RU2565377C1 - СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО pH ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК - Google Patents
СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО pH ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК Download PDFInfo
- Publication number
- RU2565377C1 RU2565377C1 RU2014142436/14A RU2014142436A RU2565377C1 RU 2565377 C1 RU2565377 C1 RU 2565377C1 RU 2014142436/14 A RU2014142436/14 A RU 2014142436/14A RU 2014142436 A RU2014142436 A RU 2014142436A RU 2565377 C1 RU2565377 C1 RU 2565377C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tumor
- sensor
- intracellular
- signal
- fluorescence
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток. Для этого осуществляют введение сенсора на внутриклеточный рН, регистрацию интенсивности флуоресценции при возбуждении на двух длинах волн в областях максимального поглощения и расчёт сигнала. В качестве сенсора на внутриклеточный pH используют генетически-кодируемый белок SypHer2. При этом обеспечивают его экспрессию в опухолевых клетках путём встраивания соответствующего гена в геном опухолевых клеток. Результирующий сигнал - рациометрический. Регистрацию сигнала сенсора на внутриклеточный pH осуществляют в живой ткани in vivo с 4-го по 28-й день роста опухоли с интервалом в три дня. Флуоресценцию регистрируют в видимом диапазоне при возбуждении светом с длиной волны 430 нм и 500 нм. Приём сигнала осуществляют на длине волны 540 нм с экспозицией 5 секунд. Способ обеспечивает повышение точности измерений и возможность динамического наблюдения в течение естественного роста опухоли и при различных воздействиях на неё, в том числе за счёт избирательной локализации используемого рН-сенсора в опухоли, и отсутствие зависимости измерений от концентрации рН-сенсора. 1 з.п. ф-лы, 20 ил., 4 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к исследованиям физических и химических свойств биологических тканей и может быть использовано в экспериментальной медицине для регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток в ходе естественного роста опухоли и при различных воздействиях.
Известно, что метаболизм опухолевых клеток отличается от метаболизма нормальных клеток, что приводит к различиям многих важных физиологических показателей. Одним из таких показателей является уровень внутриклеточного рН (водородный показатель). Важность этого физиологического параметра подтверждается тем фактом, что практически все патологические процессы сопровождаются изменением рН.
Установлено, что внутриклеточный рН опухолевых клеток является более щелочным по сравнению с нормальными клетками организма (7,12-7,65 при норме: 6,99-7,2), а внеклеточный рН опухоли более кислый (6,2-6,9 при норме: 7,3-7,4), т.е. в опухолевых тканях формируется обратный градиент вне- и внутриклеточного рН: защелачивание внутриклеточного рН и закисление среды вне клетки [1, 2, 3]. Отличия внеклеточного рН в опухолях и нормальных тканях уже используются в противоопухолевой терапии для направленной доставки препаратов за счет активации лекарства или его высвобождения из носителя (мицеллы, липосомы) в кислой среде опухоли [4]. В то же время большой интерес представляет разработка препаратов, направленных на восстановление градиента рН в опухолевых клетках за счет воздействия на внутриклеточные системы его регуляции (например, путем ингибирования вакуолярной Н+-АТФазы).
Более того, увеличение пролиферативной активности, уклонение от апоптоза и эффект множественной лекарственной устойчивости ассоциирован с нарушением градиента рН в опухолевых тканях [5, 6]. Кислый внеклеточный рН может значительно затруднять прохождение препаратов через плазматическую мембрану, что приводит к уменьшению накопления цитостатика в клетке. Поскольку многие из препаратов представляют собой слабые основания, существует вероятность их прямого протонирования и нейтрализации еще вне клетки в кислой межклеточной среде. Другой механизм хеморезистентности заключается в нарушении градиента рН на мембранах клеточных органелл (лизосом, эндосом, аппарата Гольджи, секреторных везикул), где также может происходить нейтрализация лекарства.
Однако несмотря на важность изучения внутриклеточного рН, адекватные методы его измерения in vivo отсутствуют. Существующие методы прижизненного измерения рН либо инвазивны (например, использование микроэлектродов), либо крайне сложны и дорогостоящи (ПЭТ, МРТ) [7]. В настоящее время активно развиваются подходы к анализу рН оптическими методами. Их существенным недостатком является необходимость экзогенного введения в клетку или ткань флуоресцентного зонда, чувствительного к рН. Флуоресцентный зонд, как правило, представляет собой синтетически синтезированное вещество, оптические характеристики которого сильно меняются при связывании с белками или иными компонентами клетки, а внутриклеточное распределение непостоянно. Зонды высокочувствительны к изменению рН, однако для их оптимального накопления в определенной ткани требуется порядка нескольких часов. Кроме того, основным недостатком этих сенсоров является их собственное влияние на значения рН в тканях [8, 9]. Использование таких зондов ограничено исследованиями in vitro, поскольку их доставка в клетки солидной опухоли проблематична.
Перспективным инструментом для анализа внутриклеточного рН в опухолях in vivo могут стать генетически кодируемые сенсоры на основе GFP-подобных белков [10, 11, 12].
Однако известные работы проводят только на клеточных культурах in vitro [13].
Наиболее близким к предлагаемому способу по совокупности существенных признаков и техническому результату, выбранному в качестве прототипа, является способ регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток, включающий использование сенсора на рН, регистрацию интенсивности флуоресценции при возбуждении на двух длинах волн в областях максимального поглощения и расчет рациометрического сигнала, отражающего значение внутриклеточного рН (см. Tseng J.C. In Vivo Fluorescent Labling of Tumor Cells with the HaloTag®Technology // Cur. Chem. Gen., 2012, Vol. 6, p. 48-54).
Известный способ заключается в том, что предварительно путем трансфекции клеточной линии рака кишечника человека НСТ116 получают клетки, стабильно экспрессирующие протеин HaloTag в цитозоле, НСТ116-НТ. Затем клетки подкожно прививают иммунодифицитным мышам для получения подкожной опухоли. После формирования опухоли мышам внутривенно вводят раствор SNARF-1-лиганд (1 мг, растворенный в 100 мкл 20% ДМСО и 80% PBS). На следующий день после инъекции с помощью программного обеспечения Living Image разделяли автофлуоресценцию и флуоресценцию SNARF.
Однако известный способ имеет ряд существенных недостатков:
- для накопления сенсора в опухолевых клетках требуется продолжительное время (~24 часа);
- накопление красителя SNARF не достаточно селективно, в день регистрации флуоресценции существенные помехи при регистрации сигнала возникают из-за неселективного накопления красителя в желудочно-кишечном тракте;
- спектр автофлуоресценции тканей и спектр флуоресценции SNARF перекрываются, что требует сложной математической обработки для их разделения;
- проводимые измерения не являются рациометрическими, проводят регистрацию интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении на одной длине волны, данный параметр зависит от концентрации флуорофора, которую невозможно контролировать известными способами;
- экзогенное введение красителя делает измерение однократным, т.е. не позволяет наблюдать одну и ту же опухоль в динамике в ходе естественного роста или какого-либо воздействия.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка рациометрического способа регистрации рН опухолевых клеток in vivo с использованием генетически-кодируемого сенсора с известной локализацией и с возможностью наблюдения клеток и тканей в динамике.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток, включающем использование сенсора на внутриклеточный рН, регистрацию интенсивности флуоресценции при возбуждении на двух длинах волн в областях максимального поглощения и расчет сигнала, отражающего значение внутриклеточного рН, в качестве сенсора на внутриклеточный рН используют генетически-кодируемый белок SypHer2, для чего обеспечивают его экспрессию в опухолевых клетках путем встраивания соответствующего гена в геном опухолевых клеток, результирующий сигнал является рациометрическим, регистрацию сигнала сенсора осуществляют в живой ткани in vivo с 4-го по 28-й день роста опухоли с интервалом в три дня, флуоресценцию регистрируют в видимом диапазоне при возбуждении светом с длиной волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала на длине волны 540 нм, время экспозиции 5 сек, причем регистрацию сигнала сенсора осуществляют на криосрезах ткани ex vivo. Локализация белка SypHer2 является цитоплазматической.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности измерений за счет отсутствия необходимости экзогенного введения рН-сенсора, избирательной локализации рН-сенсора в опухолевых клетках, отсутствия перераспределения рН-сенсора в опухоли, отсутствия зависимости измерений от концентрации сенсора и возможность наблюдения клеток и тканей в динамике.
Данный технический результат достигается тем, что рН-сенсором в опухолевых клетках является генетически-кодируемый белок SypHer2, для этого обеспечивают его экспрессию в опухоли путем встраивания соответствующего гена в опухолевые клетки, измерение проводят рациометрическим способом при возбуждении флуоресценции светом с длиной волны 430 нм и 500 нм.
Белок SypHer2 - это желтый флуоресцентный белок, мономер [15]. Мономер белковой молекулы состоит из двух доменов и имеет структуру, типичную для белков семейства YFP (yellow fluorescent protein). Белок имеет два пика возбуждения на длине волны 420 нм и 500 нм и пик эмиссии на длине волны 516 нм. Экспрессия белка SypHer2 в опухолевых клетках обеспечивается путем встраивания соответствующего гена в геном клетки. Белок SypHer2 может быть локализован в заданном клеточном компартменте в результате слияния его с другим белком-мишенью.
Динамический диапазон отношения интенсивности флуоресцении на длине волны 500 нм к интенсивности флуоресценции на длине волны 420 нм равен 6. Сенсор эффективно работает в физиологическом диапазоне рН, что показано авторами заявки.
Данный технический результат обусловлен тем, что генетически-кодируемый рН-сенсор представляет собой белок SypHer2, ген которого встроен в опухолевые клетки. Опухоль вырабатывает данный белок SypHer2 - рН-сенсор - путем экспрессии в цитоплазме опухолевых клетках.
Данный белок SypHer2 не оказывает влияния на метаболизм клеток. Наличие у данного белка двух пиков возбуждения флуоресценции позволяет регистрировать не просто интенсивность флуоресценции, а рассчитывать отношение интенсивностей флуоресценции, возбуждаемых на двух разных длинах волн, что делает измерение независимым от концентрации в клетке рН-сенсора. Заданная экспрессия рН-сенсора в цитоплазме опухолевых клеток позволяет избежать трудностей, связанных с неселективным накоплением красителя при экзогенном введении, а постоянная выработка сенсора самой опухолевой клеткой позволяет проводить динамическое наблюдение в течение естественного роста опухоли и при различных воздействиях. Это означает, что при регистрации флуоресценции при заданных условиях исследователь получает данные о водородном показателе именно внутри опухолевых клеток.
При этом опухолевые клетки стабильно экспрессируют рН-сенсор в заданной локализации в процессе роста новообразования, и локализация белка не изменяется со временем, поэтому нет необходимости постоянного введения сенсора и подтверждения его локализации для проведения наблюдений.
Предлагаемый способ поясняется графическим материалом
На фиг. 1 и фиг. 2 представлены флуоресцентные и результирующее изображение опухоли, фотография животного с опухолью к примерам 1 и 2 соответственно. На фиг. З представлены флуоресцентные изображения опухоли к примеру 3 (сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета), экспрессирующей белок SypHer2.
На фиг. 4 представлены флуоресцентные изображения криосрезов опухоли к примеру 4 (сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета), экспрессирующей белок SypHer2, и соответствующие гистологические изображения, окрашенные гематоксилином и эозином.
На фиг. 1 изображено:
1 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 430 нм,
2 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 500 нм,
3 - фотография опухоли, опухоли обведены пунктиром,
4 - сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета.
На фиг. 2 изображено:
5 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 430 нм,
6 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 500 нм,
7 - фотография опухоли, опухоли обведены пунктиром,
8 - сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета.
На фиг. 3 изображено:
9 - сигнал сенсора, день 7,
10 - сигнал сенсора, день 10,
11 - сигнал сенсора, день 14,
12 - сигнал сенсора, день 18,
13 - фотография опухоли, день 7,
14 - фотография опухоли, день 10,
15 - фотография опухоли, день 14,
16 - фотография опухоли, день 18.
На фиг. 4 изображено:
17 - сигнал сенсора на криосрезе толщиной 30 мкм, увеличение 200,
18 - криосрез толщиной 30 кмк, окрашенный гематоксилином и эозином,
19 - укрупненный участок зоны некроза (увеличение 400),
20 - укрупненный участок типичной опухолевой ткани (увеличение 400).
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом
Предварительно получают линию клеточной культуры Hela Kyoto, стабильно трансфецированную геном белка SypHer2 и экспрессирующую данный белок в цитоплазме.
Для регистрации внутриклеточного рН in vivo у животного с опухолью, привитой ему путем подкожной трансплантации суспензии опухолевых клеток, в которые предварительно встроен соответствующий ген белка SypHer2 и которые экспрессируют белок SypHer2 в цитоплазме, оценивают интенсивность флуоресценции белка-сенсора с 4-го по 28-й день роста опухоли с интервалом в три дня с помощью установки для поверхностного флуоресцентного имиджинга IVIS-Spectrum (Caliper, США). Возбуждение флуоресценции производится на длине волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала - на длине волны 540 нм, время экспозиции составляет 5 сек. Авторами апробированы два режима регистрации сигнала сенсора: через кожу и путем препарирования кожного лоскута над опухолью.
Предлагаемым способом осуществлено наблюдение сигнала сенсора in vivo и ex vivo у 8 животных с привитой опухолью (рак шейки матки человека), экспрессирующей белок SypHer2 в цитоплазме клеток, в процессе естественного роста.
Результатами наблюдений стали данные о неоднородности отношения I500/I430 сигнала сенсора SypHer2 в пределах одного опухолевого узла и, следовательно, значения внутриклеточного рН как в трехмерных моделях опухоли, так и у экспериментальных животных. Сопоставление данных о сигнале сенсора, зарегистрированном на гистологических срезах, с данными патоморфологического анализа позволили сделать выводы о том, что в зонах некроза опухоли отношение I500/I430 выше, следовательно, внутриклеточный рН опухолевых клеток, находящихся в зоне некроза, является более щелочным.
Примеры конкретного использования предлагаемого способа
Пример 1
Животное - иммунодефицитная мышь, самка, массой 20.5 г с привитой опухолью рак шейки матки человека, расположенной подкожно в области бедра. В опухолевые клетки предварительно был встроен ген белка SypHer2, генетически-кодируемый белок SypHer2 экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток. Регистрацию флуоресценции проводили через кожу на 16 день роста опухоли с помощью установки для поверхностного флуоресцентного имиджинга IVIS-Spectrum (Caliper, США). Возбуждение флуоресценции производится на длине волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала - на длине волны 540 нм, время экспозиции составляет 5 сек.
Полученные изображения обрабатывали в программе EMBL_ImageJ путем вычитания фона (сигнал в зоне свободной от клеток) на каждом изображении и деления изображения, полученного при возбуждении светом с длиной волны 500 нм (I500), на изображение, полученное при возбуждении светом с длиной волны 430 нм (I430). Получали результирующее изображение, на котором уровень сигнала в относительных единицах отражает уровень рН. На фиг. 1 представлены флуоресцентные и результирующее изображение опухоли, фотография животного с опухолью, где 1 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 430 нм, 2 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 500 нм, 3 - фотография опухоли, опухоли обведены пунктиром, 4 - сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета.
Пример 2
Животное - иммунодефицитная мышь, самка, массой 18,3 г с привитой опухолью рак шейки матки человека, расположенной подкожно в области бедра. В опухолевые клетки предварительно был встроен ген белка SypHer2, генетически-кодируемый белок SypHer2 экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток. На 18 день роста опухоли путем препарирования кожного лоскута непосредственно над опухолью опухоль открывали и регистрировали флуоресценцию с помощью установки для поверхностного флуоресцентного имиджинга IVIS-Spectrum (Caliper, США). Возбуждение флуоресценции производится на длине волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала - на длине волны 540 нм, время экспозиции составляет 5 сек.
Полученные изображения обрабатывали аналогично примеру 1. Получали результирующее изображение, на котором уровень сигнала в относительных единицах отражает уровень рН. На фиг. 2 представлены флуоресцентные и результирующее изображение опухоли, фотография животного с опухолью, где 5 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 430 нм, 6 - флуоресцентное изображение при возбуждении на 500 нм, 7 - фотография опухоли, опухоли обведены пунктиром, 8 - сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета.
Пример 3
Животное - иммунодефицитная мышь, самка, массой 20.0 г с привитой опухолью рак шейки матки человека, расположенной подкожно в области бедра. В опухолевые клетки предварительно был встроен ген белка SypHer2, генетически-кодируемый белок SypHer2 экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток. После формирования опухоли в период с 7 по 18 день естественного роста опухоли проводили наблюдение сигнала сенсора с поверхности открытой опухоли, как в примере 2. Обработку изображений проводили аналогично примеру 1. На фиг. 3 представлены флуоресцентные изображения опухоли (сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета), экспрессирующей белок SypHer2, и соответствующие фотографии, где 9 - сигнал сенсора, день 7, 10 - сигнал сенсора, день 10, 11 - сигнал сенсора, день 14, 12 - сигнал сенсора, день 18, 13 - фотография опухоли, день 7, 14 - фотография опухоли, день 10, 15 - фотография опухоли, день 14, 16 - фотография опухоли, день 18.
Пример 4
Животное - иммунодефицитная мышь, самка, массой 20.0 г с привитой опухолью рак шейки матки человека, расположенной подкожно в области бедра. В опухолевые клетки предварительно был встроен ген белка SypHer2, генетически-кодируемый белок SypHer2 экспрессировался в цитоплазме опухолевых клеток. После формирования опухоли на 18 день естественного роста опухоли мышь подвергали афтаназии, опухоль вырезали. Затем опухоль разрезали в поперечном направлении на две части и помещали в жидкий азот для сохранения флуоресценции сенсора. После замораживания с помощью криотома Leica LCS 900 (Leica, Германия) получали криосрезы толщиной 20-30 мкм. Интенсивность флуоресценции регистрировали с помощью флуоресцентного микроскопа DM IL LED (Leica, Германия). Обработку изображений проводили аналогично примеру 1. Затем образцы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Сопоставляли данные о гистологической структуре опухоли с данными о сигнале сенсора и выявляли взаимосвязь гистологического строения опухоли и уровня внутриклеточного рН.
На фиг. 4 представлено флуоресцентное изображение криосреза опухоли (сигнал сенсора в относительных единицах, окрашено в псевдоцвета), экспрессирующей белок SypHer2, и соответствующее гистологическое изображение, окрашенные гематоксилином и эозином, где 17 - сигнал сенсора на криосрезе толщиной 30 мкм, увеличение 200, 18 - криосрез толщиной 30 кмк, окрашенный гематоксилином и эозином.
Проводили сопоставление сигнала сенсора и гистологического строения опухоли. Установлено, что зоны с более высоким уровнем сигнала сенсора соответствуют зонам некроза, а зоны с более низким сигналам сенсора соответствуют зонам типичной опухолевой ткани. На рисунке 19 представлен укрупненный участок зоны некроза (увеличение 400), на рисунке 20 представлен укрупненный участок типичной опухолевой ткани (увеличение 400).
Источники информации
1. Webb В.A. Dysregulated рН: a perfect storm for cancer progression // NAT. REV., 2011, Vol. 11, p. 671-677.
2. Casey J.R., Grinstein S., Orlowski J.. Sensors and regulators of intracellular pH, Nanure reviews / Molecular cell Biology, 2010, Vol. 11, p. 50-61.
3. Song C.W., Griffin R., Park H.J.. Influence of Tumor pH on Therapeutic Response, Cancer Drug Discovery and Development, 2006.
4. Iessi E. et al. Tumor acidity and malignancy: novel aspects in the design of anti-tumor therapy // Cane. Ther, 2008, Vol. 6, p. 55-66.
5. C. Rauch et al. // Ch. 3 in: Multiple Drug Resistance
6. Calderon-Montano J.M., Burgos-Moron E., Perez-Guerrero C, Salvador J., Robles Α., Lopez-Lazaro M. Role of the Intracellular pH in the Metabolic Switch between Oxidative Phosphorylation and Aerobic Glycolysis - Relevance to Cancer, WebmedCentral, 2011.
7. Zhang X. et al. Tumor pH and its mesarument // J. Nucl. Med., 2010, Vol. 51, No. 8. p. 1167-1170.
8. Judenhofer M.S, Wehrl H.F., Newport D.F., Catana C., Siegel S.B, Becker M., Thielscher Α., Kneilling M., Lichy M.P., Eichner M., Klingel K., Reischl G., Widmaier S., Ro M., Nutt R.E., Machulla H., Uludag K., Cherry S.R., Claussen C.D., Pichler B.J. Simultaneous PET-MRI: a new approach for functional and morphological imaging, Nature Publishing Group, 2008.
9. Gallagher F.A., Kettunen M.I.,. Day S.E, Hu De-En, Ardenkjasr-Larsen J.H., Zandt R., Jensen P.R., Karlsson M., Golman K., Lerche M.H., Brindle K.M. Magnetic resonance imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled bicarbonate, Nature, June 2008, Vol 453.
10. Poburko D., Santo-Domingo J., Demaurex N. Dynamic Regulation of the Mitochondrial Proton Gradient during Cytosolic Calcium Elevations. // J. Biol. Chem. 2011. 286. 11672-11684.
11. Raimondo J.V., Irkle Α., Wefelmeyer W., Newey S.E., Akerman C.J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons, Front. Mol. Neurosci., May 2012.
12. Tantama M., Hung Y.P.,. Yellen G.. Imaging Intracellular pH in Live Cells with a Genetically Encoded Red Fluorescent Protein Sensor, J. Am. Chem, 2011, vol 133 (26), pp. 10034-10037.
13 Bizzarri R. et. al. Development of a Novel GFP-based Ratiometric Excitation and Emission pH Indicator for Intracellular Studies // Biophysical J., 2006, vol. 90, p. 3300-3314.
14. Tseng J.C. In Vivo Fluorescent Labling of Tumor Cells with the HaloTag®Technology // Cur. Chem. Gen., 2012, vol. 6, p. 48-54.
15. Markvicheva K.N., Bilan D.S., Mishina N.M., et. al. A genetically encoded sensor for H2O2 with expanded dynamic range. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2011. 19. 1079-1084.
Claims (2)
1. Способ регистрации внутриклеточного pH опухолевых клеток, включающий использование сенсора на внутриклеточный pH, регистрацию интенсивности флуоресценции при возбуждении на двух длинах волн в областях максимального поглощения и расчет сигнала, отражающего значение внутриклеточного pH, отличающийся тем, что в качестве сенсора на внутриклеточный pH используют генетически-кодируемый белок SypHer2, для чего обеспечивают его экспрессию в опухолевых клетках путем встраивания соответствующего гена в геном опухолевых клеток, результирующий сигнал является рациометрическим, регистрацию сигнала сенсора на внутриклеточный pH осуществляют в живой ткани in vivo с 4-го по 28-й день роста опухоли с интервалом в три дня, флуоресценцию регистрируют в видимом диапазоне при возбуждении светом с длиной волны 430 нм и 500 нм, прием сигнала на длине волны 540 нм, время экспозиции 5 сек.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что регистрацию сигнала сенсора осуществляют на криосрезах ткани exvivo.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014142436/14A RU2565377C1 (ru) | 2014-10-21 | 2014-10-21 | СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО pH ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014142436/14A RU2565377C1 (ru) | 2014-10-21 | 2014-10-21 | СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО pH ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2565377C1 true RU2565377C1 (ru) | 2015-10-20 |
Family
ID=54327179
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014142436/14A RU2565377C1 (ru) | 2014-10-21 | 2014-10-21 | СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО pH ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2565377C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112858418A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-05-28 | 北京大学 | 一种用于肿瘤细胞检测的传感器的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2455643C1 (ru) * | 2011-06-16 | 2012-07-10 | ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ГОУ ВПО "НижГМА" МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ) | Способ дифференциальной диагностики морфологических форм рака предстательной железы |
| WO2012143379A1 (en) * | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Roche Glycart Ag | Method and constructs for the ph dependent passage of the blood-brain-barrier |
| CN103099604A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-05-15 | 东南大学 | 一种基于锌离子信号增强效应的肿瘤靶向成像方法 |
-
2014
- 2014-10-21 RU RU2014142436/14A patent/RU2565377C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012143379A1 (en) * | 2011-04-20 | 2012-10-26 | Roche Glycart Ag | Method and constructs for the ph dependent passage of the blood-brain-barrier |
| RU2455643C1 (ru) * | 2011-06-16 | 2012-07-10 | ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ "НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (ГОУ ВПО "НижГМА" МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ) | Способ дифференциальной диагностики морфологических форм рака предстательной железы |
| CN103099604A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-05-15 | 东南大学 | 一种基于锌离子信号增强效应的肿瘤靶向成像方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| TSENG J.C. et al. In Vivo Fluorescent Labling of Tumor Cells with the HaloTag Technology // Cur. Chem. Gen., 2012, Vol. 6, p. 48-54. * |
| ОСИНСКИЙ С.П. и др. Некоторые параметры кислотно-основного и водно-электролитного статуса животных с экспериментальными опухолями. // Вопросы онкологии, 1977, N 1, с. 58-62. VAUPEL P.W. et al. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. // Cancer Res., 1981, 41, N 5, pp. 2008-2013. HAN L et al. Tumor cell membrane-targeting pH-dependent electron donor-acceptor fluorescence systems with low background signals. Biomaterials. 2014 Mar;35(9):2952-60. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112858418A (zh) * | 2021-02-24 | 2021-05-28 | 北京大学 | 一种用于肿瘤细胞检测的传感器的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism | |
| Zhou et al. | An FRET-based ratiometric chemosensor for in vitro cellular fluorescence analyses of pH | |
| Giorgi et al. | Intravital imaging reveals p53-dependent cancer cell death induced by phototherapy via calcium signaling | |
| Song et al. | Polyamine-targeting gefitinib prodrug and its near-infrared fluorescent theranostic derivative for monitoring drug delivery and lung cancer therapy | |
| Zakharian et al. | Inorganic polyphosphate modulates TRPM8 channels | |
| Bartelle et al. | Divalent metal transporter, DMT1: a novel MRI reporter protein | |
| Wang et al. | Evaluating tumor metastatic potential by imaging intratumoral acidosis via p H‐activatable near‐infrared fluorescent probe | |
| Siano et al. | Identification of an ERK inhibitor as a therapeutic drug against tau aggregation in a new cell-based assay | |
| US8197795B2 (en) | Method for monitoring early treatment response | |
| Mignolet et al. | Intracellular investigation on the differential effects of 4 polyphenols on MCF-7 breast cancer cells by Raman imaging | |
| Zhou et al. | A Phosphinate‐Containing Fluorophore Capable of Selectively Inducing Apoptosis in Cancer Cells | |
| RU2565377C1 (ru) | СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО pH ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК | |
| Cappellozza et al. | A spectrofluorometric analysis to evaluate transcutaneous biodistribution of fluorescent nanoparticulate gel formulations | |
| Hao et al. | Ultrasound molecular imaging of p32 protein translocation for evaluation of tumor metastasis | |
| An et al. | Visualizing mitochondria and mouse intestine with a fluorescent complex of a naphthalene-based dipolar dye and serum albumin | |
| Huang et al. | Discovery of non-substrate, environmentally sensitive turn-on fluorescent probes for imaging HDAC8 in tumor cells and tissue slices | |
| Wang et al. | Design, synthesis and application of near-infrared fluorescence probe IR-780-Crizotinib in detection of ALK positive tumors | |
| Chen et al. | Novel mitochondria-targeted and fluorescent DNA alkylation agents with highly selective activity against cancer cells | |
| Hislop et al. | Label-free cytometric evaluation of mitosis via stimulated Raman scattering microscopy and spectral phasor analysis | |
| Hillier et al. | Functional human tissue assays | |
| Yuan et al. | Rational design of mitochondria-targeted fluorescent biosensors for in vivo elucidation of the interaction between breast cancer metastasis and mitochondrial autophagy | |
| Canaple et al. | Fast screening of paramagnetic molecules in zebrafish embryos by MRI | |
| US10583209B2 (en) | Hyperpolarized 1-13C-1,1-bis(acetoxy(methyl))-2,2′-cyclopropane as metabolic marker for MR | |
| CN110272434B (zh) | 高灵敏酸碱探针、其制备及生物检测应用 | |
| Meshram | An investigation into the role of transglutaminase 2 in the uptake of cisplatin in parental and chemoresistant cancer cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171022 |