RU2551236C1 - STRAIN OF BACTERIA Bacillus thuringiensis, NEUTRALISING INFECTIOUS ACTIVITY OF HUMAN INFLUENZA VIRUS A/H3N2 (VERSIONS) - Google Patents
STRAIN OF BACTERIA Bacillus thuringiensis, NEUTRALISING INFECTIOUS ACTIVITY OF HUMAN INFLUENZA VIRUS A/H3N2 (VERSIONS) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2551236C1 RU2551236C1 RU2013159216/10A RU2013159216A RU2551236C1 RU 2551236 C1 RU2551236 C1 RU 2551236C1 RU 2013159216/10 A RU2013159216/10 A RU 2013159216/10A RU 2013159216 A RU2013159216 A RU 2013159216A RU 2551236 C1 RU2551236 C1 RU 2551236C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- preparation
- medium
- strain
- bacillus thuringiensis
- thuringiensis
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к новым штаммам Bacillus thuringiensis (Bt), обладающим противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа человека A/H3N2 для получения препаратов, направленных на подавление указанного вируса и может быть использовано в микробиологической промышленности, биотехнологии и медицине.The invention relates to new strains of Bacillus thuringiensis (Bt) with antiviral activity, in particular, with respect to the highly pathogenic human influenza virus A / H3N2, for the preparation of drugs aimed at suppressing the virus and can be used in the microbiological industry, biotechnology and medicine.
Эпидемиологически значимыми в последние 10 лет для человека являлись вирусы гриппа «А» с поверхностными антигенами A(H1N1), A(H2N2), A(H3N2), способные к быстрому генетическому изменению. Это их свойство создает большие проблемы при лечении инфицированных вирусом гриппа не только человека, но и животных и птиц Отмечается высокая заболеваемость населения (до 40%) с почти одинаковым поражением всех возрастных групп.In the last 10 years, influenza A viruses with surface antigens A (H1N1), A (H2N2), A (H3N2) capable of rapid genetic change have been epidemiologically significant for humans. This property of them creates great problems in the treatment of influenza virus infected not only humans, but also animals and birds. There is a high incidence of the population (up to 40%) with almost the same lesion in all age groups.
С июля 2012 года установлено значительное увеличение случаев заражения «вариантным» вирусом H3N2v, содержащим ген М из вируса гриппа (H1N1)pdm09 (пандемический вирус 2009 H1N1). По данным Всемирной организации здравоохранения в 2012 году в девяти штатах США зарегистрированы случаи заболеваний людей, вызванные этим вирусом. В связи с этим в настоящее время особую актуальность имеет поиск актуальных средств противовирусной защиты и создание препаратов подавляющих вирусную активность.Since July 2012, a significant increase in cases of infection with the “variant” H3N2v virus containing the M gene from the influenza virus (H1N1) pdm09 (pandemic 2009 H1N1 virus) was detected. According to the World Health Organization, in 2012, nine US states reported cases of human diseases caused by this virus. In this regard, the search for topical antiviral agents and the creation of drugs that suppress viral activity are currently of particular relevance.
Известно, что бактерии вида Bacillus thuringiensis (Bt), обладают избирательным антагонистическим действием в отношении микроорганизмов [1, 2]. Показана противовирусная активность штаммов Bt против фитопатогенов, вредителей сельскохозяйственных растений [3, 4].It is known that bacteria of the species Bacillus thuringiensis (Bt) have a selective antagonistic effect against microorganisms [1, 2]. The antiviral activity of Bt strains against phytopathogens, pests of agricultural plants has been shown [3, 4].
Известны штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций (Патент 2142287, МПК A61K 35/74, опубл. 10.12.1999 г.).Known bacterial strains of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis used as components of the drug against viral and bacterial infections (Patent 2142287, IPC A61K 35/74, publ. 10.12.1999).
Известен штамм VNPB 17-3 бактерий Bacillus thuringiensis (патент США №6528480, МПК A01N 63/00, опубл. 04.03.2003 г.), содержащий белковый токсин, обладающий противовирусным действием против вируса табачной мозаики.A known strain of VNPB 17-3 bacteria Bacillus thuringiensis (US patent No. 6528480, IPC A01N 63/00, publ. 04.03.2003) containing a protein toxin having antiviral effect against the tobacco mosaic virus.
Наиболее близким аналогом (прототипом) являются штаммы В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083 (варианты), обладающие противовирусной и антикандидозной активностью (Патент РФ №2405035, МПК C12N 1/20, опубл. 27.11.2010 г.).The closest analogue (prototype) are the strains of B. thuringiensis B-1065 and B. thuringiensis B-1083 (options) with antiviral and anti-candidiasis activity (RF Patent No. 2405035, IPC C12N 1/20, publ. 11/27/2010) .
Однако все выше приведенные аналоги и прототип не обладают ингибирующим действием против вируса гриппа человека A/H3N2.However, all of the above analogues and prototype do not have an inhibitory effect against human influenza virus A / H3N2.
Техническим результатом заявляемого решения является выявление бактериальных штаммов, обладающих ингибирующей активностью в отношении вируса гриппа человека A/H3N2.The technical result of the proposed solution is the identification of bacterial strains with inhibitory activity against human influenza virus A / H3N2.
Указанный технический результат достигается получением спорообразующего, формирующего параспоральные кристаллы, штамма бактерий Bacillus thuringiensis AK-1 (первый вариант), нейтрализующий инфекционную активность вируса гриппа человека A/H3N2 и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1272.The specified technical result is achieved by obtaining a spore-forming, forming parasporal crystals, bacterial strain Bacillus thuringiensis AK-1 (the first option), which neutralizes the infectious activity of the human influenza virus A / H3N2 and deposited in the collection of bacteria, bacteriophages and fungi of the Federal State Institution of Science “State Scientific Center for Virology” and biotechnology "Vector" under registration number B-1272.
Указанный технический результат достигается также получением второго варианта спорообразующего, формирующего параспоральные кристаллы, штамма бактерий Bacillus thuringiensis, нейтрализующий инфекционную активность вируса гриппа человека A/H3N2 и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1273.The indicated technical result is also achieved by obtaining the second variant of the spore-forming, forming parasporal crystals, bacterial strain Bacillus thuringiensis, which neutralizes the infectious activity of the human influenza virus A / H3N2 and deposited in the collection of bacteria, bacteriophages and fungi of the Federal State Institution of Science "State Scientific Center for Virology and Biotechnology" Vector "Under registration number B-1273.
Характеристика штаммов.Characterization of strains.
Штаммы В. thuringiensis AK-1 и Bacillus thuringiensis AK-2 получены при селекции на наличие противовирусной активности штаммов Bt, выделенных ранее из образцов грунта грязевого горячего котла (Долина Гейзеров, Камчатка).Strains of B. thuringiensis AK-1 and Bacillus thuringiensis AK-2 were obtained by selection for the antiviral activity of Bt strains isolated previously from soil samples from a mud hot boiler (Geyser Valley, Kamchatka).
Морфология штаммов:The morphology of the strains:
Штаммы В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 имеют сходную морфологию колоний и клеток. На агаризованной среде Nutrient Broth с добавлением 18-20% агара (среда NBA) формируют округлые, белесые, плоские, мелкозернистые, непрозрачные колонии. Клетки штаммов представлены грамположительными, палочками, размером 1,2-1,4×2-4 мкм, с расположением по 2 или в цепочках; формируют параспоральные включения округлой формы. Эндоспоры эллиптические, диаметр клетки не превышают, после разрушения спорангия споры и параспоральные включения исследуемых штаммов остаются соединенными в пары, соединялись со спорой не плотно, а через связующие их структуры. Центральные оси споры и кристалла совпадают. Для клеток штаммов В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 характерно наличие четко выраженной макрокапсулы (толщиной более 0,2 мкм). Кристаллы штаммов имеют одинаковый состав белков с характерной для Bt молекулярной массой (130, 125 и 100 кДа).Strains of B. thuringiensis AK-1 and B. thuringiensis AK-2 have a similar morphology of colonies and cells. On agri nutrient medium Nutrient Broth with the addition of 18-20% agar (NBA medium) form round, whitish, flat, fine-grained, opaque colonies. The cells of the strains are represented by gram-positive, rods, size 1.2-1.4 × 2-4 microns, with an arrangement of 2 or in chains; form round-shaped parasporal inclusions. The endospores are elliptical, the cell diameter does not exceed, after the destruction of the sporangia, the spores and parasporal inclusions of the studied strains remain paired, they are not connected to the spore tightly, but through their connecting structures. The central axis of the spores and crystal coincide. The cells of strains of B. thuringiensis AK-1 and B. thuringiensis AK-2 are characterized by the presence of a clearly defined macrocapsule (more than 0.2 μm thick). The strain crystals have the same protein composition with a characteristic molecular weight for Bt (130, 125, and 100 kDa).
Биохимические признаки штаммов:Biochemical signs of strains:
По биохимическим признакам штаммы В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 также проявляют большое сходство, незначительно отличаясь по некоторым альтернативным признакам (гидролиз сахарозы, эскулина) и по резистентности к антибиотикам. Штаммы В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 при культивировании на питательных средах растут в присутствии 0,001% лизоцима, способны к анаэробному росту, выделяют кислоту из глюкозы и мальтозы, но, не из арабинозы, ксилозы, маннита и лактозы, не образуют индол, не дезаминируют фенилаланин, имеют лизинкарбоксилазу, не обладают аргининдекарбоксилазой, восстанавливают нитраты, гидролизуют казеин, положительны в реакции MR, FP, в реакции на каталазу, оксидазу, амилазу, липазную, лецитиназную и гемолитическую (на эритроцитах кролика) активность, гидролизуют желатин; отрицательны в реакции на плазмокоагулазную и фибринолитическую активность, в реакции на уреазу и фосфатазу; не образуют индол, сероводород, аммиак, не утилизируют цитрат.By biochemical characteristics, strains of B. thuringiensis AK-1 and B. thuringiensis AK-2 also show great similarity, slightly differing in some alternative characters (hydrolysis of sucrose, esculin) and antibiotic resistance. Strains of B. thuringiensis AK-1 and B. thuringiensis AK-2, when cultured on nutrient media, grow in the presence of 0.001% lysozyme, are capable of anaerobic growth, secrete acid from glucose and maltose, but not from arabinose, xylose, mannitol and lactose, do not form indole, do not deaminate phenylalanine, have lysine carboxylase, do not have arginine decarboxylase, reduce nitrates, hydrolyze casein, are positive in the reaction of MR, FP, in reaction to catalase, oxidase, amylase, lipase, lecithinase and hemolytic (on rabbit erythrocytes hydrolysis) well latin; negative in reaction to plasmocoagulase and fibrinolytic activity, in reaction to urease and phosphatase; do not form indole, hydrogen sulfide, ammonia, do not utilize citrate.
Для определения возможности применения штаммов В. thuringiensis совместно с антибактериальными препаратами необходимо выяснить их резистентность по отношению к антибиотикам. Показано, что штамм В. thuringiensis AK-1 устойчив к азлоциллину, ампициллину, бензилпенициллину, карбенициллину, оксациллину, полимиксину и цефотаксину; чувствителен к амикацину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, рифампицину, имипенему, левомицетину, линкомицину, неомицину, стрептомицину, тетрациклину и ципрофлоксацину. Штамм В. thuringiensis AK-2 резистентен к азлоциллину, ампициллину, бензилпенициллину, карбенициллину, оксациллину и цефотаксину; слабо чувствителен к полимиксину; чувствителен к амикацину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, рифампицину, имипенему, левомицетину, линкомицину, неомицину, стрептомицину, тетрациклину и ципрофлоксацину.To determine the possibility of using strains of B. thuringiensis together with antibacterial drugs, it is necessary to determine their resistance to antibiotics. The strain B. thuringiensis AK-1 was shown to be resistant to azlocillin, ampicillin, benzylpenicillin, carbenicillin, oxacillin, polymyxin and cefotaxin; sensitive to amikacin, vancomycin, gentamicin, kanamycin, rifampicin, imipenem, chloramphenicol, lincomycin, neomycin, streptomycin, tetracycline and ciprofloxacin. The strain B. thuringiensis AK-2 is resistant to azlocillin, ampicillin, benzylpenicillin, carbenicillin, oxacillin and cefotaxin; slightly sensitive to polymyxin; sensitive to amikacin, vancomycin, gentamicin, kanamycin, rifampicin, imipenem, chloramphenicol, lincomycin, neomycin, streptomycin, tetracycline and ciprofloxacin.
Хранение штаммов осуществляется периодическими пересевами на агаризованную среду NBA, длительное хранение осуществляется в 15% растворе глицерина при низкотемпературном замораживании (65°C) [6] и в лиофильно-высушенном состоянии. Штаммы В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 депонированы в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»» под коллекционными номерами В-1072 и В-1073, соответственно.The strains are stored by periodic reseeding on an agarized NBA medium; long-term storage is carried out in a 15% glycerol solution under low-temperature freezing (65 ° C) [6] and in a lyophilized state. The strains of B. thuringiensis AK-1 and B. thuringiensis AK-2 were deposited in the collection of bacteria, bacteriophages and fungi of the Federal State Biological Research Center VB Vektor under collection numbers B-1072 and B-1073, respectively.
Справки о депонировании штаммов прилагаются.Certificates of deposit of strains are attached.
Посевной материал получали при выращивании штаммов на жидких или агаризованных средах: LB (“Difco”, США), LB с добавление агара до 1,7%, среда NBA с добавлением 18-20% агара; значение рН всех сред составляло 7.0-7.2.Inoculum was obtained by growing strains on liquid or agarized media: LB (Difco, USA), LB with agar up to 1.7%, NBA medium with 18-20% agar; the pH of all media was 7.0–7.2.
Исследование штаммов В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 на активность против вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (A/H3N2) проводится впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемых штаммов критериям изобретения «новизны» и «изобретательский уровень».The study of strains of B. thuringiensis AK-1 and B. thuringiensis AK-2 on activity against the human influenza virus A / Aichi / 2/68 (A / H3N2) is carried out for the first time, and therefore we can conclude that the proposed strains meet the criteria of the invention " novelty ”and“ inventive step ”.
1. Подготовка препаратов на основе водорастворимых метаболитов штамма В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2.1. Preparation of preparations based on water-soluble metabolites of strain B. thuringiensis AK-1 and B. thuringiensis AK-2.
1.1. Наработка культуральной жидкости (КЖ) штамма. С использованием культуры исследуемого штамма, наработанного на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензии клеток с концентрацией 1×107 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки (КТ 104, Россия). Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста (микроскоп Axioskop 40, “Карл Цейсс”, Германия).1.1. The accumulation of culture fluid (QOL) of the strain. Using a culture of the studied strain, which was developed on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, cell suspensions were prepared with a concentration of 1 × 10 7 cells / ml. The prepared suspension was introduced in an amount of 1% into flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostated rocking chair (CT 104, Russia). For the preparation of preparations used cell cultures of bacilli, which are in the vegetative stage of development. The absence of sporulation and the formation of paraspore inclusions was monitored by microscopy of the culture by the phase contrast method (Axioskop 40 microscope, Karl Zeiss, Germany).
1.2. Получение препарата на основе культуральной жидкости штамма. Для приготовления препарата полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали дважды последовательной ультрафильтрацией через Whatman фильтры, с размерами пор 0.2 µm, и хранили до использования при температуре минус 20°C.1.2. Obtaining a drug based on the culture fluid of the strain. To prepare the preparation, the obtained QL strain was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized twice by successive ultrafiltration through Whatman filters, with a pore size of 0.2 μm, and stored until use at minus 20 ° C.
Отсутствие бактериальных клеток в препарате контролировали микроскопически и при его высеве на агаризованную среду LB.The absence of bacterial cells in the preparation was monitored microscopically and when it was plated on LB agar medium.
2. Исследование токсичности и противовирусной активности штамма В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 относительно вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (A/H3N2).2. The study of the toxicity and antiviral activity of strain B. thuringiensis AK-1 and B. thuringiensis AK-2 against human influenza virus A / Aichi / 2/68 (A / H3N2).
2.1. Определение токсичности и противовирусной активности препаратов Вт. Для оценки противовирусной эффективности полученных препаратов Bt использовали вирус гриппа человека A/Aichi/2/68 (A/H3N2) из «Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»». Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из «Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»».2.1. Determination of toxicity and antiviral activity of drugs W. To assess the antiviral efficacy of the obtained Bt preparations, the human influenza virus A / Aichi / 2/68 (A / H3N2) from the Collection of Microorganisms of the Federal State Institution of Biology and Science of the World Bank “Vector” was used. To test the toxicity and antiviral activity of the drugs used transplantable cell culture MDCK obtained from the "Collection of cell cultures FBSI SSC WB" Vector "."
2.2. Определение токсических доз препаратов. В стерильном месте суспензию с известной концентрацией клеток MDCK разводили предварительно подогретой до температуры 37°C средой RPMI-1640 до концентрации 1×105 кл./мл и по 100 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя.2.2. Determination of toxic doses of drugs. At a sterile site, a suspension with a known concentration of MDCK cells was diluted with RPMI-1640 medium preheated to 37 ° C to a concentration of 1 × 10 5 cells / ml and 100 μl was added into wells of 96-well plates. Tablets with cells were placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2-3 days before the formation of a monolayer.
Препараты разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК).The preparations were diluted 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl were added to the corresponding wells of the plate with MDCK cells and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. To determine the antiviral activity of the drugs used the maximum tolerated concentration (IPC).
2.3. Определение противовирусной активности препаратов. Готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 сут при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.2.3. Determination of antiviral activity of drugs. Ten-fold dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of the preparations, 100 μl of the selected dilution of the preparation and 100 μl of 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added to the monolayer of the MDCK cell culture. Cells were incubated for 2 days at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
3. Примеры конкретного применения заявляемых штаммов.3. Examples of specific applications of the claimed strains.
Схема подготовки образцов препаратов на основе заявляемых штаммов для исследования противовирусной активности приведена в таблице.The preparation of drug samples based on the claimed strains for the study of antiviral activity is shown in the table.
3.1. Пример №1. Испытание противовирусного действия препарата №4, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis AK-1, на вирус гриппа человека A/H3N2.3.1. Example No. 1. The antiviral test of the preparation No. 4, prepared on the basis of the culture fluid of the strain Bacillus thuringiensis AK-1, on the human influenza virus A / H3N2.
С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis AK-1, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×107 кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.Using a culture of a strain of Bacillus thuringiensis AK-1, prepared on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, a cell suspension of 1 × 10 7 cells / ml was prepared. The prepared suspension was made in an amount of 1% in flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostated rocking chair. For the preparation of preparations used cell cultures of bacilli, which are in the vegetative stage of development. The absence of sporulation and the formation of parasporal inclusions was monitored by microscopy of the culture by the phase contrast method.
Для приготовления препарата №4 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2цт, полученный препарат №4 хранили до использования при температуре минус 20°C.To prepare preparation No. 4, the obtained QL strain was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized by ultrafiltration through a Whatman filter, with a pore size of 0.2ct; the resulting preparation No. 4 was stored until use at a temperature of minus 20 ° C.
Отсутствие бактериальных клеток в препарате контролировали микроскопически и при его высеве на агаризованную среду LB.The absence of bacterial cells in the preparation was monitored microscopically and when it was plated on LB agar medium.
Для определения токсических доз препарат №4 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №4 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №4 использовали разведение в 5 раз.To determine toxic doses, preparation No. 4 was diluted 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl was added to the corresponding wells of the plate and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. Drug No. 4 was non-toxic in MDCK cell culture starting with 5-fold dilution. To assess the antiviral activity of drug No. 4, a 5-fold dilution was used.
Для определения противовирусной активности препарата №4 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 5 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.To determine the antiviral activity of drug No. 4, ten-fold dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of the preparations, 100 μl / well of the drug diluted 5 times with RPMI-1640 medium and 100 μl from 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added to the monolayer of the MDCK cell culture. Cells were incubated for 2 days at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
При инфекционности вируса A/H3N2 на клетках MDCK (титр в lg ТЦД50/мл составил 6,7), ее нейтрализация под влиянием исследованного препарата составляла 0,5 lg.When the A / H3N2 virus was infectious on MDCK cells (titer in lg TCD50 / ml was 6.7), its neutralization under the influence of the studied drug was 0.5 lg.
3.2. Пример №2. Испытание противовирусного действия препарата №4-10, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis AK-1, на вирус гриппа человека A/H3N2.3.2. Example No. 2. The antiviral test of the preparation No. 4-10, prepared on the basis of the culture fluid of the strain Bacillus thuringiensis AK-1, on the human influenza virus A / H3N2.
С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis AK-1, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×107 кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.Using a culture of a strain of Bacillus thuringiensis AK-1, prepared on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, a cell suspension of 1 × 10 7 cells / ml was prepared. The prepared suspension was made in an amount of 1% in flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostated rocking chair. For the preparation of preparations used cell cultures of bacilli, which are in the vegetative stage of development. The absence of sporulation and the formation of parasporal inclusions was monitored by microscopy of the culture by the phase contrast method.
Для приготовления препарата №4-10 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, полученный препарат №4-10 хранили до использования при температуре минус 20°C.To prepare preparation No. 4-10, the obtained QL strain was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized by ultrafiltration through a Whatman filter, with a pore size of 0.2 μm, the resulting preparation No. 4-10 was stored until use at a temperature of minus 20 ° C.
Отсутствие бактериальных клеток в препарате контролировали микроскопически и при его высеве на агаризованную среду LB.The absence of bacterial cells in the preparation was monitored microscopically and when it was plated on LB agar medium.
Для определения токсических доз препарат №4-10 разводили в 2 раза, в 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №4-10 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №4-10 использовали разведение в 10 раз.To determine toxic doses, drug No. 4-10 was diluted 2 times, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl was added to the corresponding wells of the plate and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. The drug No. 4-10 was non-toxic in cell culture MDCK starting with a dilution of 5 times. To assess the antiviral activity of drug No. 4-10, dilution of 10 times was used.
Для определения противовирусной активности препарата №4-10 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 5 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% СО2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.To determine the antiviral activity of preparation No. 4-10, ten-fold dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of the preparations, 100 μl / well of the drug diluted 5 times with RPMI-1640 medium and 100 μl from 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added to the monolayer of the MDCK cell culture. Cells were incubated for 2 days at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
По отношению к вирусу A/H3N2 (титр в lgТЦД50/мл составил 6, 7) индекс нейтрализации под влиянием исследованного препарата равнялся 1.0 lg.With respect to the A / H3N2 virus (titer in lgTCD50 / ml was 6, 7), the neutralization index under the influence of the studied drug was 1.0 lg.
3.3. Пример №3. Испытание противовирусного действия препарата №4/1, приготовленного на основе культуральной жидности штамма Bacillus thuringiensis AK-1, на вирус гриппа человека A/H3N2.3.3. Example No. 3. Antiviral test of the preparation No. 4/1, prepared on the basis of the culture fluid of the strain Bacillus thuringiensis AK-1, on the human influenza virus A / H3N2.
С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-1, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×107 кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №4/1 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, полученный препарат №4/1 хранили до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.Using a culture of strain B. thuringiensis AK-1, which was prepared on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, a cell suspension of 1 × 10 7 cells / ml was prepared. The prepared suspension was made in an amount of 1% in flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostated rocking chair. For the preparation of preparation No. 4/1, cell cultures of bacilli in the vegetative stage of development were used. The resulting culture fluid was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized by ultrafiltration through a Whatman filter, with a pore size of 0.2 μm, the resulting preparation No. 4/1 was stored until use at a temperature of minus 20 ° C for 3 months.
Для определения токсических доз препарат №4/1 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №4/1 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №4/1 использовали разведение в 5 раз.To determine toxic doses, preparation No. 4/1 was diluted 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl was added to the corresponding wells of the plate and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. The drug No. 4/1 was non-toxic in the MDCK cell culture starting with a 5-fold dilution. A 5-fold dilution was used to evaluate the antiviral activity of preparation No. 4/1.
Для определения противовирусной активности препарата №4/1 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 5 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% СО2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.To determine the antiviral activity of preparation No. 4/1, ten-fold dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of the preparations, 100 μl / well of the drug diluted 5 times with RPMI-1640 medium and 100 μl from 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added to the monolayer of the MDCK cell culture. Cells were incubated for 2 days at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
При инфекционности вируса A/H3N2 на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 6,7) ее нейтрализация под влиянием исследованного препарата составляла 2.5 lg.When the A / H3N2 virus was infectious on MDCK cells (titer in lgТЦД50 / ml was 6.7), its neutralization under the influence of the studied drug was 2.5 lg.
3.4. Пример №4. Испытание противовирусного действия препарата №4/1-10, приготовленного на основе культуральной жидности штамма Bacillus thuringiensis AK-1, на вирус гриппа человека A/H3N2.3.4. Example No. 4. The antiviral test of the preparation No. 4 / 1-10, prepared on the basis of the culture fluid of the strain Bacillus thuringiensis AK-1, on the human influenza virus A / H3N2.
С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-1, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1х107 кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №4/1-10 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, полученный препарат №4/1-10 хранили до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.Using a culture of strain B. thuringiensis AK-1, which was developed on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, a cell suspension of 1x10 7 cells / ml was prepared. The prepared suspension was made in an amount of 1% in flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostated rocking chair. To prepare the preparation No. 4 / 1-10, cell cultures of bacilli in the vegetative stage of development were used. The resulting culture fluid was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized by ultrafiltration through a Whatman filter, with a pore size of 0.2 μm, the resulting preparation No. 4 / 1-10 was stored until use at a temperature of minus 20 ° C for 3 months.
Для определения токсических доз препарат №4/1-10 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №4/1-10 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK, начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №4/1-10 использовали разведение в 10 раз.To determine toxic doses, preparation No. 4 / 1-10 was diluted 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl was added to the corresponding wells of the plate and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. The drug No. 4 / 1-10 was non-toxic in cell culture MDCK, starting with a dilution of 5 times. To assess the antiviral activity of the drug No. 4/1-10, a dilution of 10 times was used.
Для определения противовирусной активности препарата №4/1-10 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 5 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% СО2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.To determine the antiviral activity of preparation No. 4 / 1-10, ten-fold dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of the preparations, 100 μl / well of the drug diluted 5 times with RPMI-1640 medium and 100 μl from 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added to the monolayer of the MDCK cell culture. Cells were incubated for 2 days at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
По отношению к вирусу A/H3N2 (титр в lgТЦД50/мл составил 6,7) индекс нейтрализации под влиянием исследованного препарата равнялся 3,2 lg.Relative to the A / H3N2 virus (titer in lgTCD50 / ml was 6.7), the neutralization index under the influence of the studied drug was 3.2 lg.
3.5. Пример №5. Испытание противовирусного действия препарата №5, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма В. thuringiensis AX-2, на вирус гриппа человека A/H3N2, хранящейся до использования при температуре минус 20°C.3.5. Example No. 5. The antiviral test of the preparation No. 5, prepared on the basis of the culture fluid of strain B. thuringiensis AX-2, on the human influenza virus A / H3N2, stored until use at a temperature of minus 20 ° C.
С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-2, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×107 кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные КЖ бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.Using a culture of strain B. thuringiensis AK-2, which was developed on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, a cell suspension of 1 × 10 7 cells / ml was prepared. The prepared suspension was made in an amount of 1% in flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostated rocking chair. For the preparation of preparations, cellular QOL of bacilli, which are in the vegetative stage of development, were used. The absence of sporulation and the formation of parasporal inclusions was monitored by microscopy of the culture by the phase contrast method.
Для приготовления препарата №5 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0,2 µm, полученный препарат №5 хранили до использования при температуре минус 20°C.To prepare preparation No. 5, the obtained QL strain was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized by ultrafiltration through a Whatman filter, with a pore size of 0.2 μm, the resulting preparation No. 5 was stored until use at a temperature of minus 20 ° C.
Для определения токсических доз препарат №5 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №5 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №5 использовали разведение в 5 раз.To determine toxic doses, preparation No. 5 was diluted 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl was added to the corresponding wells of the plate and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. Drug No. 5 was nontoxic in MDCK cell culture starting with 5-fold dilution. To assess the antiviral activity of drug No. 5, a 5-fold dilution was used.
Для определения противовирусной активности препарата №5 готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK. вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре +37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.To determine the antiviral activity of preparation No. 5, dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared in ten-fold steps using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of drugs in a monolayer of MDCK cell culture. 100 μl / well of the preparation diluted 10 times with RPMI-1640 medium and 100 μl from 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added. Cells were incubated for 2 days at a temperature of + 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
При инфекционности вируса A/H3N2 на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 6,7), ее нейтрализация под влиянием исследованного препарата составляла 1,2 lg.When the A / H3N2 virus was infectious on MDCK cells (titer in lgTCD50 / ml was 6.7), its neutralization under the influence of the studied drug was 1.2 lg.
3.6. Пример №6. Испытание противовирусного действия препарата №5-10, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма В. thuringiensis АР-2, на вирус гриппа человека A/H3N2, хранящейся до использования при температуре минус 20°C.3.6. Example No. 6. The antiviral test of the preparation No. 5-10, prepared on the basis of the culture fluid of the strain B. thuringiensis AP-2, on the human influenza virus A / H3N2, stored until use at a temperature of minus 20 ° C.
С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-2, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×107 кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные КЖ бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.Using a culture of strain B. thuringiensis AK-2, which was developed on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, a cell suspension of 1 × 10 7 cells / ml was prepared. The prepared suspension was made in an amount of 1% in flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostated rocking chair. For the preparation of preparations, cellular QOL of bacilli, which are in the vegetative stage of development, were used. The absence of sporulation and the formation of parasporal inclusions was monitored by microscopy of the culture by the phase contrast method.
Для приготовления препарата №5-10 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0,2 µm, полученный препарат №5-10 хранили до использования при температуре минус 20°C.To prepare the preparation No. 5-10, the obtained QL strain was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized by ultrafiltration through a Whatman filter, with a pore size of 0.2 μm, the resulting preparation No. 5-10 was stored until use at a temperature of minus 20 ° C.
Для определения токсических доз препарат №5-10 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% СО2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №5-10 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №5-10 использовали разведение в 10 раз.To determine toxic doses, drug No. 5-10 was diluted 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl was added to the corresponding wells of the plate and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. Drug No. 5-10 was nontoxic on MDCK cell culture starting with 5-fold dilution. To assess the antiviral activity of the drug No. 5-10 used a dilution of 10 times.
Для определения противовирусной активности препарата №5-10 готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% СО2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.To determine the antiviral activity of drug No. 5-10, dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared in tenfold increments using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of the preparations, 100 μl / well of the drug diluted 10 times with RPMI-1640 medium and 100 μl from 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added to the monolayer of the MDCK cell culture. Cells were incubated for 2 days at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
По отношению к вирусу A/H3N2 (титр в lgТЦД50/мл составил 6, 7) индекс нейтрализации под влиянием исследованного препарата равнялся 1,2 lg.Relative to the A / H3N2 virus (titer in lgTCD50 / ml was 6, 7), the neutralization index under the influence of the studied drug was 1.2 lg.
3.7. Пример №7. Испытание противовирусного действия препарата №5/1, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis AK-2, на вирус гриппа человека A/H3N2, хранящейся до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.3.7. Example No. 7. The antiviral test of the preparation No. 5/1 prepared on the basis of the culture fluid of the strain Bacillus thuringiensis AK-2 on the human influenza virus A / H3N2, stored until use at a temperature of minus 20 ° C for 3 months.
С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-2, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×107 кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки Для приготовления препарата №5/1 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об./мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, и полученный препарат №5/1 хранили до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.Using a culture of strain B. thuringiensis AK-2, which was developed on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, a cell suspension of 1 × 10 7 cells / ml was prepared. The prepared suspension was introduced in an amount of 1% into flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostatically controlled rocking chair. For preparation of preparation No. 5/1, cell cultures of bacilli in the vegetative stage of development were used. The resulting culture fluid was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized by ultrafiltration through a Whatman filter, with a pore size of 0.2 μm, and the resulting preparation No. 5/1 was stored until use at a temperature of minus 20 ° C for 3 months.
Для определения токсических доз препарат №5/1 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №5/1 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №5/1 использовали разведение в 5 раз.To determine toxic doses, preparation No. 5/1 was diluted 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl was added into the corresponding wells of the plate and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. The drug No. 5/1 was non-toxic on the MDCK cell culture starting with a 5-fold dilution. A 5-fold dilution was used to evaluate the antiviral activity of preparation No. 5/1.
Для определения противовирусной активности препарата №5/1 готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.To determine the antiviral activity of drug No. 5/1, dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared in ten-fold steps using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of the preparations, 100 μl / well of the drug diluted 10 times with RPMI-1640 medium and 100 μl from 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added to the monolayer of the MDCK cell culture. Cells were incubated for 2 days at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
При инфекционности вируса A/H3N2 на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 6, 7) ее нейтрализация под влиянием исследованного препарата составляла 3,0 lg.When the A / H3N2 virus was infectious on MDCK cells (titer in lgTCD50 / ml was 6, 7), its neutralization under the influence of the studied drug was 3.0 lg.
3.8. Пример №8. Испытание противовирусного действия препарата №5/1-10, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis AK-2, на вирус гриппа человека A/H3N2, хранящейся до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.3.8. Example No. 8. The antiviral test of the preparation No. 5 / 1-10, prepared on the basis of the culture fluid of the strain Bacillus thuringiensis AK-2, on the human influenza virus A / H3N2, stored until use at a temperature of minus 20 ° C for 3 months.
С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-2, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×107 кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №5/1-10 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, и полученный препарат №5/1-10 хранили до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.Using a culture of strain B. thuringiensis AK-2, which was developed on an agar medium for 18-24 hours at a temperature of 28-30 ° C, a cell suspension of 1 × 10 7 cells / ml was prepared. The prepared suspension was made in an amount of 1% in flasks with 50 ml of LB medium and cultured for 18 hours using a thermostated rocking chair. To prepare the preparation No. 5 / 1-10, we used cell cultures of bacilli that are in the vegetative stage of development. The resulting culture fluid was centrifuged at 6000 rpm for 30 min in a JA-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was sterilized by ultrafiltration through a Whatman filter, with a pore size of 0.2 μm, and the resulting preparation No. 5 / 1-10 was stored until use at a temperature of minus 20 ° C for 3 months.
Для определения токсических доз препарат №5/1-10 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №5/1-10 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №5/1-10 использовали разведение в 10 раз.To determine toxic doses, preparation No. 5 / 1-10 was diluted 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 times with RPMI-1640 medium, 150 μl was added to the corresponding wells of the plate and placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C, 5% CO 2 and 100% humidity for 2 days. After 2 days using an inverted microscope, the presence of toxic effects in monolayers of MDCK cells incubated with different concentrations of the preparations was evaluated. The drug No. 5 / 1-10 was non-toxic on the cell culture MDCK starting with a dilution of 5 times. To assess the antiviral activity of the drug No. 5 / 1-10, a dilution of 10 times was used.
Для определения противовирусной активности препарата №5/1-10 готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.To determine the antiviral activity of drug No. 5 / 1-10, dilutions of IMPORTANT from 1 to 8 were prepared in tenfold increments using RPMI-1640 medium containing 2 μg / ml trypsin. To determine the antiviral activity of the preparations, 100 μl / well of the drug diluted 10 times with RPMI-1640 medium and 100 μl from 1 to 8 dilutions of IMPORTANT were added to the monolayer of the MDCK cell culture. Cells were incubated for 2 days at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 in a TS-1/80 SPU thermostat (Russia). After 2 days in each well, an inverted microscope was used to record the CPD in the cell monolayer and the presence of the virus in the culture medium was determined by the hemagglutination reaction (RGA) with 1% chicken erythrocytes.
По отношению к вирусу A/H3N2 (титр в ^ТЦД50/мл составил 6, 7) индекс нейтрализации под влиянием исследованного препарата равнялся 3,2 lg.In relation to the A / H3N2 virus (titer in ^ TCD50 / ml was 6, 7), the neutralization index under the influence of the studied drug was 3.2 lg.
Таким образом, было показано, что препараты, приготовленные на основе культуральной жидкости штаммов Bacillus thuringiensis AK-1 и Bacillus thuringiensis AK-2 проявили высокую противовирусную активность относительно вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (A/H3N2).Thus, it was shown that preparations prepared on the basis of the culture fluid of the strains of Bacillus thuringiensis AK-1 and Bacillus thuringiensis AK-2 showed high antiviral activity against human influenza virus A / Aichi / 2/68 (A / H3N2).
Источники информацииInformation sources
1. Каменек Л.К., Левина Т.А., Терехин Д.А., Миначева Л.Д. Антибактериальное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis как потенциального агента защиты растений // Биотехнология. - 2005. - №1. - С.59-67.1. Kamenek L.K., Levina T.A., Terekhin D.A., Minacheva L.D. Antibacterial effect of delta-endotoxin Bacillus thuringiensis as a potential plant protection agent // Biotechnology. - 2005. - No. 1. - S. 59-67.
2. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. // Микробиология. - 1997. - Т.66. - №1. - С.25-31.2. Yudina T.G., Burtseva L.I. // Microbiology. - 1997. - T.66. - No. 1. - S.25-31.
3. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. Глупова В.В. - М.: Круглый год, 2001. - 716 с.3. Insect pathogens: structural and functional aspects / Ed. Glupova V.V. - M .: All year round, 2001 .-- 716 p.
4. Ahern М., Verschueren S., van Sinderen D. // FEMS Microbiol. Letters. - 2003. - V.220. - P.127-131.4. Ahern M., Verschueren S., van Sinderen D. // FEMS Microbiol. Letters. - 2003. - V.220. - P.127-131.
Claims (2)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013159216/10A RU2551236C1 (en) | 2013-12-30 | 2013-12-30 | STRAIN OF BACTERIA Bacillus thuringiensis, NEUTRALISING INFECTIOUS ACTIVITY OF HUMAN INFLUENZA VIRUS A/H3N2 (VERSIONS) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013159216/10A RU2551236C1 (en) | 2013-12-30 | 2013-12-30 | STRAIN OF BACTERIA Bacillus thuringiensis, NEUTRALISING INFECTIOUS ACTIVITY OF HUMAN INFLUENZA VIRUS A/H3N2 (VERSIONS) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2551236C1 true RU2551236C1 (en) | 2015-05-20 |
Family
ID=53294342
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013159216/10A RU2551236C1 (en) | 2013-12-30 | 2013-12-30 | STRAIN OF BACTERIA Bacillus thuringiensis, NEUTRALISING INFECTIOUS ACTIVITY OF HUMAN INFLUENZA VIRUS A/H3N2 (VERSIONS) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2551236C1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6528480B1 (en) * | 1995-08-02 | 2003-03-04 | Natalia Batchikova | Protein with plant protecting properties |
RU2405035C1 (en) * | 2009-04-17 | 2010-11-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Bacillus thuringiensis BACTERIA STRAIN EXHIBITING ANTIVIRAL AND ANTI-CANDIDA ACTIVITY (VERSIONS) |
RU2412238C2 (en) * | 2009-04-17 | 2011-02-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Antiviral medication (versions) |
-
2013
- 2013-12-30 RU RU2013159216/10A patent/RU2551236C1/en active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6528480B1 (en) * | 1995-08-02 | 2003-03-04 | Natalia Batchikova | Protein with plant protecting properties |
RU2405035C1 (en) * | 2009-04-17 | 2010-11-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Bacillus thuringiensis BACTERIA STRAIN EXHIBITING ANTIVIRAL AND ANTI-CANDIDA ACTIVITY (VERSIONS) |
RU2412238C2 (en) * | 2009-04-17 | 2011-02-20 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Antiviral medication (versions) |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BELL M.R. ET AL. Tobacco budworm field evaluation of microbial control in cotton using Bacillus thuringiensis and a nuclear polyhedrosis virus with a feeding adjuvant // Journal of Economic Entomology, 1980, vol. 73, no. 3, pp. 427-430 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Al-Dhabi et al. | Isolation, identification and screening of antimicrobial thermophilic Streptomyces sp. Al-Dhabi-1 isolated from Tharban hot spring, Saudi Arabia | |
Sethi et al. | Antibiotic production by microbes isolated from soil | |
Tamilselvam et al. | Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells | |
JP6598086B2 (en) | Novel bacteria of the genus Bacillus and use thereof | |
CN104946574B (en) | Bacillus subtilis Baisha2C for inhibiting plant pathogenic fungi | |
Balouiri et al. | Antifungal activity of Bacillus spp. isolated from Calotropis procera AIT. Rhizosphere against Candida albicans | |
KR20180118172A (en) | Methods for purifying antifungal compounds and exopolysaccharides from microbial cell cultures | |
Dai et al. | Isolation, evaluation and identification of rhizosphere actinomycetes with potential application for biocontrol of Valsa mali | |
Selvendran et al. | Studies on novel bacteriocin like inhibitory substance (BLIS) from microalgal symbiotic Vibrio spp MMB2 and its activity against aquatic bacterial pathogens | |
Chi et al. | Biosurfactins production by Bacillus amyloliquefaciens R3 and their antibacterial activity against multi-drug resistant pathogenic E. coli | |
Pringgenies | Explorations of symbiotic microbe from sea Cucumber gut as an anti-multi-drug resistant microbe agent for utilization in hand | |
CN102327278B (en) | Application of carborane derivatives, nano compound preparation and application of nano compound preparation | |
RU2551236C1 (en) | STRAIN OF BACTERIA Bacillus thuringiensis, NEUTRALISING INFECTIOUS ACTIVITY OF HUMAN INFLUENZA VIRUS A/H3N2 (VERSIONS) | |
Alexandrova et al. | Bacillus subtilis strain BS-F3: colonization of pear organs and its action as a biocontrol agent | |
RU2412238C2 (en) | Antiviral medication (versions) | |
RU2405035C1 (en) | Bacillus thuringiensis BACTERIA STRAIN EXHIBITING ANTIVIRAL AND ANTI-CANDIDA ACTIVITY (VERSIONS) | |
Vijayakumar et al. | Isolation, characterization and antibacterial activity of actinobacteria from dye polluted soils of Tirupur | |
Das et al. | Comparative Evaluation of Purification Methods for Production of Polypeptide Antibiotics–Polymyxin B and Cerexin A from Bacillus Species | |
Jayasree et al. | Characterization and antibacterial activity of violacein producing deep purple pigmented bacterium Pseudoalteromonas luteoviolacea (Gauthier, 1982) isolated from coral reef ecosystems | |
Ram et al. | Isolation of potential anti-microbial compounds from actinomycetes found in soil surrounding medicinal plants of Saurashtra, Gujarat, India | |
CN113564073B (en) | Leptospira predatory and application thereof in preparation of medicines for inhibiting methicillin-resistant staphylococcus aureus | |
CN114958682B (en) | Use of Rennoborn hol-de la in the preparation of a product for inducing systemic resistance in plants or seeds thereof | |
Bhuyan et al. | Antimicrobial activity of endophytic fungi isolated from a traditionally important plant of NE India-Litsea chinensis Lam. | |
Mahdi et al. | Antimicrobial Activity of Geobacillus thermoleovorans Ir1 Active Compounds against Pathogenic Bacteria | |
RU2444366C1 (en) | Antibiotic resistant therapeutic biological product for bacterial and mycotic infections |