в физиологическом растворе (до оптической плотности 4 по Мак Фарланду) и прогревали в течение 10 минут при 80°С для инактивации вегетативных клеток.Selected well-isolated, typical colonies of C. botulinum grown on solid nutrient medium (clostridial agar - 25.25 g, 1 g of yeast extract, 2 g of agar, 475 ml of distilled water), incubated under anaerobic conditions for 48 hours at 35 ° C, suspended in physiological saline (to an optical density of 4 according to Mac Farland) and heated for 10 minutes at 80 ° C to inactivate vegetative cells.

Прогретую культуру (1 мл) вносили в свежеприготовленную среду для продукции токсина (casein enzymic hydrolysate - 10 г/л, pepton aus Casein C/ESX Enzymatich for Tocingenwennung - 10 г/л, sodium thioglycollate - 0,25 г/л, дрожжевой экстракт - 10 g/l, дистиллированная вода - 500 мл), пробирки с 9 мл среды, соотношение 1/10. Инкубацию проводили при 35°С в течение 5 дней в анаэробных условиях, полученных в анаэростате при помощи газогенерирующего пакета (GasPak EZ, «BD», США).A warmed culture (1 ml) was added to a freshly prepared medium for the production of toxin (casein enzymic hydrolysate - 10 g / l, pepton aus Casein C / ESX Enzymatich for Tocingenwennung - 10 g / l, sodium thioglycollate - 0.25 g / l, yeast extract - 10 g / l, distilled water - 500 ml), tubes with 9 ml of medium, 1/10 ratio. Incubation was carried out at 35 ° C for 5 days under anaerobic conditions obtained in the anaerostat using a gas generating package (GasPak EZ, BD, USA).

Пример 3. Определение специфической активности в отношении микроорганизмов рода ClostridiumExample 3. Determination of specific activity against microorganisms of the genus Clostridium

Для проведения данного исследования использовали панель из 24 микроорганизмов, включающую микроорганизмы рода Clostridium и другие (таблица 2).To conduct this study, a panel of 24 microorganisms was used, including microorganisms of the genus Clostridium and others (table 2).

Figure 00000002
Figure 00000002

На нитроцеллюлозную мембрану (GE Healthcare Life Sciences, Amersham, Germany) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбировали инактивированные микробные клетки в концентрациях 1×106 клеток/лунку. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 3F11 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0,05% диаминобензидина (Sigma, США), 0,015% Н2О2, 0,01 M фосфатно-солевой буфер, рН-7,4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.Inactivated microbial cells were adsorbed at a concentration of 1 × 10 6 cells / well using a BIO-DOT device (BIO RAD, USA) on a nitrocellulose membrane (GE Healthcare Life Sciences, Amersham, Germany). Microorganism strains were obtained from the microorganism collection FBSI SSC PMB. The membranes were then blocked with an inert protein solution and sequentially incubated with 3F11 MCA and a peroxidase conjugate to the whole mouse IgG molecule (Sigma, USA). The reaction was visualized with a solution of a substrate mixture based on diaminobenzidine (0.05% diaminobenzidine (Sigma, USA), 0.015% H 2 O 2 , 0.01 M phosphate-buffered saline, pH 7.4). The reaction was stopped by washing with distilled water.

Как показал проведенный анализ, МКА 3F11 специфически взаимодействовали со штаммами Clostridium botulinum, содержащими ботулинический нейротоксин типа В, и не давали перекрестных реакций с другими микроорганизмами (фиг. 1).As the analysis showed, MCA 3F11 specifically interacted with strains of Clostridium botulinum containing botulinum neurotoxin type B and did not give cross-reactions with other microorganisms (Fig. 1).

Пример 4. Определение чувствительности МКА 3F11 в отношении штаммов Clostridium botulinum, содержащих ботулинический нейротоксин типа В.Example 4. Determination of the sensitivity of MCA 3F11 in relation to strains of Clostridium botulinum containing botulinum neurotoxin type B.

Была проведена проверка чувствительности КЖ гибридом 3F11 в отношении ботулотоксина типа В методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали штаммы Clostridium botulinum типа В с начальной концентрацией 1×108 м.кл./мл и титровали двукратным шагом до конечной концентрации 1×105 м.кл./мл (1 ряд - штамм Clostridium botulinum №311, тип В, 2 ряд - Clostridium botulinum №312, тип В, 3 ряд - Clostridium botulinum №364, тип В).Sensitivity testing of QL with a 3F11 hybrid against botulinum toxin type B was performed by dot blot analysis. Clostridium botulinum type B strains with an initial concentration of 1 × 10 8 μl / ml were sorbed onto a nitrocellulose filter using a Bio-Dot device (Bio-Rad, USA) and titrated in two steps to a final concentration of 1 × 10 5 m. cells / ml (1st row - strain Clostridium botulinum No. 311, type B, 2nd row - Clostridium botulinum No. 312, type B, 3rd row - Clostridium botulinum No. 344, type B).

Далее мембрану блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 3F11 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% Н2О2, 0,01 M фосфатно-солевой буфер, рН-7,4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.The membrane was then blocked with an inert protein solution and incubated sequentially with 3F11 MCA and peroxidase conjugate to the whole mouse IgG molecule (Sigma, USA). The reaction was visualized with a solution of a substrate mixture based on diaminobenzidine (0.05% diaminobenzidine (Sigma, USA), 0.015% H 2 O 2 , 0.01 M phosphate-buffered saline, pH 7.4). The reaction was stopped by washing with distilled water.

В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 3F11 выявляют ктетки штаммаов Clostridium botulinum типа В до 1×105 м.кл./мл (фиг. 2).As a result of the analysis, it was found that MCA 3F11 reveal the ketochka of strains of Clostridium botulinum type B strains up to 1 × 10 5 μl / ml (Fig. 2).

Пример 5. Определение чувствительности МКА 3F11 в отношении рекомбинантного ботулинического нейротоксина типа ВExample 5. Determination of the sensitivity of MCA 3F11 in relation to recombinant botulinum neurotoxin type B

Была проведена проверка специфической активности КЖ гибридом 3F11 в отношении ботулинического нейротоксина типа В методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали ботулотоксин В с начальной концентрацией 0,5 мкг/мл и титровали двукратным шагом. Далее мембрану блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 3F11 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0,015% Н2О2, 0,01 M фосфатно-солевой буфер, рН-7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.The specific activity of QL hybridomas 3F11 was tested against botulinum neurotoxin type B by dot blot analysis. Botulinum toxin B with an initial concentration of 0.5 μg / ml was sorbed onto a nitrocellulose filter using a Bio-Dot device (Bio-Rad, USA) and titrated twice. The membrane was then blocked with an inert protein solution and incubated sequentially with 3F11 MCA and peroxidase conjugate to the whole mouse IgG molecule (Sigma, USA). The reaction was visualized with a solution of a substrate mixture based on diaminobenzidine (0.05% diaminobenzidine (Sigma, USA), 0.015% H 2 O 2 , 0.01 M phosphate-buffered saline, pH 7.4). The reaction was stopped by washing with distilled water.

В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 3F11 выявляют до 1 нг/мл ботулотоксина В (фиг. 3).As a result of the analysis, it was found that MCA 3F11 detect up to 1 ng / ml of botulinum toxin B (Fig. 3).

Пример 6. Определение подклассовой принадлежности МКА, продуцируемых гибридомой 3F11Example 6. Determination of the subclass affiliation of MCAs produced by 3F11 hybridoma

Подклассы полученных МКА определяют с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США). В культуральную жидкость объемом 500 мкл погружают иммунохроматографическую полоску для определения изотипов мышиных моноклональных антител, не глубже чем на 1,5 см, на 5 минут. После проявления контрольной полосы и полосы, соответствующей тестируемым Ig, определяют с помощью контрольной иммунохроматографической полоски (прилагается к набору для определения изотипов мышиных моноклональных антител) подкласс антител.Subclasses of the obtained MCAs are determined using the isotype kit for murine monoclonal antibodies (Roche Diagnostic Corporation, USA). An immunochromatographic strip is immersed in a culture fluid of 500 μl to determine the isotypes of murine monoclonal antibodies, not deeper than 1.5 cm, for 5 minutes. After the development of the control band and the band corresponding to the tested Ig, the antibody subclass is determined using the control immunochromatographic strip (attached to the kit for determining isotypes of murine monoclonal antibodies).

Определение подкласса полученных МКА показало, что штамм гибридных клеток 3F11 продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgG2b подклассу иммуноглобулинов мыши (фиг. 4).Subclass determination of the obtained MCAs showed that the 3F11 hybrid cell strain produces monoclonal antibodies belonging to the IgG2b mouse immunoglobulin subclass (Fig. 4).

Пример 7. Выделение и очистка МКА 3F11Example 7. Isolation and purification of MCA 3F11

Выделение МКА из асцитической жидкости проводят путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Клеточные компоненты из культуральной и асцитической жидкостей удаляют центрифугированием (2000 g × 20 мин), рН культуральной жидкости доводят до 8,6 при помощи 1 N раствора NaOH, асцитическую жидкость разводят 1:1 посадочным буфером (0,05 M трис, 0,15 M NaCl, 0,02% NaN3, рН 8,6). Колонку уравновешивают посадочным буфером и проводят нанесение образцов со скоростью 10 мл/час при комнатной температуре. После нанесения образцов колонку отмывают от не связавшихся компонентов и проводят элюцию иммуноглобулинов 0,05 M глициновым буфером, 0,15 M NaCl, рН 2,3. Контроль выхода фракции иммуноглобулинов осуществляют при помощи УФ детектора («Pharmacia LKB», Швеция).The allocation of MCA from ascitic fluid is carried out by affinity chromatography on a column of protein G-sepharose (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Cellular components from the culture and ascitic fluids are removed by centrifugation (2000 g × 20 min), the pH of the culture fluid is adjusted to 8.6 using a 1 N NaOH solution, ascitic fluid is diluted 1: 1 with planting buffer (0.05 M Tris, 0.15 M NaCl, 0.02% NaN 3 , pH 8.6). The column is balanced with landing buffer and samples are applied at a rate of 10 ml / hour at room temperature. After applying the samples, the column is washed from unbound components and the immunoglobulins are eluted with 0.05 M glycine buffer, 0.15 M NaCl, pH 2.3. The yield control of the immunoglobulin fraction is carried out using a UV detector (Pharmacia LKB, Sweden).

Выделенные иммуноглобулины концентрируют осаждением при помощи сухого сульфата аммония (до 50% насыщения) и переводят в фосфатно-солевой буферный раствор методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (PD-10, «Pharmacia LKB», Швеция) емкостью 10 мл. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях по методу Laemmli [Laemmli, U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685]. В результате были получены очищенные препараты иммуноглобулинов (фиг. 5).The isolated immunoglobulins are concentrated by precipitation with dry ammonium sulfate (up to 50% saturation) and transferred to a phosphate-buffered saline by gel filtration on a Sephadex G-25 column (PD-10, Pharmacia LKB, Sweden) with a capacity of 10 ml. The purity of the obtained immunoglobulin fractions was evaluated in SDS-PAGE-electrophoresis under denaturing conditions by the method of Laemmli [Laemmli, U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685]. As a result, purified immunoglobulin preparations were obtained (Fig. 5).

Пример 8. Определение методом ИФА специфического взаимодействия МКА, продуцируемых гибридными клетками штамма Mus musculus с ботулиническим нейротоксином типа ВExample 8. Determination by ELISA of the specific interaction of MCA produced by hybrid cells of Mus musculus strain with botulinum neurotoxin type B

МКА 3F11 в фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 с начальной концентрацией 5 мкг/лунку титровали двукратным шагом по вертикали до конечной концентрации 0,035 мкг/лунку (по 100 мкл/лунку в ФСБ). Для титрования использовали 96-ти луночные стрипованные планшеты для ИФА. В первый вертикальный ряд планшета вносили положительные (К+) и отрицательные контроли (К-) контроли. Лунку А1 с отрицательным контролем использовали как бланк. Планшет с антителами инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°С, затем 4 раза промывали ФСБ-Т. Участки неспецифического связывания блокировали добавлением в лунки по 160 мкл молока 0,5% жирности, инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°С и промывали 3 раза ФСБ-Т. Рекомбинантный ботулинический токсин титровали двукратным шагом по горизонтали с начальной концентрацией 0,5 мкг/мл в ФСБ до конечной концентрации 0,0002 мкг/мл в ФСБ (по 100 мкл/лунку в ФСБ), инкубировали при тех же условиях, после чего промывали планшет 4 раза в ФСБ-Т. Биотинилированные МКА 1G7 (фракция №3-1,4 мг/мл) вносили заведомо в избытке (разведение 1:500) по 100 мкл/лунку в ФСБ, инкубацию и промывку планшета проводили четырехкратно, как описано выше. Затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена («Имтек», Россия) в разведении 1:5000 (согласно инструкции по применению) в ФСБ. После инкубации и четырехкратной отмывки планшета во все лунки вносили по 50 мкл субстрата (готовый раствор 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина). Планшет помещали на 3-5 минут в темное место, затем останавливали реакцию 4 N серной кислотой (50 мкл/лунку).MCA 3F11 in phosphate-buffered saline, pH 7.4 with an initial concentration of 5 μg / well, was titrated twice in vertical steps to a final concentration of 0.035 μg / well (100 μl / well in PBS). For titration, 96-well stripped ELISA plates were used. Positive (K +) and negative controls (K-) controls were added to the first vertical row of the tablet. Well A1 with negative control was used as a blank. The antibody plate was incubated for 1 h on a shaker at a temperature of 37 ° C, then washed with FSB-T 4 times. Non-specific binding sites were blocked by adding 160 μl of 0.5% fat milk to the wells, incubated for 1 h on a shaker at 37 ° C and washed 3 times with PBS-T. Recombinant botulinum toxin was titrated twice in horizontal direction with an initial concentration of 0.5 μg / ml in FSB to a final concentration of 0.0002 μg / ml in FSB (100 μl / well in FSB), incubated under the same conditions, and then the plate was washed 4 times in the FSB-T. Biotinylated MCA 1G7 (fraction No. 3-1.4 mg / ml) was obviously added in excess (1: 500 dilution) of 100 μl / well into the FSB, and the plate was incubated and washed four times as described above. Then, 100 μl horseradish streptavidin-peroxidase conjugate (Imtek, Russia) was added to the plate wells at a dilution of 1: 5000 (according to the instructions for use) in the FSB. After incubation and four times washing the plate, 50 μl of substrate (prepared solution of 3.3 ′, 5.5′-tetramethylbenzidine) was added to all wells. The tablet was placed for 3-5 minutes in a dark place, then the reaction was stopped with 4 N sulfuric acid (50 μl / well).

Планшет помещали на 3-5 мин в защищенное от света место при комнатной температуре. Учет результатов проводили с помощью планшетного спектрофотометра xMark («Bio-Rad», США) при длине волны 450 нм.The tablet was placed for 3-5 minutes in a dark place at room temperature. The results were taken into account using an xMark plate spectrophotometer (Bio-Rad, USA) at a wavelength of 450 nm.

В результате проведенного анализа было установлено, что с использованием иммобилизованных МКА 3F11 предел обнаружения ботулотоксина В составил 0,8 нг/мл (таблица 2, фиг 6).As a result of the analysis, it was found that using immobilized MCA 3F11, the detection limit of botulinum toxin B was 0.8 ng / ml (table 2, FIG. 6).

Claims (1)

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 3F11 - продуцент моноклональных антител к ботулиническому токсину типа В, депонирован в коллекцию микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ), коллекционный номер Н-45. The strain of hybrid cultured animal cells Mus musculus 3F11, a producer of monoclonal antibodies to botulinum toxin type B, was deposited in the collection of microorganisms of the Federal State Institution of Science of the State Scientific Center for Applied Microbiology and Biotechnology (FBUN SSC PMB), collection number H-45.
RU2014145295/10A 2014-11-12 2014-11-12 STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B RU2566553C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014145295/10A RU2566553C1 (en) 2014-11-12 2014-11-12 STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2014145295/10A RU2566553C1 (en) 2014-11-12 2014-11-12 STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2566553C1 true RU2566553C1 (en) 2015-10-27

Family

ID=54362308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2014145295/10A RU2566553C1 (en) 2014-11-12 2014-11-12 STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2566553C1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2623157C1 (en) * 2016-03-15 2017-06-22 Открытое акционерное общество "Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО "ВНЦМДЛ") Antigen binding section (fab), including humanized fab, against botulinical neurotoxin c (versions), method to obtain fab using yeast, method and set for botulinical neurotoxin c detection

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2152036C1 (en) * 1998-05-12 2000-06-27 Научно-производственное объединение "Биомед" Method of assay and differentiation of botulinic toxins type a and b

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2152036C1 (en) * 1998-05-12 2000-06-27 Научно-производственное объединение "Биомед" Method of assay and differentiation of botulinic toxins type a and b

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STANKER L.H. et al., A Monoclonal Antibody Based Capture ELISA for Botulinum Neurotoxin Serotype B: Toxin Detection in Food, Toxins, 2013, vol.5 no.11, pp.2212-2226. АББАСОВА С.Г. и др., Моноклональные антитела к ботулиническим нейротоксинам типов A, B, E и F, БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том 37, N3, с.344-353. *
TROLLET C., PEREIRA Y. et al., Generation of High-Titer Neutralizing Antibodies against Botulinum Toxins A, B, and E by DNA Electrotransfer, Infect. Immun., 2009, vol. 77 no. 5, pp. 2221-2229 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2623157C1 (en) * 2016-03-15 2017-06-22 Открытое акционерное общество "Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения" (ОАО "ВНЦМДЛ") Antigen binding section (fab), including humanized fab, against botulinical neurotoxin c (versions), method to obtain fab using yeast, method and set for botulinical neurotoxin c detection

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Reddy et al. Evaluation of IgY capture ELISA for sensitive detection of Alpha hemolysin of Staphylococcus aureus without staphylococcal protein A interference
US20140335543A1 (en) Antibodies to clostridium difficile spores and uses thereof
Xu et al. Two novel analytical methods based on polyclonal and monoclonal antibodies for the rapid detection of Cronobacter spp.: development and application in powdered infant formula
Ojima-Kato et al. In vitro generation of rabbit anti-Listeria monocytogenes monoclonal antibody using single cell based RT-PCR linked cell-free expression systems
Pohanka Monoclonal and polyclonal antibodies production-preparation of potent biorecognition element
Liu et al. Development of a highly sensitive lateral immunochromatographic assay for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus
RU2566553C1 (en) STRAIN OF HYBRID CELLS OF ANIMALS Mus musculus 3F11 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO BOTULINUS TOXIN TYPE B
RU2571208C1 (en) STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 1G7 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR BOTULINUM TOXIN OF TYPE B
Wang et al. Identification of a conserved linear B-cell epitope in the Staphylococcus aureus GapC protein
RU2439148C1 (en) STRAIN OF HYBRID CULTIVATED CELLS OF ANIMAL Mus musculur 1E6-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES, SPECIFIC TO BACILLUS Anthracis spores
RU2478703C1 (en) STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 5G6 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN
CN105132282B (en) Campylobacter jejuni immuno-PCR detection kit
RU2451078C1 (en) Mus musculus cultivated hybrid cell strain 11d6 producer of monoclonal antibodies specific to lipopolysaccharide francisella tularensis
RU2768838C1 (en) Strain of hybrid cultured cells mus musculus 365e11 producing monoclonal antibodies to shiga-like toxin type ii
RU2460787C1 (en) Hybrid cell strain of mus musculus animals 10g4 - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis
RU2663003C1 (en) Strain of cultivated animal hybrid cells mus musculus-producer of monoclonal antibody to the membrane protein, which is common for tcp + the strains of cholera vibrios of the o1 and o139 serogroups
RU2525663C1 (en) STRAIN OF HYBRID CULTURED ANIMAL CELLS Mus musculus 2F9-PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC FOR LYSOSTAPHIN AND INHIBITING ITS LYTIC ACTIVITY
RU2478704C1 (en) STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus musculus 2B8 - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES SPECIFIC TO Yersinia pestis V ANTIGEN
RU2460788C1 (en) Hybrid cell strain of mus musculus 13f8 animals - producer of monoclonal antibodies specific to capsular f1 antigen yersinia pestis
RU2783897C1 (en) Homo sapiens/mus musculus 1b9c7 hybrid cultured cell strain: producer of human monoclonal antibodies specific to the proteolytic domain of botulinum type a toxin
JP2711595B2 (en) Simple method for detecting soil pathogenic fungi
RU2265051C1 (en) Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l, pkkk(p) 679d - producer of monoclonal antibody with specificity to protein-polysaccharide antigen from yersinia enterocolitica o3 and o9 serovars
RU2583306C1 (en) Hybrid strain of cultured cells of animals mus musculus -t 2e5 - producer of monoclonal antibodies isotype g 1 to b subunit of cholera toxin
RU2113475C1 (en) Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies showing specificity to brucella protein preparation of molecular mass 18 and 38 kda
Chowdhury In vivo propagation of monoclonal antibodies in ascites fluid produced in BALB/c mice: Characterization and diagnostic application for the identification of Vibrio cholerae O1

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner