RU2552305C1

RU2552305C1 - Method for predicting risk of malignant new growths

Info

Publication number: RU2552305C1
Application number: RU2014113366/15A
Authority: RU
Inventors: Гюльнара Тельмановна Лютфалиева
Priority date: 2014-04-04
Filing date: 2014-04-04
Publication date: 2015-06-10

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: individual's peripheral blood is examined to measure the absolute content of natural killers (CD16+ lymphocytes) and the concentration of soluble apoptosis receptor (sAPO-1). If the CD16+ content is more than 0.5×10⁹ cell/l, whereas the sAPO-1 concentration is more than 4,000 pg/ml, the risk of malignant new growths is predicted.

EFFECT: using the given method enables detecting the malignant new growth at the early stages with using immunological methods.

4 ex

Description

Изобретение относится к онкологии, иммунологии, лабораторной диагностике и может быть применено для прогнозирования и раннего выявления лиц с риском развития злокачественных новообразований, что необходимо для обеспечения своевременного адекватного лечения и благоприятного прогноза течения заболевания.The invention relates to oncology, immunology, laboratory diagnostics and can be used to predict and early detection of persons with a risk of developing malignant neoplasms, which is necessary to ensure timely adequate treatment and a favorable prognosis of the course of the disease.

Одной из основных причин смертности в промышленно развитых странах являются злокачественные новообразования. При этом, согласно данным Международного агентства по изучению рака, к 2020 г. прогнозируется повышение заболеваемости злокачественными опухолями до 15 млн и возрастание смертности до 9 млн человек в год [Parkin D.M., Pisani P., Ferlay J. Global cancer statistics CA Cancer // J. Clin. - 1999. - Vol.49. - P. 33-64]. В связи с социальной значимостью проблемы онкологических заболеваний, правительством Российской Федерации в рамках приоритетного национального проекта «Здоровье» в 2009 году начата реализация мероприятий, направленных на совершенствование оказания медицинской помощи больным со злокачественными новообразованиями. Одной из приоритетных задач является выявление заболеваемости на ранних стадиях. Известно, что положительный результат лечения может достигать 90-95% при выявлении онкологических заболеваний на первой или второй стадии заболевания. Несвоевременная диагностика онкологических заболеваний связана с трудностью диагностики заболевания на ранней стадии.One of the main causes of death in industrialized countries is malignant neoplasms. Moreover, according to the International Agency for Research on Cancer, by 2020, an increase in the incidence of malignant tumors up to 15 million and an increase in mortality up to 9 million people per year are predicted [Parkin DM, Pisani P., Ferlay J. Global cancer statistics CA Cancer // J. Clin. - 1999. - Vol. 49. - P. 33-64]. In connection with the social significance of the problem of cancer, the Government of the Russian Federation, in the framework of the priority national project "Health" in 2009, launched measures aimed at improving the provision of medical care for patients with malignant neoplasms. One of the priority tasks is the detection of morbidity in the early stages. It is known that a positive treatment result can reach 90-95% when detecting cancer at the first or second stage of the disease. Untimely diagnosis of cancer is associated with the difficulty of diagnosing the disease at an early stage.

Несмотря на то, что в последние десятилетия были предложены многочисленные методы диагностики онкологических заболеваний, все они характеризовались теми или иными недостатками: либо низкой чувствительностью и предсказательной ценностью, либо высокой стоимостью исследования и невозможностью использования в качестве скрининговых методов диагностики. Учитывая невысокую доступность специализированных лабораторных и инструментальных методов исследования, возникает вопрос, каким образом практический врач может оценить риск развития злокачественного новообразования у конкретного больного, который является чрезвычайно актуальным.Despite the fact that in recent decades, numerous methods for the diagnosis of cancer have been proposed, all of them were characterized by one or another shortcoming: either low sensitivity and predictive value, or the high cost of the study and the inability to use as screening diagnostic methods. Given the low availability of specialized laboratory and instrumental research methods, the question arises of how a practical doctor can assess the risk of developing a malignant neoplasm in a particular patient, which is extremely relevant.

Имеющееся диагностическое исследование на выявление опухолеспецифических онкомаркеров (CA125, CA19-9, SCCA, TPS, РЭА и др.) - это возможность дифференциальной диагностики определенной опухоли в комбинации с другими диагностическими методами. Как известно, антитела к конкретному антигену выявляют в сыворотке больных раком не очень часто (около 10% случаев), с диагностической целью используют определение антител к одному из нескольких опухолеассоциированных антигенов, которые появляются примерно у половины больных [Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология._- 1996. - №6 - С.10-23]. До сих пор не охарактеризован ни один опухолевый маркер, обладающий 100% специфичностью по отношению к какому-либо органу (исключением можно считать ПСА).The available diagnostic study for the detection of tumor-specific tumor markers (CA125, CA19-9, SCCA, TPS, CEA, etc.) is the possibility of differential diagnosis of a specific tumor in combination with other diagnostic methods. As you know, antibodies to a particular antigen are not very often detected in the serum of cancer patients (about 10% of cases). For diagnostic purposes, antibodies are used to determine antibodies to one of several tumor-associated antigens that appear in about half of patients [Yarilin A.A. Apoptosis and its place in immune processes // Immunology ._- 1996. - No. 6 - S.10-23]. So far, not a single tumor marker has been characterized that has 100% specificity for any organ (PSA can be considered an exception).

Отправной точкой для разработки предлагаемого способа прогнозирования риска развития злокачественных новообразований послужила общепринятая в настоящее время концепция, согласно которой нарушение равновесия между процессами пролиферации и апоптоза является главной причиной формирования опухоли.The starting point for developing the proposed method for predicting the risk of developing malignant neoplasms was the currently generally accepted concept, according to which the imbalance between the processes of proliferation and apoptosis is the main cause of tumor formation.

Литературные данные свидетельствуют о том, что нарушение регуляции апоптоза характерно как для доброкачественных, так и злокачественных новообразований [Anderson T.J. Pathological studies of apoptosis in the normal breast // Endocr. Relat. Cancer. - 1999. - Vol.6. - №1. - P. 9-12; Talieri M., Diamandis E.P., Katsaros N., et al. Expression of BCL2L12, a new member of apoptosis-related genes, in breast tumors // Thromb. Haemost. - 2003. - Vol.89. - №6. - P. 1081-1088.]. Сравнение уровня спонтанного апоптоза при различных заболеваниях показывает увеличение его в ряду фиброаденома - фиброзно-кистозная мастопатия - рак молочной железы. Однако достоверные отличия обнаружены только с группой рака молочной железы [Боженко В.К., Гали-Оглы Г.А., Кудинова Е.А., Мельникова Н.В. Оценка уровня спонтанного апоптоза при доброкачественных и злокачественных новообразованиях молочной железы http://vestnik.mcrr.ru/vestnik/v4/papers/bozhen_v4.htm].Literature data indicate that dysregulation of apoptosis is characteristic of both benign and malignant neoplasms [Anderson T.J. Pathological studies of apoptosis in the normal breast // Endocr. Relat. Cancer - 1999. - Vol.6. - No. 1. - P. 9-12; Talieri M., Diamandis E.P., Katsaros N., et al. Expression of BCL2L12, a new member of apoptosis-related genes, in breast tumors // Thromb. Haemost. - 2003. - Vol. 89. - No. 6. - P. 1081-1088.]. Comparison of the level of spontaneous apoptosis in various diseases shows its increase in the series of fibroadenoma - fibrocystic mastopathy - breast cancer. However, significant differences were found only with the breast cancer group [Bozhenko V.K., Gali-Ogly G.A., Kudinova E.A., Melnikova N.V. Estimation of the level of spontaneous apoptosis in benign and malignant neoplasms of the mammary gland http://vestnik.mcrr.ru/vestnik/v4/papers/bozhen_v4.htm].

Большое внимание в литературе уделяется изучению особенностей и выявление различных маркеров апоптоза при злокачественных новообразованиях [Gonzalez-Campora R., Galera Ruiz M.R., Vazquez Ramirez F., et al. Apoptosis in breast carcinoma // Pathol. Res. Pract. - 2000. - Vol.196. -№3. - P. 167-174.; Антонеева И.И., Петров С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника / Онкология. - 2008. - Т. 10. - №2. - С.234-237]. Так, исследование роли индекса апоптоза как предиктора прогноза пациентов с первичным раком молочной железы не выявил прямой взаимосвязи исследуемого показателя прогноза с заболеванием. Однако зарегистрирована ассоциация развития рака молочной железы с ингибиторами апоптоза, получены свидетельства, что патологический процесс может включать ингибиторы клеточного цикла физиологически [Schöndorf Т., Göhring U.-J., Becker М., et al. High Apoptotic Index Correlates to p21 and p27 Expression Indicating a Favorable Outcome of Primary Breast Cancer Patients, but Lacking Prognostic Significance in Multivariate Analysis // Pathobiology. - 2004. - №4. - Vol.71. - P. 217-222].Much attention is paid in the literature to the study of features and the identification of various markers of apoptosis in malignant neoplasms [Gonzalez-Campora R., Galera Ruiz M.R., Vazquez Ramirez F., et al. Apoptosis in breast carcinoma // Pathol. Res. Pract. - 2000 .-- Vol.196. -Number 3. - P. 167-174 .; Antoneeva I.I., Petrov S.B. Markers of apoptosis and proliferation of tumor cells in the dynamics of progression of ovarian cancer / Oncology. - 2008. - T. 10. - No. 2. - S.234-237]. Thus, a study of the role of the apoptosis index as a predictor for the prognosis of patients with primary breast cancer did not reveal a direct relationship between the studied prognosis and the disease. However, an association of the development of breast cancer with apoptosis inhibitors is registered, evidence has been obtained that the pathological process may include physiological cell cycle inhibitors [Schöndorf T., Göhring U.-J., Becker M., et al. High Apoptotic Index Correlates to p21 and p27 Expression Indicating a Favorable Outcome of Primary Breast Cancer Patients, but Lacking Prognostic Significance in Multivariate Analysis // Pathobiology. - 2004. - No. 4. - Vol. 71. - P. 217-222].

Получены данные, что в процессе прогрессирования рака яичников, в первичном опухолевом узле имеет место гиперэкспрессия ингибитора апоптоза Bcl-2, обеспечивающее более агрессивное течение заболевания [Антонеева И.И., Петров С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника / Онкология. - 2008. - Т. 10. - №2. - С.234-237]. Изучены механизмы, благодаря которым Bcl-2 реализует свою антиапоптотическую функцию при онкологических процессах [Mitselou A., Ioachim Е., Kitsou Е., et al. Immunohistochemica study of apoptosis - related bcl-2 protein and its correlation with proliferation indices (Ki-67, PCNA), tumor suppression genes (p53, pRb), the oncogene c-erb-B2, sex steroid hormone receptor and other clinico-pathological features, in normal, hyperplastic and neoplastic endometrium // In vivo. - 2003. - Vol.17. - P. 469-478.]. Однако данные относительно уровня экспрессии белка Bcl-2 и возможностей использования его в качестве прогностического фактора у больных с солидными опухолями достаточно противоречивы [Zhang G.J., Kimijima I., Abe R., et al. Apoptotic index correlates to bcl-2 and p53 protein expression, histological grade and prognosis in invasive breast cancers. // Anticancer Res. - 1998. - Vol.18. - P. 1989-1998; Абраменко И.В., Фильченков A.A. Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии // Вопр. онкол. - 2003. - №49. - С.21-30; Мильчаков Д.Е. Клинико-морфологическая характеристика серозного рака яичников у женщин (на примере Кировской обл.): Автореф. дис … канд. мед. наук. - Санкт-Петербург. - 2007. - 19 с.].The data were obtained that in the process of progression of ovarian cancer, in the primary tumor node there is overexpression of the Bcl-2 apoptosis inhibitor, which provides a more aggressive course of the disease [Antoneeva II, Petrov SB Markers of apoptosis and proliferation of tumor cells in the dynamics of progression of ovarian cancer / Oncology. - 2008. - T. 10. - No. 2. - S.234-237]. The mechanisms by which Bcl-2 realizes its anti-apoptotic function in oncological processes [Mitselou A., Ioachim E., Kitsou E., et al. Immunohistochemica study of apoptosis - related bcl-2 protein and its correlation with proliferation indices (Ki-67, PCNA), tumor suppression genes (p53, pRb), the oncogene c-erb-B2, sex steroid hormone receptor and other clinico-pathological features, in normal, hyperplastic and neoplastic endometrium // In vivo. - 2003. - Vol.17. - P. 469-478.]. However, data on the level of expression of Bcl-2 protein and the possibilities of using it as a prognostic factor in patients with solid tumors are quite contradictory [Zhang G.J., Kimijima I., Abe R., et al. Apoptotic index correlates to bcl-2 and p53 protein expression, histological grade and prognosis in invasive breast cancers. // Anticancer Res. - 1998. - Vol. 18. - P. 1989-1998; Abramenko I.V., Filchenkov A.A. Evaluation of apoptosis parameters in the diagnosis of cancer, their prognosis and optimization of treatment regimens // Vopr. onkol. - 2003. - No. 49. - S.21-30; Milchakov D.E. Clinical and morphological characteristics of serous ovarian cancer in women (on the example of the Kirov region): Abstract. dis ... cand. honey. sciences. - St. Petersburg. - 2007. - 19 p.].

Интенсивно изучается биологическая роль растворимого рецептора Fas - sAPO-1, большинство исследований сосредоточено на малигнизации клеток при лейкемии и солидных новообразовниях [Knipping Е., Debatin К.М., Stricker К., et al. Identification of soluble APO-1 in supernatants of human B- and T-cell lines and increased serum levels in B- and T-cell leukemias // Blood. -1995. - Vol.85. - P. 1562-1569; Wong W.W., Dimitroulakos J., Minden M.D., et al. HMG-CoA reductase inhibitors and the malignant cell: the statin family of drugs as triggers of tumor-specific apoptosis // Leukemia. - 2002. - Vol.16. - P. 508-519]. Предполагают, что растворимые формы ингибируют апоптоз, блокируя связывание мембранной формы Fas с Fas-L, за счет взаимодействия в кровотоке [Serrao K.L., Fortenberry J.D., Owens M.L., et al. Neutrophils induce apoptosis of lung epithelial cells via release of soluble Fas ligand // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2001. - Vol.280. - P. 298-305]. Имеются данные, что sAPO-1 может защищать клетки от Fas - лиганд-индуцированного апоптоза [Chen J., Zhou Т., Liu С.et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule // Science. - 1994. - Vol.263. - P. 1759-1762]. Следовательно, секреция sAPO-1 может дать возможность опухолевым клеткам ускользнуть от иммунного надзора и, таким образом, вовлечена в процесс развития опухоли.The biological role of the soluble Fas-sAPO-1 receptor is intensively studied, most of the studies are focused on malignancy of cells in leukemia and solid neoplasms [Knipping E., Debatin K.M., Stricker K., et al. Identification of soluble APO-1 in supernatants of human B- and T-cell lines and increased serum levels in B- and T-cell leukemias // Blood. -1995. - Vol. 85. - P. 1562-1569; Wong W.W., Dimitroulakos J., Minden M.D., et al. HMG-CoA reductase inhibitors and the malignant cell: the statin family of drugs as triggers of tumor-specific apoptosis // Leukemia. - 2002 .-- Vol.16. - P. 508-519]. It is believed that soluble forms inhibit apoptosis by blocking the binding of the membrane form of Fas to Fas-L due to interaction in the bloodstream [Serrao K.L., Fortenberry J.D., Owens M.L., et al. Neutrophils induce apoptosis of lung epithelial cells via release of soluble Fas ligand // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2001 .-- Vol. 280. - P. 298-305]. There is evidence that sAPO-1 can protect cells from Fas - ligand-induced apoptosis [Chen J., Zhou T., Liu C. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule // Science. - 1994 .-- Vol.263. - P. 1759-1762]. Therefore, the secretion of sAPO-1 can enable the tumor cells to escape from immune surveillance and is thus involved in the development of the tumor.

Попытка использования количественного значения sAPO-1 в прогностических целях была предпринята в исследованиях, проведенных Касимовой А.К. и Тулеутовым А.Е. [Касимова А.К. Растворимый Fas - антиген у больных новообразованиями яичников и его клиническое значение: Автореф. дис. … канд. мед. наук. - Астана. - 2008. - 24 с.]. Было показано, что безрецидивная выживаемость больных раком яичников зависела от исходного (до лечения) уровня растворимого Fas рецептора (sAPO-1/Fas) и достоверно ниже в группе больных с повышенным (более 200 пг/мл) содержанием в сыворотке крови sAPO-1. Однако динамика количественных изменений растворимого рецептора изучалась только у больных женщин с новообразованиями яичников, кроме того, указанные значения sAPO-1 не могут расцениваться как «повышенная продукция» в связи с тем, что референсные значения данного показателя, согласно рекомендации фирмы-производителя «Bender MedSystems» (Австрия) составляют 1334-2411 пг/мл, что согласуется и с другими исследованиями [Choi J.W. Reference intervals of serum APO-1 (Fas/CD95) concentration in healthy adults // An. Clin. Lab. Science. - 2006. - Vol.36. - P. 103-104].An attempt to use the quantitative value of sAPO-1 for prognostic purposes was made in studies conducted by A. Kasimova and Tuleutov A.E. [Kasimova A.K. Soluble Fas - antigen in patients with ovarian neoplasms and its clinical significance: Abstract. dis. ... cand. honey. sciences. - Astana. - 2008. - 24 p.]. It was shown that the relapse-free survival of patients with ovarian cancer depended on the initial (before treatment) level of soluble Fas receptor (sAPO-1 / Fas) and significantly lower in the group of patients with elevated (over 200 pg / ml) serum sAPO-1. However, the dynamics of quantitative changes in the soluble receptor was studied only in sick women with ovarian neoplasms, in addition, the indicated sAPO-1 values cannot be regarded as “increased production” due to the fact that the reference values of this indicator, according to the recommendation of the manufacturer Bender MedSystems "(Austria) are 1334-2411 PG / ml, which is consistent with other studies [Choi JW Reference intervals of serum APO-1 (Fas / CD95) concentration in healthy adults // An. Clin. Lab. Science. - 2006. - Vol. 36. - P. 103-104].

Данных о дозозависимых эффектах sAPO-1, взаимосвязи уровня концентрации растворимого рецептора Fas/APO-1 с риском развития злокачественных новообразований на доклиническом этапе в литературе мы не обнаружили.We did not find any data on the dose-dependent effects of sAPO-1, the relationship between the concentration level of the soluble Fas / APO-1 receptor and the risk of developing malignant neoplasms in the literature.

При исследовании научно-технической патентной информации идентичная совокупность существенных признаков, заявленная в изобретении, также не была выявлена. Известен способ прогнозирования развития профессиональных злокачественных новообразований кожи у работников производства стекловолокна [Патент РФ №2454668, опубл. 27.06.2012], при котором из периферической венозной крови обследуемых лиц выделяют ДНК лимфоцитов и осуществляют анализ генного полиморфизма с помощью полимеразной цепной реакции. Указанный аналог изобретения требует длительной и трудоемкой пробоподготовки, включающей ночную инкубацию в термостате, фенол-хлороформную экстракцию и амплификацию ДНК, шестичасовой рестрикционный анализ с последующей оценкой на приборе. Способ, основанный на молекулярно-генетической диагностике, является дорогостоящим, проведение которого возможно только в специализированных лабораториях.In the study of scientific and technical patent information, an identical set of essential features claimed in the invention was also not revealed. A known method for predicting the development of professional malignant neoplasms of the skin in workers manufacturing fiberglass [RF Patent No. 2454668, publ. 06/27/2012], in which lymphocyte DNA is isolated from the peripheral venous blood of the test subjects and gene polymorphism is analyzed using a polymerase chain reaction. The specified analogue of the invention requires a long and time-consuming sample preparation, including night incubation in a thermostat, phenol-chloroform extraction and DNA amplification, six-hour restriction analysis, followed by evaluation on the device. A method based on molecular genetic diagnostics is expensive, the implementation of which is possible only in specialized laboratories.

Известен способ оценки и прогнозирования факторов риска злокачественных новообразований гортани [Патент РФ №2246894, опубл. 27.02.2005], включающий медико-генетическое обследование пациента и дополнительное исследование многочисленных факторов, в том числе: возраст, длительность курения, стаж работы с профвредностями, регулярность употребления алкоголя, бытовые вредности, экологические факторы, срок проживания в загрязненном районе. Данные показатели оцениваются в баллах, затем вычисляют коэффициент прогнозирования по разработанной формуле. Недостатком представленного аналога изобретения является его трудоемкость, временная и экономическая затратность при прогнозировании факторов риска только злокачественных новообразований гортани. Способ требует проведения объемных диагностических процедур, параметры полученных данных нуждаются в соответствующих измерениях и стандартизованной оценке, что ограничивает применение способа в практической медицине.A known method for assessing and predicting risk factors for malignant neoplasms of the larynx [RF Patent No. 2246894, publ. 02/27/2005], including a medical genetic examination of the patient and an additional study of numerous factors, including: age, duration of smoking, work experience with occupational hazards, regularity of alcohol consumption, domestic hazards, environmental factors, length of stay in a polluted area. These indicators are evaluated in points, then the prediction coefficient is calculated according to the developed formula. The disadvantage of the presented analogue of the invention is its complexity, time and cost in predicting risk factors for only malignant neoplasms of the larynx. The method requires extensive diagnostic procedures, the parameters of the data obtained need appropriate measurements and a standardized assessment, which limits the application of the method in practical medicine.

Целью заявленного изобретения является прогнозирование риска развития и раннее выявление злокачественных новообразований в организме человека в условиях широкой сети учреждений практического здравоохранения. Поставленная цель достигается тем, что в периферической крови человека определяют абсолютное содержание естественных киллеров CD16+ лимфоцитов и концентрацию растворимого рецептора апоптоза (sAPO-1). При содержании CD16+ клеток более 0,5×10⁹ кл/л и концентрации sAPO-1 более 4000 пг/мл прогнозируют риск развития злокачественных новообразований. Технический результат предлагаемого способа заключается в том, что посредством дифференцированной оценки количественных значений двух показателей: естественных киллеров CD16+ лимфоцитов и растворимого рецептора апоптоза sAPO-1 в крови человека прогнозируют риск развития злокачественных новообразований.The aim of the claimed invention is to predict the risk of development and early detection of malignant neoplasms in the human body in a wide network of institutions of practical health care. This goal is achieved by the fact that the absolute content of natural killers of CD16 + lymphocytes and the concentration of soluble apoptosis receptor (sAPO-1) are determined in human peripheral blood. When the content of CD16 + cells is more than 0.5 × 10 ⁹ cells / l and the concentration of sAPO-1 is more than 4000 pg / ml, the risk of developing malignant tumors is predicted. The technical result of the proposed method is that through a differentiated assessment of the quantitative values of two indicators: natural killers of CD16 + lymphocytes and a soluble apoptosis receptor sAPO-1 in human blood, the risk of developing malignant neoplasms is predicted.

По данным исследований в модельных системах и косвенных свидетельств, полученных из опыта иммунотерапии опухолей человека, ключевую роль в иммунном повреждении опухолевых клеток играют цитотоксические лимфоциты - естественные киллеры (NK-клетки) и цитотоксические Т-лимфоциты. Основная функция естественных киллеров (NK-клетка, экспрессирующая молекулы CD16) - цитолиз клеток, несущих признаки трансформации, инфицирования или клеточного стресса, при отсутствии на них собственных молекул MHC-I и секреция цитокинов (в первую очередь IFNγ). Они используют классический перфорин-гранзимовый механизм контактного цитолиза, а также Fas-зависимую индукцию апоптоза опухолевых клеток [Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. - 1996. - Т. 6. - С.10-23].According to studies in model systems and indirect evidence obtained from the experience of immunotherapy of human tumors, a key role in the immune damage of tumor cells is played by cytotoxic lymphocytes - natural killer cells (NK cells) and cytotoxic T-lymphocytes. The main function of natural killer cells (NK cell expressing CD16 molecules) is the cytolysis of cells bearing signs of transformation, infection or cell stress, in the absence of their own MHC-I molecules and the secretion of cytokines (primarily IFNγ). They use the classical perforin-granzyme contact cytolysis mechanism, as well as the Fas-dependent induction of apoptosis of tumor cells [Yarilin A.A. Apoptosis and its place in immune processes // Immunology. - 1996. - T. 6. - S.10-23].

Таким образом, эффект защитной реакции, реализуемый естественными киллерами (CD16+), а также уровень содержания в периферической крови человека ингибитора апоптоза растворимого рецептора sAPO-1 позволяют оценить эффективность работы противоопухолевого иммунитета организма и способность опухолевыми клетками избегать действия эффекторных факторов иммунитета, что дает возможность использовать количественные значения данных биомаркеров в качестве прогноза риска развития злокачественных новообразований.Thus, the protective reaction effect realized by natural killer cells (CD16 +), as well as the level of the soluble apiotic inhibitor apoptosis inhibitor sAPO-1 in the human peripheral blood, makes it possible to evaluate the effectiveness of the antitumor immunity of the body and the ability of tumor cells to avoid the effects of immune effector factors, which makes it possible to use quantitative values of these biomarkers as a prediction of the risk of developing malignant neoplasms.

Преимуществом предлагаемого изобретения является одновременная оценка параметров, определяющих с одной стороны - активность противоопухолевой защиты организма, реализуемую естественными киллерами (CD16+), с другой стороны - защита опухолевых клеток от апоптоза путем его ингибирования (sAPO-1).An advantage of the invention is the simultaneous assessment of parameters that determine, on the one hand, the antitumor defense activity of the body realized by natural killer cells (CD16 +), and, on the other hand, protect tumor cells from apoptosis by inhibiting it (sAPO-1).

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники и не являющиеся очевидными для специалиста. Способ позволяет сократить время и упростить методику прогнозирования, так как позволяет использовать материалы, реактивы и методы исследования, широко применяемые в стандартной клинико-лабораторной практике. Предлагаемый способ диагностики расширяет контингент обследуемых с целью раннего выявления лиц с риском развития злокачественных новообразований, что необходимо для обеспечения своевременного адекватного лечения и благоприятного прогноза заболевания.The essential features characterizing the invention, showed in the claimed combination of new properties that are not explicitly derived from the prior art and are not obvious to a specialist. The method allows to reduce time and simplify the forecasting technique, as it allows the use of materials, reagents and research methods that are widely used in standard clinical and laboratory practice. The proposed diagnostic method expands the contingent of subjects with the aim of early identification of individuals at risk of developing malignant neoplasms, which is necessary to ensure timely adequate treatment and a favorable prognosis of the disease.

Способ осуществляется следующим образом. Кровь для исследования берется из локтевой вены в объеме 1 мл в 9-10 часов утра, натощак. Методом микроскопирования изучается содержание лимфоцитов в мазках крови, окрашенных по методу Романовскому-Гимзе. Фенотип лимфоцитов (CD16+) определяется непрямой иммунопероксидазной реакцией с использованием моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр», г. Москва). Количественное определение растворимого рецептора Fas - sAPO-1 в сыворотке крови проводится методом «конкурентного» иммуноферментного анализа (ИФА) в микропланшетном формате с использованием реактивов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия).The method is as follows. Blood for research is taken from the ulnar vein in a volume of 1 ml at 9-10 o’clock in the morning, on an empty stomach. Microscopy is used to study the content of lymphocytes in blood smears stained by the Romanovsky-Giemsa method. The lymphocyte phenotype (CD16 +) is determined by an indirect immunoperoxidase reaction using monoclonal antibodies (NPC "MedBioSpektr", Moscow). Quantitative determination of the soluble Fas-sAPO-1 receptor in blood serum is carried out by the method of "competitive" enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in a microplate format using reagents of the company "Bender MedSystems" (Austria).

Исследование проводилось на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Evolis» фирмы «Bio-Rad» (Германия-США). Заявленным способом в апреле 2008 года были обследованы 230 человек, родившихся и постоянно проживающих в г. Архангельске от 28 до 90 лет (средний возраст 58,3 лет). В декабре 2013 года проведен ретроспективный анализ анамнеза жизни исследуемых людей за данный период. Диагноз установлен в Архангельском областном клиническом онкологическом диспансере, обследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Статистический анализ был выполнен с использованием пакета прикладных программ «SPSS for Windows» (версия 11.5; США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера Европейской территории России. Распределение содержания сывороточного sAPO-1 отличалось от нормального, поэтому представлено в виде медианы, 25- и 75- перцентилей. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Статистическая достоверность присваивалась при значении p<0,05.The study was conducted on an automatic enzyme-linked immunosorbent analyzer "Evolis" company "Bio-Rad" (Germany-USA). In April 2008, 230 people who were born and permanently residing in the city of Arkhangelsk from 28 to 90 years old (average age 58.3 years) were examined by the claimed method. In December 2013, a retrospective analysis of the anamnesis of the life of the studied people for this period was carried out. The diagnosis was made in the Arkhangelsk Regional Clinical Oncology Center, the examination was carried out in compliance with the basic norms of biomedical ethics. Statistical analysis was performed using the SPSS for Windows application package (version 11.5; USA). The type of research is retrospective, samples are random, one-stage. General population - residents of the north of the European territory of Russia. The distribution of serum sAPO-1 content was different from normal, therefore it is presented as a median, 25- and 75-percentiles. The significance of differences between the groups was evaluated using the Student t-test for independent samples and the nonparametric Wilcoxon test. Statistical significance was assigned when p <0.05.

Наши исследования показали влияние количества естественных киллеров (CD16+ лимфоцитов) и концентрации растворимого рецептора апоптоза sAPO-1/Fas на развитие злокачественных новообразований у исследуемых людей за период наблюдения 5 лет и 8 месяцев (p<0,05). Установлено, что общее абсолютное содержание естественных киллеров CD16+ значительно выше у обследуемых, у которых в последующем было диагностировано злокачественное новообразование по сравнению с группой лиц без онкологических заболеваний: 0,78±0,03 против 0,34±0,05×10⁹ кл/л (p<0,05), соответственно. При этом повышение количества естественных киллеров (CD16+) сопровождалось увеличением числа цитотоксических лимфоцитов (CD8+) и было ассоциировано с повышением уровня антител ds-DNA (r=0,46; p<0,05) на фоне активизации Fas-опосредованного апоптоза (p<0,05). Естественные киллеры, как известно, обеспечивают первую, еще неспецифическую цитотоксичность в отношении генетически чужеродных клеток или клеток, содержащих чужеродную информацию. Продуцируемый естественными киллерами интерферон гамма (IFNγ) подавляет пролиферацию опухолевых клеток, способствует развитию апоптоза опухолевых клеток, индуцируя экспрессию каспазы 1, а также Fas-рецептора на опухолевых клетках и Fas-лиганда на цитотоксических Т-лимфоцитах [Опферман Т., Корсмэер С. Роль апоптоза в период становления иммунной системы и при развертывании иммунного ответа // Аллергология и иммунология. - 2006. - Т. 7. - №4. - С.464-470].Our studies showed the effect of the number of natural killers (CD16 + lymphocytes) and the concentration of the soluble apoptosis receptor sAPO-1 / Fas on the development of malignant neoplasms in the studied people over the observation period of 5 years and 8 months (p <0.05). It was found that the total absolute content of natural CD16 + killers is significantly higher in subjects who were subsequently diagnosed with a malignant neoplasm compared with a group of people without cancer: 0.78 ± 0.03 versus 0.34 ± 0.05 × 10 ⁹ cells / l (p <0.05), respectively. Moreover, an increase in the number of natural killer cells (CD16 +) was accompanied by an increase in the number of cytotoxic lymphocytes (CD8 +) and was associated with an increase in the level of ds-DNA antibodies (r = 0.46; p <0.05) against the background of the activation of Fas-mediated apoptosis (p < 0.05). Natural killers, as is known, provide the first, yet non-specific cytotoxicity with respect to genetically foreign cells or cells containing foreign information. Interferon gamma (IFNγ) produced by natural killers inhibits the proliferation of tumor cells, promotes the development of apoptosis of tumor cells, inducing the expression of caspase 1, as well as the Fas receptor on tumor cells and the Fas ligand on cytotoxic T lymphocytes [Opferman T., Korsmeer S. Role apoptosis during the formation of the immune system and the deployment of the immune response // Allergology and Immunology. - 2006. - T. 7. - No. 4. - S.464-470].

Наши исследования показали, что содержание растворимого рецептора sAPO-1 в сыворотке крови людей, у которых за период наблюдения диагностировано злокачественное новообразование, значительно выше (44705,80 (9464,525-253649,4) пг/мл), чем у людей, наблюдаемых за тот же период без онкологической патологии (1257,8 (626,30-2015) пг/мл; p<0,05). Повышение sAPO-1 выше 4000 пг/мл ассоциировалось с достоверным увеличением абсолютного числа моноцитов (0,54±0,04 против 0,31±0,09×109 кл/л, p<0,05). Участие моноцитов/макрофагов в противоопухолевом иммунитете связано с секрецией интерферонов, а также с TNF-α, которые активируют клетки-продуценты и усиливают цитотоксическую функцию естественных и специализированных киллеров. Моноциты, инфильтрируя опухоль, способствуют ее разрушению, спонтанному рассасыванию [Войтенков Б.О., Окулов В.Б. Основные характеристики макрофага как клетки эффектора // Вопр. онкологии. - 1995. - №3. - С.59-64; Луговская С.А. Структура и функции моноцитов и макрофагов // Клин. лаб. диагностика. - 1997. - №9. - С.10-15; Secchiero Р., Gonelli A., Mirandola P. et al. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand induces monocytic maturation of leukemic and normal myeloid precursors through a caspase-dependent pathway // Blood. - 2002. - V. 100. - P. 2421-2429]. Показано, что повышение концентрации sAPO-1 выше 4000 пг/мл ассоциировано с увеличением относительного числа лимфоцитов с маркером активации иммунной системы через IL-2 (CD25+)-(23,7±1,32×10⁹ кл/л против 19,85±0,83×10⁹ кл/л, p<0,01), что свидетельствует о взаимосвязи гиперсекреции растворимого рецептора с пролиферативной реакцией.Our studies showed that the content of the soluble sAPO-1 receptor in the blood serum of people who have been diagnosed with a malignant neoplasm during the observation period is significantly higher (44705.80 (9464.525-253649.4 pg / ml) than in people observed for the same period without oncological pathology (1257.8 (626.30-2015) pg / ml; p <0.05). An increase in sAPO-1 above 4000 pg / ml was associated with a significant increase in the absolute number of monocytes (0.54 ± 0.04 versus 0.31 ± 0.09 × 109 cells / l, p <0.05). The involvement of monocytes / macrophages in antitumor immunity is associated with the secretion of interferons, as well as with TNF-α, which activate producer cells and enhance the cytotoxic function of natural and specialized killers. Monocytes, infiltrating a tumor, contribute to its destruction, spontaneous resorption [Voitenkov B.O., Okulov VB Main characteristics of the macrophage as effector cells // Vopr. oncology. - 1995. - No. 3. - S. 59-64; Lugovskaya S.A. The structure and functions of monocytes and macrophages // Klin. lab. diagnostics. - 1997. - No. 9. - S.10-15; Secchiero P., Gonelli A., Mirandola P. et al. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand induces monocytic maturation of leukemic and normal myeloid precursors through a caspase-dependent pathway // Blood. - 2002. - V. 100. - P. 2421-2429]. It was shown that an increase in sAPO-1 concentration above 4000 pg / ml is associated with an increase in the relative number of lymphocytes with a marker of activation of the immune system through IL-2 (CD25 +) - (23.7 ± 1.32 × 10 ⁹ cells / l against 19.85 ± 0.83 × 10 ⁹ cells / l, p <0.01), which indicates the relationship of soluble receptor hypersecretion with a proliferative reaction.

Установленная в процессе исследования взаимосвязь повышения количества естественных киллеров (CD16+) и гиперсекрецией сывороточного sAPO-1 с развитием злокачественных новообразований, логическая обоснованность данных взаимосвязей, позволяют оценить активность противоопухолевой защиты организма и способность опухолевыми клетками избегать действия эффекторных факторов иммунитета путем ингибирования апоптоза, что дает возможность использовать количественные значения данных биомаркеров в качестве прогноза риска развития злокачественных новообразований. В результате были получены следующие характеристики: чувствительность - 75%, специфичность - 84,3%. Предлагаемый нами способ имеет предсказательную ценностью для прогнозирования риска развития и раннего выявления злокачественных новообразований в организме человека, достоверное и доступное для проведения в стандартной клинической практике.The relationship between the increase in the number of natural killers (CD16 +) and serum sAPO-1 hypersecretion with the development of malignant neoplasms, the logical validity of these relationships, established in the course of the study, makes it possible to evaluate the activity of the antitumor defense of the body and the ability of tumor cells to avoid the effects of effector immunity factors by inhibiting apoptosis, which makes it possible use the quantitative values of these biomarkers as a prediction of the risk of developing malignant s tumors. As a result, the following characteristics were obtained: sensitivity - 75%, specificity - 84.3%. Our proposed method has predictive value for predicting the risk of development and early detection of malignant neoplasms in the human body, reliable and affordable for standard clinical practice.

Примеры, иллюстрирующие изобретениеExamples illustrating the invention

Пример 1. Больная С., 54 года. При лабораторном обследовании периферической венозной крови в апреле 2008 г.: абсолютное содержание CD16+ лимфоцитов 0,37×10⁹/л; концентрация sAPO-1 составила 694,7 пг/мл. По данным исследования риска развития злокачественного новообразования нет. За период наблюдения с апреля 2008 года по декабрь 2013 года новообразований выявлено не было. Прогноз верен.Example 1. Patient S., 54 years old. In a laboratory examination of peripheral venous blood in April 2008: the absolute content of CD16 + lymphocytes 0.37 × 10 ⁹ / l; the concentration of sAPO-1 was 694.7 pg / ml. According to a study of the risk of developing malignant neoplasms, no. During the observation period from April 2008 to December 2013, no tumors were detected. The forecast is correct.

Пример 2. Больная В., 32 года. При лабораторном обследовании периферической венозной крови в апреле 2008 г.: абсолютное содержание CD16+ 0,64×10⁹/л; концентрация sAPO-1 составила 4648,8 пг/мл. Сделано заключение о риске развития злокачественного новообразования. Диагноз: Рак яичников, Т-2 ст, Mts 0-1. Заболевание диагностировано в сентябре 2008 года. Прогноз верен.Example 2. Patient C., 32 years old. In a laboratory examination of peripheral venous blood in April 2008: the absolute content of CD16 + 0.64 × 10 ⁹ / l; the concentration of sAPO-1 was 4648.8 pg / ml. The conclusion is made about the risk of developing a malignant neoplasm. Diagnosis: Ovarian cancer, T-2 st, Mts 0-1. The disease was diagnosed in September 2008. The forecast is correct.

Пример 3. Больная Н., 72 года. При лабораторном обследовании периферической венозной крови в апреле 2008 г.: абсолютное содержание CD16+ 0,81×10⁹/л; концентрация sAPO-1 составила 312647,9 пг/мл. Сделано заключение о риске развития злокачественного новообразования. Диагноз: Рак молочной железы, Т-3 ст, Mts 2 (в региональные лимфоузлы). Заболевание диагностировано в январе 2009 года. Прогноз верен.Example 3. Patient N., 72 years old. In a laboratory examination of peripheral venous blood in April 2008: the absolute content of CD16 + 0.81 × 10 ⁹ / l; the concentration of sAPO-1 was 312647.9 pg / ml. The conclusion is made about the risk of developing a malignant neoplasm. Diagnosis: Breast cancer, T-3 st, Mts 2 (in regional lymph nodes). The disease was diagnosed in January 2009. The forecast is correct.

Пример 4. Больной Б., 65 лет. При лабораторном обследовании периферической венозной крови в апреле 2008 г.: абсолютное содержание CD16+ 0,72×10⁹/л; концентрация sAPO-1 составила 76653,8 пг/мл. Сделано заключение о риске развития злокачественного новообразования. Диагноз: Рак прямой кишки, Т-3 ст, Mts 3-4, диагностирован в 2010 году. Больной умер в 2011 году. Прогноз верен.Example 4. Patient B., 65 years old. In a laboratory examination of peripheral venous blood in April 2008: the absolute content of CD16 + 0.72 × 10 ⁹ / l; the concentration of sAPO-1 was 76653.8 pg / ml. The conclusion is made about the risk of developing a malignant neoplasm. Diagnosis: Colorectal cancer, T-3 st, Mts 3-4, diagnosed in 2010. The patient died in 2011. The forecast is correct.

Claims

A method for predicting the risk of developing malignant neoplasms, characterized in that the absolute content of natural killers (CD16 + lymphocytes) and the concentration of soluble apoptosis receptor (sAPO-1) are determined in human peripheral venous blood; with a CD16 + content of more than 0.5 × 10 ⁹ cells / l and sAPO-1 of more than 4000 pg / ml, the risk of developing malignant tumors is predicted.