RU2564578C2

RU2564578C2 - E.coli PENICILLIN ACYLASE MUTANT WITH IMPROVED PROPERTIES

Info

Publication number: RU2564578C2
Application number: RU2012116431/10A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Андреевич Суплатов; Павел Александрович Кудрявцев; Николай Владимирович Панин; Татьяна Анатольевна Щербакова; Витаутас-Юозапас Каятоно Швядас
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2015-10-10
Also published as: RU2012116431A

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. The invention represents a mutant of penicillin acylase (Penicillin G acylase) from E.coli, containing a substitution of a residue of asparaginic acid of a beta-chain enzyme in position 484 (numeration starts with the first amino acid residue of the beta-chain, containing 557 amino acid residues) with an asparagine residue.

EFFECT: invention makes it possible to obtain penicillin acylase with improved catalytic properties.

2 tbl, 2 ex

Description

Пенициллинацилаза из разных источников используется в фармацевтической промышленности при получении полусинтетических β-лактамных антибиотиков [1]. Широкая субстратная специфичность и стереоселективность могут дать возможность применения пенициллинацилазы в тонком органическом синтезе для получения энантиомеров α-, β-, γ-аминокислот и их элементоорганических аналогов [2] для высокоэффективного стереоселективного ацилирования аминосоединений в водной среде и получения энантиомерно чистых соединений [WO 02/20820, WO 02/20821, 3]. Высокий биокаталитический потенциал пенициллинацилазы делает ее перспективным объектом биоинженерии для создания биокатализаторов с улучшенными свойствами. Одним из основных путей улучшения свойств пенициллинацилазы является получение ее мутантных форм путем замены одной или нескольких аминокислотных остатков в структуре фермента данного типа, приводящей к улучшению каталитических свойств фермента.Penicillin acylase from various sources is used in the pharmaceutical industry for the production of semi-synthetic β-lactam antibiotics [1]. Wide substrate specificity and stereoselectivity can make it possible to use penicillin acylase in fine organic synthesis to obtain enantiomers of α-, β-, γ-amino acids and their organoelement analogs [2] for highly effective stereoselective acylation of amino compounds in an aqueous medium and to obtain enantiomerically pure compounds [WO 02 / 20820, WO 02/20821, 3]. The high biocatalytic potential of penicillin acylase makes it a promising bioengineering facility for the creation of biocatalysts with improved properties. One of the main ways to improve the properties of penicillin acylase is to obtain its mutant forms by replacing one or more amino acid residues in the structure of an enzyme of this type, leading to an improvement in the catalytic properties of the enzyme.

В научных публикациях описаны мутации по целому ряду аминокислотных остатков прокариотических пенициллинацилаз. Основные данные изложены в обзоре [4], а также в более поздних и не вошедших в данный обзор работах [5-18]. Задачи, которые пытаются решить исследователи, вводя мутации в структуру пенициллинацилазы, - это увеличение эффективности ферментативного синтеза β-лактамных антибиотиков [9, 12, 13], улучшение специфичности и стереоспецифичности пенициллинацилазы [12, 13], увеличение стабильности пенициллинацилазы [8, 14, 16], изучение механизма процессинга пенициллинацилазы [17, 18].Mutual amino acid residues of prokaryotic penicillin acylases are described in scientific publications. The main data are presented in the review [4], as well as in later works [5–18], which were not included in this review. The tasks researchers are trying to solve by introducing mutations into the structure of penicillin acylase are an increase in the efficiency of enzymatic synthesis of β-lactam antibiotics [9, 12, 13], an improvement in the specificity and stereospecificity of penicillin acylase [12, 13], and an increase in the stability of penicillin acylase [8, 14, 16], a study of the mechanism of penicillin acylase processing [17, 18].

Несмотря на то, что в литературе описано довольно много различных вариантов мутаций пенициллинацилазы, лишь немногие из них позволили улучшить субстратную специфичность и каталитические свойства фермента.Despite the fact that quite a lot of different variants of penicillin acylase mutations are described in the literature, only a few of them have improved the substrate specificity and catalytic properties of the enzyme.

Показательными являются мутантные варианты пенициллинацилазы из E.coli и K.citrophila по положению βF71, с измененной специфичностью по отношению к ацильной части субстратов, впервые способные катализировать гидролиз адипил- и глутарил-L-лейцина [19, 20]. Однако «оборотной стороной» такой мутации в пенициллинацилазе является драматическое снижение активности по отношению к природным субстратам пенициллину G и V по сравнению с ферментом дикого типа.Mutant variants of penicillin acylase from E. coli and K. citrophila at βF71 position, with a specificity change with respect to the acyl part of substrates, capable of catalyzing the hydrolysis of adipyl- and glutaryl-L-leucine for the first time [19, 20] are indicative. However, the “flip side” of such a mutation in penicillin acylase is a dramatic decrease in activity with respect to the natural substrates of penicillin G and V compared to the wild-type enzyme.

Варианты пенициллинацилазы из E.coli по положениям αR145 и αF146 в 2-4 раза эффективнее катализируют синтез пенициллина и ампициллина методом ацильного переноса по сравнению с диким типом [6, 21, 22]. Наибольший эффект характерен для мутантов aR145G/S/L.The E. coli penicillin acylase variants at positions αR145 and αF146 are 2–4 times more effective than catalyzing the synthesis of penicillin and ampicillin by the acyl transfer method compared to the wild type [6, 21, 22]. The greatest effect is characteristic of mutants aR145G / S / L.

Представляет интерес мутация bF24A, посредством которой можно добиться увеличения выхода в реакциях синтеза ампициллина, амоксициллина, цефалексина и цефадроксила за счет увеличения соотношения скоростей синтеза и гидролиза [22]. Однако этот эффект достигается на фоне существенного снижения каталитической активности фермента (не более 1,6% каталитической активности пенициллинацилазы из E.coli дикого типа).Of interest is the bF24A mutation, through which it is possible to increase the yield in the synthesis reactions of ampicillin, amoxicillin, cephalexin and cefadroxil by increasing the ratio of synthesis and hydrolysis rates [22]. However, this effect is achieved against the background of a significant decrease in the catalytic activity of the enzyme (not more than 1.6% of the catalytic activity of penicillin acylase from wild-type E. coli).

Патентная литература по получению мутантов пенициллинацилазы из прокариот с целью улучшения ее каталитических свойств также охватывает широкий круг мутаций. В основном, улучшение свойств направлено на увеличение эффективности синтеза β-лактамных антибиотиков.Patent literature on the production of penicillin acylase mutants from prokaryotes in order to improve its catalytic properties also covers a wide range of mutations. In general, the improvement of properties is aimed at increasing the efficiency of the synthesis of β-lactam antibiotics.

В патентах [WO 9605318 и US 6033823], принадлежащих одной группе авторов, заявлено изменение субстратной специфичности и активности пенициллинацилазы из прокариот мутацией аминокислотных остатков по значительному числу сайтов альфа-цепи (α139-152) и бета- цепи (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), хотя патенты основаны лишь на нескольких примерах влияния мутаций по отдельным положениям αM143, αF147, βL56, βA67, βl177 в пенициллинацилазе из Alcaligenes faecalis на способность фермента катализировать гидролиз природных пенициллинов G и V, а также синтез ампициллина.In the patents [WO 9605318 and US 6033823], belonging to one group of authors, a change in the substrate specificity and activity of penicillin acylase from prokaryotes by mutation of amino acid residues by a significant number of alpha chain sites (α139-152) and beta chain (β20-27, β31, β32, β49-52, β56, β57, β65-72, β154-157, β173-179, β239-241, β250-263, β379-387, β390, β455, β474-480), although the patents are based on only a few examples the influence of mutations at certain positions αM143, αF147, βL56, βA67, βl177 in penicillin acylase from Alcaligenes faecalis on the enzyme's ability to catalyze the hydrolysis of natural penicillins G and V as well as the synthesis of ampicillin.

В патентах [WО 9820120, US 6403356] круг вариантов пенициллинацилазы из Е. coli существенно сужен и ограничен мутациями по сайтам αM142, αF146, βF24, βV56, βl177.In the patents [WO 9820120, US 6403356], the range of E. coli penicillin acylase variants is substantially narrowed and limited by mutations at the αM142, αF146, βF24, βV56, βl177 sites.

Приоритетные права данных патентов ограничиваются способом получения 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот ферментативным гидролизом их ацилированных форм, а также способом получения β-лактамных антибиотиков ферментативным ацилированием 6-аминопенициллиновой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот. Наиболее значительный эффект дала мутация по сайту β24 при замене L-фенилаланина на L-аланин, позволившая увеличить выход в синтезе пенициллинов и цефалоспоринов при использовании сложных эфиров в качестве ацильного донора. Существенно, что данная улучшенная мутантная форма фермента позволяет использовать амиды в качестве ацильных доноров.The priority rights of these patents are limited by the method of producing 6-aminopenicillanic and 7-aminodetacetoxycephalosporanic acids by enzymatic hydrolysis of their acylated forms, as well as by the method of producing β-lactam antibiotics by enzymatic acylation of 6-aminopenicillinic and 7-aminodetacetoxycephalosporanic acids. The most significant effect was produced by the β24 site mutation when L-phenylalanine was replaced by L-alanine, which allowed increasing the yield in the synthesis of penicillins and cephalosporins when using esters as an acyl donor. It is significant that this improved mutant form of the enzyme allows the use of amides as acyl donors.

В патенте [US 2005124029] авторы заменяли в пенициллинацилазе из E.coli аминокислотный остаток αR145 на L, K, или C. Для мутанта αR145L выход антибиотика в синтезе цефалексина увеличился с 70 до 81% в слабощелочных условиях, однако при этом наблюдалась существенная (более 10 раз) потеря каталитической активности.In the patent [US 2005124029], the authors replaced the amino acid residue αR145 in L, K, or C in penicillin acylase from E. coli. For the αR145L mutant, the antibiotic yield in the cefalexin synthesis increased from 70 to 81% under slightly alkaline conditions, but significant (more 10 times) loss of catalytic activity.

В патенте [WO 2010072765] заявлены мутации в положениях α3, α77, α90, α144, α192, β24, β109, β148, β313, β460, β488 пенициллинацилазы из E.coli, предпочтительно мутации αM90K, αN144S, αV192E, βF24L, βK109R, βV148L, βS313N, βF460L, βF488L, а также находящие соответствие в прокариотических ПА. Авторы патента делают акцент на многоточечных заменах, содержащих мутацию βF24L либо βF460L в сочетании с любыми из вышеперечисленных мутаций. Заявленные авторами варианты пенициллинацилазы обладают улучшенными свойствами в синтезе полусинтетических β-лактамных антибиотиков, в частности амоксициллина, ампициллина, цефалексина, цефадроксила и цефрадина, и позволяют повысить выход в синтезе амоксициллина до 90-95% относительно 6-аминопенициллановой кислоты.[WO 2010072765] claims mutations at the positions α3, α77, α90, α144, α192, β24, β109, β148, β313, β460, β488 penicillin acylases from E. coli, preferably mutations αM90K, αN144S, αV192E, βF24L, βV14B, β14L, β , βS313N, βF460L, βF488L, as well as those found in prokaryotic PA. The authors of the patent emphasize multipoint substitutions containing a βF24L or βF460L mutation in combination with any of the above mutations. The penicillin acylase variants claimed by the authors have improved properties in the synthesis of semi-synthetic β-lactam antibiotics, in particular, amoxicillin, ampicillin, cephalexin, cefadroxil and cefradine, and can increase the yield in the synthesis of amoxicillin to 90-95% relative to 6-aminopenicillanic acid.

В патенте [WO 2010054319] заявлены варианты пенициллинацилаз, содержащие изменения в аминокислотной последовательности в позициях 24, 28, 31, 56, 71, 74, 547, 697, 701. Полученные мутанты обладают повышенной стереоселективностью по отношению к α-положению ацильной группы метилового эфира α-гидрокси-фенилуксусной кислоты, улучшенным соотношением синтез/гидролиз в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина из сложных эфиров, а также повышенной термостабильностью и стабильностью в водно-органических средах по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа из K.Citrophila.Patent [WO 2010054319] claims penicillin acylase variants containing changes in the amino acid sequence at positions 24, 28, 31, 56, 71, 74, 547, 697, 701. The obtained mutants have increased stereoselectivity with respect to the α position of the acyl group of methyl ester α-hydroxy-phenylacetic acid, an improved synthesis / hydrolysis ratio in the synthesis of ampicillin and amoxicillin from esters, as well as increased thermal stability and stability in aqueous-organic media compared to wild-type penicillin acylase and K.Citrophila.

Технической задачей настоящего изобретения является создание пенициллинацилазы с улучшенными каталитическими свойствами, в частности с повышенной каталитической активностью, стереоселективностью, операционной стабильностью в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и эфиров, а также их применение для проведения биокаталитических превращений.An object of the present invention is to provide penicillin acylase with improved catalytic properties, in particular with increased catalytic activity, stereoselectivity, operational stability in the acylation of amino compounds and the hydrolysis of amides and esters, as well as their use for biocatalytic conversions.

Техническим результатом изобретения является создание пенициллинацилазы с увеличенной каталитической эффективностью, стереоизбирательностью и операционной стабильностью в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и эфиров, а также их применение для проведения биокаталитических превращений, в том числе для получения функционализированных и энантиомерно чистых соединений, в частности с целью получения так называемых ядер бета-лактамных антибиотиков 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот, β-лактамных антибиотиков.The technical result of the invention is the creation of penicillin acylase with increased catalytic efficiency, stereo selectivity and operational stability in the reactions of acylation of amino compounds and the hydrolysis of amides and esters, as well as their use for biocatalytic conversions, including for obtaining functionalized and enantiomerically pure compounds, in particular with the aim of obtaining the so-called beta-lactam antibiotic nuclei of 6-aminopenicillanic and 7-aminodetacetoxycephalosporanic acids, β-lactam antibiotics.

Указанный технический результат достигается путем внесения изменений в структуру пенициллинацилазы, а именно путем замены аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента, соответствующего позиции β484 пенициллинацилазы из E.coli.The specified technical result is achieved by making changes in the structure of penicillin acylase, namely by replacing the amino acid residue of aspartic acid of the beta chain of the enzyme corresponding to the β484 position of penicillin acylase from E. coli.

Наиболее близкими аналогами настоящего изобретения являются патенты [WO 9820120, US 6403356, US 2005124029], описанными выше.The closest analogues of the present invention are the patents [WO 9820120, US 6403356, US 2005124029] described above.

В научной и патентной литературе нет данных о получении пенициллинацилазы с улучшенными каталитическими свойствами путем замены аминокислотного остатка 484. Полученное улучшение каталитических свойств, заявленное в настоящем патенте, не вытекает с очевидностью из известной структуры пенициллинацилазы и ее функций.There is no data in the scientific and patent literature on the production of penicillin acylases with improved catalytic properties by replacing amino acid residue 484. The obtained improvement in catalytic properties claimed in this patent does not follow clearly from the known structure of penicillin acylase and its functions.

Настоящее изобретение относится к области инженерной энзимологии и биотехнологии, а именно к получению и применению пенициллинацилазы из E.coli, полученной из предшественника фермента посредством замены аминокислотного остатка аспарагиновой кислоты бета-цепи фермента, соответствующего позиции 484, на другой аминокислотный остаток, в частности на аспарагин, любыми доступными методами генной инженерии, направленной эволюции или селекции.The present invention relates to the field of engineering enzymology and biotechnology, and in particular to the preparation and use of penicillin acylase from E. coli obtained from the enzyme precursor by replacing the amino acid residue of the beta chain of the enzyme at position 484 with another amino acid residue, in particular asparagine , by any available methods of genetic engineering, directed evolution or selection.

Пенициллинацилаза по настоящему изобретению может применяться в качестве катализатора реакции конденсации ацильного донора и нуклеофила при получении амидов, пептидов, в частности бета-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи, или при получении энантиомерно чистых соединений.The penicillin acylase of the present invention can be used as a catalyst for the condensation reaction of an acyl donor and a nucleophile in the preparation of amides, peptides, in particular beta-lactam antibiotics with a peptide bond in the side chain, or in the preparation of enantiomerically pure compounds.

Пенициллинацилаза по настоящему изобретению может применяться в качестве катализатора реакции гидролиза эфиров, амидов или пептидов, в частности бета-лактамных антибиотиков с пептидной связью в боковой цепи, при получении ценных продуктов, в частности энантиомерно чистых соединений, 6-аминопенициллановой и 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислот.The penicillin acylase of the present invention can be used as a catalyst for the hydrolysis of esters, amides or peptides, in particular beta-lactam antibiotics with a peptide bond in the side chain, to produce valuable products, in particular enantiomerically pure compounds, 6-aminopenicillanic and 7-aminodetacetoxycephalosporanoic acids.

В качестве ацильных доноров в ферментативных реакциях конденсации, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы карбоновые кислоты, их сложные эфиры и амиды, в частности амиды и эфиры аминокислот и их замещенных производных в α-положении и в ароматическом кольце предпочтительно амиды и эфиры R, S-фенилглицина.Carboxylic acids, their esters and amides, in particular amides and esters of amino acids and their substituted derivatives in the α-position and in the aromatic ring, preferably amides and esters of R, can be used as acyl donors in enzymatic condensation reactions catalyzed by the proposed penicillin acylase variant. S-phenylglycine.

В качестве нуклеофилов в ферментативных реакциях конденсации, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы амины, аминоспирты, аминокислоты, их эфиры, амиды и соответствующие элементоорганические аналоги, в частности 6-аминопенициллановая и 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислоты.As nucleophiles in the enzymatic condensation reactions catalyzed by the proposed penicillin acylase variant, amines, amino alcohols, amino acids, their esters, amides and corresponding organoelemental analogs, in particular 6-aminopenicillanic and 7-aminodetacetoxycephalosporanic acid, can be used.

В качестве субстратов в ферментативных реакциях гидролиза, катализируемых предложенным вариантом пенициллинацилазы, могут быть использованы ацильные производные аминов, аминоспиртов, аминокислот, их эфиров и амидов, в частности природные антибиотики.Acyl derivatives of amines, amino alcohols, amino acids, their esters and amides, in particular natural antibiotics, can be used as substrates in enzymatic hydrolysis reactions catalyzed by the proposed penicillin acylase variant.

Пенициллинацилаза по изобретению может быть получена и использована в виде гомогенного препарата, раствора с содержанием других химических соединений или белков, мицелл, агрегатов, или в твердом состоянии в виде кристаллов, агрегатов или иммобилизированных в геле, на различных подложках и носителях препаратах, или применяется в виде культуры клеток.The penicillin acylase according to the invention can be obtained and used in the form of a homogeneous preparation, a solution containing other chemical compounds or proteins, micelles, aggregates, or in the solid state in the form of crystals, aggregates or immobilized in a gel, on various substrates and carriers of preparations, or used in form of cell culture.

Примеры улучшения каталитических свойств пенициллинацилазы приведены ниже. Изменения в аминокислотную последовательность пенициллинацилазы из E.coli вводили путем конструирования мутантного гена методом сайт-специфического мутагенеза по методикам, описанным в литературе [6]. После процедур клонирования, культивирования, выделения и очистки были получены гомогенные препараты мутантов пенициллинацилазы.Examples of improving the catalytic properties of penicillin acylase are given below. Changes in the amino acid sequence of E. coli penicillin acylase were introduced by constructing the mutant gene by site-specific mutagenesis according to the methods described in the literature [6]. After cloning, culturing, isolation and purification procedures, homogeneous preparations of penicillin acylase mutants were obtained.

Пример 1. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза цефалексинаExample 1. The increase in yield in the enzymatic synthesis of cephalexin

Реакцию ферментативного синтеза цефалексина переносом ацильной группы на ядро антибиотика 7-аминодезацетоксицефалоспорановую кислоту проводили, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. При использовании варианта пенициллинацилазы βD484N наблюдается увеличение выхода продукта реакции от 1,5 до 1,9 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (см. табл. 1).The enzymatic synthesis of cephalexin by transferring the acyl group to the core of the antibiotic 7-aminodecetoxycephalosporanic acid was carried out as described in the experimental part. As the acyl donor, D-phenylglycine amide was used. When using the βD484N variant of penicillin acylase, an increase in the yield of the reaction product is observed from 1.5 to 1.9 times compared with wild-type penicillin acylase (see Table 1).

Таблица 1Table 1 Выход продукта реакции ферментативного синтеза цефалексинаThe yield of the reaction product of the enzymatic synthesis of cephalexin [7-ADCA]/[D-PGA], mM[7-ADCA] / [D-PGA], mM Выход цефалексина, %The yield of cephalexin,% Дикий типWild type βD484NβD484N 200/200200/200 4040 6060 200/400200/400 3939 7373

Пример 2. Увеличение выхода в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицинаExample 2. The increase in yield in the reaction of enzymatic synthesis of D-phenylglycyl-glycine

Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина переносом ацильной группы на глицин проводили в водной среде, как описано в экспериментальной части. В качестве ацильного донора использовали амид D-фенилглицина. Оказалось, что в случае варианта пенициллинацилазы βD484N выход продукта реакции увеличивается приблизительно в 4,7 раза по сравнению с пенициллинацилазой дикого типа (табл. 2).The enzymatic synthesis of D-phenylglycyl-glycine by transferring the acyl group to glycine was carried out in an aqueous medium, as described in the experimental part. As the acyl donor, D-phenylglycine amide was used. It turned out that in the case of the βD484N variant of penicillin acylase, the yield of the reaction product increased by approximately 4.7 times in comparison with wild-type penicillin acylase (Table 2).

Таблица 2table 2 Выход продукта в реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицинаThe product yield in the enzymatic synthesis of D-phenylglycyl-glycine Вариант пенициллинацилазыPenicillin Acylase Option Выход D-фенилглицил-глицина, %The yield of D-phenylglycyl-glycine,% Дикий типWild type 1717 βD484NβD484N 8080

Описание экспериментальной частиDescription of the experimental part

Определение ферментативной активности Determination of enzymatic activity

Активность вариантов пенициллинацилазы определяли спектрофотометрически по накоплению хромофора в процессе гидролиза 1 мМ раствора цветного субстрата 6-нитро-3-(фенилацетамидо)бензойной кислоты при 400 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 (Япония). Реакцию проводили при 25°C в 0,01 М фосфатном буфере, pH 7,5, 0,1 М KCl.The activity of penicillin acylase variants was determined spectrophotometrically from the accumulation of the chromophore during the hydrolysis of a 1 mM solution of a colored substrate of 6-nitro-3- (phenylacetamido) benzoic acid at 400 nm on a Shimadzu UV-1601 spectrophotometer (Japan). The reaction was carried out at 25 ° C in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.5, 0.1 M KCl.

Определение концентрации активных центров. Абсолютную концентрацию активных центров каждой из мутантных форм пенициллинацилазы определяли титрованием активных цетров фермента необратимым ингибитором фенилметилсульфонилфторидом по методике [23]. Остаточную ферментативную активность определяли спектрофотометрически по гидролизу цветного субстрата, как описано выше.Determination of the concentration of active centers. The absolute concentration of active centers of each of the mutant forms of penicillin acylase was determined by titration of the active enzyme centers with an irreversible phenylmethyl sulfonyl fluoride inhibitor according to the procedure [23]. Residual enzymatic activity was determined spectrophotometrically by hydrolysis of a colored substrate, as described above.

ВЭЖХ анализ HPLC analysis

Количественное определение компонентов реакционной смеси проводили методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series (США); колонка Kromasil Eternity C18 (AkzoNobel, США), 250 x 4.6 мм, размер частиц 5 µм; подвижная фаза CH₃CN/вода 30:70, 0,68 г/л KH₂PO₄, 0,1 г/л додецилсульфата натрия, pH 3,0; скорость потока 0,7 мл/мин; объем вкола 10 мкл; УФ детектирование при 210 нм.The quantitative determination of the components of the reaction mixture was performed by reverse phase high performance liquid chromatography on a chromatographic system Perkin Elmer 200 Series (USA); Kromasil Eternity C18 column (AkzoNobel, USA), 250 x 4.6 mm, particle size 5 μm; mobile phase CH ₃ CN / water 30:70, 0.68 g / l KH ₂ PO ₄ , 0.1 g / l sodium dodecyl sulfate, pH 3.0; flow rate 0.7 ml / min; injection volume 10 μl; UV detection at 210 nm.

Проведение реакции ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина The enzymatic synthesis of D-phenylglycyl-glycine

Реакцию ферментативного синтеза D-фенилглицил-глицина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 9,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200 мМ D-фенилглицина, 200 мМ глицина, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.The enzymatic synthesis of D-phenylglycyl-glycine was carried out in an aqueous medium in a temperature-controlled cell of a Titrino 719 pH stat (Metrohm, Switzerland) at 25 ° C, pH 9.5 with constant stirring. Initial reagent concentrations: 200 mM D-phenylglycine, 200 mM glycine, 1 μM active centers of penicillin acylase, reaction volume 3 ml. The time of the experiment did not exceed 5 hours. Along the course of the reaction, aliquots were taken from the reaction mixture, diluted with their mobile phase and analyzed by HPLC as described above.

Проведение реакции ферментативного синтеза цефалексина The enzymatic synthesis of cephalexin

Реакцию ферментативного синтеза цефалексина проводили в водной среде в термостатируемой ячейке pH-стата Titrino 719 (Metrohm, Швейцария) при 25°C, pH 8,5 при постоянном перемешивании. Начальные концентрации реагентов: 200-400 мМ D-фенилглицина и 200 мМ 7-дезацетокси-цефалоспорановой кислоты, 1 мкМ активных центров пенициллинацилазы, объем реакционной смеси 3 мл. Время проведения эксперимента не превышало 5 часов. По ходу протекания реакции из реакционной смеси отбирали аликвоты, разбавляли их подвижной фазой и анализировали методом ВЭЖХ, как описано выше.The enzymatic synthesis of cephalexin was carried out in an aqueous medium in a thermostatic cell of a pH stat Titrino 719 (Metrohm, Switzerland) at 25 ° C, pH 8.5 with constant stirring. Initial reagent concentrations: 200-400 mM D-phenylglycine and 200 mM 7-deacetoxy-cephalosporanic acid, 1 μM active centers of penicillin acylase, reaction volume 3 ml. The time of the experiment did not exceed 5 hours. Along the course of the reaction, aliquots were taken from the reaction mixture, diluted with their mobile phase and analyzed by HPLC as described above.

ЛитератураLiterature

1. Bruggink, A., Roos, E.G., De Vroom, E. Penicillin acylase in the industrial production of (3-lactam antibiotics. Org. Process. Res. Dev. (1998) 2, 128-133.1. Bruggink, A., Roos, E.G., De Vroom, E. Penicillin acylase in the industrial production of (3-lactam antibiotics. Org. Process. Res. Dev. (1998) 2, 128-133.

2. Svedas, V.K., Savchenko, M.V., Beltser, A.I., Guranda, D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N.-Y. Acad. Sci. (1996) 799, 659-669.2. Svedas, V.K., Savchenko, M.V., Beltser, A.I., Guranda, D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N.-Y. Acad. Sci. (1996) 799, 659-669.

3. Guranda, D.T., Khimiuk, A.I., van Langen, L.M., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A., Svedas, V.K. An "easy-on, easy-off" protecting group for the enzymatic resolution of (±)-1-phenylethylamine in an aqueous medium. Tetrahedron: Asymm. (2004) 15(18), 2901-2906.3. Guranda, D.T., Khimiuk, A.I., van Langen, L.M., van Rantwijk, F., Sheldon, R.A., Svedas, V.K. An "easy-on, easy-off" protecting group for the enzymatic resolution of (±) -1-phenylethylamine in an aqueous medium. Tetrahedron: Asymm. (2004) 15 (18), 2901-2906.

4. Rajendhran, J., Gunasekaran, P. Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases. J. Biosci. Bioeng. (2004) 97, 1-13.4. Rajendhran, J., Gunasekaran, P. Recent biotechnological interventions for developing improved penicillin G acylases. J. Biosci. Bioeng. (2004) 97, 1-13.

5.Gabor, E.M. and Janssen, D.B. in Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17,571-579.5.Gabor, E.M. and Janssen, D.B. in Protein Engineering, Design and Selection (2004) 17,571-579.

6. Jager, SAW., Shapovalova, I.V., Jekel, PA, Alkema, W.B.L, Svedas, V.K., Janssen, D.B. Saturation mutagenesis reveals the importance of residues a!phaR145 and alphaF146 of penicillin acylase in the synthesis of beta-lactam antibiotics. J. Biotechnol. (2008) 133, 18-26.6. Jager, SAW., Shapovalova, I.V., Jekel, PA, Alkema, W.B.L, Svedas, V.K., Janssen, D.B. Saturation mutagenesis reveals the importance of residues a! PhaR145 and alphaF146 of penicillin acylase in the synthesis of beta-lactam antibiotics. J. Biotechnol. (2008) 133, 18-26.

7. Wang, J., Zhang, Q., Huang, H., Yuan, Z., Ding, D., Yang, S., Jiang, W. Increasing synthetic performance of penicillin G acylase from Bacillus megaterium by site-directed mutagenesis. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74, 1023-1030.7. Wang, J., Zhang, Q., Huang, H., Yuan, Z., Ding, D., Yang, S., Jiang, W. Increasing synthetic performance of penicillin G acylase from Bacillus megaterium by site-directed mutagenesis. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 74, 1023-1030.

8. Polizzi, K.M., phaparro-Riggers, J.F., yazquez-Figueroa, E., Bommarius, A.S. Structure-guided consensus approach to create a more thermostable penicillin G acylase. Biotechnol. J. (2006) 1(5), 531-6.8. Polizzi, K.M., phaparro-Riggers, J.F., yazquez-Figueroa, E., Bommarius, A.S. Structure-guided consensus approach to create a more thermostable penicillin G acylase. Biotechnol. J. (2006) 1 (5), 531-6.

9. Chandel, A.K., Rao, L.V, Narasu, M.L., Singh, O.V., The realm of penicillin G acylase in beta-lactam antibiotics. Enzyme Microb. Technol. (2008) 42, 199-207.9. Chandel, A.K., Rao, L.V., Narasu, M.L., Singh, O.V., The realm of penicillin G acylase in beta-lactam antibiotics. Enzyme Microb. Technol. (2008) 42, 199-207.

10. Prieto, I., Martin, J., Arche, R., Fernandez, P., Perez-Aranda, A., Barbero, J.L. Penicillin acylase mutants with altered site-directed activity from Kluyvera citrophila. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990) 33, 553-559.10. Prieto, I., Martin, J., Arche, R., Fernandez, P., Perez-Aranda, A., Barbero, J.L. Penicillin acylase mutants with altered site-directed activity from Kluyvera citrophila. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990) 33, 553-559.

11. Shi, Y.F., Soumillion, P., Ueda, M. Effects of catalytic site mutations on active expression of phage fused penicillin acylase. J. Biotechnol. (2010) 145, 139-142.11. Shi, Y. F., Soumillion, P., Ueda, M. Effects of catalytic site mutations on active expression of phage fused penicillin acylase. J. Biotechnol. (2010) 145, 139-142.

12. Carboni, С., Kierkels, H.G., Gardossi, L, Tamiola, K., Janssen, D.B., Quaedflieg, P.J. Preparation of D-amino acids by enzymatic kinetic resolution using a mutant of penicillin-G acylase from E.coli. Tetrahedron: Asymmetry (2006) 17, 245-251.12. Carboni, S., Kierkels, H. G., Gardossi, L, Tamiola, K., Janssen, D.B., Quaedflieg, P.J. Preparation of D-amino acids by enzymatic kinetic resolution using a mutant of penicillin-G acylase from E. coli. Tetrahedron: Asymmetry (2006) 17, 245-251.

13. Alkema, W.B., Hensgens, C.M., Snijder, H.J., Keizer, E., Dijkstra, B.W., Janssen, D.B. Structural and kinetic studies on ligand binding in wild-type and active-site mutants of penicillin acylase. Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17, 473-480.13. Alkema, W. B., Hensgens, C. M., Snijder, H. J., Keizer, E., Dijkstra, B. W., Janssen, D. B. Structural and kinetic studies on ligand binding in wild-type and active-site mutants of penicillin acylase. Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17, 473-480.

14. Abian, 0., Grazu, V., Hermoso, J., Gonzalez, R., Garcia, J.L., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J.M. Stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli: site-directed mutagenesis of the protein surface to increase multipoint covalent attachment. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70, 1249-1251.14. Abian, 0., Grazu, V., Hermoso, J., Gonzalez, R., Garcia, J.L., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J.M. Stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli: site-directed mutagenesis of the protein surface to increase multipoint covalent attachment. Appl. Environ. Microbiol. (2004) 70, 1249-1251.

15. Kasche, V., Galunsky, В., Ignatova, Z. Fragments of pro-peptide activate mature penicillin amidase ofAlcaligenesfaecalis. Eur. J. Biochem. (2003) 270, 4721-4728.15. Kasche, V., Galunsky, B., Ignatova, Z. Fragments of pro-peptide activate mature penicillin amidase of Alcaligenesfaecalis. Eur. J. Biochem. (2003) 270, 4721-4728.

16. Wang, Т., Zhu, H., Ma, X., Ма, Y., Wei, D. Structure-based stabilization of an enzyme: the case of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. Protein Pept. Lett. (2006) 13, 177-183.16. Wang, T., Zhu, H., Ma, X., Ma, Y., Wei, D. Structure-based stabilization of an enzyme: the case of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. Protein Pept. Lett. (2006) 13, 177-183.

17. Choi, K.S., Kim, J.A., and Kang, H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacteriol. (1992) 174, 6270-6276.17. Choi, K.S., Kim, J.A., and Kang, H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacteriol. (1992) 174, 6270-6276.

18. Lee, H., Park, O.K., and Kang, H.S. Identification of a new activ site for autocatalytic processing of penicillin acylase precursor in Escherichia coli ATCC 11105. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 272, 199-204.18. Lee, H., Park, O.K., and Kang, H.S. Identification of a new activ site for autocatalytic processing of penicillin acylase precursor in Escherichia coli ATCC 11105. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 272, 199-204.

19. Forney, L.J., Wong, D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. (1989) 55(10), 2550.19. Forney, L.J., Wong, D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. (1989) 55 (10), 2550.

20. Roa, A., Garcia, J.L, Salto, F., Cortes, E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J. (1994), 303, P. 869.20. Roa, A., Garcia, J. L, Salto, F., Cortes, E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J. (1994), 303, P. 869.

21. Alkema, W.B., Hensgens, C.M., Kroezinga, E.H., de Vries, E., Floris, R., van der Laan, J.M., Dijkstra, B.W., Janssen, D.B. Characterization of the beta-lactam binding site of penicillin acylase of Escherichia coli by structural and site-directed mutagenesis studies. Protein Engineering (2000) 13(12), 857-863.21. Alkema, W. B., Hensgens, C. M., Kroezinga, E. H., de Vries, E., Floris, R., van der Laan, J. M., Dijkstra, B. W., Janssen, D. B. Characterization of the beta-lactam binding site of penicillin acylase of Escherichia coli by structural and site-directed mutagenesis studies. Protein Engineering (2000) 13 (12), 857-863.

22. Alkema, W.B.L, Dijkhuis, A., de Vries, E., and Janssen, D.B. The role of hydrophobic activ-site residues in substrate specificity and acyi transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. (2002) 269, 2093-2100.22. Alkema, W.B.L, Dijkhuis, A., de Vries, E., and Janssen, D.B. The role of hydrophobic activ-site residues in substrate specificity and acyi transfer activity of penicillin acylase. Eur. J. Biochem. (2002) 269, 2093-2100.

23. Швядас, В.К., Марголин, А.Л., Шерстюк, С.Ф., Березин, И.В. Инактивация пенициллинамидазы из E.coli под действием фенилметилсульфонил фторида: кинетический анализ и титрование активных центров. Биоорган. химия (1977) 3, 546-553.23. Shvyadas, V.K., Margolin, A.L., Sherstyuk, S.F., Berezin, I.V. Inactivation of E. coli penicillin amidase by phenylmethylsulfonyl fluoride: kinetic analysis and titration of active sites. Bioorgan. Chemistry (1977) 3, 546-553.

Claims

The penicillin acylase mutant (Penicillin G acylase) from E. coli, containing the replacement of the aspartic acid residue of the beta chain of the enzyme at position 484 (numbering begins with the first amino acid residue of the beta chain containing 557 amino acid residues) by the asparagine residue.